Laboratoire de Physiologie Végétale Travaux pratiques de

Université de Neuchâtel Physiologie végétale

(2005)

EXTRACTION ET DIGESTION DE PLASMIDES D'ESCHERICHIA COLI

Objectifs

Au cours de cette séance de Travaux Pratiques, vous effectuerez une mini-

extraction d'ADN plasmidique à partir d'une culture de bactéries Escherichia coli,
en utilisant la technique de la lyse alcaline. Cette méthode permet de récupérer
facilement et rapidement une grande quantité d'ADN plasmidique plus ou moins pur,
c'est-à-dire peu contaminé par de l'ADN génomique, des protéines (nucléases et
autres...) ou d'autres composants bactériens.
Lorsqu'il est suffisamment pur, l'ADN plasmidique peut être digéré sans
problème par une enzyme de restriction, ce que vous réaliserez dans la deuxième
partie du TP. Vous pourrez ainsi confirmer ou infirmer la présence d'inserts dans les
plasmides, et évaluer leur taille.
Vous estimerez également la qualité de la préparation d'ADN, en procédant à
une réaction à la RNase. L'ADN issu des différents traitements sera finalement
soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose. L'ensemble de ces manipulations
vous permettra de vous familiariser avec les techniques de base de la biologie
moléculaire.

A- EXTRACTION DE PLASMIDES DE BACTERIES

NotI
Les cultures bactériennes que vous allez
utiliser ont été ensemencées la veille avec des
bactéries dans 3 ml de LB + Ampicilline.
Les plasmides que vous allez extraire sont les
vecteurs pGEX vide ou contenant la séquence
du gène codant pour la protéine Toc159. Ces
vecteurs (cf carte ci contre) vous permettront,
à la prochaine séance d'exprimer Toc159 et de
la purifier. La séquence codante pour la
protéine a été clonée en phase avec une
"étiquette" présente dans le vecteur, la GST
(glutathion transférase). Cette étiquette
permettra de purifier, par chromatographie
d'affinité, la protéine Toc159 parmi toutes les
protéines de bactérie que vous allez extraire.

1
Principe de la lyse alcaline
Le milieu de culture est d'abord éliminé par centrifugation. Le culot de bactéries
est ensuite resuspendu dans la solution 1, qui contient du Tris (tamponne le pH) et
de l'EDTA. L'EDTA chélate les cations métalliques divalents (majoritairement le
calcium et le magnésium), ce qui déstabilise la membrane bactérienne, et inactive les
DNases.
Les bactéries sont ensuite lysées dans la solution 2. Cette solution contient de
la soude (NaOH 0.2 M) ainsi que du SDS, qui est un détergent. Les parois
bactériennes sont fragilisées à pH basique. De plus, à pH basique, les deux brins de
l'ADN se séparent. Le chromosome bactérien, très fragile, se linéarise en grands
fragments, mais les deux brins des plasmides, beaucoup plus petits, restent
circulaires et donc demeurent associés (contrainte topologique).
La solution 3, constituée d'acétate de potassium 3M à pH 5,5, permet aux brins
d'ADN de se réapparier de façon complémentaire. L'ADN plasmidique se renature
très vite car les brins n'avaient pas pu se séparer l'un de l'autre. La renaturation de
l'ADN génomique nécessite plus de temps, et finalement ne peut avoir lieu car ces
fragments d'ADN simple brin précipitent sous l'effet de la forte concentration en sels.
L'ADN double brin reste en solution. Le SDS est lui aussi éliminé par précipitation.
L'ADN plasmidique est finalement précipité par addition d'isopropanol ou
d'éthanol. Ces alcools mobilisent l'eau du milieu, ce qui diminue la solubilité de
l'ADN. Les charges négatives portées par les phosphates de l'ADN sont neutralisées
par les ions potassium ajoutés lors de l'extraction.

Manipulation : extraction d'ADN plasmidique

Si vous êtes 3 ou 4 par groupe, vous pouvez faire deux extractions en parallèle pour
un même plasmide.

1 - Resuspendre le culot dans 300 µl de Solution 1 en s'aidant de la micropipette et

le transférer dans un microtube de 1,5 ml.

2 - Ajouter 300 µl de solution 2, mélanger délicatement par inversion et incuber 5 min

à température ambiante. La solution devient très visqueuse.

3 - Ajouter 300 µl de solution 3 et mélanger immédiatement mais délicatement par

inversion du tube. Observez la précipitation des débris bactériens et de l'ADN
chromosomique.

4 - Centrifuger 10 min à 13 000 g (vitesse maxi).

5 - Transférer le surnageant dans un microtube neuf.

6 - Ajouter 650 µl d'isopropanol, mélanger par inversion et laisser précipiter pendant

3 min.

7 - Centrifuger 15 min à 13 000 g.

8 - Aspirer le surnageant à la micropipette en veillant à ce que le culot reste collé

au fond du tube. Ajouter 700 µl d'éthanol 70 % et rincer le culot par inversion.

2
9 - Centrifuger 5 min à 13 000 g.

10 - Vider doucement le surnageant en veillant à ce que le culot reste collé au

fond du tube.

11 - Centrifuger brièvement pour rassembler les dernières gouttes d'éthanol au fond

du tube. Les ôter à la pipette.

12 - Retourner le tube ouvert sur une feuille de papier absorbant et laisser sécher le
culot 10 min environ.

13 - Reprendre le culot dans 30 µl de tampon TE pH 8 (solution 1). Vortexer si

besoin. Garder le tube dans la glace.

14 - Préparer 500 µl de dilution 100X de chaque solution de plasmide. Vous ferez la

dilution dans du tampon TE (solution 1). Mesurer la DO à 260 et 280 nm.

15 - Garder les échantillons dans la glace et procéder à la digestion.

B- ANALYSE DES PLASMIDES RECOMBINANTS PAR DIGESTION AVEC UNE

ENZYME DE RESTRICTION

Connaissances de base
Les enzymes de restriction ont d'abord été découvertes chez les bactéries. Ce
sont des enzymes capables de couper un ADN double-brin au niveau d'une
séquence spécifique propre à chaque enzyme. Elles font partie du système de
"restriction-modification" qui permet à la bactérie de cliver ("restriction") les ADN
étrangers porteurs du site reconnu par l'enzyme - un virus par exemple. Cette
séquence de reconnaissance est aussi présente dans le génome de la bactérie, mais
n'est pas clivée par l'enzyme de restriction car elle a été méthylée (activité de
"modification" qui protège l'ADN de la bactérie).

Les enzymes de restriction sont pour la plupart des homodimères liés l'un à
l'autre en orientation inverse. Chaque sous-unité reconnaît une suite de bases sur un
des deux brins d'ADN. Ceci explique pourquoi les séquences reconnues par les
enzymes de restriction sont généralement symétriques. En général ces séquences
vont de 4 à 8 paires de bases reconnues. Pour un même brin, le clivage laisse un 3'-
OH d'un côté et un 5'-Phosphate de l'autre. Le magnésium est le seul cofacteur
nécessaire à cette catalyse enzymatique.

Au cours de ce TP les enzymes de restriction que vous allez utiliser sont SpeI
(provenant de Sphaerotilus species) et NotI (provenant de Norcardia otidis-
caviarum).

A C T A G T G C G G C C G C
T G A T C A C G C C G G C G
SpeI NotI

3
Manipulations
Action de la RNase et des enzymes de restriction

Vous disposez normalement de 2 x 25 µl d'ADN amplifié à partir de deux colonies

différentes. C'est suffisant mais ne vous trompez pas dans vos tubes : vous n'en
n'auriez pas assez pour recommencer !!!

- Préparer 5 microtubes et ajouter dans l'ordre (tous les volumes sont indiqués en µl)
:
ATTENTION ! Les enzymes de restriction sont fragiles et coûtent très cher. Pour les
préserver au maximum, on les conserve à - 20°C, et on ne les sort qu'au dernier
moment sur un portoir métallique préalablement refroidi à - 20°C. Elles sont ensuite
immédiatement replacées au congélateur.

Tube 1 2 3 4 5 6 7

H2O qsp 20
µl
Tampon 10 2 2 2 2 2 2 2
X
ADN 1 5 5 5 5 - - -

ADN 2 - - - - 5 5 5

RNase - 2 2 2 2 2 2

SpeI - - - 1 - - 1

NotI - - 1 1 - 1 1

- Mélanger puis centrifuger 5 secondes pour collecter le liquide au fond des tubes.
- Laisser le tube 1 dans la glace et incuber les autres à 37°C pendant 30 min.

Préparation du gel d'agarose à 1%

- Peser la quantité d'agarose nécessaire pour confectionner un gel à 1% (p/v)

sachant que le volume final du gel sera 25 ml.
- Transférer la poudre d'agarose dans un erlenmeyer et ajouter 25 ml de TAE 0,5 X
mesurés à l'éprouvette (le volume de l'erlenmeyer doit être 3 à 5 fois supérieur au
volume de liquide qu'il contient).
- Porter à ébullition au micro-ondes jusqu'à ce que tout l'agarose soit fondu.
- Laisser tiédir (on doit pouvoir tenir l'erlenmeyer dans sa main sans se brûler) et
rajouter 0,5 µl de BET.
- Couler sur le support horizontal et mettre le peigne.
- Laisser l'agarose refroidir et se solidifier.

4
 Le BET ou bromure d'éthidium est un agent intercalant à fluorescence
rouge-orange quand il est soumis à des rayons ultraviolets. Sa fluorescence est
augmentée lorsqu'il est lié à de l'ADN double-brin, c'est pourquoi on l'utilise de façon
courante pour visualiser le résultat d'une électrophorèse d'ADN sur gel d'agarose.

ATTENTION ! Le BET est un mutagène puissant du fait de sa capacité à se

fixer sur l'ADN. Il importe donc de le manipuler, ainsi que toutes les solutions qui le
contiennent, avec précaution (pas de projections de liquide, gants, etc...)

Analyse par électrophorèse

- Après incubation, ajouter 3 µl de tampon de charge à chaque tube.

- Placer le gel dans la cuve avec du tampon TAE 0,5 X (le gel doit être légèrement
submergé).
- Identifier votre gel en coupant un ou plusieurs des angles avec une lame de
scalpel.
- Déposer les échantillons en n'oubliant pas le marqueur
- Fermer le couvercle de la cuve à électrophorèse et faire migrer à 50 V.
- Arrêter la migration en coupant le courant lorsque le colorant du tampon de charge
a suffisamment migré.
- Prendre une photo du gel sous rayonnement UV.

Quelques pistes (dans le désordre) pour le compte-rendu

- Le SDS contenu dans la solution 2 est un détergent. Quel peut être son rôle ?
- Evaluez la qualité et quantifiez les préparations d'ADN obtenues en vous basant
sur les DO mesurées. L'absorption maximale des acides nucléiques est à 260 nm et
celle des protéines à 280 nm. Pour un ADN pur, le rapport DO260/DO280 > 1,5, et pour
un ADN double brin, 1 Unité D.O. = 50 µg/ml à 260 nm.
- Quelle quantité totale de plasmides avez-vous obtenue après extraction ?
Pouvez vous décrire en une ligne l'intérêt de faire une mini-extraction d'ADN ?
- Comment savoir si les ADN plasmidiques sont contaminés par d'autres acides
nucléiques (ADN chromosomique et ARN) ?
- Rappelez brièvement quel est l'intérêt de procéder à ces réactions de digestion
et de RNase dans le cadre du TP. Quelles sont les autres utilisations de ces
réactions en biologie moléculaire ?
- Faites un schéma du gel en fournissant la photo.
-Tracez la courbe : Distance de migration = f(log taille)
- D'après cette courbe, déterminer la taille des bandes obtenues. Identifiez
clairement les différentes bandes observées en justifiant votre raisonnement.
- Sachant que le gene Toc159 a été inséré dans le pGEX au niveau du site NotI,
dessinez la carte de restriction des deux plasmides que vous avez testés. Quel est
celui qui contient la séquence codant pour Toc159? Pourquoi?
- Décrivez les différentes régions d'intérêt du pGEX_4T_1 en expliquant leur rôle.
- Comment confirmer que l'ADN inséré est bien celui qu'on a voulu cloner ?
- Commentez vos résultats en identifiant clairement les problèmes éventuellement
rencontrés.

5
Matériel à fournir par groupe de 4
- 2 culots de culture de bactéries de 1,4 mL pour chaque plasmide

- solution 1 (5 mL): Tris-HCl 50 mM pH 8

EDTA 10 mM
- solution 2 (5 mL): NaOH 0,2 M
SDS 1 %
- solution 3 (5 mL): Acétate de potassium 3M pH 5,5
- Isopropanol (5 mL)
- Ethanol 70% (v/v) (5 mL)

- enzymes de restriction NotI, SpeI (5 µL)

- RNase A à 0,5 mg/ml (20 µL)
- tampon de charge
- marqueur de taille
PHOTO MARQUEUR DE TAILLE

-bac à glace, glace.

- poubelles pour cones contaminés avec bactoches…
- cones stériles : P200 + P1000
- tubes ependorf de 1,5 ml
- H2O pour dilution de ADN
-centri, spectro, cuves en quartz

-marqueurs
-micropipettes

-cuves à électrophorèse, petits supports, agarose, balance

-bain marie à 37C + portoirs pour tubes
-centri

moi la veille : ensemencer les cultures.