29/08/2019

Halosperm a été développé par Halotech DNA pour répondre aux besoins des utilisateurs du
test SCD (test de dispersion de la chromatine des spermatozoïdes) pour évaluer la
fragmentation de l'ADN des spermatozoïdes chez l'homme.

Principe de la méthode

Les spermatozoïdes intacts non fixés (frais, congelés / non dilués, échantillons dilués) sont
immergés dans un microgel d'agarose inerte, sur une lame prétraitée. Un traitement acide
initial dénature l'ADN dans ces spermatozoïdes avec de l'ADN fragmenté.
Suite à cela, la solution de lyse enlève la plupart des protéines nucléaires. Lorsqu’il n’y a pas
de rupture massive d'ADN, les nucléoïdes spermatiques avec de l'ADN fragmenté ne
montrent pas de halo de dispersion (ou le halo est minime). La sensibilité et la spécificité
du diagnostic sont de 93%. Ce test est une aide au diagnostic. L'interprétation des
résultats se fera selon des critères médicaux.

Description des réactifs du kit

Chaque kit contient le nécessaire pour effectuer 10 tests. Les composants sont :
- Lames Super-Coated (SCS) ; 10 unités
- Tubes Eppendorf Agarose (ACS) ; 10 unités
- Solution 1 (DA) Agent Dénaturant, une bouteille de 10 ml
- Solution 2 (LS) Solution de lyse, une bouteille de 110 ml
- Flotteur
- Notice d’utilisation

Matériel et équipement requis, non fournis avec le kit

• Microscope à champ clair ou à • Boîtes de Pétri

fluorescence • Pipettes jetables
• Réfrigérateur à 4º C • Eau distillée
• Bain(s) marie à 37º C et 95-100º C • Ethanol à 70% et 100%
• Gants en plastique • Micro-ondes
• Lamelles en verre (24 x 24 mm) • Hotte
• Micropipettes
Solutions Recommandées pour la visualisation microscopique :
• Microscopie à fond clair : Diff-Quick stain (several trademarks) ou Wright solution
(Merck 1.01383.0500)
• Microscopie en Fluorescence: Fluorochromes for DNA staining, (FluoGreen ou
FluoRed Halotech DNA)
• Tampon Phosphate pH 6.88 (Merck 1.07294.1000)
• Mounting medium : Eukitt® (Panreac 253681)
Veillez à ce que tout le matériel soit calibré

Échantillon de sperme

Les échantillons de sperme frais doivent être prélevés dans un récipient stérile. Le test de
fragmentation de l'ADN des spermatozoïdes doit être effectué immédiatement après
l'obtention ou la décongélation de l'échantillon de sperme après cryoconservation.

Sans fragmentation Avec fragmentation

1. Grand Halo 2. Halo Moyen 3. Petit Halo 4. Sans Halo 5. Dégradé

Classification du sperme

Comptez un minimum de 300 spermatozoïdes par échantillon selon ce critère :

• Spermatozoïdes sans fragmentation de l’ADN :

o Spermatozoïdes à grand halo : ceux dont la largeur du halo est similaire ou

supérieure au diamètre du noyau (Gros Halo).
o Spermatozoïdes avec halo de taille moyenne (Halo Moyen).

• « Autres » : nucléides cellulaires qui ne correspondent pas aux spermatozoïdes L'une

des caractéristiques morphologiques qui les distinguent est l'absence de queue : ces
cellules ne doivent pas être incluses dans l'estimation de la fréquence des
spermatozoïdes à ADN fragmenté.
 • Spermatozoïdes avec l'ADN fragmenté :

o Spermatozoïdes avec un petit halo : la largeur du halo est similaire ou

inférieure à 1/3 du diamètre du noyau (Petit Halo).
o Spermatozoïdes sans halo : (Pas d’Halo).
o Spermatozoïdes sans halo et dégradés : ceux qui ne montrent pas de halo et
qui présentent un noyau irrégulièrement ou faiblement coloré (Dégradé).

Contrôles positifs et négatifs

• Contrôle Positif : Tous les spermatozoïdes présentent un halo. Suivez les instructions
d'utilisation en sautant l'étape 8.

• Contrôle Négatif : Tous les spermatozoïdes sont sans halo. Suivez les instructions
d'utilisation en sautant l'étape 9.

Sécurité et environnement

• Des précautions doivent être prises pour éviter tout contact avec la peau ou les yeux et
éviter l'inhalation. La solution d'acide (DA) contient de l'acide chlorhydrique et la
solution de lyse (LS) contient du dithiothréitol et du Triton X-100. Travailler dans un
environnement d'extraction d'air et suivre les consignes de sécurité du fabricant
concernant la manipulation en toute sécurité.
• Ne pas libérer les produits utilisés dans l'environnement. Veuillez suivre les règles de
sécurité spécifiques de votre laboratoire en ce qui concerne le stockage des produits
chimiques et l'élimination des produits toxiques, ainsi que l'exposition à ceux-ci.

Précautions

• Tous les échantillons de patients et les réactifs doivent être traités comme
potentiellement infectieux. L'utilisateur doit porter des gants de protection, des lunettes
de protection et une blouse de laboratoire lors de l'exécution du test.
• Le test doit être jeté dans un récipient de danger biologique approprié après le test.
• Ne pas manger, boire ou fumer dans la zone où sont manipulés les échantillons et les
réactifs du kit.
• Ne pas utiliser au-delà de la date d'expiration, qui apparaît sur l'étiquette de
l'emballage.
• L'utilisation de gants et d'un masque facial est recommandée.
• La fiche de données de sécurité est disponible sur demande.
Condition de conservation

Après avoir reçu le kit, le stocker entre 2º et 30ºC à l’abri de la lumière.

Après ouverture le kit est stable 12 mois.
Mode d'emploi

1
1. Placer le tube à agarose « Agarose Cel Support » (ACS)
dans le flotteur et fondre en utilisant un bain marie (ou un
bécher avec de l'eau sur une plaque chaude) à 95 1 ̴ 00°C
pendant 5 minutes (ou jusqu'à ce qu'il soit complètement
fondu). Il est également possible de faire fondre l'agarose
en utilisant un four à micro-ondes. Remplir 100 ml d'eau
dans un bécher. Ensuite, placez l'ACS légèrement ouvert
avec le flotteur à l'intérieur du bécher et chauffez-le à
puissance maximale pendant 1,5 minute. Surveillez
constamment et arrêtez le processus dès que l'eau
commence à bouillir. S'il vous plaît ne gardez pas l'ACS
bouillant dans le micro-ondes ! Placer Immédiatement les
aliquots Eppendorf à 37°C pendant 5 minutes (pour éviter
la gélification).
2. Les tubes Eppendorf restants qui ne seront pas utilisés à
ce moment seront stockés dans le réfrigérateur avec le
kit.
3. Faire revenir les solutions 1 et 2 à température ambiante
(22°C) pendant tout le processus.
4. Préparez et sélectionnez les lames Super-Coated (SCS)
qui vont être utilisées.

2
Diluer l'échantillon de sperme dans un milieu de lavage
approprié (ou du PBS) à un maximum de 20 millions de
spermatozoïdes par millilitre

3
Immédiatement après, transférer 50 µl de l'échantillon de
sperme dans un aliquot (tube Eppendorf) et mélanger
doucement avec une micropipette.
La formation de bulles doit être empêchée
4
Placer ensuite une goutte de 8 µL de suspension
cellulaire sur le centre du puit « échantillon » ("S").
Couvrir avec une lamelle.
Appuyez doucement, en évitant la formation de bulles
d'air.
Les lames doivent être maintenues en position
horizontale tout au long du processus.
Utilisez le puit "C" pour traiter un échantillon témoin.

5
Placer la lame sur une surface froide (par exemple, une
plaque de métal ou de verre pré-refroidie à 4°C) et
transférer dans le réfrigérateur à 4°C, pendant 5 minutes
pour solidifier l'agarose

6
Préparer la Solution Dénaturante (AD). Pour cela, ajouter
80 µL de la Solution 1 (Agent Dénaturant AD) à 10 mL
d’eau distillée, mélanger et place le sur le plateau
d’incubation.

7
Sortez la lame du réfrigérateur et retirez la lamelle en la
faisant glisser doucement.
Tout le processus doit se faire à température ambiante
(22 ºC environ).
8
Immerger immédiatement la lame (en position
horizontale) dans la solution de dénaturation (préparée à
l’étape 6) et incuber pendant 7 minutes.
Ne pas dépasser le temps d’incubation !!
Veillez à ce que la lame soit entièrement couverte par
le réactif pendant tout le processus.

9
Placer ensuite la lame dans un autre plateau d'incubation
contenant 10 ml de solution de lyse tempérée. Incuber
pendant 25 minutes en position horizontale.

10
Prenez la lame et placez-la en position horizontale dans
un plateau contenant de l'eau distillée en abondance afin
de laver la solution de lyse. Laisser incuber pendant 5
minutes.

11
Prenez la lame et placez-la en position horizontale dans
un plateau contenant 70% d'éthanol (2 minutes) puis
100% d'éthanol (2 minutes). Laisser ensuite sécher à
température ambiante dans une position horizontale sur
un papier filtre ou similaire. Après séchage, les lames
réalisées peuvent être conservées dans des boîtes
d'archives à température ambiante et à l'obscurité,
pendant des mois.
Après cela, le kit de coloration peut être appliqué en
suivant les instructions de votre fournisseur.
12
Observer sous microscopie à champs clair ou à
fluorescence
Si la coloration est trop intense, la lame peut être lavée à
l'eau du robinet.
Si la coloration est trop faible, immerger la lame dans de
l'éthanol à 100%, laisser sécher et répéter l'étape 10.

Pour la coloration par microscopie de fluorescence,

veuillez contacter le revendeur agréé.

13
Calculer le pourcentage de spermatozoïdes avec de
l'ADN fragmenté.
Les résultats doivent être évalués en tenant compte de
tous les résultats cliniques et de laboratoire liés à
l'échantillon de sperme.
Des seuils pour la fréquence de la fragmentation de l'ADN
des spermatozoïdes (SDF) ont été suggérés par
Dr.Evenson et al. (Evenson et Nixon, Reprod Biomed
Online 12: 466-472, 2006).