β CARBA Test

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Détection rapide des souches d’entérobactéries productrices de carbapénèmases

881159 – 2015/05

Sommaire

1. INTERET CLINIQUE

2. RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST

3. PRINCIPE DU TEST

4. RÉACTIFS

5. PRÉCAUTIONS D’UTILISATION

6. ÉCHANTILLONS

7. PROCÉDURE

8. PERFORMANCES

9. LIMITES DU TEST

10. BIBLIOGRAPHIE

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1. INTÉRET CLINIQUE
La sensibilité diminuée aux carbapénèmes peut être la conséquence d’une production d’enzymes (carbapénèmases) par
les bactéries ou bien d’une modification de la membrane bactérienne empêchant ainsi la pénétration de la molécule à
l’intérieur de la bactérie.
Le test β CARBA est un test colorimétrique qualitatif utilisé pour la détection de souches à sensibilité diminuée aux
carbapénèmes par production de carbapénèmases. Le test peut être réalisé directement à partir de colonies isolées
d’entérobactéries. Le test β CARBA ne prétend pas remplacer les méthodes habituelles de détermination de sensibilité
aux antibiotiques.

2. RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST

Les carbapénèmes constituent la classe d’antibiotiques à large spectre encore active sur les bactéries gram-négatif multi-
résistantes, et la dissémination actuelle des souches d’entérobactéries productrices de carbapénèmases (CPE) est
extrêmement inquiétante. Toute espèce d’entérobactéries peut acquérir des gènes codant pour la production de
carbapénèmases et les CPE sont fréquemment résistantes à tous les autres antibiotiques limitant ainsi les autres options
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thérapeutiques .
Les carbapénèmases sont groupées en 3 classes selon leur homologie de séquence des acides aminés (classification
d’Ambler) :
• Carbapénèmases de classe A: largement représentées par le type KPC;
• Carbapénèmases de classe B ou métallo-β-lactamases (MBL): principalement les types IMP, VIM et NDM ;
• Carbapénèmases de classe D: OXA-48 et ses variants.
Le test β CARBA permet une rapide détection des CPE, information d’une extrême importance pour déterminer le
traitement approprié et pour implémenter les mesures de contrôle des infections. L’interprétation des résultats doit être
réalisée en lien avec le contexte clinique du patient.

3. PRINCIPE DU TEST
Le principe du test β CARBA est basé sur un changement de couleur d’un substrat chromogénique* en présence d’une
souche de CPE. Le test est réalisé directement dans des micro-tubes avec des colonies d'entérobactéries fraîchement isolées et
la lecture doit être effectuée dans les 30 minutes qui suivent.
* Dr. Hideaki Hanaki (université Kitasato, Japon)

4. RÉACTIFS
4.1 Description
Un coffret contient les réactifs R1, R2, R3 et 25 micro-tubes.

Identification Description Présentation

Solution d'extraction (incolore)
R1 TM Un flacon prêt à l'emploi, 1mL
Conservateur : 0.1% ProClin 300
R2 Réactif chromogénique lyophilisé jaune Un flacon à reconstituer avec R3
Suspension solution
R3 TM Un flacon prêt à l'emploi, 1.1mL
Conservateur : 0.1% ProClin 300

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4.2 Stockage et conditions de manipulations
Ce kit doit être conservé à +2-8 °C, à l'abri de la lumière.
Les réactifs sont utilisables jusqu'à la date de péremption indiquée sur l'emballage.

Identification Conservation (après la première ouverture)

R1 pendant 3 mois à +2-8 °C
R2(solution reconstituée) pendant 3 mois à +2-8 °C

S'assurer que les bouchons des deux flacons sont bien fermés pour éviter toute contamination ou l'assèchement du réactif
et conserver les flacons en position verticale.

5. PRÉCAUTIONS D’UTILISATION
Pour le diagnostic in vitro uniquement.
À usage professionnel uniquement.

Consignes d’hygiène et de sécurité :

• La manipulation de ce test est uniquement réservée à un personnel qualifié, formé aux procédures de laboratoire et
connaissant les risques potentiels. Porter des vêtements de protection adaptés, des gants et une protection
oculaire/faciale et procéder de manière appropriée en appliquant les bonnes pratiques de laboratoire.
• Éliminer tous les échantillons et le matériel utilisé pour réaliser le test comme des déchets infectieux. Les déchets de
laboratoire, chimiques ou biologiques dangereux doivent être manipulés et éliminés conformément à toutes les
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réglementations locales, régionales et nationales .
• Pour connaître les recommandations liées aux risques et les précautions relatives à certains produits chimiques contenus
dans ce kit, consulter le(s) pictogramme(s) figurant sur les étiquettes et les informations fournies à la fin des instructions
d'utilisation. La fiche technique de sécurité est disponible sur www.bio-rad.com.

Précautions liées à la procédure

Ne pas utiliser des coffrets présentant des signes de détérioration

5.1. Préparation
• Le test β CARBA doit être utilisé suivant la méthodologie détaillée dans la notice. Tout changement dans la
procédure d’utilisation peut entraîner des résultats incorrects.
• Ne pas mélanger ou associer des réactifs issus de lots différents pour une même analyse.
• Avant utilisation, homogénéiser chaque réactif R1 et R3 en vortexant brièvement.
• S’assurer que la totalité du réactif lyophilisé est dans le fond du flacon R2 avant la reconstitution avec R3.
• Reconstituer le lyophilisat R2 avec 1.1 mL de la solution R3 (le bouchon caoutchouc doit être alors éliminé).
• Ne pas utiliser la solution R2 reconstituée si celle-ci est colorée en rouge.
• Ne pas congeler les réactifs R1, R2 (reconstitué ou non) et R3.
• Ne pas préparer à l'avance le mélange réactionnel de R1 avec R2.
• Ne pas utiliser de réactifs périmés.
• Ne pas utiliser de colonies d'entérobactéries isolées sur un milieu ayant été incubé plus de 24 heures.
• Utiliser uniquement des colonies bien isolées.

5.2. Manipulation
• Effectuer le test à température ambiante (entre 18 et 30 °C).
• Homogénéiser les réactifs R1 et R2 avant utilisation.
• Après utilisation, conserver les réactifs R1 et R2 dans leur coffret à +2-8°C.
• Respecter la quantité d'inoculum en utilisant une öse de 1μl pleine.
• La lecture du changement de couleur doit être effectuée dans les 30 minutes d’incubation.

6. ÉCHANTILLONS
Le test est réalisé à partir de colonies bien isolées après 18-24 heures d’incubation. Les colonies peuvent être isolées à
partir des milieux suivants : Gélose Columbia + 5% de sang de mouton, UriSelect™ 4, Drigalski, Trypto-Caséine-Soja.
Pour une utilisation à partir d’un autre milieu de culture, contacter le représentant Bio-Rad.

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7. PROCÉDURE

7.1 Équipement requis

7.1.1 Équipement fourni
• Micro-tubes
• Réactifs R1 et R2 (R2 préalablement reconstitué avec R3)

7.1.2. Équipement requis non fourni

• Öses plastiques de 1µl
• Minuteur
• Etuve

7.2 Mode opératoire

• Identifier le micro-tube.
• Ajouter 40 µL de réactif R1 et 40 µL de réactif R2 dans le micro-tube.
• Sélectionner des colonies d'entérobactéries isolées et les prélever avec une öse de 1 µl. L’öse doit être remplie.
Choisir des colonies d'une couleur homogène et de morphologie similaire si l’isolement a été réalisé sur milieu
chromogénique.
• Décharger l’öse dans le micro-tube.
• Homogénéiser le mélange réactionnel.
• Noter la couleur du mélange à T0.
• Incuber le micro-tube à 37°C (entre 33-39°C) pendant 30 minutes et lire le résultat.
• Noter tout changement de couleur et interpréter le résultat (négatif/positif). L’interprétation finale de la couleur doit
être faite dans les 30 minutes d’incubation ; toutefois, un résultat positif peut être observé en moins de 30 minutes.

7.3 Contrôle de qualité

• Contrôle négatif, par ex. : Escherichia coli ATCC 35218 (souche productrice de pénicillinase de type TEM-1).
• Contrôle positif, par ex. : Klebsiella pneumoniae NCTC 13438. Cette souche produit une carbapénèmase de type
KPC-3 qui confère la résistance aux carbapénèmes. En routine, il est possible d'utiliser une souche clinique
d’entérobactérie caractérisée comme productrice de carbapénèmase.

7.4 Interprétation des résultats

Résultat Interprétation
Changement de couleur à l’orange franc, rouge ou
Positif Présence de production de carbapénèmase
pourpre
Pas de changement de couleur à l’orange franc, ou
Négatif Absence de production de carbapénèmase
rouge ou pourpre

8. PERFORMANCES

8.1. Étude de précision.

Sur une période de 3 semaines, 4 souches ont été testées en triplicat 10 fois par 2 manipulateurs différents. La répétabilité
et la reproductibilité intermédiaire ont été calculées avec trois lots différents de β CARBA. Tous les tests étaient conformes
aux résultats attendus.

8.2. Performances cliniques

Deux études européennes ont été réalisées avec des souches de collection parfaitement caractérisées génotypiquement.
298 souches d’entérobactéries ont été testées. Parmi elles, 91 étaient des souches non productrices de carbapénèmases
(résultats négatifs attendus), 207 étaient des souches productrices de carbapénèmases (résultats positifs attendus). Le
détail des types de carbapénèmases était le suivant : KPC (53), OXA-48-like (57), NDM (36), VIM (34), IMP (15), IMI (5),
GES-5 (4) et des souches de Klebsiella pneumoniae productrices de KPC & MBL (3).
Le test β CARBA a été réalisé à partir de cultures de 18-24 heures sur les milieux Drigalski, gélose Columbia + 5% sang
de mouton ou UriSelect™4.

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8.2.1. Sensibilité

Résultats du test β CARBA

Positifs à 30 min Total
Souches productrices de carbapénèmases 185 207
KPC 53 53
OXA-48-like 50 57
NDM 36 36
VIM 30 34
IMP 12 15
IMI 1 5
GES-5 0 4
KPC & MBL 3 3

• La sensibilité est de 89.4% (185/207) avec un intervalle de confiance de 95% [84.0-94.7%] pour les souches
d’entérobactéries productrices de carbapénèmases.
• Un résultat positif avant 30 minutes (lecture faite à 15 minutes) a été observé pour 100%, 98.6% et 77.6% des
souches vraies positives isolées respectivement sur la gélose Columbia + 5% sang de mouton, UriSelect™ 4 et
milieu Drigalski.

8.2.2. Spécificité

Résultats du test β CARBA

Négatifs à 30 min Total
Souches non productrices de carbapénèmases 89 91

• La spécificité est de 97.8% (89/91) avec un intervalle de confiance à 95 % [94.0-100%] pour les souches non
productrices de carbapénèmases.
• Les deux souches fausses positives étaient des souches caractérisées AmpC avec une sensibilité diminuée aux
carbapénèmes.

9. LIMITES DU TEST
- Il n’est pas recommandé d’utiliser des colonies d’entérobactéries isolées à partir des géloses Mac Conkey, CLED, BCP
ou EMB.
- Le test ne peut être réalisé à partir de colonies colorant le mélange réactionnel en orange franc, rouge ou pourpre à T0.
- Quelques souches productrices de carbapénèmases de type IMI et GES ne sont pas détectées.

10. BIBLIOGRAPHIE
1- Nordmann P, Naas T, Poirel L. Global spread of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Emerg Infect Dis.
2011 Oct.
®
2 - CLSI M29-A, Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Current
Revision.

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