Biologie moléculaire

TP1

1) Quelle est le rôle du SDS et du NaCl dans cette expérience ?

Le SDS est un détergent et va provoquer la rupture des membranes
plasmiques et nucléaires donc il va faciliter la libération de l’ADN. Le Na +
du NaCl va à venir à entourer les molécules d’ADN, chargés de manière
négative. L’ADN en présence des ions Na+ va se détacher des histones
et les faire précipiter donc faciliter l’extraction d’ADN dans le surnageant
après centrifugation
2) Notre ADN est-il fragmenté après les procédures réalisées dans
ce TP ?
Pourquoi ?
Non, les méthodes physiques utilisés (vortex, agitations) ne sont pas
suffisamment fortes pour casser notre ADN, on devrait utiliser la
sonication ou l’action d’enzymes de restrictions par exemple comme
EcoRI ou HindIII qui reconnaissent des séquences assez communes
dans l’ADN.
3) Quel était la masse de votre morceau de banane ?

4) Quel était le volume du filtrat (V1) ?

On prendra comme exemple 10 ml

5) Quel volume de SDS 10% doit-on ajouter pour avoir une

concentration finale de 1%?
Vi = le volume de SDS 10% à ajouter
Vf= 10 mL + Vi
CiVi= CfVf ; 10%Vi= 1% (Vi+10) ;
10%Vi= Vi +10 ;
9Vi = 10 ;
Vi= 10/9 ; Vi =1,11 mL de SDS 10%

6) Quel était le volume de NaCl 5M ajouté ? Quelle sera la

concentration de NaCl finale dans le tube ?
Volume de NaCl = 1/2 V1 = 5 mL
Vfinal= (10 de filtrat+ 1,11 mL de SDS 10% + 5 mL de NaCl 5 M) = 16,11
mL
CiVi= CfVf ;
5M x 5 mL = Cf x 16,11 ml ;
Cf= 1,55 M
TP2

1) Quelle dilution a-t-on fait pour mesurer les A à 260 et 280 nm ?

F= Vf/Vi 3 / 0,6 = 5 (600 μL dans 3 mL)

i) Notez les A :
A tampon 260= 0,006 A sol ADN 260= 0,159
A tampon 280= 0,004 A sol ADN 280= 0,092
j) Calculer le rapport A260/A280 :
L’absorbance corrigé de l’ADN à 260 ou 280 nm sera :
l’absorbance de la solution d’ADN – l’absorbance du tampon
A260/A280 : (0,159-0,006) / (0,092-0,004) = 0,153 – 0,088 = 1,74
Pour des solutions d’ADN pures, ce rapport est compris entre 1,8 et 2. Si
ce rapport
est inférieur à 1,8 l’extrait d’ADN est contaminé avec des protéines. Si en
revanche le rapport est supérieur à 2, l’extrait d’ADN est contaminé avec
de l’ARN.
2)
L’ADN est de bonne qualité et bien extrait. Il y a une légère
contamination de protéines, très probablement des histones.

3) Calculer la concentration (en μg/ml) de la solution d’ADN que

vous avezpurifiée, en utilisant la loi de Beer-Lambert.
A 260 nm, le coefficient d’extinction spécifique (E) de l’ADN double brin
est d’environ 0,02 (μg/ml)-1cm-1
A260= c x E x l ;
Attention! l’absorbance à 260 nm est l’absorbance corrigé de l’ADN!
0,153 = c x 0,02 x 1 ;
c = 7,65 μg/mL
4) Quelle était la quantité d’ADN présente dans 1g de banane ?
Détailler le calcul.
Dans la dilution : 7,65 μg 1mL
 3 mL de TE 1X donc 7,65x 3 = 22,95 μg
Dans l’ADN : 22,95 μg - 0,6 mL (ADN)
X - 3 mL ADN final (en 3 ml de TAE 1X)
X= 114,75 μg
114,75 μg – 10 mL de filtrat (V1)– 10 g de banane
On doit diviser par 10 pour avoir 1g tout dépend de la masse de banane
de départ
11,475 μg/1g de banane