Bakhoum Iphigenie

UNVERSTE CHEKH ANTA DOP DE DAKAR
FACULTE DE MEDECNE, DE PHARMACE ET D'ODONTO-STOMATOLOGE

CONTROLE DE QUALITE ET VALIDATION
DE DIFFERENTES MICROMETHODES
D'IDENTIFICATION BACTERIENNE
These pour obtenir le grade de docteur en pharmacie (dipIome d'etat) prsente et soutenue
publiquement par
BAKHOUM Iphignie Maria Ndye Sira
Sous la direction de Cheikh Saad Bouh BOYE : Professeur
le 31 Janvier 2004
N 08
Devant le JURY compos de : Prsident : Omar NDR : Professeur Membres : Cheikh Saad Bouh
BOYE : Professeur M. Amadou DOUF: Matre de Confrences Agrg M. Yrim Mbagnick DOP :
Matre de Confrences Agrg
TabIe des matires
Introduction . .
1
Premire partie : RappeIs .
3
Chapitre Les staphylocoques . .
3
.1. - Dfinition .
3
.2. - Taxonomie . .
3
.3. Caractres bactriologiques (15, 33, 48, 60) .
5
.4. dentification .
8
Chapitre Les streptocoques .
9
.1. - Dfinition . .
9
.2. - Taxonomie .
9
.3. Caractres bactriologiques .
11
.4. dentification . .
13
Chapitre Les enterobacteries . .
15
.1. - Dfinition .
15
.2. - Taxonomie . .
15
.3. Caractres bacteiologiques .
16
.4. dentification .
20
Chapitre V Les mycoplasmes .
21
V.1. - Dfinition . .
21
V.2. - Taxonomie .
21
V.3. Caractres bactriologiques des mycoplasmes . .
23
V.4. dentification . .
25
Chapitre V Le controle de qualite et la validation . .
25
V.1. - Dfinition .
25
V.2. - Assurance interne de la qualit : contrle de qualit (11) .
26
V.3. Procdures de validation et dfinition de quelques paramtres de validation
28
(58) .
Deuxime partie : notre exprience .
31
Chapitre Cadre d'tude .
31
Chapitre - souches bactriennes .
31
Chapitre matriel .
31
.1. Matriel pour la prparation des milieux . .
31
.2. Matriel pour le contrle de qualit . .
32
.3. Matriel pour la conservation des souches .
33
Chapitre V Les staphylocoques .
33
V.1. Ractifs .
33
V.2. - Mthodologie . .
34
Chapitre V Les streptocoques .
46
V.1. Ractifs .
46
V.2. - Mthodologie .
47
Chapitre V Les entrobacteries . .
56
V.1. Ractifs .
56
V.2. - Mthodologie . .
57
Chapitre VII - Les mycoplasmes urogenitaux .
68
V.1. Ractifs .
69
V.2. Composition des diffrents ractifs . .
69
V.3. - Mthodologie .
70
Chapitre V Contrle de qualite et validation .
75
V.1. Les parametres de contrle de qualit . .
75
V.2. Validation .
77
Troisime partie : RsuItats & commentaires .
79
Chapitre Staphylocoques, streptocoques et enterobacteries . .
79
.1. Rsultats sur le contrle de qualit DES SOUCHES .
79
.2. Rsultats sur le contrle de qualit des micromthodes d'identification Micro
CSB SYSTEM . 83
.3. Rsultats de la validation des micromthodesd'identification . .
94
Chapitre Mycoplasmes urognitaux .
94
.1 solats .
94
.2 Contrle qualit de la micromthode d'identification .
94
.3 Rsultats de la validation de la micromthode 'identification .
96
Quatrime partie : Discussion . .
97
Chapitre - Les souches testes . .
97
.1. - dentification des souches de staphylocoques et de streptocoques .
98
.2. - dentification des souches d'entrobactries . .
98
.3. - dentification des mycoplasmes urognitaux . .
98
Chapitre - les micromthodes d'identification des bactries .
98
Chapitre - Contrle de qualit . .
101
Chapitre V - La validation . .
102
ConcIusion .
103
BIBLIOGRAPHIE . .
105
Introduction
Les infections bactriennes dues aux Staphylocoques, Streptocoques, Entrobactries et
Mycoplasmes urognitaux, si diverses dans leurs manifestations cliniques, sont parmi les
plus frquentes.
En effet, la plupart des Streptocoques sont des commensaux habituels des cavits
naturelles et des tguments, et peuvent dans certaines circonstances particulires,
devenir pathognes pour l'homme.
Les Staphylocoques sont responsables chez l'homme, d'infections qui peuvent tre
localises et de propagation directe en atteignant essentiellement le revtement cutan ;
elles peuvent aussi diffuser par voie sanguine en prenant un caractre septicmique avec
un polymorphisme symptomatique extrme.
Les Entrobactries peuvent tre pathognes spcifiques ou opportunistes du tube
digestif de l'homme.
Quant aux Mycoplasmes urognitaux, Ureaplasma urealyticum est implique dans 15
% des urtrites non gonocciques, dans la strilit masculine par altration de la mobilit
des spermatozodes et est mise en cause dans les avortements spontans rptition
dans 28 % des cas tandis que Mycoplasma hominis est responsable de vaginites non
spcifiques, d'abcs pelviens, de salpingites et d'endomtrie.
La frquence, la gravit et/ou la mortalit de toutes ces infections bactriennes,
traduisent des difficults de prise en charge de ces infections lies entre autres aux
difficults d'identification microbiologique formelle de ces germes.
Introduction
1
Face cette proccupation, l'instar des pays dvelopps, la mise au point de
micromthodes d'identification des bactries (Staphylocoques, Streptocoques,
Entrobactries, Mycoplasmes urognitaux) simples, fiables, peu onreuses et permettant
une bonne prise en charge du diagnostic bactriologique, a t effectu au Laboratoire de
Bactriologie-Virologie du Centre Hospitalier Universitaire Aristide Le Dantec de Dakar.
La mise en route de tels types de mthodes exige un contrle de qualit et une
validation de ces techniques d'identification. Cette exigence est pratique courante dans le
domaine industriel o toute nouvelle mthode dcrite dans un dossier d'autorisation de
mise sur le march (AMM) doit tre accompagne d'un contrle de qualit et d'une
validation complte.
Notre tude s'inscrit dans ce cadre et avait pour objectifs d'obtenir des tests fiable et
de cot abordable en mettant en ouvre un ensemble de procdures pour :
vrifier les diffrentes phases du test : contrle de qualit de la micromthode
d'identification ;
assurer que les rsultats ont t obtenus dans des conditions techniques
satisfaisantes : validation.
CONTROLE DE QUALITE ET VALIDATION DE DIFFERENTES MICROMETHODES
2
Premire partie : RappeIs
Chapitre I - Les staphyIocoques
I.1. - Dfinition
Les Staphylocoques sont des cocci Gram positif, non mobiles, asporules et
habituellement non capsuls.
La plupart des espces sont aro-anarobies facultatives et catalase positve,
l'exception de S. saccharolyticus et S. aureus subsp. anaerobius. Ce sont des germes
dpourvus d'oxydase en dehors de S. lentus, S. sciuri et S. caseolyticus.
I.2. - Taxonomie
I.2.1. - Historique (48)
Les Staphylocoques ont t identifis par d'minents microbiologistes l'instar de Koch,
Pasteur, Ogston et Rosenbach.
3
En 1878, KOCH souligne le rle pathogne des bactries se prsentant sous forme
de cocci Gram positif. Ces cocci seront ensuite isols puis identifis d'un pus par Louis
Pasteur en 1880.
ls seront baptiss en 1883 par OGSTON sous le nom de Staphylocoques, du latin
Staphylla ou grappe et coccus ou grain .
En 1884, ils sont classs en fonction de la pigmentation des colonies par
ROSENBACH en S. aureus du latin orange et S. albus, du latin blanche .
I.2.2. - Habitat
Les Staphylocoques sont des bactries trs rpandues dans la nature, aussi bien dans
l'air que dans le sol ou dans l'eau. Ce sont des commensaux extrmement frquents de la
peau et des cavits naturelles de l'Homme et des animaux (avec une prdominance pour
les fosses nasales et le prine) : la plupart des espces rencontres sont opportunistes,
d'autres peuvent tre occasionnellement pathognes (S. aureus).
I.2.3. - CIassification
Le genre Staphylococcus appartient la famille des Micrococaceae qui comprend trois
autres genres :
Micrococcus
Planococcus
Stomatococcus.
Le genre Staphylococcus est compos de 39 espces et sous-espces qui se distinguent
par leurs caractres phnotypiques dont l'espce type est S. aureus.
Les espces du genre Staphylococcus sont classes en deux groupes selon qu'elles
produisent ou non une coagulase libre active sur le plasma oxalate de lapin.
Staphylococcus aureus est le premier agent pathogne, lequel peut tre responsable
d'infection svre, et il est important de le diffrencier des autres staphylocoques
opportunistes coagulase ngative.
Les autres espces de staphylocoques coagulase positive sont :
Staphylococcus hyicus
Staphylococcus schleiferi sous-espce coagulans
Staphylococcus intermedius.
Ces souches sont occasionnellement rencontres dans les infections humaines.
Les SCN sont des agents opportunistes pathognes. On distingue plus de 30
espces parmi lesquelles on peut citer S. epidermidis et S. saprophyticus qui sont moins
frquents dans les infections.
Les espces les plus impliques dans les infections sont :
4
Staphylococcus capitis
Staphylococcus cohnii
Staphylococcus haemolyticus
Staphylococcus hominis
Staphylococcus lugdenensis
Staphylococcus schleiferi ssp scheiferi
Staphylococcus warneri
Staphylococcus simulans
Les Staphylocoques coagulase ngative (SNC) peuvent tre diviss en six grands
groupes. Cependant, les espces rencontres en pathologie humaine sont localises
dans deux groupes : le groupe de Staphylococcus epidermidis et legroupe de
Staphylococcus saprophyticus.
TabIeau I : CIassification des StaphyIocoques responsabIes d'infections humaines (4, 33, 47)
Espces Sous-espces
STAPHYLOCOQUES
COAGULASE
POSTVE
Staphylococcus
aureus Staphylococcus aureus
aureus anaerobius
STAPHYLOCOQUES
COAGULASE
NEGATVE
Staphylococcus
epidermitis Staphylococcus
capitis Staphylococcus
capitis Staphylococcus
hominis Staphylococcus
haemolyticus Staphylococcus
lugdunensis Staphylococcus
saccharolyticus Staphylococcus
warneri Staphylococcus
saprophyticus Staphylococcus
cohnii Staphylococcus cohnii
capitis ureolyticus hominis novobiosepticus
cohnii ureolyticus
Groupe S. epidermidis Groupe
S. saprophyticus
STAPHYLOCOQUES
COAGULASE
POSTVE
Staphylococcus
caprae Staphylococcus
hyicus Staphylococcus
intermedius Staphylococcus
schleiferi Staphylococcus
schleiferi Staphylococcus
simulans
coagulans schleiferi
I.3. - Caractres bactrioIogiques (15, 33, 48, 60)
I.3.1. - Caractres morphoIogiques et structuraux
5
A l'examen microscopique, les Staphylocoques se prsentent sous l'aspect de coques en
petits amas, en diplocoques ou en trs courtes chanettes de 3 5 lments positivement
colors au Gram..
Le mode de groupement dit en grappe ou en amas est plus caractristique
aprs culture sur un milieu glose. La disposition en amas s'expliquer par la division
cellulaire des Staphylocoques en trois plans successifs et perpendiculaires les uns aux
autres, et par le fait que les cellules filles ne se sparent pas compltement de la cellule
mre dont elles sont issues.
Sur le plan individuel, ce sont des cocci mesurant 0,7 1,2 m, immobiles asporuls,
gnralement acapsuls ou ayant une faible capacit de synthse de capsule.
I.3. 2. - Caractres cuIturaux
Les Staphylocoques sont en gnral aro-anarobie facultatif et poussent sur milieu
ordinaire en arobiose l'exception de S. saccharolyticus et S. aureus anaerobius qui
sont donc catalase ngative.
Certaines souches ncessitent cependant une forte pression en CO
2
pour une
croissance optimale ainsi que la prsence d'autres mtabolites tels que l'hmine ou la
mnadione.
Cependant, certains facteurs de croissance sont indispensables pour la multiplication
des Staphylocoques ; ce sont la vitamine B
1
et l'acide nicotinique.
La temprature optimale de croissance est de +30 +45C avec un maximum 37C
et le pH varie entre 4,8 9,4 avec un optimum 7,5.
- En bouillon ordinaire, la culture est rapide et les Staphylocoques se multiplient en
quelques heures, formant un trouble homogne ou un dpt.
- En milieu solide, on observe frquemment une zone claire d'hmolyse (bta
hmolyse) autour des colonies. Ceci est li au fait que certains Staphylocoques, en
particulier S. aureus, sont susceptibles de synthtiser quatre hmolysines distinctes et
variables d'une souche l'autre et dont l'activit diffre selon le type d'hmatie en cause.
- La plupart des souches de Staphylocoques pousse sur un milieu synthtique
contenant entre autres du glucose, des sels minraux, 14 acides amins dont la cystine,
la vitamine B1 et l'acide nicotinique.
A +4C, les Staphylocoques conservent leur vitalit pendant trois mois dans le pus et
pendant un an sur glose ; ils sont dtruits 58C au bout de 60 mn d'incubation.
I.3.3. - Caractres biochimiques
L'tude des diffrents caractres biochimiques des souches de Staphylocoques a permis
le dveloppement de galeries d'identification rapides et efficaces, permettant de dfinir les
diffrents profils biochimiques des diffrentes espces de Staphylocoques.
I.3.3.1. - Production d'urase
6
Les bactries hydrolysent toute l'ure mais, seules celles ayant une urase constitutive,
c'est--dire dont la synthse est indpendante de la prsence du substrat, vont arriver
alcaliniser le milieu, entranant le virage de l'indicateur color.
L'urase est galement une enzyme inductible.
La recherche de l'urase repose sur la libration d'ions ammonium qui alcalinisent le
milieu, entranant le virage de l'indicateur color (le rouge de phnol) du jaune au rouge
cerise.
I.3.3.2. - Production d'actone
Les micro-organismes produisent lors de leur mtabolisme de nombreux produits de
dgradation qui, comme dans le cas ci-prsent, peuvent tre recherchs.
L'actone en langage courant, ou hydroxy-3-butanone ou encore dans le
nomenclature ancienne actyl-mthyl-carbinol (AMC) est un produit de dgradation du
glucose au cours de la fermentation 2-3 butylne glycolique en passant par l'actolactate
et le diactyl. Elle peut galement tre obtenues par condensation de deux molcules de
pyruvate.
I.3.3.3. - Production de dcarboxyIases
Les dcarboxylases sont des enzymes qui sont actives pH acide ; le milieu d'tude sera
donc acidifi par la fermentation du glucose puis ralcalinis par l'action des
dcarboxylases sur le milieu qui est un acide amin.
Les dcarboxylases scindent les acides amins avec formation de l'amine
correspondante et libration de dioxyde de carbone.
Les enzymes recherchs le plus souvent sont :
l'ornithine dcarboxylase (ODC) ;
l'arginine dihydrolase (ADH) ;
la lysine dcarboxylase (LDC).
I.3.3.4. - Production de Ia bta-gaIactosidase
La bta-galactosidase est une enzyme bactrienne inductible, existant un niveau de
base dans le milieu intracellulaire, capable de scinder la molcule de lactose en sucres
simples que sont la glucose et la galactose aprs avoir travers la paroi cellulaire sous
l'action de la 8-galatosidase permase.
Le test l'ONPG est une technique relativement simple, base sur l'action directe de
l'enzyme sur une molcule chromogne pouvant tre l'ortho-nitrophnyl- 8
-D-galactopyranoside, ou le 2-naphtol- 8 -D-galactopyranoside. Ceux-ci sont utiliss
comme substrats et librent respectivement l'orthonitrophnol jaune et le 8 -naphtol qui se
combine au sel de Fast blue B en solution dans le 2-mthoxythanol pour donner une
coloration rouge pourpre.
7
I.3.3.5. - Rduction des Nitrates
La rduction des nitrates et des nitrites constitue un des caractres biochimiques
importants chez les staphylocoques lors de leur identification.
Ce test permet d'tudier la raction de rduction des nitrates en nitrites sous l'action
de la nitrate rductase produite par certains Staphylocoques.
La raction sera mise en vidence par l'addition d'acide sulfanilique et l'acide
q-naphtylamide qui rvlent la prsence de l'ammoniaque libre.
I.3.3.6. - UtiIisation des hydrates de carbone
Les glucides sont utiliss de trois manires diffrentes par les Staphylocoques : soit aprs
conversion par l'action d'isomrases, aprs hydrolyse en sucres simples ou directement,
s'ils sont fournis sous une forme simple (glucose, fructose.).
L'assimilation tudie surtout par la voie fermentaire mais galement par la voie
oxydative se traduit presque toujours par l'accumulation de drivs acides quelle que soit
la voie de dgradation.
I.4. - Identification
I.4.1. - MiIieux d'isoIement
Le milieu le plus frquemment utilis est la glose au sang ordinaire, incube 35 37C
+ 5-10 % CO2 pendant 16 48H.
Les Staphylocoques peuvent tre isols sur d'autres milieux tels que :
- la glose de CHAPMANN
- la glose STAPH/STREP slective
- la glose au mannitol (Salt) (MSA).
I.4.2. - Aspect des coIonies
Sur la glose au sang les Staphylocoques donnent des colonies gnralement opaques,
pouvant tre blanches ou crmeuses et ds fois jaune-orang.
Les colonies peuvent tre entoures ou non d'une hmolyse.
I.4.3. - Aspect microscopique
Les Staphylocoques sont des cocci Gram positives se prsentant sous l'aspect de coques
en petits amis, en diplocoques ou en trs courtes chanettes de 3 5 lments.
I.4.4. - Tests d'identification
8
Les Staphylocoques sont catalase positive, l'exception de Staphylococcus aureus
anaerobius et Staphylococcus capitis qui sont catalase ngative.
Staphylococcus aureus et les souches de S. hyicus, S. intermedius, et S. schleiferi
sous sp coagulans sont coagulase positive et thermostable nuclase.
Les autres espces de Staphylocoques sont coagulase ngative et thermostable
nuclase ngative.
Permet de diffrencier le genre Staphylococcus et du genre Micrococcus.
l s'agit de tests rapides, renfermant des substrats dshydrats et bass sur l'tude
des caractres biochimiques des diffrentes espces de Staphylocoques.
On peut citer :
AP 20 STAPH (Biomrieux, rf.20.500) : 19 tests ; identification de 20 espces de
Staphyolocoques ;
D 32 Staph (Biomrieux, rf.32500) : 26 tests; identification de 24 espces de
Staphylocoques;
MCRO CSB staphylocoque : 15 tests, identification de la plupart des espces de
Staphylocoques rencontres en clinique humaine.
Chapitre II - Les streptocoques
II.1. - Dfinition
Les Streptocoques sont des cocci Gram positif groups par paires, chanettes ou
ttrades. ls sont immobiles, non sporuls, aro-anarobies facultatifs, dpourvus de
catalase et d'oxydase. ls ne rduisent pas les nitrates et sont rsistants aux aminosides.
Les diverses espces de Streptocoques sont regroupes dans la famille des
Streptococcaceae qui comporte sept genres :
Streptococcus (genre-type) et Enterococcus, frquemment rencontrs en mdecine
humaine ;
Aerococcus, Gemella, Leuconostoc, bactries opportunistes rares en mdecine
humaine ;
Lactococcus et Pediococcusnon pathognes.
Rcemment (en 1995), le genre Abiotrophia a t dcrit. l regroupe deux espces : A.
defectiva et A. adiacens, antrieurement ranges avec les streptocoques.
II.2. - Taxonomie
9
II.2.1. - Historique (48)
Le nom Streptococcus (Streptus = flexible ; coccus = grain) fut pour la premire fois
attribu par BRLOTH et ERLCH des coques formant des chanettes observes dans
les prlvements provenant de blessures infectes.
PASTEUR, CHAMBERLAND et ROUX (1881) rendirent compte d'une infection
septicmique obtenue chez les lapins inoculs avec de la salive humaine.
FAHLESEN (1883) dcrivit un coque similaire comme agent de l'rysiple. Le nom
de Streptococcus pyogenes fut donn par ROSENBACH (1884) des coques groups en
chanettes et isols de lsions suppuratives chez l'homme.
NOCARD et MOLLEREAU (1887) dcouvrirent le Streptococcus de la mammite
de Nocard qui ensuite, fut appel Streptococcus agalactiae.
LANCEFELD, en 1933, dcrivit les groupes srologiques de A F. Les souches de
rfrence de streptocoques du groupe B taient d'origine bovine. Les infections
nonatales dues ce groupe ont t signales en 1962 par RETEL, WAHL et
collaborateurs ; en 1964 par ECKHOFF et collaborateurs.
SCHULTZ dcrivit les Streptocoques isols de lsions de pneumonie et de gourme
chez les chevaux.
SCHLEFER ralisa la sparation des deux genres Streptococcus et Enterococcus en
1984. Les infections Streptocoques qui, autrefois, taient considres comme propres
aux pays froids et humides, sont maintenant frquentes en zone tropicale particulirement
en Afrique de l'Ouest.
Pour ce qui est du Sngal, les premiers travaux ont t dcrits avec les infections
Streptocoques hmolytiques du groupe A (19).
II.2.2. - Habitat
Les Streptocoques sont retrouvs l'tat commensal sur la peau et les muqueuses. Ce
sont des germes ubiquitaires.
Les Streptocoques du Groupe D sont retrouves dans l'intestin et ceux du groupe B
dans les voies gnitales. Dans la bouche, on a les streptocoques non groupables appels
salivarius, sanguis, mitis, mutans qui donnent des dextranes jouant un rle dans les caries
dentaires.
II.2.3. - CIassification (39)
Les Streptocoques ne sont pas classs sur des critres cliniques ou de pathognicit, car
la plupart des espces (commensales ou pathognes) peuvent tre responsables
d'infections ralisant des aspects cliniques trs diffrents.
Par consquent, la classification des Streptocoques est base sur des critres
bactriologiques.
10
II.2.3.1. - Critres de cIassification
On distingue :
Ie pouvoir hmoIytique
Hmolyse incomplte : Streptocoques alpha-hmolytiques,
Hmolyse complte : Streptocoques bta-hmolytiques,
Pas d'hmolyse : Streptocoques non hmolytiques.
Un antigne de la paroi, le polyoside C, permet de dfinir plusieurs groupes : A, B, C, D,
E, F, G, H, K, L, M, N, O, P, R, S, T, U, V.
Certains Streptocoques dpourvus de polyoside C sont dits "non groupables".
ls permettent d'individualiser les espces dans le genre : Streptococcus pyogenes,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus bovis, etc.
Ces classifications ne sont pas superposables ; toutefois, les caractres
phnotypiques peuvent permettre en routine de classer et d'identifier la plupart des
Streptocoques.
II.2.3.2. - CIassification en ensembIes et sous-ensembIes
Actuellement, on classe les Streptocoques en "ensembIes" et "sous-ensembIes", ce qui
n'est gure en conformit avec les rgles de la taxonomie bactrienne.
Ainsi, on distingue :
Cet ensemble comprend plusieurs sous-ensembles :
Streptococcus pyogenes, espce-type du genre : c'est le Streptocoque
bta-hmolytique du Groupe A ;
Streptococcus agalactiae : Streptocoque bta-hmolytique du groupe B ;
les Streptocoques bta-hmolytiques des Groupes C, G ou L ;
les souches non hmolytiques d'origine animale.
On retrouve dans cet ensemble trois espces commensales du tube digestif de l'homme :
Streptococcus bovis, le plus frquemment isol ;
Streptococcus equinus ;
Streptococcus alactolyticus.
On y distingue six sous-ensembles. Ce sont ceux dnomms autrefois Streptocoques
viridans. ls sont pour la plupart, q-hmolytiques, non hmolytiques ou non groupables.
Parmi eux, Streptococcus pneumoniae.
II.3. - Caractres bactrioIogiques
11
II.3.1. - Caractres morphoIogiques et structuraux (48, 51)
Les Streptocoques se prsentent sous forme de coques ovodes ou sphriques Gram
positif et groups en chanettes. Les chanettes rsultent de la non sparation des paires
de coques en division et se prsentent comme une succession de diplocoques.
Par contre, la formation des chanettes est de rigueur dans les milieux artificiels et
dans les exsudats purulents des lsions ouvertes.
Les Streptocoques des Groupes A, C, G, caractriss par de longues chanettes,
donnent sur milieux liquides une culture en dpt.
Les autres donnent un trouble homogne du bouillon et se prsentent alors sous la
forme de diplocoques (S. pneumoniae) ou de courtes chanes (S. bovis).
II.3.2. - Caractres cuIturaux(4, 6, 48)
Les Streptocoques peuvent pousser sur des milieux usuels mais nanmoins, ils ont des
exigences nutritives trs complexes.
Tous les Streptocoques sont aro-anarobies. Ce sont des germes trs fragiles. La
temprature idale de croissance est comprise entre 42C avec un optimum 35 37C.
La plupart des Streptocoques poussent sur ces milieux et ralise sur glose nutritive
des colonies trs fines, transparentes, disperses la surface en grain de semoule avec
une couleur lgrement bleute.
Cette culture tant difficile, il est prfrable de la raliser sur milieux enrichis.
Certaines substances sont habituellement utilises pour enrichir les milieux. Ce sont
les peptones, les extraits de viande ou infusion de cour cervelle, le sang, le srum et ou
l'ascite.
Les milieux peuvent se prsenter soit sous forme liquide soit sous forme solide :
Les Streptocoques supportent trs mal les milieux glucoss. En effet, le glucose par
voie fermentative donne de l'acide lactique avec un abaissement du pH qui rend le milieu
hostile. C'est la raison pour laquelle on utilise le bouiIIon gIucos tamponn (B.G.T.).
On peut galement utiliser le bouiIIon streptoseI. Les Streptocoques donnent sur ce
milieu soit :
- un trouble homogne avec ou sans dpt (groupe B, D) ;
- une pousse granulaire avec sdimentation rapide, le surnageant pouvant tre
limpide ou lgrement trouble (A, C, G)
Les milieux les plus gnralement utiliss sont les gloses enrichies au sang (sang de
mouton ou de cheval). Ces milieux permettent de voir la capacit des Streptocoques
lyser les hmaties.
L'aspect de la zone d'hmolyse et sa dimension sont fonction de l'hmolysine
labore par la souche, du sang utilis mais galement du milieu.
12
On distingue trois types d'hmolyse :
- hmoIyse aIpha : les globules rouges ne sont que partiellement lyss sur un
diamtre d'environ 1 2 mm. Cette hmolyse peut quelquefois tre accompagne
d'un verdissement du milieu, on parle d'une hmolyse q-viridans. Le mcanisme de
cette coloration est mal connue.
- hmoIyse bta : les hmaties sont compltement lyss sur un diamtre d'environ 3
4 mm autour des colonies.
- hmoIyse gamma ou absence d'hmolyse : il n'existe aucun trace d'hmolyse ; on
utilise couramment le terme streptocoque non hmolytique.
II.3.3. - Caractres biochimiques
Les Streptocoques ne possdent ni catalase, ni peroxydase
Elle permet d'tablir un diagnostic diffrentiel entre Streptococcus d'une part et
Staphylococcus, Micrococcus d'autre part. L'absence de catalase constitue alors un
caractre clef d'orientation vers les streptocoques.
La mise en vidence d'activits enzymatiques, de la fermentation de sucres et de la
croissance en milieu hostile, l'aide de micromthodes, permet l'identification des
diffrentes espces de Streptocoques.
Les caractres biochimiques des Streptocoques sont prsentes dans le tabIeau IV.
II.4. - Identification
II.4.1. - Critres d'identification
Aprs isolement sur les milieux de culture adquates, les Streptocoques sont identifis
suivant :
- l'aspect des colonies = examen macroscopique ;
- la coloration de Gram = examen microscopique ;
- le test de groupage de LANCEFELD ;
- le test de sensibilit l'optochine ;
- le test de solubilit la bile.
Une identification future peut tre possible en utilisant des tests commercialiss, bass
sur les caractres biochimiques. Ces tests permettent le diagnostic diffrentiel des
diffrentes espces de streptocoques.
II.4.2. - MiIieux d'isoIement
- Glose au sang ordinaire incub 35 37C + 5 % CO
2
pendant 24 48H.
13
- Glose au sang cuit + gentamicine incub 35 57C + 5 % CO
2
pendant 48 H
pour les pneumocoques.
- Glose STAPH/STREP incub 35 37C pendant 16 48H l'tuve.
- Glose anarobie facultative incub en anarobiose pendant 16 48H.
II.4.3. - Aspects des coIonies
TabIeau V
Organisme Group Hmolyse Caractristiques de la croissance sur glose au
sang aprs incubation 35 37C pendant 16
24H
Streptocoques
bta-hmolytique
8 Approximativement 0,5 mm, bordure entire
peuvent avoir un aspect sec. Les colonies
peuvent tre difficiles prlever.
Streptocoques viridans q ou NH Colonies ont un diamtre de 0,5 - 1,0 mm
S. pneumoniae q Colonies mesurent 1 2 mm. Aprs incubation
en anarobiose, les colonies peuvent tre larges
et mucodes.
S. anginosus q, 8 ou non Colonies sont petites 0,5 mm Hmolyse est
variable.
N.H. = non hmolytique
II.4.4. - Aspect microscopique
Les Streptocoques sont des cellules Gram positives rondes ou ovodes groups par
paires, en chanettes courts ou longs et des fois en grappe.
Streptococcus pneumoniae prsentent un aspect de diplocoques en flamme de
bougie (lancols), en 8 ou en courtes chanettes, Gram positif. Les formes virulentes
sont capsules.
II.4.5. - Procdures des tests
Les Streptocoques sont catalase ngative.
Les Streptocoques du Groupe D de LANCEFELD hydrolyse esculine en prsence de
40 % de bile, contrairement aux autres streptocoques.
S. pneumoniae est spcifiquement sensible l'optochine, ce qui n'est pas le cas des
autres streptocoques qui sont rsistants l'optochine.
S. pneumoniae est soluble dans 10 % de sels biliaires, les autres Streptocoques
alpha-hmolytiques ne le sont pas.
l permet d'identifier les groupes A, B, C, D, F ou G.
Streptococcus pyogenes est positive.
14
Bas sur l'identification des espces par leurs caractres biochimiques.
Chapitre III - Les enterobacteries
III.1. - Dfinition
Toutes les espces d'Entrobactries ont en commun les caractres suivants :
- bacilles Gram ngatif de dimensions moyennes : 0,5 sur 3 ;
- immobiles ou mobiles grce leur ciliature pritriche
- se dveloppant aisment sur milieux ordinaires
- arobies facultatifs ;
- faisant fermenter le glucose avec ou sans gaz ;
- ne possdant pas d'oxydase ;
- rduisant les nitrates en nitrites (quelques exceptions parmi Erwinia).
III.2. - Taxonomie
III.2.1. - Historique (26, 30, 41, 50)
La naissance de la famille des Enterobacteriaceae se situe en 1937 lorsque Otto RAHN
proposa le genre Enterobacter pour regrouper des micro-organismes prsentant des
proprits biochimiques et morphologiques communes et parmi lesquelles on trouvait
dj des noms tels que Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Serratia ou Shigella.
Deux annes aprs cette description qui concernait 112 espces, ce nombre fut
ramen 67.
Les travaux des quipes de DON BRENNER et de Patrick A.D. GRMONT a permis
une vritable explosion de cete famille avec un trs grand nombre de nouveaux genres et
espces dcrits depuis une vingtaine d'annes.
En 1972, EDWARDS et EWNG rapportaient 11 genres et 26 espces dans les
Enterobacteriaceae.
En 1985, FARMER et coll. dcrivaient 22 genres comprenant 69 espces et 29
groupes entriques.
En 1971, 31 genres et 139 espces taient caractrises.
III.2.2. - Habitat
Les Entrobactries sont en gnral des htes normaux ou pathologiques du tube digestif
15
de l'homme et des animaux d'o leur nom. Mais ce caractre cologique n'est pas
exclusif, des entrobactries pouvant en effet prolifrer en abondance dans
l'environnement (sol et eau) et participer aux grands cycles des matires organiques.
III.2.3. - CIassification
Parmi toutes les espces dcrites ce jour, seule une vingtaine est habituellement
rencontre depuis longtemps et de faon rgulire en clinique humaine ; la plupart des
espces nouvellement dcrites demeurant d'isolement rare.
Ainsi, les espces d'entrobactries les plus frquentes en clinique humaine sont
classes dans 12 genres qui peuvent tre regroups en 5 groupes (tabIeau VI).
TabIeau VI : CIassification des espces d'Entrobactries Ies pIus frquents en cIinique humaine (24, 51)
Genre Espces
EDWARDSELLEAE Edwardsiella
GROUPE I SALMONNELLEAE Salmonella Salmonella typhi Salmonella
paratyphi Salmonella enteridis
ESCHERCHEAE Escherichia Escherichia coli
GROUPE Shigella Shigella dysenteriae Shigella
flexneri Shigella boydii Shigella
sonnei
LEVNEAE Levinea
KLEBSELLEAE Klebsiella Klebsiella pneumoniae Klebsiella
oxytoca
GROUPE Enterobacter Enterobacter
aerogenes Enterobacter cloacae
Serratia Serratia marcecescens
Erwinia
GROUPE V PROTEAE Proteus Proteus mirabilis Proteus
vulgaris Proteus rettgerii
Providencia
GROUPE V YERSNEAE Yersinia Yersiniae enterolitica Yersiniae
pseudotuberculosis
III.3. - Caractres bacteioIogiques
III.3.1. - Caractres morphIogiques et structuraux (51)
Toutes les entrobactries ont une morphologie trs voisine ; ce sont des bacilles Gram
ngatif, de 0,5 sur 3 en moyenne, gnralement polymorphes : on rencontre parfois
des lments coccodes, mais aussi des formes pseudo-filamenteuses. .
Lorsqu'elles sont mobiles, les entrobactries se dplacent plus ou moins vite grce
leur ciIiature pritriche.
16
Les entrobactries peuvent tre capsules (Klebsiella). Elles ne sont jamais
sporules.
III.3.2. - Caractres cuIturaux
Les entrobactries poussent sur milieux ordinaires en 24 heures 37C, pH voisin de
la neutralit.
1 - Sur glose , on observe plusieurs types de colonies :
coIonies S (Smooth) lisses, de 1,5 3 mm de diamtre, rgulirement arrondies,
limites par un bord rgulier, lgrement bombes, de surface lisse, translucides,
ayant souvent des reflets bleuts ;
coIonies R (rough), rugueuses, de 1,5 3 mm de diamtre, limites par un bord
irrgulier finement dentel, assez plates, de surface rugueuse, translucides et
gristres.
Cet aspect correspond gnralement de vieilles souches.
coIonies M muqueuses, plus volumineuses, arrondies, limites par un bord rgulier,
trs bombes, de surface lisse, brillante, opaques : elles ralisent l'aspect en coule
de miel .
coIonies naines seulement visibles la loupe.
2 - En bouillon , les formes S donnent en 24 heures un trouble homogne avec des
ondes moires lors de l'agitation du tube.
Les formes R donnent une culture grumuleuse, dpose dans le fond du tube. Le
surnageant reste clair.
La culture des formes M se traduit par un trouble intense.
3 - En glose en pente , les colonies des entrobactries apparaissent dans toute la
hauteur du tube : ces bactries sont donc arobies facultatives.
III.3.3. - Caractres biochimiques (24)
1 - Production de SH
2
(hydrogne sulfur)
La production de SH
2
par les micro-organismes est mise en vidence par incorporation
de fer ou de plomb dans le milieu destin cette tude.
l se forme une prcipit noir de sulfure de fer ou de plomb.
S
2+
+ 4 lectrons S
2-
.
Ce soufre rduit va se combiner avec le fer ferreux Fe
2+
selon la raction :
Fe
2+
+ S
2-
FeS sulfure de fer
17
L'ion Fe
2+
vient du sulfate de fer : SO
4
Fe SO
4
2-
+ Fe
2+
2 - Recherche de l'urase
Toutes les bactries hydrolysent l'ure :
NH
2
urase
CO + H
2
O COOH-NH
2
+ NH
3
NH
2
Seule une urase trs active aboutit finalement la raction :
COOH-NH
2
CO
2
+ NH
3
CO
2
+ NH
3
se combinent donnant du carbonate d'ammonium :
CO
2
+ 2 NH
3
+ H
2
O CO
3
2-
+ (NH
4
+
)
2
Le carbonate d'ammonium form alcalinise le milieu que traduit le virage de
l'indicateur color de l'orange au rose framboise ou ds fois au rouge violac.
3 - Production d'indole
Certaines bactries dgradent le tryptophane, grce une tryptophanase. l se forme de
l'indole, de l'acide pyruvique et de l'ammoniac.
L'indole est apolaire et ragit fortement avec le paradimthylamino-benzaldhyde en
milieu acide et donne un anneau rouge qui remonte en surface.
4 - Recherche des dcarboxylases
Les dcarboxylases (LDC, ODC, ADH) scindent les acides amins entranant la formation
de l'amine correspondante et la libration de CO2 suivant la raction :
dcarboxylases
R-CH-COOH R-CH
2
NH
2
+ CO
2
|
NH
2
l s'agit d'enzymes induites dont la synthse est favorise par un pH acide (pH
optimum : 3,5 5,5) et des conditions anarobioses.
Le milieu d'tude contient du glucose, un indicateur color (le rouge phnol) et bien
entendu l'acide amin.
Ches les bactries mtabolisme fermentatif, la fermentation du glucose entrane
une baisse de pH suffisante pour favoriser la synthse de l'enzyme ; l'alcalinit due
l'amine entrane ensuite le virage de l'indicateur au violet aprs une courte phase de
jaunissement. Si la bactrie tudie ne possde pas de dcarboxylases, le milieu restera
acide donc jaune.
5 - Recherche des dsaminases oxydatives
18
Les dsaminases, enzymes induites, agissent sur les acides amins en entranant la
formation des acides ctoniques correspondants selon la raction :
dcarboxylases
R-CH-COOH R-CO-COOH +NH
3
NH
2
Acide amin
Les acides ctoniques forms ont la proprit de donner des complexes colors avec
les ions Fe
+++
, raction utilise pour la lecture.
6 - Utilisation du citrate de Simmons (CS)
L'utilisation du citrate, comme seule source de carbone, par les bactries se traduit par
une alcalinisation du milieu (virage au bleu).
Nous avons la raction suivante :
Citrate + 3 H
2
O Acide citrique + 3 OH
7 - Utilisation du malonate
Le malonate inhibe le cycle de Krebs (inhibition de la succinate dshydrognase). Seules
les bactries qui peuvent utiliser le cycle glyoxylique sont capables de pousser sur un
milieu au malonate.
L'utilisation du malonate s'accompagne d'une libration d'ions OH alcalinisants
suivant la raction :
-
OOC-CH
2
-COO
-
+ 2 H
2
O HOOC-CH
2
-COOH + 2OH
-
Acide malonique
8 - Milieu au citrate de Christensen (CC)
A la diffrence de Simmons, ce milieu contient une faible quantit de glucose et d'extrait
de levure (qui permet le dpart de la culture) et une source d'azote organique. Dans ces
conditions, certaines bactries citrate-ngatives sur milieu de Simmons sont capables
d'utiliser le citrate en milieu de Christensen. La formation d'ions hydroxyles alcalinise le
milieu (virage du jaune au rose).
9 - Recherche de l'actone ou raction de Voges-Proskauer (VP)
On tudie la formation de l'actylmthyl carbionol (AMC, ou actone) soit partir de deux
molcules d'acide pyruvique, soit partir du glucose. En prsence d'une base forte,
l'actone donne une coloration rouge en milieu trs oxygn (oxydation en diactal).
10 - Test l'ONPG (orthonitrophnyl 8-D-galactopyranoside)
Le terme ONPG hydrolase est plus propos que celui de bta-galactosidase dans la
mesure o il prcise que le substrat utilis est l'ONPG et non le lactose. En effet, il existe
19
des germes qui reconnaissent que l'ONPG du ct nitro-2-phnol et non celui du
bta-galactoside. Ces germes ont donc une activit ONPG hydrolase tout en ne
fermentant pas les lactoses.
Le test l'ONPG est une technique base sur l'action directe de l'enzyme sur une
molcule chromogne pouvant tre l'ortho-nitrophnyl-bta-D-galactopyranoside ou le
2-naphtol-bta-D-galactopyranoside. Ceux-ci sont utiliss comme substrat et librent
respectivement l'orthonitrophnol (jaune) et le bta-naphtol.
III.4. - Identification
L'identification de la souche isole est assure par diffrents techniques savoir :
- l'examen microscopique ;
- l'examen microscopique ;
- le test l'oxydase ;
- l'tude des caractres biochimiques avec des micromthodes d'identification
commercialises sous forme de Kit, qui permet de faire le diagnostic diffrentiel
d'espces des entrobactries.
Les entrobactries poussant sur :
- glose trypticase soja incub 37C pendant 24 heures ;
- glose EMB : osine bleu de mthylne , incub 37C pendant 24H.
Les colonies des Entrobactries sont habituellement lisses, brillantes, de structure
homogne (type S ). Cet aspect peut voluer aprs cultures successives pour donner
des colonies surface sche rugueuse type R .
Les colonies des Entrobactries capsules telles que les Klebsiella sont mucodes,
de grande taille.
Les Entrobactries sont des bacilles Gram ngatif asporuls. Certains genres sont
composs de bactries toujours immobiles (Klebsiella, Shigella), d'autres sont mobiles.
La prsence de capsules est frquent chez les Klebsiella.
Les Entrobactries sont oxydase ngative.
Effectu avec des micromthodes d'identification commercialiss sous forme de Kit.
On peut citer entre autres :
- le test AP
R
20 ENTERO ;
- le test Micro CSB System ENTERO.
20
Chapitre IV - Les mycopIasmes
IV.1. - Dfinition
Micro-organismes ubiquitaires retrouvs chez l'Homme, l'animal, les plantes et les
insectes, les Mycoplasmes sont des bactries aux proprits orginales. Ce sont les plus
petits procaryotes capables de se multiplier de faon autonome.
IV.2. - Taxonomie
IV.2.1. - Historique
Les Mycoplasmes sont connus depuis les travaux de ROUX et NOCARD en 1898. Ce
n'est qu'en 1937 que DENES et ESDALL isolent le premier spcimen humain dans un
pus de bartholinite.
D'abord nomms Pleuro-Pneumonialike Organisms (PPLO) et rattachs aux
shizomyctes, ces microorganismes, les plus petits vivants l'tat libre ont t
individualiss en 1967 dans la classe des bactries sans paroi.
En 1954, SHEPARD isole partir des voies gnito-urinaires humaines des
mycoplasmes formant des colonies de petite taille ; les souches T (tinny = minuscule)
appeles aujourd'hui Ureaplasma.
IV.2.2. - Habitat
Les Mycoplasmes sont largement rpandus dans la nature. Chez l'Homme, ils colonisent
les muqueuses respiratoires et gnitales. Certains seraient peut-tre prsents au niveau
du tractus intestinal.
IV.2.3. - CIassification
Le terme mycoplasme est utilis pour l'ensemble de la classe des mollicutes. Cette classe
comporte quatre ordres : (tabIeau VIII)
- les Mycoplasmatales ;
- les Entomoplasmatales ;
- les Acholeplasmatales ;
- les Anaroplasmatales.
L'ordre des MycopIasmataIes comprend une seuIe famiIIe : Ies MycopIasmataceae.
Cette famiIIe est caractrise par son exigence en stroIs. EIIe est constitue de deux
21
genres :
- le genre Mycoplasma est constitu de 100 espces dont 13 espces humaines
(tabIeau IX).
- le genre Ureaplasma est constitu de six espces dont une seule est pathogne
pour l'homme. Ureaplasma urealyticum. Sa localisation principale est urognitale.
L'ordre des EntomopIasmataIes comprend deux famiIIes : Ies EntomopIasmataceae
et Ies SpiropIasmataceae. La famiIIe est EntomopIasmataceae qui coIonise Ies
pIantes et Ies insectes est constitue de deux genres :
- Entomoplasma ;
- Mesoplasma.
La famille des Spiroplasmataceae comprend un seul genre : Spiroplasma avec trois
espces dont Spiroplasma citrii.
l existe un genre position taxonomique incertaine : le genre Thermoplasma avec
une seule espce.
TabIeau VIII : CIassification des MycopIasmes (69)
Classification Habitat
ORDRE 1 : MYCOPLASMATALES Famille
1 : Mycoplasmataceae Genre 1 :
Mycoplasma Genre 2 : Ureaplasma
Homme, animaux, plantes, insectes Homme,
animaux.
ORDRE 2 : ENTOMOPLASMATALES
Famille 1 : Entomoplasmataceae Genre 1 :
Entomolasma Genre 2 : Msoplasma
Famille 2 : Spiroplasmataceae Genre 1 :
Spirolasma
Plantes, insectes Plantes,
insectes. Arthropodes (insectes inclus),
plantes
ORDRE 3 : ACHOLEPLASMATALES
Famille 1 : Acholeplasmataceae Genre 1 :
Acholeplasma
Animaux, plantes, insectes
ORDRE 4 : ANAEROPLASMATALES
Famille 1 : Anaeroplasmataceae Genre 1 :
Anaeroplasma Genre 2 : Astroplasma
Ruminants Ruminants
TabIeau IX : Les diffrentes espces humaines de Mycoplasmes (49)
22
Classification Localisation
principale
Pouvoir
pathogne
Premier
isolement
Mycoplasma buccale Respiratoire - 1965
Mycoplasma faucium Respiratoire - 1969
Mycoplasma fermentans Urognitale,
sanguine
1952
Mycoplasma genitalium Urognitale 1981
Mycoplasma hominis Respiratoire,
urognitale
+ 1937
Mycoplasma lipophilum respiratoire - 1974
Mycoplasma pirum Sanguine 1968
Mycoplasma pneumoniae Respiratoire + 1962
Mycoplasma primatum Respiratoire - 1955
Mycoplasma orale Respiratoire - 1964
Mycoplasma salivarium Respiratoire - 1953
Mycoplasma spermatophilum Gnitale 1991
Mycoplasma penetrans urognitale 1991
- Non pathogne probable + certain
IV.3. - Caractres bactrioIogiques des mycopIasmes
IV.3.1. - Caractres morphoIogiques et structuraux
Les Mycoplasmes sont des cellules simples. ls ont la forme d'un coccus. ls sont difficiles
observer au microscope optique mme en contraste de phase. C'est au microscope
lectronique que leur morphologie a t tudie.
Les Mycoplasmes prsentent un grand pliomorphisme : il existe des formes
allonges, fusiformes ou filamenteuses. Le diamtre des plus petits cocci capables de se
rpliquer est de 300 nm environ. Cette taille leur permet de passer travers les filtres de
porosit 450 nm.
ls sont dpourvus de paroi, ce qui leur confre les proprits suivantes :
- une sensibilit la pression osmotique du milieu, au pH, aux variations de
temprature et aux agents tensio-actifs. La pression osmotique est maintenue par le
chlorure de sodium des diffrents milieux de culture ;
- une rsistance aux antibiotiques qui inhibent la synthse de la paroi comme les
bta-lactamines ;
- une grande plasticit.
Les Mycoplasmes sont entours d'une membrane plasmique trois feuillets. Cette
membrane est constitue de lipides, de protines, de polysaccharides et de
lipopolysaccharides. ls possdent galement de nombreux ribosomes, un ADN
filamenteux au centre et parfois des corps dont on ne connat pas la nature exacte.
23
IV.3 2. - Caractres structuraux
Du fait de leur petit gnome, les Mycoplasmes ont une capacit de biosynthse limite.
Les Mycoplasmes sont des bactries exigeantes. Leurs milieux de culture sont complexes
et comportent du srum de cheval ou de poulain et de l'extrait de levure.
Le srum est non dcomplment et strilis par filtration. l apporte des protines
naturelles, des lipides non toxiques, du cholestrol non estrifi. Ce cholestrol est
incorpor dans la membrane et leur confre la solidit vis--vis de l'environnement.
L'extrait de levure apporte des vitamines et des ions minraux.
Le milieu de base est constitu de macration de viande, de protines animales ou
vgtales, de glucose 0,1 % et de NaCl 0,5 %. l peut tre rendu solide par addition de
glose.
Les milieux adapts la croissance de Mycoplasma hominis drivent des milieux de
HAYFLCK et des milieux SP4. ls prsentent un pH ajust 7,2 75 et contiennent de
l'arginine, du rouge de phnol et des inhibiteurs des contaminants. Le temps d'incubation
est de 1 3 jours (alcalinisation du milieu par dgradation de l'arginine).
Sur milieu glos, aprs incubation sous atmosphre anarobie ou sous CO
2
, les
Mycoplasmes donnent des colonies de 100-300 m de diamtre visibles au microscope
optique. Ces colonies prsentent l'aspect d'oufs sur le plat.
Les milieux pour les Ureaplasmes drivent du milieu de SHEPARD et contiennent du
chlorure de manganse qui donnent aux colonies d'Ureaplasma urealyticum une couleur
brun-noire. Les colonies sont petites (10 50 m de diamtre) irrgulires et prsentent
un aspect d'oursin. Le temps de croissance est de 1 3 jours 37C en anarobiose. En
revanche, la dtection en milieu liquide s'effectue plus rapidement par l'activit urasique
puissante des Uraplasmes (18 heures pour obtenir une alcalinisation du milieu).
IV.3.3. - Caractres biochimiques
Les mycoplasmes fermentent le glucose, hydrolysent l'ure et l'arginine. Ces trois
proprits sont utilises dans le diagnostic biologique et permettent de les diffrencier
(tabIeau X).
TabIeau X : ProfiI biochimique des Mycoplasmes (49)
24
Classification Caractres biochimiques
Glucose Arginine Ure
Mycoplasma buccale - + -
Mycoplasma faucium - + -
Mycoplasma fermentans + + -
Mycoplasma genitalium + - -
Mycoplasma hominis - + -
Mycoplasma lipophilum - + -
Mycoplasma pirum + + -
Mycoplasma pneumoniae + - -
Mycoplasma primatum - + -
Mycoplasma orale - + -
Mycoplasma salivarium - + -
Mycoplasma spermatophilum - - -
Mycoplasma urealyticum - - +
IV.4. - Identification
Cette identification repose sur deux critres essentiels :
- l'aspect des colonies en milieu solide ;
- les caractres biochimiques.
Le diagnostic rapide est possible grce la dtection du gnome par PCR ou par
hybridation molculaire. Ces techniques ont une sensibilit et une spcificit suprieure
celle de la culture en milieu liquide.
Des tests srologiques de Mycoplasmes urognitaux ont t proposs pour la
recherche d'anticorps spcifiques, mais la prsence de plusieurs srotypes (7 pour
Mycoplasma hominis et 14 pour Ureaplasma urealyticum) complique leur ralisation et
certains ne sont utilisables chez les sujets traits par des antibiotiques inhibiteurs
mtaboliques. Etant donn le caractre peu immunogne, la srologie ne permet
d'effectuer qu'un diagnostic diffrentiel entre une infection profonde (salpingite,
endomtrite, prostatite, septicmie du post-abortum et du post-partum.) et une infection
basse mycoplasme.
Les trois techniques les plus connues sont : l'inhibition mtabolique ; l'ELSA et
l'immunofluorescence.
Chapitre V - Le controIe de quaIite et Ia vaIidation
V.1. - Dfinition
25
Le domaine de la qualit utilise un vocabulaire spcifique qu'il est important de matriser
pour tout biologiste..
Pour cela, il convient de se reporter aux dfinitions, de la Norme SO 8402 Version
1994, et du Guide de Bonne Excution des Analyses de Biologie Mdicale pour les
termes suivants :
Qualit : la qualit est l'aptitude d'un produit, d'un procd ou d'un service rendu,
satisfaire les besoins exprims et implicites de l'utilisateur.
Contrle de qualit : ensemble des procdures mises en ouvre dans un laboratoire
en vue de permettre un contrle de qualit des rsultats des analyses au fur et
mesure de leur excution.
Validation : opration permettant d'assurer qu'un rsultat a t obtenu dans des
conditions techniques satisfaisantes et tient compte notamment des rsultats obtenus
avec les chantillons de contrle.
Echantillon de contrle : chantillon adapt la mthode utilise et destine
apprcier l'exactitude et la prcision des rsultats.
V.2. - Assurance interne de Ia quaIit : contrIe de quaIit (11)
Le contrle qualit interne est indispensable pour permettre de dceler les anomalies et
les erreurs des mesures pour y remdier immdiatement. l est organis par le biologiste.
l comporte toutes les mesures destines vrifier les diffrentes phases de l'activit
permettant l'obtention des rsultats et notamment, l'analyse d'chantillons de contrle
effectu dans les mmes conditions que celles appliques aux chantillons biologiques.
Les procdures opratoires doivent prciser la frquence de passage des
chantillons de contrle et les valeurs acceptables pour chaque constituant. Elles doivent
galement comporter les instructions concernant les mesures prendre en cas
d'anomalies constates.
l est rappel que les chantillons de contrle ne peuvent en aucun cas se substituer
aux chantillons de calibrage des mesures et, inversement, les chantillons de calibrage
ne peuvent tre utiliss en mme temps comme chantillon de contrle.
Chaque laboratoire a un programme de vrification de la qualit de ses propres tests.
Le contrle interne de la qualit comprend thoriquement :
- une surveillance continue de la qualit des tests ;
- une vrification complte chaque tape du test.
V.2.1. - Les paramtres de contrIe de quaIit
Le pH d'un milieu prpar n'a pas besoin d'tre systmatiquement vrifi lorsqu'il est
correctement prpar partir de poudre dshydrate. Si le milieu est prpar partir des
26
constituants de base, il faut le laisser refroidir avant de vrifier son pH. Les milieux solides
seront tests l'aide d'une lectrode de surface, ou aprs macration dans de l'eau
distille.
Si le pH s'carte de plus de 0,2 units de la norme, l'ajuster avec un acide ou une
base ou prparer un nouveau lot.
l faut pratiquer les preuves de strilit habituelles sur les milieux auxquels on a
ajout du sang ou autres lments aprs autoclavage. Prlever 3 5 % de chaque lot et
incuber 37C pendant deux jours. Rfrigrer le reste.
Si l'on observe pour :
- les ractifs un trouble du milieu ;
- les milieux de culture, plus de deux colonies par bote, il faut jeter l'ensemble du lot.
Le laboratoire doit conserver une srie de souches de rfrence pour surveiller l'efficacit
du milieu. Une liste de ces souches est propos dans le tabIeau XI. Elles peuvent tre
obtenues dans le cadre du travail ordinaire, achetes dans le commerce ou tre fournies
par des laboratoires efficaces.
La dmarche suivre lorsqu'on effectue des preuves d'efficacit sur de nouveaux
lots est la suivante :
- prparer une suspension de la souche de rfrence avec un trouble peine visible,
quivalent celui de l'talon Mac Farland 0,5 et utiliser le contenu d'une anse comme
inoculum ;
- laisser incuber pendant la dure habituelle. Lire le rsultat comme d'habitude ;
- noter soigneusement le rsultat.
Les autres critres de qualit d'un test diagnostique sont les suivants :
- la fiabilit : le rsultat est-il correct ?
- la reproductibilit : obtient-on le mme rsultat lorsqu'on rpte le test ?
- la rapidit : le test est-il suffisamment rapide pour tre utile ?
- le rapport cot/Avantage : le cot du test est-il raisonnable au regard des avantages
qu'il prsente pour la communaut ?
TabIeau XI : Souches de rfrence proposes pour Ie contrIe de Ia quaIit
27
Streptocoques Staphylocoques
Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus
Enterococcus agalactiae Micrococcus sp
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Staphylococcus epidermidis
Enterococcus faecalis Staphylococcus saprophyticus
Streptococcus bovis Staphylococcus capitis
Strepto D non entrocoques Staphylococcus xylosus
Streptococcus milleri Staphylococcus cohnii
Streptococcus equinus Staphylococcus haemolyticus
Streptococcus sanguis Staphylococcus warneri
Streptococcus bovis
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus equi
Streptococcus mutans
Entrobactries Mycoplasmes urognitaux
Salmonella typhi Enterobacter
cloacae Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella
pneumoniae Proteus mirabilis Shigella
flexneri Pseudomonas aeruginosa Citrobacter
malonaticus Citrobacter freundii
Ureaplasma urealyticum Mycoplasma
hominis
V.3. - Procdures de vaIidation et dfinition de queIques paramtres
de vaIidation (58)
La validation est la confirmation par examen et l'apport de preuves effectives du fait que
les prescriptions particulires d'une mthode analytique en vue d'une utilisation prvue
dtermine sont remplies.
La validation a pour principal objectif de s'assurer qu'un test microbiologique
dtermine donnera des rsultats suffisamment fiables et reproductibles, compte-tenu du
but de l'analyse. l faudra donc dfinir correctement la fois les conditions dans lesquelles
le test sera utilise et le but dans lequel il sera employ.
En effet, la validation inclut la spcification des exigences, la dtermination des
caractristiques des tests, ainsi qu'une dclaration relative la validit.
Ainsi, la validation d'une mthode permet de connatre ses caractristiques pour
dfinir et juger la qualit du processus analytique (reproductibilit, rptabilit, prcision,
exactitude, spcificit, linarit et domaine d'utilisation, sensibilit, limite de dtection) et
d'en prciser les limites de validit.
La validation peut se dcomposer en diffrents modules correspondant l'valuation
de chacune de ses caractristiques :
- linarit et domaine d'utilisation ;
- rptabilit et reproductibilit ;
28
- limite de dtection ;
- prcision ;
- exactitude ;
- sensibilit ;
- spcificit.
C'est l'valuation de la limite haute et basse de la relation linaire existant entre la
concentration de l'analyte et la dilution effectue.
La linarit d'une mthode analytique est sa capacit donner des rsultats
directement proportionnels la concentration de l'analyte dans les chantillons.
C'est la plus petite quantit ou concentration qui peut tre distingue, avec une
probabilit connue, d'un blanc de la raction ralis dans les mmes conditions.
C'est le degr d'accord entre les rsultats obtenus lors d'essais diffrents.
Evaluation de la dispersion des rsultats obtenus partir des aliquotes d'un mme
spcimen distribues dans un mme srie d'analyse (rptabilit) ou dans des sries
diffrentes (reproductibilit).
La mesure de la variation des rsultats obtenus au sein d'un mme laboratoire
caractrise la prcision obtenue lorsque la mthode est rpte par le mme analyste
dans les mmes conditions (ractifs, matriel, rglage, laboratoire) dans un court
intervalle de temps.
C'est la prcision de la mthode lorsqu'elle est applique dans des conditions
diffrentes, gnralement dans des laboratoires diffrents, des chantillons distincts,
thoriquement identiques, prlevs sur le mme lot homogne de produit analyser.
C'est l'aptitude d'une mthode mesurer la concentration de l'analyte sans
interfrence de la part des autres constituants de l'chantillon.
C'est l'aptitude d'une mthode dtecter de petites variations de concentration.
Evaluation de l'exactitude d'une mthode B par rapport une mthode A reconnue
pour sa fiabilit (technique de rfrence), avec des spcimens de contrle.
L'exactitude d'une mthode est le degr de concordance entre les rsultats obtenus e
la vraie valeur de la grandeur mesure.
Remarque
Toutes ces caractristiques ne sont pas toujours applicables toutes les mthodes
d'essai ni tous les produits analyser.
Dans tous les cas, chacune des caractristiques de performance applicable la
mthode analytique doit faire l'objet d'une valuation fonde sur des donnes
exprimentales.
29
30
Deuxime partie : notre exprience
Chapitre I - Cadre d'tude
Ce Travail a t effectu l'Unit de Recherche et de Biotechnologie Microbienne du
Laboratoire de Bactriologie-Virologie de l'Hpital Aristide Le Dantec.
Chapitre II - souches bactriennes
Nous avons utilis des souches de contrle de staphylocoques, de streptocoques,
d'entrobactries ainsi que des isolats de contrle de Mycoplasmes urognitaux.
Chapitre III - matrieI
III.1. - MatrieI pour Ia prparation des miIieux
31
- Agitateur magntique
- Balance de prcision
- pH-mtre
- Seringues
- Filtre de 0,2 m de diamtre
- Micropipettes de 100 et 200 l
- Embouts striles ;
- Flacons en verre avec bouchon vis de 5, 100 et 150 ml
- Tubes striles bouchon de 2,5 et 5 ml
- Erlen-meyer
- Bain-marie
- Autoclave.
III.2. - MatrieI pour Ie contrIe de quaIit
III.2.1. - MatrieI Iger
- Microplaques de 20 ou 96 puits avec couvercle
- Micropipettes de 100 l et 200 l
- 1 bcher rempli d'eau de javel
- 1 plateau (inoxydable de prfrence)
- 1 papier buvard
- 1 talon de Mac Farland d'chelle 1
(*)
- Anse de platine
- Emballage plastique
- Lame porte-objets
- Botes de Ptri
- Gnrateur de CO
2
ou bougie.
III.2.2. - MatrieI Iourd
- Bec bunsen
- Etuve
- Four micro-ondes
- Hygromtre
32
- Appareil de scellage
- Dessiccateur sous vide air renouvel
- Microscope optique
- Jarre d'incubation.
(*) : Etalon de Mac Farland varie :
- pour les Streptocoques : l'talon de Mac Farland est d'chelle 4
- pour les Entrobactries : l'talon de Mac Farland est d'chelle 0,5.
III.3. - MatrieI pour Ia conservation des souches
- Cryotubes billes
- Tubes visse
- Tube nunc
- Ecouvillons
- Portoirs.
Chapitre IV - Les staphyIocoques
IV.1. - Ractifs
IV.1.1. - Ractifs pour enrichissement et isoIement
- BTS : Bouillon Trypticase Soja
-Glose MH : Mller Hinton
- Glose trypticase - soja
- Sang de cheval
IV.1.2. - Ractifs pour I'identification
IV.1.2.1. - Substrats pour identification
- Glucides : Glucose, Mannitol, Xylose, Saccharose, Glycrol,
Mannose, Lactose, Rafinose.
33
- MEVAG STREPTO/STAPH
- Milieu de FALKOW
- Milieu ure - tryptophane
- Milieu de Clark et Lubs (VP)
- Milieu l'ONPG
- Milieu pour la recherche de la nitrate rductase.
IV.1.2.2. - Ractifs de rvIation
- Potasse 10 %
- Cratinine 1 %
- Alpha-naphtol
- Acide sulfanilique 8 g/l
- Acide naphtylamine 5 g/l.
IV.1.3. - Ractif pour Ia conservation des souches
- Bouillon cour cervelle + 10 % de glycrol
- Lait crm + 10 % de glycrol
- Glose MH : Muller Hinton
- Billes en tube.
IV.2. - MthodoIogie
IV.2.1. - Prparation des diffrents miIieux
IV.2.1.1. - MiIieux d'enrichissement et d'isoIement
C'est le milieu de rgnration des souches conserves +4C ou 70C..
Formule
Ractifs Quantit
- Trypticase soja 15 g
- Eau distille 500 ml
Autoclaver 121C pendant 15 mn. Rpartir dans les tubes visse.
C'est le milieu d'isolement des Staphylocoques ; il permet d'obtenir des colonies de
taille plus importante.
Milieu de base
34
Ractifs Quantit
- Glose Agar 8,5g
- Trypticase soja 15g
Autoclaver le mlange 121C pendant 15 minutes. Laisser refroidir.
Milieu complet
Ractifs Quantit
- Milieu de base 500 ml
- Sang de cheval 12,5 ml
Au milieu de base refroidi, on ajoute du sang de cheval. Le mlange est
homognis puis rparti dans des botes de ptri raison de 4 ml pour les botes de 8
cm de diamtre et 8 ml pour les botes de 16 cm de diamtre.
N.B. : Ce milieu est aussi utilis pour l'isolement des streptocoques (page.).
IV.2.1.2. - MiIieux d'identification de Ia micromthode Micro CSB
STAPHYLOCOQUE
IV.2.1.2.1. - MiIieux Iiquides
Prparation
> Les sucres
Glucides Strilisation Temprature et Dure
Glucose 10 % Trhalose
10 % Mannitol 10 % Xylose
10 % Saccharose 10
% Glycrol 10 % Mannose
10 % Lactose 10
% Raffinose 10 %
Autoclavage Autoclavage
Autoclavage Filtration
Tyndalisation ou
Filtration Autoclavage Autoclavage
Tyndalisation ou
Filtration Autoclavage
110C 10 min. 110C 10
min. 110C 10 min. 60C 30
min. x 3 jours 115C 30 min.
110C 10 min. 60C 30 min.
x 3 jours 110C 10 min.
> MEVAG STREPTO/STAPH
l s'agit d'une base de culture au rouge de phnol, commercialise sous forme de
poudre dshydrate, servant la diffrenciation de cultures pures bases sur la raction
de fermentation.
Formule approximative par litre
Ractifs Quantit
- Extrait pancratique de casine 10,0g
- Chlorure de sodium 5,0g
- Rouge de phnol 0,018g
35
Mode d'emploi
Suspendre 15g de poudre dans un litre d'eau distille.
Autoclaver le mlange 118C pendant 15 minutes.
> Autres miIieux d'identification
MiIieu de FALKOW
C'est le milieu de base pour la recherche des dcarboxylases. Le milieu de FALKOW
est commercialis sous forme dshydrate.
FormuIe
Ractifs Quantit
- Extrait de levure 0,6g
- Glucose 0,2g
- NaCl 1g
- Acide Amine (L-ornithine ou L-arginine) 1g
- Eau distille qsp 100 ml
Le milieu ainsi prpar doit tre autoclav 120C pendant 15 minutes et son pH
ajust 6,3 6,4.
Milieu Ure - Tryptophane
l permet la recherche de l'urase.
Formule
Ractifs Quantit
- L-tryptophane 0,6g
- Phosphate monopotassique 0,2g
- Phosphate dipotassique 0,2g
- NaCl 1g
Strilisation par filtration.
Milieu de CLARK et LUBS (VP)
Le but de son utilisation est la mise en vidence de la production d'actone.
Formule
Ractifs Quantit
- Peptone trypsique ou polypeptane 2,1g
- Pyruvate de sodium 1,84g
36
- Fumarate disodique 0,6g
- Glucose 1,5g
Ajuster le mlange pH 7 et filtrer.
Milieu l'ONPG
l concourt la caractrisation de la 8-galactosidase.
Les disques d'ONPG ont t immerges dans une solution de lactose 10 % puis le
milieu obtenu a t homognis pour favoriser l'lution des disques.
Milieu pour la recherche de la nitrate rductase
l s'agit d'un bouillon nutritif nitrat. Le bouillon nutritif a la formule suivante :
Formule
Ractifs Quantit
- Peptone 0,5g
- Extrait de viande 0,3g
Ajuster pH 7 et ajouter 2g de nitrate de sodium.
Dissoudre et autoclaver 121C pendant 15 minutes.
NB : avec du bouillon nutritif dshydrat, il suffit de dissoudre 1,6g de milieu sec
dans 100 ml d'eau distille pour prparer le bouillon.
> Ractifs de rvlation
Potasse 10 % (VP1)
- potasse 10g
- eau distille 100 ml
Cratinine 1 % (VP2)
- cratinine 1g
Alpha-naphtol (VP3)
- naphtol 1g
- thanol 70C 100 ml
Acide sulfanilique 8 g/l (GRESS )
- acide sulfanilique 0,8g
37
- thanol 95C 100 ml
Alpha-naphtylamine 5 g/l (GRESS )
- alpha naphtylamine 0,5g
- thanol 100 ml
Contrle de qualit des milieux liquides
Une fois qu'un lot de milieux liquides a t prpar, il est ncessaire de s'assurer de
la strilit et de l'efficacit de ces diffrents milieux.
> Test de strilit
l est bas sur la mise en vidence de l'absence de souillures des milieux liquides
pralablement prpars.
Technique
Nous avons utilis des tubes hmolyse.
Nous avons prlev 2 ml de chaque milieu liquide et nous l'avons introduit dans un
tube donn. Sur chaque tube, nous avons mentionn le nom du substrat introduit.
Nous avons ajout 1 ml d'eau physiologique strile dans les tubes contenant les
milieux allant de URE NIT.
Dans les tubes allant de GIu RAF, nous avons ajout 1 ml de MEVAG
STREPTO/STAPH.
Les tubes ont t ferms avec du coton et incub l'tuve 37C pendant 24H.
nterprtation et rsultats
Les milieux sont considrs comme striles en l'absence de :
- trouble du milieu
- virage de l'indicateur color
- coloration du milieu aprs ajout de ractifs de rvlation pour les cupules
concernes.
> Test d'efficacit
Ainsi, lorsqu'un milieu liquide a t considr comme strile, elle fait l'objet d'une tude en
ce qui concerne sa capacit donner un rsultat positif avec une souche dont le
caractre correspondant est positif et donner un rsultat ngatif si ce caractre est
ngatif pour une autre souche donne. De ce fait, pour chaque caractre biochimique
(milieu liquide), une souche de contrle a t choisie comme tmoin positif et une autre
comme tmoin ngatif.
Nous avons ralis une subculture de chaque souche de contrle sur glose au sang
24 48 heures.
A partir des colonies prleves avec soin de la glose, nous avons ralis pour
chaque souche de contrle un inoculum dont la turbidit est ajuste celle de l'chelle 1
de l'talon standard de Mac Farland, en dlayant les colonies dans de l'eau distille
38
strile.
Nous avons distribu les milieux liquides dans les microcupules. Nous avons prpar
deux plaques ; l'un pour les contrles positifs et l'autre pour les contrles ngatifs.
Nous avons ensemenc les cupules de URE NT avec l'inoculum de la souche de
contrle correspondant (100 l).
Pour la cupule allant de Glu RAF, l'inoculum de la souche de contrle
correspondant a t mlang avec le MEVAG STREPTO/STAPH, puis nous avons
ensemenc les cupules avec le MEVAG ainsi inocul (100 l).
Nous avons ensuite ferm les cupules ADH, ODC, URE et tous les sucres avec 2
gouttes d'huile de paraffine.
Nos plaques de contrle ont t incubes 37C sur un plateau recouvert de papier
buvard imbib d'eau.
La lecture se fait 24H aprs l'incubation.
TabIeau XII : PIan des pIaques pour contrIe CSB des StaphyIocoques PIaque des contrIes positifs
URE
Staphyloccus
xylosus
ADH
Streptococcus
pyogenes
ODC Proteus
mirabilis
VP
Enterococcus
faecalis
ONPG
Staphylococcus
xylosus
NT
Staphylococcus
aureus
GLU
Staphylococcus
aureus
TRE
Streptococcus
epidermitis
MAN
Streptotoccus
pneumoniae
XYL
Staphylococcus
xylosus
SAC
Staphylococcus
haemolyticus
GLY
Staphylococcus
aureus
MNE
Staphylococcus
aureus
LAC
Streptococcus
pneumoniae
RAF
Staphylococcus
lentus
Plaque des contrles ngatifs
URE
Staphylococcus
haemolyticus
ADH
Enterococcus
avium
ODC
Staphylococcus
aureus
VP
Streptococcus
pneumoniae
ONPG
Staphylococcus
aureus
NT
Staphylococcus
cohnii
GLU
Micrococcus sp
TRE
Micrococcus sp
MAN
Staphylococcus
aureus
XYL
Micrococcus sp
SAC
Micrococcus sp
GLY
Staphylococcus
epidermitis
MNE
Micrococcus sp
LAC
Staphylococcus
haemolyticus
RAF
Rsultats
La lecture se fait suivant le tableau de lecture de la micromthode Micro CSB
Staphylocoques.
39
IV.2.1.2.2. - MiIieux dshydrats
Prparation
Les milieux dshydrats ont t prpars, aprs avoir obtenu et contrl la strilit et
l'efficacit des milieux liquides.
> Distribution des milieux
Nous avons rparti les milieux liquides pralablement prpars dans les puits des
microplaques, raison de 100 l par substrats (milieux).
Nous avons fait la distribution selon le dispositif suivant :
Plaques de 20 puits
URE ADH ODC VP ONPG
NT GLu TRE MAN XYL
SAC GLy MNE LAC RAF
> Dshydratation des milieux
Aprs rpartition dans les microcupules, nous avons dshydrat les milieux liquides
au four micro-ondes en prsence de dessiccateur.
La temprature est de 37C pendant 48 heures.
Contrle de qualit
Une fois qu'un lot de milieux dshydrats a t prpar, il est ncessaire de s'assurer
de la strilit et de l'efficacit de ces lots de milieux.
> Test de striIit
l est bas sur la mise en vidence de l'absence de souillures des milieux
pralablement dshydrats.
Technique
Nous avons sur une microplaque, les diffrents milieux dshydrats.
Les cupules renfermant les milieux allant de URE NT ont t inoculs avec de
l'eau physiologique strile et les cupules renfermant les milieux allant de GLU RAF avec
le MEVAG STREPTO/STAPH.
Nous avons recouvert la plaque d'un parafilm et incub l'tuve 37C pendant 24H
sur plateau recouvert de papier buvard imbib d'eau.
TabIeau XIII : PIan contrIe de striIit des micropIaquesCSB StaphyIocoques
40
URE Eau
physiologique
strile
ADH Eau
physiologique
strile
ODC Eau
physiologique
strile
VAP Eau
physiologique
strile
ONPG Eau
physiologique
strile
NT Eau
physiologique
strile
GLU MEVAG TRE MEVAG MAN MEVAG XYL MEVAG
SAC MEVAG GLY MEVAG MNE MEVAG LAC MEVAG RAF MEVAG
> Test d'efficacit
Ainsi, lorsqu'un milieu dshydrat a t considr comme strile, elle fait l'objet d'une
tude en ce qui concerne sa capacit donner un rsultat positif avec une souche dont le
caractre correspondant est positif et donner un rsultat ngatif si ce caractre est
ngatif pour une autre souche donne.
Le test permet de voir si le milieu ne s'est pas dgrad au cours de la dshydratation.
De ce fait, pour chaque caractre biochimique (milieu), une souche de contrle a t
choisie comme tmoin positif et une autre comme tmoin ngatif.
Technique
Nous avons eu recours la mme technique que celle utilise pour les milieux
liquides.
Remarque : la diffrence est que les cupules renferment des substrats dshydrats.
RsuItats
ls sont prsents sous forme de tableau et ont t identiques ceux obtenus avec
les milieux liquides.
IV.2.2. - Identification des souches bactriennes
IV.2.2.1. - IsoIement
En vue d'obtenir des colonies des germes identifier, les souches conserves +4C ou
70C ont t rgnres dans un bouillon trypticase soja (BTS), puis ensemences sur
une glose trypticase soja enrichie par 5 % de sang de cheval (GSO). L'incubation se fait
l'tuve 37C + 5 % de CO
2
pendant 24 heures.
IV.2.2.2. - Identification
Les staphylocoques donnent sur glose au sang ordinaire, des colonies de grande taille,
lisses, entoures frquemment d'une zone claire d'hmolyse totale de type bta.
A partir d'une colonie, nous avons confectionn un frottis que nous avons ensuite
color au Gram.
L'observation microscopique l'objectif immersion montre des diplocoques Gram
positif, disposs en petits amas ou grappes.
Principe
41
La catalase est une enzyme qui hydrolyse le peroxyde d'hydrogne (3%) en eau plus
de l'oxygne.
Technique
A partir de colonies prleves avec soin de la glose, nous avons ralis un frottis.
Nous y avons dpos quelques gouttes de peroxyde d'hydrogne 3% et recherch
immdiatement une libration d'oxygne se matrialisant par la production de bulles.
Interprtation
- Raction positive : une production de bulles indique la prsence de catalase.
- Raction ngative : une absence de bulles signe un test ngatif.
Rsultats
- Les Staphylocoques sont catalase positive, l'exception de S. saccharolyticus et
S. aureus anaerobius qui sont catalase ngative.
Limites de la raction et prcautions prendre
Le test de la catalase ne doit pas tre ralis sur des colonies vieilles de plus de 24
heures ; ces dernires peuvent donner des ractions faussement ngatives, puisque
l'enzyme ne se retrouve que dans des cultures viables.
l faut prendre garde ne pas prlever de la glose lors du transfert des colonies de
la bote de Ptri la lame, car les globules rouges renferment de la catalase.
> dentification par le test AP 20 STAPH
AP 20 STREP est un systme d'identification du genre Staphylococcus comportant
des tests biochimiques standardiss et miniaturiss.
Principe
Les diffrents tests de la galerie se prsentent sous forme dshydrate. Leur
reconstitution se fait lors de l'addition chaque tube, d'AP STAPH Medium ensemenc
avec la souche tudier. Celle-ci doit tre cultive au pralable sur une glose au sang
ordinaire. L'incubation se fait 35 37C durant 18 24 heures. La lecture et
l'interprtation sont ralises partir du catalogue Analytique AP STAPH ou d'un logiciel
d'identification.
Composition des milieux et ractifs
42
APi STAPH Mdium 6 ml Extrait de levure Bactopeptone Chlorure de
sodium Oligolments Eau dminralise
qsp pH 7,0 7,4
0,5g 10g 5g 10
ml 1000 ml
Ractif VP1 Hydroxyde de potassium H
2
O 40g 100 ml
Ractif VP2 q-naphtol Ethanol 6g 100 ml
Ractif NiT1 Acide sulfanilique Acide actique H
2
O 0,4g 30g 70
ml
Ractif NiT2 N,N-dimthyl-1-naphtylamine Acide
actique H2O
0,6g 30g 70
ml
Ractif ZYM A Trib-hydroxymthyl-aminothane Acide
chlorhydrique 37 % Laurylsulfate de Na H
2
O
25g 11
ml 10g 100
ml
Ractif ZYM B 8 ml Fast Blue BB 2-mthoxythanol 0,35g 100
ml
Mode opratoire
Prparation de la galerie
- Nous avons rparti 5 ml d'eau distille dans les botes d'incubation puis nous y
avons plac la galerie.
Prparation de l'inoculum
Aprs avoir ouvert une pr-culture sur GSO 18-24H 37C, nous avons prlev
l'aide d'un couvillon, des colonies isoles de cette culture. Une suspension bactrienne
homogne d'opacit gale 0,5 de Mc FARLAND a t prpar avec une ampoule d'AP
STAPH Mdium.
noculation de la galerie
A l'aide d'une pipette, nous avons rempli les tubes de la galerie avec AP STAPH
Mdium ensemenc.
Nous avons cr une anarobiose dans les tests ADH et URE en remplissant leur
cupule d'huile de paraffine (2 gouttes) pour former un mnisque convexe.
La bote d'incubation a t referme et place l'tuve 35 37C pendant 18 24
heures.
Lecture de Ia gaIerie
Nous avons lu les ractions conformment au tableau de lecture en ajoutant une
goutte de chacun des ractifs suivants :
- test VP : VP1 et VP2 ; attendre 10 mn ;
- test NiT : NiT 1 et NiT 2 ;
- test PAL : ZYM A et ZYM B.
Identification
Elle est ralise l'aide du catalogue Analytique et du logiciel d'identification.
43
TabIeau XIV : Lecture de Ia gaIerie API
STAPH
QTE Rsultats
Tests Substrats (mg/cup.) Ractions/Enzymes Ngatif Positif
GLU FRU MNE MAL LAC TRE MAN XLT MEL D-glucose D-fructose
D-mannose D-maltose D-lactose (origine
bovine) D-trhalose D-mannitol Xylitol D-mlibiose
1,56 1,4 1,4 1,4 1,4 1,32 1,36 1,4 1,32 (Tmoin positif
(D-glucose) Acidification
(D-fructose) Acidification
(D-mannose) Acidification
(D-maltose) Acidification
(D-lactose) Acidification
(D-trehalose) Acidification
(D-mannito) Acidification
(D-xylitol) Acidification
(D-melbiose)
Rose Jaune
Nitrate de 0,08 Rduction des nitrates NT 1 + NT 2/10 min.
NT potassium en nitrites ncolore-rose
ple
Rouge
< ZYM A + ZYM B/10 min
PAL 8-glucuronidase 0,0244 Phosphatase alcaline Vert
ple-jaune
Rose
Production d'actyl mthyl- VP 1 + VP 2/10 min.
VP Sodium pyruvate 1,904 carbinol (Voges
Proskauer)
Vert
ple-jaune
Rose
RAF XYL SAC MDG NAG D-raffinose D-xylose D-saccharose Mthyl-
q-D- glucopyranoside N-actyl-glucosamine
1,56 1,4 1,32 1,26 1,28 Acidification
(Rafinose) Acidification
(Xylose) Acidification
(Saccharose) Acidification
(Mthyl-
q-D-glucopyranoside) Acidification
(N-actyl-glucosamine)
Rouge Jaune
ADH L-arginine 1,904 Arginine dihydrolase Jaune Orange-rouge
URE Ure 0,76 Urase Jaune Rouge-violet
- Les tests MNE et XLT peuvent tre oranges lorsqu'ils sont entours ou prcds de
tests positifs. On doit alors les considrer comme ngatifs.
IV.2.3. - La Micromthode d'identification System Micro CSB staphyIocoque
l s'agit d'une mthode miniaturise permettant la mise en vidence d'activits
enzymatiques, de la fermentation des sucres. Avec 15 tests biochimiques, il permet de
faire un diagnostic d'espces des staphylocoques.
Principe
La Micro CSB Staphylocoques consiste utiliser des plaques constitues de 20
microcupules contenant des substrats sous forme dshydrate destines la mise en
vidence d'activit enzymatique ou d'assimilation de diffrents substrats.
44
Les puits (microcupules) sont inoculs avec une suspension de bactries (inoculum)
qui reconstitue le milieu. Les ractions produites pendant la priode d'incubation se traduit
par des virages colors, spontans ou rvls par l'addition de ractifs.
Mode opratoire
Les souches conserves 70C dans un bouillon cour cervelle + 10 % de glycrol
sont rgnres dans un bouillon trypticase soja 37C avant d'tre repiques sur glose
au sang ordinaire sous 5 % de CO
2
pendant 24 heures 37C.
La suspension bactrienne est prpare en dlayant des colonies bien isoles dans
de l'eau physiologique (1 ml) par couvillonnage.
La turbidit de la suspension est ajuste l'chelle 1 de l'talon standard de Mac
FARLAND.
Ensemencement et incubation
- Distribuer 100 l d'inoculum bactrien par microcupule de URE NT.
- Verser le reste de la suspension bactrienne dans 1 ml de base de culture rouge de
phnol (bouillon au rouge de phnol) et mlanger..
- Ensemencer les cupules de GLU RAF avec le bouillon rouge de phnol ainsi
inocul (3 4 gouttes), environ 100 l par cupule.
- Recouvrir les puits destins la recherche d'urase et des dcarboxylases avec 2
gouttes d'huile de paraffine afin de maintenir l'anarobiose ncessaire aux ractions.
- ncuber 37C sur un plateau recouvert de papier buvard imbib d'eau.
- Lire aprs 4 heures, puis aprs 18 heures d'incubation.
Lecture et interprtation
La lecture repose sur le changement de la coloration initiale des diffrents milieux.
Pour la plupart des milieux, la lecture s'est faite directement, par contre pour d'autres,
elle a ncessit l'addition de ractifs.
La lecture des caractres est faite sur une fiche de lecture (cf tableau de lecture).
L'identification est rendue possible grce l'utilisation du tableau d'identification (cf
tableau d'identification).
TabIeau XV : Lecture pIaques Micro CSB StaphyIocoques
45
Tests Substrats Ractions
/ Enzymes
Ractifs ajouter Rsultats
positifs
Rsultats
ngatifs
URE Ure Urase Rose
framboise
Orange
ADH Arginine Arginine
dihydrolase
Rouge Jaune
ODC Ornithine Ornithine
dcarboxylase
Rose-rouge Jaune
VP Glucose +
pyruvate
Production
d'actone
1 goutte de
KOH 1goutte de
cratinine 1 goutte de
q-naphtol
Rose-Rouge ncolore
ONPG ONPG Bta-galactosidase Rouge ncolore
NT Nitrate de
potassium
Nitrate
rductase
1 goutte
d'acide sulfanilique 1
goutte
q-naphtylamine
Noir ncolore
GLU TRE MAN XYL SAC GLY MNE LAC RAF Glucose
Trhalose
Mannitol
Xylose
Saccharose Fermentation Jaune Rouge
Glycrol
Mannose
Lactose
Raffinose
Chapitre V - Les streptocoques
V.1. - Ractifs
V.1.1. - Ractifs pour enrichissement et isoIement
- BGT : Bouillon Glucose Tamponn
-Glose MH : Mller Hinton
- Glose trypticase - soja
- Sang de cheval
- Gentamicine
- Acide nalidixique.
46
V.1.2. - Ractifs pour enrichissement et isoIement
V.1.2.1. - Substrats pour identification
- Glucides : L-arabinose, Mannitol, Sorbitol, Trhalose, Raffinose,
Sorbose, nuline, Lactose, Ribose, Amidon
- MEVAG STREPTO/STAPH
- Milieu de Clark et Lubs (VP)
- Milieu de FALKOW
- Bouillon hypersal : BHS
- Esculine.
V.1.2.2. - Ractifs de rvIation
- Cratinine 1 % (VP2)
- Potasse 10 % (VP1).
V.1.3. Ractifs pour Ia conservation des souches(cf. page 58)
V.2. - MthodoIogie
V.2.1. - Prparation des diffrents miIieux
V.2.1.1. - MiIieux d'enrichissement et d'isoIement
Bouillon Trypticase-Soja (cf page 58)
Glose au sang cuit + Gentamicine
C'est le milieu d'isolement de Streptococcus pneumoniae.
Milieu de base
Ractifs Quantit
- Glose 8,5g
- Trypticase soja 15g
MiIieu compIet
Ractifs Quantit
47
- Sang de cheval 12,5 ml
- Gentamicine 6 ml
Mlanger chaud et rpartir le mlange obtenu dans les botes de ptri.
GIose au sang ordinaire : GSO ( cf page 58 )
V.2.1.2. - MiIieux d'identification de Ia micromthode Micro CSB
STREPTOCOQUE
V.2.1.2.1. - MiIieux Iiquides
Prparation
> Les sucres
Arabinose 10 % Mannitol
10 % Sorbitol 10
% Trhalose 10
% Raffinose 10 % Sorbose
10 % nuline 5% Lactose
10 % Amidon
2,5% Glycrol 10 %
Tindalisation ou
Autoclavage Autoclavage Autoclavage Autoclavage Tyndalisation
ou
60C 30 min. x 3 jours 110C
10 min. 110C 10 min. 110C
10 min. 110C 10 min. 110C
10 min. 110C 10 min. 60C
30 min. x 3 jours 115C 30
min. 115C 30 min.
> MEVAG STREPTO/STAPH (cf page 60)
> Autres milieux d'identification
Milieu de CLARK et LUBS (Voges Proskauer)
(cf page 61)
Milieu pour la mise en vidence de l'attaque de l'esculine
Formule
Ractifs Quantit
- Peptone 20 g/l
- Citrate de fer ammoniacal 2 g/l
- Glucose 2 g/l
Ajuster le pH du mlange 7,4. Striliser 110C pendant 30 minutes.
MiIieu de FALKOW (cf page 60)
BouiIIon hypersaI
FormuIe
Ractifs Quantit
- Bouillon MH ou infusion de coeur 5g
48
- NaCl 13g
- Glucose 0,2g
- BCP (1,6 %) 200 l
Ajuster le pH 7 7,2.
Strilisation par autoclavage 121C pendant 20 minutes.
> Ractifs de rvIation
Cratinine 1 % (VP2)
- Cratinine 1g
Potasse 10 % (VP1)
- KOH 10g
Le contrle de ces milieux est bas sur les tests de strilit et d'efficacit.
> Test de strilit (cf page 63)
- Nous avons ajout 1 ml d'eau physiologique strile dans les tubes contenant les
milieux VP, ESC, ADH, BHS.
- Dans les tubes contenant les sucres, nous avons ajout 1 ml de MEVAG
STREPTO/STAPH.
> Test d'efficacit (cf page64)
L'talon standard de Mac Farland est d'chelle 4.
TabIeau XVI: PIan des pIaques pour contrIe d'efficacit CSB Streptocoques PIaque des contrIes positifs
VP Enterococcus
faecalis
ESC Enterococcus
faecalis
ADH Streptococcus
pyogenes
BHS Enterococcus
faecalis
ARA Enterococcus
avium
MAN Streptococcus
pneumoniae
SOR Enterococcus
avium
TRE Enterococcus
faecalis
RAF Klebsiella
pneumoniae
SOS Enterococcus
faecalis
NU Streptococcus
pneumoniae
LAC Streptococcus
pneumoniae
RB Enterococcus
faecalis
AMD Enterococcus
faecalis
Gly Enterococcus
faecalis
49
VP
Streptococcus
pneumoniae
ESC Streptococcus
agalactiae
ADH Enterococcus
avium
BHS Streptococcus
pyogenes
ARA Streptococcus
pyogenes
MAN Micrococcus
sp
SOR Streptococcus
pyogenes
TRE Micrococcus
sp
RAF Streptococcus
pyogenes
SOS Enterococcus
avium
NU Enterococcus
faecalis
LAC Enterococcus
faecalis
RB Streptococcus
pyogenes
AMD Enterococcus
avium
Gly Enterococcus
avium
Rsultats
La lecture se fait suivant le tableau de lecture de la micromthode Micro CSB
ENTERO.
V.2.1.2.2. - MiIieux dshydrats
Prparation
Les milieux dshydrats ont t prpars, aprs avoir obtenu et contrl les milieux
liquides.
Plaques de 20 puits
VP ESC ADH BHS ARA
MAN SOR TRE RAF SOS
NU LAC RB AMD Gly
> Dshydratation des milieux (cf page 66)
Contrle de qualit
Les tests de strilit et d'efficacit ont t raliss suivant les techniques dcrites
avec les milieux dshydrats Micro CSB Staphylocoques.
TabIeau XVII : PIan contrIe de striIit des MicropIaques CSB Streptocoques
VP Eau
physiologique
strile
ESC Eau
physiologique
strile
ADH Eau
physiologique
strile
BHS Eau
physiologique
strile
ARA MEVAG
MAN MEVAG SOR MEVAG TRE MEVAG RAF MEVAG SOS MEVAG
NU MEVAG LAC MEVAG RB MEVAG AMD MEVAG GLy MEVAG
50
> Test d'efficacit (cf. page 67)
V.2.2. - Identification des souches bactriennes
V.2.2.1. - IsoIement
En vue d'obtenir des colonies des germes identifier, les prlvements ont t
ensemencs sur les milieux suivants :
- GSO pour les streptocoques ;
- GSC+Gentamicine 6 mg/ml pour les pneumocoques ;
- puis incubs 37C + 5 % CO
2
pendant :
24H pour milieu GSO
48 H pour milieu GSC + Gentamicine.
V.2.2.2. - Identification
Les Streptocoques donnent sur glose au sang cuit, des colonies lisses entoures d'une
d'hmolyse qui varie suivant l'espce :
- les Streptocoques pyogenes (S. pyogenes, S. agalactiae, S. equi) ont une hmolyse
complte de type bta ;
- les Streptocoques oraux (S. sanguis, S. mitis, S. milleri) et ceux du groupe D (S.
bovis, S. equinus) sont non hmolytiques.
Tandis que les Pneumocoques (Streptococcus pneumoniae) donnent sur glose au
sang cuit, de petites colonies mucodes ou dpression centrale, transparentes, rondes
et dveloppant une hmolyse de type alpha (alpha viridans).
color au Gram.
L'observation microscopique l'objectif immersion montre des diplocoques Gram
positif, en flamme de bougie, capsuls. l s'agit l d'une morphologie gnralement
caractristique du pneumocoque.
Les streptocoques se prsentant, quant eux, sous forme de cocci Gram positif
disposs en chanettes.
N.B. : - Les streptocoques sont catalase ngative.
AP 20 STREP est un systme standardis associant 20 tests biochimiques qui
prsentent un grand pouvoir discriminant. l permet de faire un diagnostic de groupe ou
d'espce pour la plupart des streptocoques rencontrs en bactriologie mdicale.
Principe
La galerie AP 20 STREP comporte 20 microtubes contenant les substrats
dshydrats pour la mise en vidence d'activit enzymatique ou de fermentation de
51
sucres.
Les tests enzymatiques sont inoculs avec une suspension dense, ralise partir
d'une culture pure, qui rhydrate les substrats. Les ractions produites pendant la priode
d'incubation se traduisent par des virages colors spontans ou rvls par l'addition de
ractifs.
Les tests de fermentation sont inoculs avec un milieu enrichi qui rhydrate les
sucres. La fermentation des carbohydrates entrane une acidification se traduisant par un
virage spontan de l'indicateur color.
La lecture de ces ractions se fait l'aide du tableau de lecture et l'identification
obtenue l'aide d'un logiciel d'identification.
Suspension Mdium 2 ml Eau dminralise
Api GP Mdium 2 ml Cystine Tryptone Chlorure de
sodium Sulfite de sodium Rouge de
phnol Eau dminralise qsp pH 7,8
0,5g 20g 5g 0,5g 0,17g 1000
ml
Ractif NN 5 ml Ninhydrine 2-mthoxy thanol 7g 100 ml
Ractif VP1 5 ml Hydroxyde de potassium H
2
O 40g 100 ml
Ractif VP2 q-naphtol Ethanol 6g 100 ml
Ractif ZYM A 8 ml Trib-hydroxymthyl-aminothane Acide
chlorhydrique 37 % Laurylsulfate de
Na H
2
O
25g 11
ml 10g 100
ml
Ractif ZYM B 8 ml Fast Blue BB 2-mthoxythanol 0,35g 100
ml
Mode opratoire
Slection des colonies
Aprs isolement et vrification de l'appartenance de la souche identifier au genre
Streptococcus :
- nous avons prlev une colonie bien isole et nous l'avons mise en suspension
dans 0,3 ml d'eau strile ;
- nous avons ensuite inond une bote de glose Columbia au sang de mouton avec
cette suspension ;
- la bote a t incube 18 24 heures 35 37C en anarobiose.
- Runir fond et couvercle d'une bote d'incubation et rpartir environ 5 ml d'eau
distille dans les alvoles pour crer une atmosphre huide. :
- nscrire la rfrence de la souche sur la languette latrale de la bote.
- Sortir la galerie de son emballage individuel.
- Placer la galerie dans la bote d'incubation.
52
Aprs avoir ouvert une ampoule de suspension Medium, nous avons l'aide d'un
couvillon, prlev toute la culture pralablement prpare afin de raliser une
suspension trs dense (opacit suprieure 4 de Mc FARLAND).
- Dans la premire moiti de la galerie (tests VP ADH), nous avons rparti la
suspension prcdente en vitant la formation de bulles :
*pour les tests VP LAP : environ 100 l dans chaque cupule ;
*pour les tests ADH : remplir uniquement le tube.
- Dans la deuxime moiti de la galerie (tests RiB GLYG :
* nous avons ouvert une ampoule d'APiGP Medium et y avons transfr le reste de la
suspension, soit environ 0,5 ml ;
* nous avons rparti cette nouvelle suspension dans les tubes uniquement.
- Nous avons rempli les cupules des tests souligns ADH GLYG avec de l'huile de
paraffine en formant un mnisque convexe puis referm la bote d'incubation.
Lecture de la galerie
Aprs 4 heures d'incubation, nous avons ajout les ractifs :
* test VP : 1 goutte de VP1 et VP2
* test HiP : 2 gouttes de NN
* test PYRA, q-GAL, 8-GUR, 8-GAL, PAL, LAP : 1 goutte de ZYM A et ZYM B.
Aprs 10 mn, la lecture est effectue en se rfrant au tableau de lecture.
TabIeau XVIII : Lecture de Ia gaIerie API Streptocoques
53
Rsultats
/Enzymes
Ngatif Positif
VP1 + VP2/jusqu' 10 mn
VP pyruvate Production
d'actone
Rose-Rouge ncolore
NIN/jusqu' 10 mn
HiP Hippurate Hydrolyse ncolore/Bleu ple Bleu fonc/Violet
4H 24H 4H 24H
ESC Esculine 8-glucosidase ncolore
jaune-ple
ncolore
jaune-ple
gris-clair
Noir
gris
noir
ZYM A + ZYB B / 10 mn (PYRA LAP)
PYRA Pyrrolidonyl-2- naphtyl
amide
Pyrrolidonyl
arylamidase
ncolore ou orange trs
ple
Orange
q-GAL 6 Bromo-2- naphtyl
q-D galactopyranoside
8-galactosidase ncolore Violet
8-GUR Naphtol
AS-B 8-D-glucuromatoside
8-glucuronidase ncolore Bleu
8-GAL 2-Naphtyl
8-D- galactopyranoside
8-galactosidase ncolore ou violet trs
ple
Violet
PAL 2-naphtyl
phosphate
Phosphatase
lcaline

LAP L-leucine-2-naphtylamide Leucine
arylamidase
ncolore orange
dihydrolase
Jaune Rouge
4H 24H 4H 24H
RiB ARA MAN SOR LAC TRE NU RAF AMD Ribose L-arabinose Mannitol Sorbitol Lactose Trhalose nuline Raffinose Amidon Acidification Rouge Orange /
Rouge
Orange
/ jaune
Jaune
GLYC Glycogne Acidification Rouge ou Orange Jaune franc
V.2.3. - La Micromthode d'identification System Micro CSG streptocoques
l s'agit d'une mthode miniaturise permettant la mise en vidence d'activits
enzymatiques, de la fermentation des sucres et de la croissance en milieu hostile.
Avec 15 tests biochimiques, il permet de faire un diagnostic de groupe ou d'espces
de streptocoques (non groupables).
Principe
Les galeries CSB Streptocoques permettent la mise en vidence d'activits
enzymatiques ou d'assimilation de substrats carbons en milieu appropri (fermentation)
ou hostile.
Ces microplaques renfermant des substrats dshydrats sont ensemences avec un
54
inoculum qui reconstitue le milieu.
Aprs incubation, la lecture des ractions est effectue directement (virage de
l'indicateur color utilis) ou aprs addition de ractifs de rvlation.
Mode opratoire
Prparation de I'inocuIum
Les souches conserves 70C dans un bouillon cour cervelle + 10 % de glycrol
sont rgnres dans un bouillon trypticase soja 37C pendant 24 heures avant d'tre
repiques sur glose au sang ordinaire sous 5 % de CO
2
pendant 24 heures 37C pour
les streptocoques et, sur glose au sang cuit + gentamycine sous 5 % de CO
2
pendant
48 heures 37C pour les pneumocoques.
La suspension bactrienne est prpare en dlayant des colonies bien isoles dans 1
ml d'eau physiologique par couvillonnage.
La turbidit de la suspension est ajuste l'chelle 4 de l'talon standard de Mac
Farland.
Ensemencement et incubation
- Nous avons distribu 100 l d'inoculum bactrien par microcupule de VP BHS.
- Nous avons vers le reste de la suspension bactrienne dans 1 ml de MEVAG
STREPTO/STAPH.
- Nous avons ensemenc les cupules de ARA GLY avec le MEVAG
STREPTO/STAPH ainsi inocul (3 4 gouttes).
- Les cupules ADH et tous les sucres sont ferms avec 2 gouttes d'huile de paraffine.
- Les plaques sont incubes 37C sur un plateau recouvert de papier buvard imbib
d'eau pendant 24H.
Lecture et interprtation
La lecture des caractres est faite sur une fiche de lecture et l'identification est
rendue possible grce l'utilisation du tableau d'identification.
TabIeau XIX : Lecture pIaques Micro CSB Streptocoques
55
Tests Substrats Ractions /Enzymes Ractifs ajouter Rsultats
positifs
Rsultats
ngatifs
VP Glucose +
pyruvate
Production d'actoine 1 goutte de KOH 1
goutte de
cratinine 1 goutte
de naphtol
Rose -
Rouge
ncolore
ESC Esculine 8-glucosidase Noir ncolore
ADH Arginine Arginine dihydrolase Rouge Jaune
BHS Glucose Croissance en milieu
hypersal
Jaune Violet
ARA L-Arabinose
MAN Mannitol
SOR Sorbitol
TRE Trehalose
RAF Raffinose
SOS Sorbose Fermentation Jaune Rouge
NU nuline
LAC Lactose
RB Ribose
AMD Amidon
GLY Glycrol
Chapitre VI - Les entrobacteries
VI.1. - Ractifs
VI.1.1. - Ractifs pour enrichissement et isoIement
- BGT: Bouillon Glucos Tamponn
- BTS : Bouillon Tryticase Soja
- Glose EMB : Eosine bleu de mthylne
VI.1.2. - Ractifs pour I'identification par Ia micromthode Micro CSB
ENTERO
VI.1.2.1. - Substrats pour identification
- Sucres : Lactose, Glucose, Mannitol, Saccharose, Sorbitol, Rhamnose,
Adonitol, Dulcitol, nositol.
56
- Milieu pour la recherche des dcarboxylases : Milieu de FALKOW
- Lysine dcarboxylase : LDC
- Ornithine dcarboxylase : ODC
- Arginine dihydrolase : ADC
- Milieu ure - tryptophane
- Milieu de CLARK et LUBS : VP
- Bouillon au citrate de Simmons
- Bouillon au citrate de Christensen
- Bouillon au malonate
- Solution ONPG
- Milieu pour la recherche de la nitrate rductase.
VI.1.2.2. - Ractifs de rvIation
- Cratinine 1 % (VP2)
- Potasse 10 % (VP1)
- Alpha-naphtol (VP2)
- Perchlorure de fer au 1/3
- Ractifs de KOVACS.
VI.1.3. - Ractifs pour Ia conservation des souches bactriennes(cf page58)
VI.2. - MthodoIogie
VI.2.1. - Prparation des diffrents miIieux
VI.2.1.1. - MiIieux d'enrichissement et d'isoIement des souches
Bouillon Trypticase-Soja (cf page 58)
Milieu Glose EMB
C'est le milieu d'isolement des entrobactries ; il permet d'obtenir des colonies de
taille plus importante. l est prsent sous forme de poudre dshydrate.
Formule
Ractifs Quantit
- Glose EMB 18,25g
Porter bullition le mlange jusqu' dissolution complte. Striliser par autoclavage
57
121C pendant 15 minutes. Refroidir 60C et agiter le milieu de faon oxyder le bleu
de mthylne (le milieu devient bleu) et dissoudre le prcipit qui est un constituant
important du milieu.
Rpartir dans les botes de ptri.
VI.2.1.2. - MiIieux de Ia micromthode d'identification Micro CSB
ENTEROBACTERIES
VI.2.1.2.1. - MiIieux Iiquides
Prparation
> Les sucres
Lactose 10 % Glucose 10
% Mannitol 10
% Saccharose 10
% Sorbitol 10 % Rhamnose
10 % Adonitol 5 % Dulcitol
2% nositol 5 %
Tyndalisation ou
Filtration Autoclavage
Autoclavage Tyndalisation ou
Autoclavage Autoclavage
Autoclavage
60C 30 min. x 3j 110C 10
min. 110C 10 min. 60C 30
min x 3j 110C 10 min. 110C
10 min. 110C 10 min. 110C
10 min. 110C 10 min.
> MEVAG des Entrobactries
l s'agit d'une base de culture pourpre, commercialise sous forme de poudre
dshydrate, servant la diffrenciation de cultures pures bases sur la raction de
fermentation.
- Peptone de protase n2 10,0g
- Extrait de Bouf 1,0g
- Chlorure de sodium 5g
- Bromocrsol pourpre (BCP) 0,02g
Mode d'emploi
Mettre 16g de poudre en suspension dans 1 litre d'eau purifi.
> Autres milieux d'identification
Milieu de FALKOW (cf page 60)
Milieu Ure Tryptophane (cf page 61)
Milieu de CLARK et LUBS (VOGES PROSKAUER)
(cf page 61)
Prparation de la glatine
58
- Glatine 15g
La solution est chauffe au bain-marie bouillant jusqu' la dissolution complte,
refroidie 45C ensuite, on ajoute en mlangeant, activement 4g de charbon de bois en
poudre fine.
Le moulage se fait dans les moules de 0,5 cm sur une surface horizontale puis port
une demi-heure la glacire.
Dmouler et faire sjourner les plaques pendant 24 heures dans la solution de formol
suivant :
- Formol de commerce 40 % 1 volume
- Eau distille 69 volumes
Dcouper ensuite en petits fragments de 0,5 cm de ct qui sont rincs l'eau
courante pendant 24 48 heures pour liminer le formol.
Les cubes lavs sont introduits dans des flacons contenant de l'eau distille pour tre
tyndaliss 1 heure 60C, 3 jours de suite.
Formule
Ractifs Quantit
- Sulfate de magnsium 0,04g
- Phosphate mono-ammonique 0,02g
- Citrate trisodique 0,4g
- NaCl 1g
- Bleu de bromothymol 0,016g
Dissoudre le mlange chaud.
Ajuster le pH 7. Autoclaver 120C pendant 20 minutes.
Formule
Ractifs Quantit
- Peptone de casine 6g
- Peptone de viande 1,98g
- Tryptophane 0,9g
- Citrate ferrique ammoniacal 0,06g
- Thiosulfate de sodium 0,06g
Ajuster le pH 7,5. Autoclaver 120C pendant 15 minutes.
C'est une base de culture permettant la diffrenciation des entrobactries utilisant le
59
malonate. l est commercialis sous forme de poudre dshydrate.
Ractifs Quantit
- Extrait de levure 1g
- Sulfate d'ammonium 2g
- Phosphate mono-ammoniaque 0,4g
- Malonate de sodium 3g
- Dextrose 0,25g
- Bleu de bromothymol 0,025g
Mode d'emploi
Dissoudre 9,3g de poudre dans 1 litre d'eau distille, et agiter jusqu' dissolution
complte.
Ajuster le pH 6,7 0,2. Autoclaver 121C 124C pendant 15 minutes.
Milieu l'ONPG (cf page 61)
> Ractif de rvlation
Potasse 10 % (VP1)
- potasse 10g
Cratinine 1 % (VP2)
- cratinine 1g
Alpha-naphtol (VP3)
- naphtol 1 6g
- thanol 60C 100 ml
Perchlorure de fer au 1/3
- perchlorure de fer officinal 10 ml
Ractif de KOVACS
- P-dimthylamino-benzaldhyde 5g
- Alcool amylique 75 ml
- HCl pur 25 ml
Dissoudre l'aldhyde dans l'alcool au bain-marie 60C. Refroidir et ajouter l'acide
60
goutte goutte en maintenant le rcipient dans la glace. Conserver 4C en flacon
ambr.
Les tests tudis pour ce contrle sont ceux de la strilit et de l'efficacit.
N.B. : L'eau physiologique est mise dans les tubes allant de LDC ONPG.
Le MEVAG ENTERO est introduit dans les tubes allant de LAC NO.
> Test d'efficacit (cf page 64)
N.B. : Le milieu de culture est la glose EMB.
L'inoculum est ensemenc dans les cupules allant de LDC ONPG.
Pour les cupules allant de LAC NO, l'inoculum est ensemenc aprs mlange avec
le MEVAG ENTERO.
TabIeau XX : PIan des pIaques pour contrIe d'efficacit CSB ENTEROBACTERIES PIaque des contrIes
positifs
LDC E. coli ODC Enterobacter
cloacae
ADH Enterobacter
cloacae
URE Klebsiella
pneumoniae
VP Klebsiella
pneumoniae
GEL Proteus
mirabilis
CS MEVAG Entrobacter
cloacae
CC E. coli SH
2
Salmonella
typhi __________ ND E.
coli
MAL Klebsiella
pneumoniae ___________ PDA Proteus
vulgaris
ONPG E. coli LAC E. coli GLU E. coli MAN E. coli SAC Shigella
flexneri
SOR Enterobacter
cloacae
RMA E. coli ADO E. coli DUL Klebsiella
pneumoniae
NO Klebsiella
pneumoniae
LDC Enterobacter
cloacae
ODC Klebsiella
pneumoniae
ADH E. coli URE E. coli VP E. coli
GEL E. coli CS E. coli CC Klebsiella
pneumoniae
H
2
S E.
coli __________ ND Klebsiella
pneumoniae
MAL E.
coli ___________ PDA E.
coli
ONPG Shigella
flexneri
LAC Shigella
flexneri
GLU Pseudomonas
aeruginosa
MAN Shigella
flexneri
SAC Shigella
flexneri
SOR Shigella
flexneri
RMA Shigella
flexneri
ADO Salmonella
typhi
DUL E. coli NO Salmonella
typhi
Rsultats
La lecture se fait suivant le tableau de lecture de la micromthode MicroCSB
Entrobactries.
61
VI.2.1.2.2. - MiIieux dshydrats
Prparation
Les milieux dshydrats ont t prpars aprs avoir obtenu et contrl la strilit et
l'efficacit des milieux liquides.
Plaques de 20 puits
LDC ODC ADH URE VP
GEL CS CC SH2 ND MAL PDA
ONPG LAC GLU MAN SAC
SOR RAM ADO DUL NO
> Dshydratation des milieux (cf page 66)
Contrle de qualit
TabIeau XXI : PIan contrIe de striIit des MicropIaques CSB Entrobactries
LDC Eau
physiologique
strile
ODC Eau
physiologique
strile
ADH Eau
physiologique
strile
URE Eau
physiologique
strile
VP Eau
physiologique
strile
GEL Eau
physiologique
strile
CS Eau
physiologique
strile
CC Eau
physiologique
strile
SH
2
ND Eau
physiologique
strile
MAL PDA Eau
physiologique
strile
ONPG Eau
physiologique
strile
LAC MEVAG GLU MEVAG MAN MEVAG SAC MEVAG
SOR MEVAG RMA MEVAG ADO MEVAG DUL MEVAG NO MEVAG
> Test d'efficacit (cf page67)
VI.2.2. - Identification des souches bactriennes
VI.2.2.1. - IsoIement
En vue d'obtenir des colonies des germes identifier, les souches conserves +4C ou
70C ont t rgnres dans un bouillon trypticase soja (BTS) puis ensemencs sur
une glose EMB. L'incubation se fait l'tuve 37C pendant 24 heures.
62
VI.2.2.2. - Identification
> Examen macroscopique
Les entrobactries donnent sur milieu glos EMB, des colonies habituellement
lisses, brillantes, de structure homogne (type smooth ou S).
Les colonies des bactries du genre Klebsiella sont elles mucodes, plus grandes que
les colonies S avec une tendance la confluence.
> Examen microscopique
color au Gram. L'observation microscopique l'objectif immersion montre des bacilles
Gram ngatif asporuls, immobiles ou mobiles par leur ciliature pritriche.
> Test l'oxydase
Principe
Sous l'action d'un cytochrome oxydase, le di-mthyl-paraphnylne diamine,
incolore, est transform en une semi-quinone violace qui s'oxyde rapidement pour
donner un compos noirtre.
Technique
Nous avons prpar une suspension paisse de bactries dans 0,5 ml d'eau
physiologique. Nous y avons rajout le disque.
Interprtation
Une raction positive se manifeste au bout de 30 60 secondes par la coloration
violette de la suspension, persistant pendant 15 minutes environ.
Rsultats
Les souches d'entrobactries sont oxydase ngative.
Remarque : Ne pas utiliser pour prlever les colonies tester des anses mtalliques
chargs d'oxydase qui pourraient tre responsables d'un rsultat faussement positif.
> Test AP 20 ENTERO
Le test AP
20E est un systme qui permet de faire le diagnostic d'espces des

Entrobactries, utilisant 21 tests biochimiques standardiss et miniaturiss.
Principe
La galerie AP
20E comporte 20 microtubes contenant des substrats dshydrats.

Les microtubes sont inoculs avec une suspension bactrienne qui reconstitue le milieu.
Les ractions produites pendant la priode d'incubation se traduisent par des virages
colors spontans ou rvls par l'addition de ractifs.
La lecture de ces ractions se fait l'aide du tableau de lecture et l'identification est
obtenue l'aide d'un logiciel d'identification.
63
NaCl 0,85 % Mdium 5 ml Chlorure de sodium Eau dminralise 8,5g 100 ml
Suspension Mdium 5 ml Eau dminralise
Ractif TDA (5 ml) Perchlorure de fer H
2
O qsp 3,4g 100 ml
Ractif JAMES Composant J2183 HCl 1N qsp 3,4g 100 ml
Ractif VP1 Hydroxyde de potassium H
2
O 40g 100 ml
Ractif VP2 q- naphtol thanol 6g 100 ml
Ractif NiT1 Acide sulfanilique Acide actique H
2
O 0,4g 30g 70
ml
Ractif NiT2 N,N-dimthyl-1-naphtylamine Acide
actique H
2
O
0,6g 30g 70
ml
Mode opratoire
Nous avons rparti 5 ml d'eau distille dans les botes d'incubation pour crer une
atmosphre humide, puis nous y avons plac la galerie.
Aprs avoir ouvert une pr-culture sur glose EMB 24H 37C, nous avons prlev
l'aide d'une anse de platine, une seule colonie bien isole sur milieu glos. Nous avons
prpar une suspension bactrienne avec une ampoule de suspension Mdium.
A l'aide d'une pipette, nous avons rempli les tubes et cupules des tests CT, VP et
GEL.
Nous avons ensuite rempli les tubes (et non les cupules) des autres tests.
Nous avons cr une anarobiose dans les tests ADH, LDC, ODC, H
2
S, URE en
remplissant leur cupule d'huile de paraffine.
La bote d'incubation a t referme avec son couvercle et place l'tuve 37C
pendant 18 24 heures.
Lecture de la galerie
Aprs 18 24H, nous avons lu les ractions conformment au tableau de lecture.
Si trois tests ou plus (test Glu + ou -) sont positifs, rvler les tests ncessitant
l'addition de ractifs.
- test TDA : ajouter une goutte de ractifs + AD :
couleur marron-rougetre raction positive
- test ND : ajouter une goutte de ractif JAMES :
couleur diffuse raction positive
- test VP : ajouter une goutte des ractifs VP1 et VP2, attendre 10 mn
couleur rose au rouge raction positive
- test NO2 : ajouter une goutte des ractifs NiT 1 et NiT 2 dans le tube Glu. Attendre
64
2 5 mn.
couleur rouge raction positive
une coloration jaune raction positive
Elle peut tre due la production d'azote : ajouter 2 3 mg de ractif Zn des cupule
Glu. Aprs 5 minutes :
tube jaune raction positive
couleur orange-rouge raction ngative
Si le nombre de tests positifs (y compris le test Glu) est infrieur 3, ne pas ajouter
les ractifs.
noculer 2 ampoules d'AP OF Mdium pour vrifier ce mtabolisme du glucose.
Ensemencer un milieu de Mac CONKEY ;
Vrifier la mobilit : inoculer une ampoule d'AP mdium ou observer entre lame et
lamelle au microscope
ncuber la galerie 24 heures de plus.
Ajouter les ractifs comme indiqu prcdemment.
dentification
L'identification est obtenue l'aide du logiciel d'identification.
TabIeau XXII: Lecture de Ia gaIerie API 20 ENTERO
65
Rsultats
Tests Substrats Ractions/Enzymes Ngatif Positif
ONPG O-nitro-phnyl-8-D-galactopyranoside 8-D-galactopyranoside ncolore Jaune ple
jaune vif
LDC Lysine Lysine dcarboxylase Jaune vert gris
bleut
Bleu
bleu-violet
ODC Ornithine Ornithine dcarboxylase Jaune vert
gris-bleut
Bleu
bleu-violet
URE Ure Urase Jaune Rose-violet
CT Citrate de sodium Utilisation Jaune
jaune-vert
Vert bleu
PPA Phnylalanine Phnylalanine dsaminase ncolore Brun/orange
MNT Malonate Utilisation jaune Vert bleu
ESC Esculine 8-glucosidase incolore Gris noir
ARA XYL ADO RHA CEL MEL SAC TRE RAF GLU Arabinose Xylose Adonitol Rhamnose Cellobiose Melibiose Saccharose Trehalose Raffinose Glucose Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Acidification Bleu Bleu Bleu
Bleu Bleu Bleu
Bleu Bleu Bleu
Bleu
Vert
jaune Vert
jaune Vert
jaune Vert
jaune Vert
jaune Vert
jaune Vert
jaune Vert
jaune Vert
jaune Vert
jaune
JAMES/immdiat
ND Tryptophane Vert ple-jaune Rose
VP 1 + VP2 / 5-10 min
VP Pyruvate Vert ple-jaune Rose
OX (voir notice du test
oxydase
(voir notice du test oxydase
VI.2.3. - La micromthode d'identification System Micro CSB entrobactries
La micromthode d'identification Micro CSB Entrobactries est une mthode
miniaturise utilisant une galerie de 20 cupules renfermant chacun un substrat
dshydrat.
La galerie Micro CSB Entrobactries permet de raliser 22 tests biochimiques et de
faire le diagnostic d'espce de la plupart des Entrobactries.
Principe
La technique consiste ensemencer des plaques prsentant des cupules qui
renferment des substrats dshydrats destins la mise en vidence d'activits
enzymatiques ou d'assimilation de substrats carbons.
66
Ces puits sont ensemencs avec un inoculum qui reconstitue le milieu.
Aprs incubation, la lecture des ractions est effectue directement (virage de
l'indicateur color utilis) ou aprs addition de ractifs de rvlation.
L'identification se fait l'aide d'un tableau de lecture.
Mode opratoire
- Prparation de I'inocuIum
Les souches conserves +4C ou 70C dans un bouillon cour-cervelle + 10 %
glycrol sont rgnres dans un bouillon trypticase soja (BTS) 37C pendant 24
heures, avant d'tre repiques sur glose EMB pendant 24 heures 37C.
La suspension bactrienne est prpare en dlayant, les colonies prleves de la
glose avec soin, dans 1,5 ml d'eau distille par couvillonnage.
La turbidit de la suspension bactrienne est ajuste l'chelle 0,5 de l'talon
standard de Mac Farland.
- Ensemencement et incubation
Nous avons distribu 100 l d'inoculum bactrienne par microcupule de LDC
ONPG.
Nous avons ensuite vers le reste de la suspension bactrienne dans 1 ml de
MEVAG Entrobactries et homognis.
Puis nous avons form les cupules LDC, ODC, ADH, URE et tous les sucres avec 2
gouttes d'huile de paraffine.
Les plaques ont t incubes 37C sur un plateau recouvert d'un papier buvard
imbib d'eau.
La lecture se fait 18 24 heures aprs.
- Lecture et interprtation
La lecture des caractres est faite sur une fiche de lecture (cf tableau de lecture).
L'identification de l'espce est rendue possible grce l'utilisation du tableau
d'identification (cf tableau d'identification).
TabIeau XXIII : Lecture pIaques Micro CSB Entrobactries
67
/ Enzymes
Ractifs ajouter Rsultats
positifs
Rsultats
ngatifs
LDC Lysine Lysine
dcarboxylase
Rouge Jaune
dcarboxylase
Rouge Jaune
dihydrolase
Rouge Jaune
URE Ure Urase Rose
framboise
Orange
dihydrolase
Rouge Jaune
dcarboxylase
Rose-rouge Jaune
VP Glucose +
pyruvate
Production
d'actone
1 goutte de
KOH 1goutte de
cratinine 1 goutte de
q-naphtol
Rose-Rouge ncolore
GEL Glatine Glatinase Diffusion du
charbon
inchang
CS Citrate de sodium Utilisation du citrate Bleu Vert
CC Citrate de sodium Utilisation du citrate Rose Jaune clair
H
2
S Thiosulfate de
sodium
Production d'H
2
S Noir ncolore
ND Tryptophane Tryptophanase 1 goutte de Kovacs Anneau
rouge
Anneau
incolore
MAL Malonate de
sodium
Utilisation du
malonate
Bleu Jaune vert
TDA Phnyl-alanine Phnylalanine
dsaminase
1 goutte de
perchlorure de fer
Marron Jaune
ONPG ONPG B-galactosidase Jaune ncolore
LAC Lactose
GLU Glucose
MAN Mannitol
SAC Saccharose
SOR Sorbitol Fermentation Jaune Rouge
RHA Rhamnose
ADO Adonitol
DUL Dulcitol
NO nositol
Chapitre VII - Les mycopIasmes urogenitaux
68
VII.1. - Ractifs
- Bouillon A3
- Bouillon ure
- Bouillon Arginine
- Glose Mycoplasma A7.
VII.2. - Composition des diffrents ractifs
VII.2.1. - BouiIIon A3
- Bouillon PPLO
R
3g
- Srum de cheval 43 ml
- sovitalex 1 ml
- VNC 2 ml
VII.2.2. - BouiIIon PPLO
R
l s'agit d'un milieu dshydrat :
Formule approximative/L
- Peptone de protase n1 1g
- Extrait de bouf 1g
- Digestion de cour de bouf 4g
- Peptone 10g
VII.2.3. - BouiIIon ure
Ractifs Quantits
- Bouillon PPLO
R
3g
- VCN 2 ml
- Ure 1 ml
69
VII.2.4. - BouiIIon arginine
Ractifs Quantits
- Bouillon PPLO
R
3g
- VCN 2 ml
- Arginine 20 % 1 ml
VII.2.5. - GIose MycopIasma A7
Ractifs Quantits
- PPLO Agar Base Mycoplasmol
R
34g
- Extrait de levure 10% 1 ml
- Ure 10 % 1 ml
- Arginine 10 % 0,1 ml
- Glucose 50 % 0,4 ml
- Chlorhydrate de cystine 4 % 0,25 ml
- Pnicilline (500.000 U/ml) 0,25 ml
VII.3. - MthodoIogie
VII.3.1. - Prparation des diffrents miIieux
- Bouillon A3 : milieu de conservation et de transport
- Bouillon Arginine : milieu d'isolement et d'identification de M. hominis
- Bouillon Ure : milieu d'isolement et d'identification et U. urealyticum
- Glose Mycoplasma A7 : milieu d'isolement et d'identification au microscope
optique des mycoplasmes urognitaux dj identifis par le test Micro CSB MYCO.
Chaque milieu est constitu d'un milieu de base et d'un supplment.
VII.3.1.1. - MiIieu de conservation et de transport : BouiIIon A3
70
Milieu de base
- Bouillon PPLO
R
3g
Le mlange est autoclav 120C pendant 15 minutes.
MiIieu compIet
- sovitalex 1 ml
- VCN 2 ml
Au milieu de base autoclav, on ajoute les ractifs homogniss et filtrs pour avoir
le milieu complet.
Le milieu obtenu a t rparti dans des flacons vis sous un volume de 2 ml et
conserv 4C pendant 3 semaines ou 20C pendant 1 an.
VII.3.1.2. - MiIieu d'isoIement et d'identification
>Bouillon Ure
Milieu de base
- Bouillon PPLO 3g
Ajuster le pH 6,1 6,3 puis autoclaver 120C pendant 15 mn.
Laisser refroidir 60C.
Milieu complet
- VCN 2 ml
- Ure 0,05g
Au milieu de base, on ajoute les ractifs homogniss et striliss par filtration, pour
avoir le milieu complet.
Le mlange ainsi constitu a t rparti dans des flacons sous un volume de 2 ml et
conserv +4C pendant 3 semaines ou 20C pendant un an.
>Bouillon Arginine
Milieu de base
71
- Bouillon PPLO
R
3g
Ajuster le pH 6,1 6,3 puis autoclaver 120C pendant 15 mn.
Laisser refroidir 60C.
Milieu complet
- VCN 2 ml
- Arginine 20 % 1 ml
Au milieu de base, on ajoute les ractifs homogniss et striliss par filtration, pour
avoir le milieu complet.
Le mlange ainsi constitu a t rparti dans des flacons sous un volume de 2 ml et
conserv +4C pendant 3 semaines ou 20C pendant un an.
>Glose Mycoplasma A7
Milieu de base
- PPLO Agar Base Mycoplasma 34g
Chauffer le mlange sous agitation frquente et laisser bouillir pendant une minute de
manire dissoudre parfaitement la poudre.
Rpartir ensuite le mlange dans des flacons de 150 ml sous un volume de 80 ml ;
autoclaver 121C pendant 15 minutes.
Milieu complet
- Extrait de levure 10% 1 ml
- Ure 10% 1 ml
- Arginine 10 % 0,1 ml
- Glucose 50 % 0,4 ml
- Chlorhydrate de cystine 4 % 0,25 ml
- Pnicilline 500.000 U/ml 0,25 ml
Mlanger doucement pour viter l'incorporation des bulles d'air.
Rpartir dans des botes de ptri de 4 cm de diamtre de 4 ml par bote ou dans des
botes de 6 cm de diamtre raison de 10 ml par bote. Laisser scher, puis conserver
72
+4C dans des sacs en plastique scells.
VII.3.2. - IsoIement et identification
VII.3.2.1. - RecueiI et traitement des prIvements
L'chantillonnage tait constitu de prlvements d'endocol.
Le prlvement doit s'effectuer par grattage doux au niveau de la muqueuse afin de
recueillir le maximum de cellules auxquelles adhrent les mycoplasmes.
Ces prlvements ont t recueillis chez des patients venant en consultation l'.H.S.
Les couvillons sont dchargs dans 2 ml de transport.
VII.3.2.2. - IsoIement
Ensemencement sur la microplaque
La microplaque utilise dispose de 20 puits :
Chaque prlvement a t inocul dans 4 puits dont :
- 2 pour bouillon Ure
- 2 pour le bouillon Arginine.
Les bouillons ont ensuite t distribus l'aide d'une micropipette raison de 180 l
par puits.
Aprs avoir homognis le contenu du milieu de transport, 20 l ont t inoculs
dans chaque premier puits des diffrents bouillons. Aprs avoir homognis (par
aspiration et refoulement) puis chang d'embout, 20 l du premier puits ont t distribus
dans le deuxime puits.
Les microplaques ont t ensuite recouvertes d'un film adhsif et incubes 37C
sur un support humide (papier buvard imbib d'eau) pour viter la dshydratation du puits.
La lecture a t effectue 24 heures aprs l'incubation ; en cas de culture ngative la
plaque a t rincube 24 heures supplmentaires pour une dernire lecture.
Ensemencement sur milieu solide : glose A7
Aprs avoir agit le milieu de transport A3, une aliquote a t prlev la pipette
Pasteur. La glose pralablement sch 15 minutes 37C a t ensemenc avec 3
gouttes de bouillon (les gouttes tant non confluentes) sans les taler.
La glose ainsi ensemence a t sche 5 minutes l'air ambiante.
La lecture a t effectu au microscope optique l'objectif X10 aprs 2 4 jours
d'incubation en atmosphre anarobique (jarre) ou microarophilique.
VII.2.2.3. - Identification
Sur milieu liquide
73
Principe
Le principe est bas sur le mtabolisme en milieu liquide du substrat prsent dans les
bouillons ure et arginine par les mycoplasmes, lequel mtabolisme est dtect par le
virage de l'indicateur color (rouge de phnol).
Voie de l'arginine dihydrolase
Arginine ATP + NH
3
+ CO
2
Urase
Ure CO
2
+NH
3
L'ammoniac libr va augmenter le pH dans les bouillons entranant ainsi le virage du
milieu du jaune au rouge-orang pour l'ure et au rouge framboise pour l'arginine.
Mycoplasma hominis est identifie en fonction de sa capacit de mtaboliser
l'arginine alors que le mtabolisme de l'ure est caractristique de Ureaplasma
urealyticum.
La croissance des mycoplasmes ne s'accompagne jamais d'un trouble du milieu : ce
qui traduit une croissance bactrienne.
On peut galement observer la croissance des levures qui mtabolisent certains
constituants du milieu en librant des substrats basiques. Cette croissance est reconnue
par un trouble et/ou dpt blanchtre.
Sur miIieu soIide
L'identification sur glose A7 permet de confirmer le diagnostic d'espce effectue
avec la micromthode d'identification Micro CSB Mycoplames.
Le principe est bas sur l'aspect des colonies observes au microscope l'objectif
x40.
Mycoplasma hominis a des colonies d'oufs sur le plat de 100 300 m de diamtre.
Ureaplasma urealyticum a des colonies brunes en oursin de 10 50 m de diamtre.
Sur milieu liquide
Prlvements
J1 Bouillon arginine Bouillon ure
Mtabolisation
Voie de l'arginine Urase
dihydrolase
ATP + NH
3
+ CO
2
CO
2
+ NH
3
pH | pH |
J2 ou J3 Virage du milieu Virage du milieu du jaune
du jaune au rouge framboise au rouge-orang
Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum
74
J4 solement sur glose A7 solement sur glose A7
Chapitre VIII - ContrIe de quaIite et vaIidation
Le contrle de qualit et la validation des diffrentes micromthodes d'identification
repose sur le mme principe.
VIII.1. - Les parametres de contrIe de quaIit
VIII.1.1. - Test de reproductibiIit
Principe
l consiste effectuer le test d'identification Micro CSB des mmes souches de
contrle pour chaque lot de milieux prpars.
Technique
Nous avons prpar trois lots de milieux pour identification par MicroCSB.
Nous avons prpar un inoculum pour chaque souche de contrle.
Nous avons effectu le test d'identification Micro CSB pour chaque souche de
contrle avec les trois lots de milieux dshydrats dans les plaques.
nterprtation et rsultat
Ces souches de contrle doivent prsenter le mme profil biochimique lors de
l'identification Micro CSB pour les trois lots de milieux.
Le test d'identification Micro CSB tait ainsi considr comme reproductible.
VIII.1.2. - Test de rptabiIit
Principe
l consiste tester la micromthode d'identification. Les mmes souches de contrle
avec le mme lots de milieux n fois dans les mmes conditions (par exemple : n = 3).
Technique
Pour chaque souche de contrle nous avons prpar trois inoculum partir des
colonies prleves de la glose au sang.
Nous avons effectu le test d'identification Micro CSB avec le mme lot de milieux
dshydrats pour les trois inoculum de la souche de contrle.
nterprtation et rsultat
La souche de contrle doit prsenter le mme profil biochimique autant de fois que le
test est effectu.
75
Si la faisabilit de la micromthode d'identification est possible dans les mmes
conditions, il est donc rptable.
VIII.1.3. - Conditionnement
A partir du moment o la micromthode d'identification a t contrle, nous avons
prpar une srie de plaques de milieux dshydrats.
Ces plaques sont :
- recouvertes d'un film adhsif ;
- colles sur un support en carton permettant d'identifier le contenu de chaque
cupule ;
- mises sous emballage avec un dshydratant ;
- puis conserves +4C ou 20C pendant un certain temps, en vue d'une utilisation
ultrieure.
VIII.1.4. - ContrIe de quaIit des pIaques prtes I'empIoi
Ces plaques ainsi prtes l'emploi, ont t contrles en faisant un certain nombre de
tests savoir :
- tude de la stabilit
- valuation du temps de ralisation du test Micro CSB.
Etude de Ia stabiIit
Elle consiste dterminer d'une part, le temps au bout duquel les milieux
dshydrats restent efficaces en donnant de bons rsultats lors de l'identification et
d'autre part, les conditions optimales de conditionnement et de conservation des plaques
prts l'emploi.
Pour en arriver la conclusion de la stabilit, il existe trois paramtres tudier :
- le conditionnement dans du plastique hermtiquement ferm ;
- la temprature de conservation qui pourrait tre de +4C et de 20C ;
- le temps de conservation qui a t tudi un mois, deux mois et trois mois.
EvaIuation du temps de raIisation
Principe
Pour rendre la mthode performante, il faut qu'elle soit facilement ralisable, ce qui
permet un gain de temps lors de la manipulation.
Technique
Nous avons chronomtr le temps mis pour raliser trois tests d'identification Micro
CSB Staphylocoques avec trois plaques prts l'emploi.
Interprtation
La dure du test Micro CSB Staphylocoques est gale la moyenne du temps des
76
trois tests pralablement effectus.
T
1
+ T
2
+ T
3
Soit : T = -----------------------
n (n = 3)
avec T = dure test Micro CSB n = nombre de test
T
1
= temps de ralisation du 1
er
test
T
2
me
test
T
3
me
test.
RsuItat
La dure de ralisation du test Micro CSB Staphylocoques est de 3 minutes.
VIII.2. - VaIidation
l s'agit d'une opration permettant d'assurer qu'un rsultat a t obtenu dans des
conditions techniques satisfaisants.
La validation repose sur l'tude de la sensibilit, de la spcificit et de la fiabilit de la
micromthode et sur le thorme de BAYES.
>Etude de la fiabilit
Elle consiste valuer la performance des micromthodes d'identification Micro CSB
en la comparant aux galeries AP.
>Thorme de BAYES
l est bas sur l'quation suivante :
P(R/T)
P(Ti/R) = -----------------------
P(R/Ti)
P(Ti/R) = probabilit pour qu'un micro-organisme prsentant le test R appartienne au
taxon T
P(R/Ti) = probabilit pour les membres du taxon T soient prsents dans le test R.
L'quation de BAYES nous a permis de dterminer la sensibilit et la spcificit des
micromthodes d'identification.
>Etude de la sensibilit
C'est l'aptitude du test Micro CSB identifier une souche de contrle positif pour un
substrat donn, comme tant positif ; et une souche de contrle ngatif pour un autre
substrat comme tant ngatif.
>Etude de la spcificit
La spcificit est l'aptitude par exemple du test de la Micro CSB identifier une
77
souche de S. aureus donn, comme tant S. aureus avec le mme profil biochimique.
78
Troisime partie : RsuItats &
commentaires
Notre tude qui s'est droule au Laboratoire de Bactriologie-Virologie du CHU Le
Dantec de Dakar a port sur le contrle de qualit et la validation des micromthodes
d'identification des souches de Staphylocoques, Streptocoques, Entrobactries et
Mycoplasmes urognitaux.
Chapitre I - StaphyIocoques, streptocoques et
enterobacteries
I.1. - RsuItats sur Ie contrIe de quaIit DES SOUCHES
I.1.1. - Souches testes
L'valuation a port sur des souches de contrle c'est--dire des souches adaptes au
test et destines apprcier l'exactitude et la prcision des rsultats, pour les
Staphylocoques, Streptocoques, Entrobactries et les souches ont t conserves dans
Troisime partie : RsuItats & commentaires
79
un bouillon nutritif +4C.
Nous avons eu tester :
- 5 souches de contrle de Staphylocoques ;
- 8 souches de contrle de Streptocoques ;
- 5 souches de contrle d'Entrobactries.
La rpartition des souches bactriennes est donne par les tableaux XXV, XXV et
XXV.
TabIeau XXIV: Souches de contrIe des staphyIocoques
Souches Nombre
Staphylococcus aureus 1
Staphylococcus aureus 1
S. xylosus 1
S. epidermidis 1
S. cohnii 1
Total 5
TabIeau XXV : Souches de contrIe de Streptocoques
Souches
Genre Espces Nombre
Streptococcus S. pyogenes S. agalactiae CSB
276 S. bovis CSB 172 S. milleri CSB
240 S. mitis ATCC 4021 S. sanguis S.
pneumoniae ATCC 49.619
1 1 1 1 1 1 1
Total 7
ENTEROCOCCUS E. faecalis ATCC 29212 1
Total 8
TabIeau XXVI : Souches de contrIe des entrobactries
Souches
Genre Espces Nombre
Escherichia Shigella Salmonella Enterobacter E. coli S. flexneri S.
typhi S. typhi E.
cloaceae
1 1 1 1 1
Total 5
I.1.2. - Identification
A partir d'une colonie obtenue d'une culture de 24H sur milieu glos au sang (pour les
Staphylocoques et Streptocoques) et milieu glos EMB (Entrobactries), toutes les
80
souches de contrle ont t identifies.
I.1.2.1. - Les StaphyIocoques
> Test la catalase
Souches Catalase
Staphylococcus aureus II +
Staphylococcus aureus +
S. xylosus +
S. epidermidis +
S. cohnii +
Les souches de contrle de staphylocoques sont toutes catalase positive.
> Test AP
R
STAPH
Substrats utiliss
La galerie d'identification AP STAPH comporte 19 substrats dshydrats :
- D-glucose - Raffinose
- D-fructose - Xylose
- D-mannose - Saccharose
- Maltose - q-mthyl-D-glucoside
- D-trhalose - N-actyl-glucosamine
- D-mannitol - Arginine
- Xylitol - Ure
- D-mlibiose - Nitrate de potassium
- 8-naphtyl ac. Phosphate - Pyruvate de sodium
Lecture
La lecture des caractres mtaboliques se fait aprs un dlai de 16 heures. Le
rsultat obtenu la 16
me
heure reste inchang jusqu' 24 heures d'incubation.
Identification
Elle est ralise l'aide du Logiciel d'identification.
Les cinq souches de contrle de Staphylocoques ont donn de bon profil
biochimique.
I.1.2.2. - Les Streptocoques
> Test la catalase
81
Souches Catalase
S. pyogenes S. agalactiae S. bovis
S. milleri S. mitis S. sanguis S.
pneumoniae
- - - - - - -
Enterococcus faecalis -
Les souches de contrle des Streptocoques sont catalase ngative.
> Test AP
STREPTO
Substrats utiliss
La galerie d'identification AP STREPTO comporte 19 substrats dshydrats :
VP Pyruvate
HiP Hippurate
ESC Esculine
PYRA Pyrrolidonyl-2-naphtyl amide
q-GAL 6 Bromo-2-naphtyl q-D-galactopyranoside
8-GUR Naphtol AS-B 8-D-glucuromatoside
8-GAL 2-Naphtyl 8-D-galactopyranoside
PAL 2-naphtyl phosphate
LAP L-leucine-2-naphtylamide
Arginine
Ribose L-arabinose Mannitol Sorbitol Lactose Trhalose nuline Raffinose Amidon
Glycogne
Lecture
La lecture se fait aprs un dlai de 18 heures. Le rsultat obtenu la 18
me
heure
reste inchang jusqu' 24 heures d'incubation.
I.1.2.3. - Les Entrobactries
> Test l'oxydase
Souches Oxydase
Shigella flexneri Salmonella typhi
Salmonella typhi Enterobacter
cloacae E. coli
- - - - -
Les Entrobactries sont oxydase ngative.
> Test AP
20 ENTERO
Substrats utiliss
- ONPG : ortho-nitro-phnyl-B-D-galactopyranoside
- Les acides amins : Arginine, Lysine, Ornithine
82
- Citrate de sodium
- Thiosulfate de sodium
- Ure
- Tryptophane
- VP : pyruvate de sodium
- Glatine de Kokr
- Sucres : glucose, mannitol, inositol, sorbitol, rhamnose, saccharose, mlibiose,
amygdaline, arabinose.
- Nitrate de potassium
- Oxydase : test oxydase
- AP M Medium : Test mobilit
- Glucose (AP of Medium).
Lecture
La lecture se fait aprs un dlai de 18 heures.
Le rsultat obtenu la 18
me
heure reste inchang jusqu' la 24
me
heure.
I.2. - RsuItats sur Ie contrIe de quaIit des micromthodes
d'identification Micro CSB SYSTEM
I.2.1. - Les substrats utiIiss
> Pour les Staphylocoques
La galerie d'identification de la micromthode a comport 15 substrats.
- Les sucres (glucose, trhalose, mannitol, xylose, saccharose, glycrol, mannose,
lactose, raffinose) qui sont associs avec le MEVAG ;
- La recherche de l'urase.
- Les acides amins (ornithine, arginine) qui sont utiliss pour l'tude des
dcarboxylases.
- VP (production d'actone)
- ONPG : recherche de la 8-galactosidase.
- Nitrate de potassium.
> Pour les Streptocoques
- Les sucres : L-arabinose, Mannitol, Sorbitol, Trhalose, Raffinose, Sorbose, nuline,
Lactose, Ribose, Amidon, Glycrol.
- VP : production d'actone
83
- Esculine
- Arginine
- Bouillon hypersal : BHS
> Pour les Entrobactries
- Les sucres : Lactose, Glucose, Mannitol, Saccharose, Sorbitol, Rhamnose, Adonitol,
Dulcitol, nositol.
- Les acides amins (Lysine, Ornithine, Arginine) qui sont utiliss pour l'tude des
dcarboxylases.
- La glatine
- La recherche de l'urase
- VP : production d'actone
- La production SH
2
- La production d'indole
- L'utilisation du malonate
- La phnylalanine.
I.2.1.1. - Dshydratation
Les milieux d'tude ont t dshydrats au four micro-ondes la temprature de 37C
en prsence de dessiccateur. Au bout de 48H, toutes les plaques se trouvaient
dshydrates.
I.2.1.2. - StriIit des miIieux
A chaque lot de milieu nouvellement prpar, la strilit a t contrle. Le milieu tmoin
non ensemenc ne doit normalement pas virer aprs une incubation l'tuve. Tout virage
de ce milieu indique une souillure.
I.2.1.3. - Efficacit des miIieux
Les milieux striles ont t soumis un contrle d'efficacit. Chaque milieu a t test
pour voir sa capacit donner un rsultat positif avec une souche de contrle positif et
donner un rsultat ngatif avec une autre souche de contrle ngatif.
Ce test permet de voir galement si les substrats n'ont pas t dgrads au cours de
la dshydratation.
TabIeau XXVII : Souches de contrIe de I'efficacit des miIieux d'identification pour Ies StaphyIocoques
84
Tests Tmoins positifs Tmoins ngatifs
UREE ADH ODC VP ONPG NTRATE GLUCOSE TREHALOSE MANNTOL XYLOSE SACCHAROSE GLYCEROL MANNOSE LACTOSE RAFFNOSE Staphyloccus
xylosus Streptococcus
pyogenes Proteus
mirabilis Enterococcus
faecalis Staphylococcus
xylosus Staphylococcus
aureus Staphylococcus
aureus Streptococcus
epidermitis Streptotoccus
pneumoniae Staphylococcus
xylosus Staphylococcus
haemolyticus Staphylococcus
pneumoniae Staphylococcus lentus
Staphylococcus
haemolyticus Enterococcus
avium Staphylococcus
pneumoniae Staphylococcus
cohnii Micrococcus sp Micrococcus
sp Staphylococcus
aureus Micrococcus sp Micrococcus
sp Staphylococcus
epidermitis Micrococcus
sp Staphylococcus haemolyticus
TabIeau XXVIII : Souches de contrIe de I'efficacit des miIieux d'identification pour Ies Streptocoques
VP Enterococcus faecalis Streptococcus pneumoniae
Esculine Enterococcus faecalis Streptococcus agalactiae
ADH Streptococcus pyogenes Enterococcus avium
BHS Enterococcus faecalis Streptococcus pyogenes
Arabinose Enterococcus avium Streptococcus pyogenes
Mannitol Streptococcus pneumoniae Micrococcus sp
Sorbitol Enterococcus avium Streptococcus pyogenes
Trhalose Enterococcus faecalis Micrococcus sp
Raffinose Klebsiella sp Streptococcus pyogenes
Sorbose Enterococcus faecalis Enterococcus avium
nuline Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis
Lactose Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis
Ribose Enterococcus faecalis Streptococcus pyogenes
Amidon Enterococcus faecalis Enterococcus avium
Glycrol Enterococcus faecalis Enterococcus avium
TabIeau XXIX : Souches de contrIe de I'efficacit des miIieux d'identification pour Ies Entrobactries
85
LYSNE
LDC ODC ADH URE VP GELATNE CS CC SH2 ND MAL PDA ONPG LACTOSE GLUCOSE MANNTOL SACCHAROSE SORBTOL RHAMNOSE ADONTOL DULCTOL NOSTOL
E. coli Enterobacter
cloacae Enterobacter
cloacae Klebsiella
pneumoniae Klebsiella
pneumoniae Proteus
mirabilis Enterobacter cloacae E.
coli Salmonella typhi E.
coli Klebsiella pneumoniae Proteus
vulgaris E. coli E. coli E. coli E.
coli Shigella flexneri Enterobacter
cloacae E. coli E. coli Klebsiella
pneumoniae Klebsiella pneumoniae
Enterobacter cloacae Klebsiella
pneumoniae E. coli E. coli E. coli E.
coli E. coli Klebsiella pneumoniae E.
coli Klebsiella pneumoniae E. coli E.
coli Shigella flexneri Shigella
flexneri Pseudomonas
aeruginosa Shigella
flexneri Klebsiella
pneumoniae Shigella
flexneri Shigella flexneri Salmonella
typhi E. coli Salmonella typhi
I.2.2. - RsuItats des micromthodes d'identification
I.2.2.1. - Identification
noculum bactrien en fonction des colonies
La concentration en bactrie de l'inoculum permettant une bonne identification
correspond la turbidit de :
- l'chelle 1 de Mac Farland pour les staphylocoques ;
- l'chelle 4 de Mac Farland pour les streptocoques.
- l'chelle 0,5 de Mac Farland pour les entrobactries.
Lecture
Aprs 18h d'incubation, l'identification des souches a t effectue, avec un taux de
concordance donn par les tableaux XXX, XXX et XXX.
A la 24
me
heure, l'identification tait similaire celle obtenue la 18
me
heure.
Nous avons obtenu des profils ininterprtables la 48
me
heure.
TabIeau XXX : RsuItat du profiI biochimique des souches de contrIe des StaphyIocoques
86
Espces Substrats S. aureus II S. aureus III S. epidermidis S. xylosus S. cohnii
URE + + + - +
ADH + + - + -
ODC - - - -- -
VP + + + + +
ONPG - - - - -
NT + + + + +
GLU + + + + +
TRE + + + + +
MAN + + + + +
XYL - - - + -
SAC - + - + -
GLY + + + + +
MNE - - - + -
LAC + + + + +
RAF - - - - -
+ = positif - = ngatif
Par comparaison avec le tableau d'identification des Staphylocoques, l'quation de
BAYES nous a permis de dterminer le pourcentage de concordance des caractres
biochimiques qui est de :
- 99 % pour Staphylococcus aureus
- 99 % pour Staphylococcus aureus
- 98 % pour S. epidermitis
- 99 % pour S. cohnii
- 100 % pour S. xylosus
La lecture des caractres VP et NT se fait 10 mn aprs addition des ractifs de
rvlation.
TabIeau XXXI : RsuItat du profiI biochimique des souches de contrIe des Streptocoques
87
Souches Substrats S.
pyogenes
S.
agalactiae
S. bovis S. mitis S. milleri S.sanguis S.
pneumoniae
S.
faecalis
VP - + + - + - - +
ESC + + + + + + + +
ADH + + - - + - + +
BHS - - - - - + + -
ARA + - - - + - - -
MAN + - + + + + - +
SOR + - + - + + - +
TRE + + + - + - + +
RAF - - + - + + + -
SOS - + - - - - - -
NU - - - - - + + +
LAC + + + - + + + +
RiB NT NT NT NT NT NT NT NT
AMD - - + - + + - -
GLY - + - - - - + -
Par comparaison avec le tableau d'identification des Streptocoques, l'quation de
- 97 % pour S. pyogenes
- 100 % pour S. agalactiae
- 98 % pour S. bovis
- 98 % pour S. mitis
- 97 % pour S. sanguis
- 98 % pour S. pneumoniae
- 97 % pour E. faecalis
La lecture des caractres VP et NT se fait 10 mn aprs addition des ractifs de
rvlation.
TabIeau XXXII : RsuItat du profiI biochimique des souches de contrIe d'Entrobactries
88
Souches Substrats E.coli Salmonella
typhi
Salmonella
typhi
Enterobacter
cloaceae
Shigella
flexneri
LDC + + + + -
ODC + + + + +
ADH - - - + -
URE - - - - -
VP - - - - -
GEL - - - + -
CS - - - + -
CC + - + - -
H2S - + + + -
ND + - - - +
MAL + - - + -
TDA - - - - -
ONPG + - - + -
LAC + - - + -
GLU + + + + +
MAN - + + + +
SAC - + + + +
SOR - + + + +
RHA + + + + +
ADO - - - - -
DUL - - - + -
NO - - - - -
Par comparaison avec le tableau d'identification des Entrobactries, l'quation de
- 99 % pour E. coli ; - 98 % pour Salmonella typhi
- 100 % pour Enterobacter cloacae ; - 98 % pour Shigella flexneri.
I.2.2.2. - ReproductibiIit
Toutes les souches de contrle ont t mise l'essai raison d'un test par 3 lots de
milieux et les rsultats ont montr une bonne reproductibilit.
TabIeau XXXIII : RsuItat du test de reproductibiIit des souches de contrIe des staphyIocoques
89
Souches S. aureus II S. aureus III S. epidermidis S. xylosus S. cohnii
Substrats L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3
URE + + + + + + + + + - - - + + +
ADH + + + + + + - - - + + + - - -
ODC - - - - - - - - - -- - - - - -
VP + + + + + + + + + + + + + + +
ONPG - - - - - - - - - - - - - - -
NT + + + + + + + + + + + + + + +
GLU + + + + + + + + + + + + + + +
TRE + + + + + + + + + + + + + + +
MAN + + + + + + + + + + + + + + +
XYL - - - - - - - - - + + + - - -
SAC - - - + + + - - - + + + - - -
GLY + + + + + + + + + + + + + + +
MNE - - - - - - - - - + + + - - -
LAC + + + + + + + + + + + + + + +
RAF - - - - - - - - - - - - - - -
+ = positif ; - = ngatif ; L = lot
Le profil biochimique est identique avec les trois lots de substrats pour toutes les
souches de contrle ; donc la reproductibilit est totale = 100 %.
TabIeau XXXV : RsuItat du test de reproductibiIit des souches de contrIe d'Entrobactries
90
Souches E.coli Salmonella
typhi
Salmonella
typhi II
Enterobacter
cloacae
Shigella
flexneri
Substrats L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3
LDC + + + + + + + + + + + + - - -
ODC + + + + + + - - - + + + - - -
ADH - - - - - - - - - - - - - - -
URE - - - - - - - - - - - - - - -
VP - - - - - - - - - - - - - - -
GEL - - - - - - - - - + + + - - -
CS - - - - - - - - - + + + - - -
CC + + + - - - + + + - - - - - -
H2S - - - + + + + + + + + + - - -
ND + + + - - - - - - - - - + + +
MAL + + + - - - - - - + + + - - -
TDA - - - - - - - - - - - - - - -
ONPG + + + - - - - - - + + + - - -
LAC + + + - - - - - - + + + - - -
GLU + + + + + + + + + + + + + + +
MAN - - - + + + + + + + + + + + +
SAC - - - + + + + + + + + + + + +
SOR - - - + + + + + + + + + + + +
RHA + + + + + + + + + + + + + + +
ADO - - - - - - - - - - - - - - -
DUL - - - - - - - - - + + + - - -
NO - - - - - - - - - - - - - - -
+ = positif ; - = ngatif ; L = lot
souches de contrle ; donc le test est reproductible.
I.2.2.3. - RptabiIit
Toutes les souches de contrle ont t mises l'essai raison de 3 tests par lot de
milieux et les rsultats ont montr une bonne rptabilit.
TabIeau XXXVI : RsuItat du test de rptabiIit des souches de contrIe des staphyIocoques
91
Souches S. aureus II S. aureus III S. epidermidis S. xylosus S. cohnii
Substrats N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
URE + + + + + + + + + - - - + + +
ADH + + + + + + - - - + + + - - -
ODC - - - - - - - - - -- - - - - -
VP + + + + + + + + + + + + + + +
ONPG - - - - - - - - - - - - - - -
NT + + + + + + + + + + + + + + +
GLU + + + + + + + + + + + + + + +
TRE + + + + + + + + + + + + + + +
MAN + + + + + + + + + + + + + + +
XYL - - - - - - - - - + + + - - -
SAC - - - + + + - - - + + + - - -
GLY + + + + + + + + + + + + + + +
MNE - - - - - - - - - + + + - - -
LAC + + + + + + + + + + + + + + +
RAF - - - - - - - - - - - - - - -
+ = positif ; - = ngatif ; N = numro
souches de contrle ; donc la rptabilit est totale = 100 %.
TabIeau XXXVIII : RsuItat du test de rptabiIit des souches de contrIe d'Entrobactries
92
Souches E.coli Salmonella
typhi I
Salmonella
typhi II
Enterobacter
cloacae
Shigella
flexneri
Substrats N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
LDC + + + + + + + + + + + + - - -
ODC + + + + + + - - - + + + - - -
ADH - - - - - - - - - - - - - - -
URE - - - - - - - - - - - - - - -
VP - - - - - - - - - - - - - - -
GEL - - - - - - - - - + + + - - -
CS - - - - - - - - - + + + - - -
CC + + + - - - + + + - - - - - -
H2S - - - + + + + + + + + + - - -
ND + + + - - - - - - - - - + + +
MAL + + + - - - - - - + + + - - -
TDA - - - - - - - - - - - - - - -
ONPG + + + - - - - - - + + + - - -
LAC + + + - - - - - - + + + - - -
GLU + + + + + + + + + + + + + + +
MAN - - - + + + + + + + + + + + +
SAC - - - + + + + + + + + + + + +
SOR - - - + + + + + + + + + + + +
RHA + + + + + + + + + + + + + + +
ADO - - - - - - - - - - - - - - -
DUL - - - - - - - - - + + + - - -
NO - - - - - - - - - - - - - - -
+ = positif ; - = ngatif ; N = numro
souches de contrle ; donc le test est rptable.
I.2.2.4. - StabiIit des pIaques
Les plaques une fois prpares, ont t conserves +4C ce qui a permis d'avoir une
stabilit relativement bonne aprs prparation.
Plaques Micro CSB Stabilit
Staphylocoques Streptocoques Entrobactries 3 6 mois 3 6 mois 3 6
mois
I.2.2.5 - Dure des tests
Tests Micro CSB Rapidit
d'excution
Temps de
lecture
Staphylocoques Streptocoques Entrobactries 4 mn 4 mn 3 mn 24H 24H 24H
93
I.3. - RsuItats de Ia vaIidation des micromthodesd'identification
Nous avons identifi simultanment toutes les souches de contrle avec les plaques prts
l'emploi des diffrentes Micromthodes et avec les galeries AP correspondantes.
Nous avons obtenu un bon taux de concordance entre les plaques des
micromthodes Micro CSB et les galeries AP correspondant..
Nous avons obtenu 100 % de reproductibilit et de rptabilit pour toutes les
micromthodes d'identification Micro CSB System.
Les micromthodes d'identification Micro CSB System sont donc fiables,
reproductibles, rptables et par consquent valides.
Chapitre II - MycopIasmes urognitaux
II.1 - IsoIats
Dans le cadre de notre tude, nous avons analys 25 prlvements de femmes
(prlvements d'endocol).
Les prlvements des patients provenaient de l'nstitut d'Hygine Sociale (HS).
Les 25 prlvements taient tous considrs comme positifs c'est--dire
responsables d'infection.
II.2 - ContrIe quaIit de Ia micromthode d'identification
II.2.1. - ContrIe des miIieux Iiquides
II.2.1.1. - StriIit
A chaque lot de prparation du milieu d'identification par Micro CSB system et du milieu
d'isolement, la strilit a t contrle. Le milieu tmoin non ensemenc ne doit
normalement pas virer aprs une incubation l'tuve. Tout virage de ce milieu indique
une souillure.
Pour le milieu d'isolement, il ne doit pas y avoir de croissance aprs une incubation
l'tuve.
II.2.1.2. - StabiIit
Les milieux d'identification Micro CSB System Mycoplasmes sont conservs +4C
94
pendant 6 9 mois.
II.2.2. - ContrIe des pIaques
II.2.2.1. - Substrats utiIiss
La galerie d'identification de la micromthode comprend deux (2 substrats) : ure,
arginine. Le milieu d'isolement des prlvements est la glose A7.
II.2.2.2. - Identification
Rsultats de l'identification par Test Micro CSB MYCO
Les 25 prlvements taient tous considrs comme positifs ; nous avons obtenu :
- Ureaplasma urealyticum seul dans 14 prlvements ;
- Mycoplasma hominis seul dans 3 prlvements ;
- Ureaplasma urealyticum et Mycoplasma hominis dans 8 prlvements.
Nature des
prlvements
Nombre de
prlvements
Mycoplasma
hominis
Ureaplasma
urealyticum
Mh/Uu Total des
positifs
Endocol 25 3 14 8 25
Uu = Ureaplasma urealyticum ; Mh = Mycoplasma hominis
Rsultats des isolats en fonction de la culture
Tous les 25 prlvements ont t ensemencs sur Glose A7. Ainsi :
les 22 prlvements positifs avec Micro CSB System Mycoplasmes l'ure, nous
avons obtenu :
- 16 prlvements avec des colonies brunes en forme d'oursin et de petite taille de 10
50 m ;
- 6 prlvements o nous n'avons pas eu de colonies.
Sur les 11 prlvements positifs avec Micro CSB System l'arginine, nous avons
obtenu :
- 7 prlvements avec des colonies en forme d'ouf sur le plat de 100 -300 m.
- 4 prlvements ngatifs.
Parmi les rsultats ci-dessus, nous avons obtenu 6 prlvements avec des rsultats
mixtes.
La confirmation d'une culture positive se fait par repiquage sur milieu solide (Glose
A
7
) avec observation au microscope l'objectif X10 d'une colonie caractristique pour
chaque espce.
Mais nous pouvons observer des cas particuliers :
Croissance en glose sans virage du bouillon. Ce cas est observ avec des
95
mycoplasmes de faible activit enzymatique.
Virage du bouillon sans croissance en glose. Dans ce cas, nous pouvons avoir 3
causes diffrentes :
- souches inadaptes la croissance en glose ;
- contamination bactrienne ou fongique ;
- Mycoplasmes prsents un titre infrapathologique c'est--dire <10
3
UCC/ml.
TabIeau XXXIX : TabIeau d'identification et isoIement
Rsultats Mycoplasma hominis Ureaplasma
urealyticum
Ngatif
Bouillon : Couleur et
caractre biochimique
correspondant
Rouge
framboise = Arginine
+
Rouge
orange = Ure ++
Jaune
orange = Absence de
culture
Glose : Aspect des
colonies
Colonies en ouf sur
le plat de 100-300
Colonies en ouf
sur le plat de 10-50
Absence de culture
II.2.2.3. - ReproductibiIit
Tous les 25 prlvements ont t mis l'essai raison d'un test par trois lots de milieux
et les rsultats ont montr une bonne reproductibilit.
II.2.2.4. - RptabiIit
Tous les prlvements ont t mis l'essai raison de trois tests par lot de milieux et les
rsultats ont montr une bonne rptabilit.
II.2.2.5. - Dure du test
Le test MCROCSB Mycoplasma est ralis en une minute et la lecture est effectue au
bout de 24 48 heures.
II.3 - RsuItats de Ia vaIidation de Ia micromthode 'identification
La validation repose sur la reproductibilit et la rptabilit du test. Nous avons obtenu
100 % de reproductibilit et de rptabilit.
Le test Micro CSB MYCOPLASMA est fidle, donc valide.
96
Quatrime partie : Discussion
Le but de notre travail tait de faire un contrle de qualit et une validation de
micromthodes dìdentification de bactries .
Elle a port sur quatre groupes de bactries :
- les Staphylocoques ;
- les Streptocoques ;
- les Entrobactries ;
- les Mycoplasmes urognitaux.
Ceci nous a permis outrement de comparer notre travail avec d'autres mthodes qui ont
t dcrites dans la littrature. Cette comparaison sera un moyen de jauger les capacits
des diffrentes micromthodes.
Chapitre I - Les souches testes
Les souches qui ont t utilises, sont des souches de contrle du Laboratoire de
Bactriologie-Virologie du CHU A. Le Dantec. Une souche de contrle est une souche
adapte la mthode utilise et destine apprcier l'exactitude et la prcision des
rsultats.
97
I.1. - Identification des souches de staphyIocoques et de
streptocoques
Nous avons d'abord eu recours au test de catalase qui nous a permis de faire le
diagnostic de genre diffrentiel entre les Staphylocoques et les Streptocoques Ensuite
nous avons procd l'identification d'espces par le test AP STAPH pour les souches
de Staphylocoques et le AP STREP pour les souches de Streptocoques. Les tests du
System AP sont des rfrences mondiales en micromthodes d'identification.
I.2. - Identification des souches d'entrobactries
Si pour les souches Staphylocoques et Streptocoques, le test la catalase permet
d'identifier le genre, c'est le test lòxydase qui permet d'identifier avec certitude les
diffrentes genres d'Entrobactries. ci aussi le diagnostic d'espce est tabli grce au
test AP 20 ENTERO qui utilise l'tude des caractres biochimiques des souches de
contrles des entrobactries.
I.3. - Identification des mycopIasmes urognitaux
Contrairement aux Staphylocoques, Streptocoques et Entrobactries, nous avons utilis
pour les Mycoplasmes urognitaux des isolats contrls positifs provenant de l'HS
(nstitut d`Hygine Sociale) de Dakar.
Chapitre II - Ies micromthodes d'identification des
bactries
Les micromthodes d'identification Micro CSB SYSTEM des bactries (Staphylocoques,
Streptocoques, Entrobactries, Mycoplasmes urognitaux) sont adaptes la routine et
offrent plusieurs avantages parmi lesquels la scurit d'identification des espces
bactriennes.
L'identification bactrienne constitue une tape importante dans le diagnostic d'une
maladie infectieuse. Les supports des substrats utiliss sont miniaturiss, se prsentant
en plaques de 20 cupules. Le nombre de tests ou substrats varie de :
-15 pour la Micro CSB Staphylocoques ;
- 15 pour la Micro CSB Streptocoques;
- 22 pour la Micro CSB Entrobactries ;
- 2 pour la Micro CSB Mycoplasmes.
98
Plusieurs phases dans l'identification peuvent tre distingues, depuis la glose
d'isolement jusqu' l'impression des rsultats.
Les deux phases initiales sont la prparation de l'inoculum et sa distribution.
L'inoculum bactrien constitue un lment important dans l'identification biochimique; une
forte concentration de l'inoculum entrane un puisement rapide et une faible
concentration entrane un temps de virage trs long de l'indicateur color. La densit
bactrienne correspondant l'inoculum de dpart est talonne vis--vis d'une gamme de
Mac Farland. Elle ncessite une ou plusieurs colonies selon la taille de l'inoculum exige
par la technique.
C'est ainsi que pour :
- la Micro CSB Staphylocoque, la turbidit de l'inoculum est ajuste l'chelle 1 de
Mac-Farland ;
- la Micro CSB Streptocoque, elle est ajuste l'chelle 4 de Mac-Farland ;
- la Micro CSB Entrobactries, l'chelle 0,5 de Mac-Farland ;
- la qualit de la glose de base est galement importante pour l'expression des
caractres biochimiques.
Aprs l'inoculation, notons qu'il est souvent ncessaire de recouvrir certains tests
avec de l'huile de paraffine.
La temprature gnrale dìncubation est comprise entre 35 et 37C. Une fois
ensemencs, les supports sont incubs l`tuve, dans un plateau humidifi afin d'viter
la dshydratation. La dure dìncubation est variable selon la micromhode, les espces
identifier et la taille de l'inoculum.
Elle est visuelle (avec ou non adjonction pralable de ractif) et se fait l'aide d'un
tableau de lecture.
A ct de ces micromthodes d'identification miniaturises, nous avons des
systmes automatiques d'identification bactrienne commercialiss sur le march.
C'est ainsi qu'en France, deux firmes commercialisent ces automates (41), il s'agit de
:
- la socit Bio-Mrieux qui commercialise le mini AP et le Vitek qui possde deux
modles Vitek 32 et Vitek 2 ;
- la socit Dade Behring qui commercialise la gamme MicroScan et le Walk Away.
Deux types d'automates existent chez chacun des deux firmes :
- des systmes semi-automates (mini AP et AutoScan4) o les supports sont
ensemencs manuellement, incubs classiquement et disposs secondairement dans
làppareil de lecture spcifique. La lecture et l'impression des rsultats sont
automatiques ;
- des systmes automatiques avec tuve intgre grant toutes les tapes, de
l'incubation au rendu des rsultats. Seule la prparation de l'inoculum est manuelle. Sa
distribution est automatique pour l'un (Vitek), manuelle pour l'autre (Walk Away )
99
Les supports des substrats d'identification sont diffrentes selon les automates :
- galeries pour le mini AP ;
- plaques pour le systme MicroScan ;
- cartes pour le Vitek.
Le nombre de cupules ou puits varie de 32 (mini AP) 96 (MicroScan) en passant par 45
et 64 (Vitek 32 et Vitek 2).
Les galeries du mini AP concernent soit l'ensemble des bacilles Gram ngatifs
arobies (D32GN), soit les Entrobactries (D32E et Rapid D 32E), soit les
Streptocoques (Rapid D 32 Strep), soit les Staphylocoques (D 32 Staph).
Les plaques ou cartes des MicroScan et Vitek possdent des supports pour
l'identification des bactries Gram positifs arobies ou des bacilles Gram ngatif.
Le nombre total de tests varie pour le systme mini AP de :
- 26 pour D 32 STAPH ;
- 32 pou Rapid D 32 STREP ;
- 32 pour D 32 GN ;
- 32 pour D 32 E ;
- 30 pour Rapid D 32 E.
Une tude sur les identifications des bactries a t ralise par COLY(17) qui identifie
avec la plaque Micro CSB system 90,5 % des 243 souches testes dont 5,8 %
demandent des tests complmentaires et 3,7 % sont non identifies.
Freney et collaborateurs (35) avec la galerie Rapid D 32 STREP identifie 95,3 % des
433 espces testes dont 25,1 % demandent des tests complmentaires (S. sanguis, S.
oralis , S. mitis, et S. pneumoniae ); 3,7 % sont non identifis .
Bannerman et collaborateurs (7) identifient les staphylocoques coagulase ngative
avec les cartes Vitek GP : 92 % des S .epidermitis, 95 % des S. haemolyticus, 100 % de
S. saprophyticus mais seulement 63 % S. hominis sont correctement identifies .
Bassel et collaborateurs (8) prsentant les rsultats de l'essai de la plaque Rapid du
Vitek 2 trouvent respectivement 86,3 % et 84,3 % d'identification sans tests
supplmentaires pour des souches de Micrococacceae et Streptococacceae isoles
frachement aux USA et en France .
Freney et collaborateurs (36) tudient 41 souches d'entrobactries avec les galeries
Rapid D 32 E en 4 heures. ls observent seulement 2,4 % d'absence d'identification .
York et collaborateurs (77) trouvent, quant eux, 96,4 % d'identification correcte pour
400 bactries fermentatives Gram ngatif avec l'autoscan W/A.
Colonna et collaborateurs (16) comparent trois systmes dont AutoScan W/A et Vitek
pour identifier 358 entrobactries. ls trouvent que Vitek avec 94,7 % d'identification
correcte devance AutoScan W/A avec 83 %.
100
Ainsi, mme si les systmes automatiques d'identification prsentent un taux
d'identification gal ou suprieur aux micromthodes Micro CSB System et une trs
bonne rapidit d'identification avec des temps de lecture trs faibles, il n'en demeure pas
moins que ce sont des mthodes peu utilises dans les pays en voie de dveloppement,
cause du cot lev des appareils.
C'est ce niveau que les microplaques d'identification des techniques Micro CSB
System ont un intrt majeur car tant simples et peu onreuses.
l s'agit de mthodes aussi fiables que les systmes automatiques d'identification
Chapitre III - ContrIe de quaIit
La miniaturisation, si elle apporte aux biologistes un moyen rapide d'identification,
n'empche nullement de contrler les rsultats
Pour contrler les diffrentes micromthodes d'identification, nous avons travaill sur
des paramtres tels que :
- la strilit,
- l'efficacit,
- la reproductibilit,
-la rptabilit,
- la stabilit,
- la dure.
Nous avons test 18 souches de contrles (5 souches de Staphylocoques, 8 souches de
Streptocoques, 5 souches d'Entrobactries) et 25 isolats de contrle de mycoplasmes
urognitaux.
Le contrle doit s'effectuer chaque tape du travail.
Elle est totale pour tous les milieux liquides et dshydrats.
Le contrle d'efficacit des tests, ralis en comparaison avec les galeries AP, a
donn les rsultats suivants; pour les contrles positifs :
- 95,3 % de concordance pour les Staphylocoques ;
- 89,9 %de concordance pour les Streptocoques ;
- 90,1% de concordance pour les Entrobactries.
Les contrles ngatifs ont donn 100 % de concordance dans tous les tests.
Les disconcordances observes sont inhrentes la sensibilit de certains substrats
: VP, Esculine, BHS.
Les tests de reproductibilit et de rptabilit ont donn des rsultats identiques avec
101
les souches de contrles.
Elle est trs bonne, les plaques conditionnes peuvent tre conserves pendant 3 6
mois au frais et au sec sans aucune altration.
Elle varie selon les micromthodes, ainsi pour les micromthodes Micro CSB STAPH
et Micro CSB STREPTO elle est de 4 minutes ; pour Micro CSB ENTERO de 3 minutes et
d'une minute pour Micro CSB MYCO.
Chapitre IV - La vaIidation
La validation est une opration permettant de s'assurer qu'un rsultat a t obtenu dans
des conditions techniques satisfaisantes.
Pour valider les micromthodes d'identification, nous avons tudi entre autres
paramtres la sensibilit, la spcificit, la fiabilit.
102
ConcIusion
Les infections bactriennes dues aux Staphylocoques, Streptocoques, Entrobactries et
Mycoplasmes urognitaux, si diverses dans leurs manifestations cliniques, sont parmi les
plus frquentes.
Le diagnostic microbiologique et le traitement de ces infections imposent
lìdentification correcte de làgent tiologique en vue d'une bonne prise en charge
thrapeutique.
Cèst dans cette optique que nous avons entrepris un contrle de qualit et une
validation des micromthodes d'identification Micro CSB utilises au Laboratoire de
Bactriologie-Virologie de l'Hpital Aristide Le Dantec.
l s'agit de mthodes miniaturises, standardises permettant la mise en vidence
dàctivits enzymatiques et de fermentation de sucres chez les bactries. Les
micromthodes Micro CSB mettent en oeuvre des tests biochimiques (substrats
dshydrats) destins l'identification de la plupart des Staphylocoques, Streptocoques,
Entrobactries, Mycoplasmes urognitaux isols lors du diagnostic bactriologique des
infections humaines.
La procdure de contrle de qualit et validation que nous avons utilise tout au long
de cette tude reprsente le travail minimum devant tre ralis dans un laboratoire afin
de garantir un rsultat fiable rpondant d'une part, aux normes scientifiques et d'autre
part, aux exigences financires de nos laboratoires.
Ainsi pour une meilleure apprciation des paramtres de contrle de qualit et de
ConcIusion
103
validation, il nous a sembl intressant d'tudier l'activit de ces tests biochimiques
(substrats dshydrats) sur des souches de contrle.
Nous avons eu tester :
5 souches de contrle de Staphylocoques pour la micromthode dìdentification Micro
CSB Staphylocoques qui utilise 15 tests biochimiques ;
8 souches de contrle de Streptocoques pour la micromthode dìdentification Micro
CSB Streptocoques qui utilise 15 tests biochimiques ;
5 souches de contrle dèntrobactries pour la micromthode dìdentification Micro
CSB Entrobactries qui utilise 22 tests biochimiques ;
25 isolats de contrle de mycoplasmes urognitaux pour la micromthode
dìdentification Micro CSB Mycoplasmes qui utilise 2 tests biochimiques.
Toutes les normes d'assurance interne de qualit ont t respectes durant toutes les
tapes de nos manipulations. Pour cela, nous avons contrl les matriels et appareils
utiliss, les milieux de culture, les ractifs et les souches de contrle (identification
morphologique et biochimique par les tests AP).
Les rsultats des tests de strilit et d'efficacit rvlent que les substrats
dshydrats sont striles, efficaces et permettent une identification du profil biochimique
: 98% pour les Staphylocoques ; 97% pour les Streptocoques ; 99% pour les
Entrobactries et 100% pour les Mycoplasmes
Les tests de reproductibilit et de rptabilit ont t de 100 % pour toutes les
micromthodes d'identification Micro CSB.
Les substrats dshydrats, contrairement aux milieux liquides, donnent une meilleure
stabilit (entre 3 et 6 mois).
Le conditionnement de la microplaque se fait avec des emballages en plastique.
Pour la validation des tests, nous avons tudi les critres de fiabilit, de sensibilit et
de spcificit avec le thorme de Bayes.
En conclusion, les diffrentes micromthodes d'identification des bactries utilises
au Laboratoire de Bactriologie-Virologie du CHU Aristide Le Dantec sont des mthodes
fiables, valides et superposables aux galeries AP (rfrence mondiale en micromthodes
d'identification).
De par leur cot peu onreux, ces tests permettent une bonne prise en charge du
diagnostic microbiologique dans nos pays en voie de dveloppement.
104
BIBLIOGRAPHIE
AFNOR.-
Grer et assurer la qualit
AFNOR, Paris, 1995.
ALOUF J.-
Les toxines staphylococciques et streptococciques immunocytotropes et
inductrices de choc.
Ann. Institut Pasteur / Actualits, 1990, 1 : 262-267.
API 20E.-
Systme didentification des entrobactries et autres bacilles Gram
Ngatif.
Biomrieux S.A.
AVRIL J.L., DABENAT H., DENIS F., MONTEIL H.-
Bactriologie clinique.
Edition Marketing, Paris, 1988 : 49-52.
AVRIL J.L., DABENAT H., DENIS F., MONTEIL H.-
Mycoplasma - Ureaplasma
Bactriologie clinique.
BIBLIOGRAPHIE
105
Edition Ellipses, Paris, 1988, 39 : 481-491.
AVRIL J.L., PLAISANCE J.-
Caractres culturaux et biochimiques des streptocoques.
Sensibilit aux antibiotiques.
Md. Mal. Infect., 1980, 10 : 627-632.
BANNERMAN T.L., KLEEMAN K.T., and KLOSS W.E.-
Evaluation of the Vitek System Gram positive identification card for
species identification of coagulase negative staphylococci.
J. Clin. Microbiol., 1993, 31 (5) : 1322-1325.
BASSEL, MAKKAR A.R., REINER D., BALZER J.L. and PINCUS D.-
Rapid automated identification of Gram positive cocci will the vilek O
2
system.
Clin. Microbiol. Inf., 1997, 3 (suppl. 2) : 53.
BEBEAR C.-
Les infections mycoplasmes urognitaux.
Rev. Europ. Dermatol. MST,1990, 2 : 7-14.
BEBEAR C., LATRILLE J.-
Mycoplasmes
Dans : Bactriologie Mdicale Lon-Le-Minor, ed. Flammarion, Paris,
1990 : 1088-1097.
BOCOUM M.-
Lassurance de la qualit en microbiologie. Applications dans le
diagnostic bactriologique des infections respiratoires basses, aigus
Dakar.
Thse Pharm., Dakar, 2001, n119 : 20-28.
BONISSOL CH.-
Biologie des Mycoplasmes
Bull. Mm. Soc. Md., Paris, Tome III, n6.
BONNES PRATIQUES DE FABRICATION DES PRODUITS PHARMACEUTIQUES.-
In : Comit OMS dexperts des spcifications relatives aux prparations
pharmaceutiques.
32
me
rapport Organisation Mondiale de la Sant, Genve, 1992, Srie de
Rapports Techniques, n823, Annexe 1.
BONNES PRATIQUES DE FABRICATION DES PRODUITS PHARMACEUTIQUES.-
In : Comit OMS dexperts des spcifications relatives aux prparations
pharmaceutiques.
42
me
rapport Organisation Mondiale de la Sant, Genve, 1992, Srie de
106
Rapports Techniques, n822.
BRUN Y. et BES M.-
Mthodes diagnostiques des staphylocoques coagulase ngatifs.
Md. Mal. Inf., 1990, Hors srie, Mars : 16-23.
COLONNA P., NIKOLAI D. and BRUCKNER D.-
Comparison of Microscan auto SCAN-W/A and Vitek systemsfor rapid
identification of Gram negative bacilli.
American Society for Microbiology, Washington DC, 1990, Abstr. C157.
COLY I.-
Micromthode didentification biochimique des bactries.
Mmoire, Sciences, 1999.
COPIN E., LEBRUN L.-
Infections Mycoplasmes urognitaux.
Feuill. Biol., 1991, 181 : 9-15.
CORREA P., DAVID A.P., CHIRON J.P.-
Recherche des streptocoques hmolytiques chez les femmes enceintes et
les nouveau-ns Dakar.
Md., 1979, 24 : 186-187.
DENIS F., SAMBA A., CHIRON J.P., DIOP MAR I.-
Infections streptocoques en Afrique vues par les Laboratoires.
Bull. Soc. Med. Afr., 1978, 23 : 347-350.
DETOLLE S.-
Contribution linterprtation dun contrle de qualit des mdicaments.
Mmoire pour le Concours du Prix de lInternat en Pharmacie des
Hpitaux de Paris, 1998 : 15-17.
DIENE S.L., ESDALL G.-
Observation on the L-organisms of organisms of Klieneberger.
Pror. Soc. Exp. Biol. Med., 1937, 56 : 740-744.
Thse Pharm., Dakar,1998, n54.
DIOP A.-
Validation de mthodes de contrle microbiologique de diffrents
mdicaments antiseptiques.
DRAME B.-
Micromthodes didentification et dtude de la sensibilit des
entrobactries intrts thrapeutiques et diagnostiques.
Thse Pharm., Dakar,2001, n86 : 4-8.
BIBLIOGRAPHIE
107
ELSA I.-
Lassurance de la qualit dans un laboratoire officiel de contrle des
mdicaments.
Thse Pharm., Marseille, 1999, n28.
EDWARDS P.R., EWING W.H.-
Identification of Enterobacteriaceae, 1972, 3rd ed., Burgess, Minneapolis.
ENCYCLOPEDIE MEDICALE DE LA FAMILLE.-
Larousse, Slection du Readers Digest, 1991.
ESKA.-
Prcis de Bactriologie Clinique.
2000, 40 : 806p.
FARMER.-
Biochemical identification of new species and biogroup of
Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens.
J. Clin. Microbiol., 1985, 21 : 46-76.
FARMER.-
Enterobacteriaceae : Introduction and identification.
In : Manual of Clinical Microbiology, P.R. Murray, E.J. Baron,
M.A. Pfatter, Tenoven F.C. and R.H. Yolken (eds), 7
th
ed.
American Society for Microbiology, Washington D.C., 1999 : 442-458.
FERRON A.-
Bactriologie mdicale.
Editions C et R., 1994, 15
me
d.
FLEURETTE J.-
Staphylocoques et microcoques.
Bactriologie Mdicale
Flam. Md. Science, Paris, 1
er
d., 1982.
FLEURETTE J.-
Taxonomie et cologie des staphylocoques.
Md. Mal. Inf., 1990.
FOURNIER J.M.-
S. aureus.
In Cryz. S. J. Jr., Vaccines and Immunothrapy.
Pergamon Presse, 1991 : 166-177.
FRENEY J., BLAND S., ETIENNE S., DESMONCEAUX M., BOEUFGRAS J.M. and
FLEURETTE J.-
Description and evaluation of semi-automated 4 hours rapid ID32 Strep
108
method for identification of Streptococci and members of related
genera.
J. Clin. Microbiol., 1992, 30 : 2657-2661.
FRENEY J., C. HERVE, DESMONCEAUX M., ALLARD F., BOEUFGRAS J.M.,
MONGET D. and FLEURETTE J.-
Description and evaluation of semi-automated ATB 32E for identification
method for identification of Enterobacteriaceae.
J. Clin. Microbiol., 1991, 29: 138-141.
GAUDIN O.G.-
Infections humaines mycoplasmes.
Encycl. Med. Chir., Paris-France, Mal. Infect., 1989, 8039V, 9 : 1-6.
HORODNICCANU T., DELBOS F., CHABBERT Y.A.-
Souches des streptocoques isoles et sensibilit aux antibiotiques.
Ann. Microbiol., Institut Pasteur, 1977 : 205-206.
HOUNKPONOU E.-
Etude compare de lidentification et de la sensibilit de Streptococcus
pneumoniae et Streptococcus pyogenes isols dinfections humaines
(Donnes prospectives Dakar).
JACQUES C.
Les systmes automatiques didentification bactrienne.
Prcis de Bactriologie Clinique, 2000, 6, 147p.
JANDA J.M. and ABBOTT S.L.-
Historical perspectives on the family Enterobacteriacaea.
In : The Enterobacteria, Lippincott Raven Publishers, Philadelphia,
1998 : 1-7.
JURAN J.M.-
Gestion de la qualit.
AFNOR, Paris, 1983.
KISKA D.L.-
Staphylococcal and streptococal toxic shock syndrome.
Clin. Microbiol.Newsl., 1997, 19 : 33-40
KLESPIES S.L., BOORD S.L. and SWEIJK-JONES S.-
Catalase negative Staphylococcus aureus.
Clin. Microbiol. Newsl., 1996, 18 : 126-127.
KLOSS W.E. and LAMBE Jr.D.W.-
Staphylococcus.
BIBLIOGRAPHIE
109
In Manual of Clinical Microbiology, 4
th
ed.
Am. Soc. for Microbiol., 1981 : 222-235.
KLOSS W.E. and WOLFSHOA L.J.F.-
Identification of Staphylococcus with API Staph
J. Clin. Microbiol., 1982, 16 (3) : 503-516.
KLOSS W.E. and BANNERMAN T.L.-
Staphylococcus and Micrococcus
In P.R. Murray, E.J. Barron, M. Pfaller, F.C. Tenover and R.H. Yolken
(eds).
Manual of Clinical Microbiology, Washington, 1995, 6
th
ed., ASM Press
: 282-298.
KONATE B.-
Micromthodes didentification et dtude de la sensibilit des
staphylocoques, entrocoques et streptocoques. Intrt et application dans
le diagnostic rapide des infections microbiennes.
KONATE D.-
Standardisation, optimisation et valuation dune micromthode dtude
de la sensibilit des mycoplasmes urognitaux.
KONEMAN E.W., ALLEN S.D., JANDA W.M., SCHREC-KENBERGER P.C. and WINN
W.C.-
Color atlas and texbook of diagnostic microbiology, 1997, 5
th
ed.,
Lippincott, Philadelphia.
LE MINOR L., VERON N.-
Bactriologie Mdicale
Flam. Md. Science, Paris, 1989 : 333-318 ; 773-823.
LEMOZY J. et C. SUC.-
Actualits sur les streptocoques et entrocoques. Donnes taxonomiques
et identification.
Feuillets de Biologie, 1997 : 15-22.
MACONDO E.A.-
Mise au point et mthode didentification des Mycoplames.
DEA de Chimie et de Biochimie, Dakar, 1995.
MARA M.-
Etude des maladies streptococciques en Afrique Occidentale.
Thse Md., Dakar, 1973, n26.
110
MARCHAL N., BOURDON J.L., RICHARD C.L.-
Milieux de culture pour lisolement et lidentification biochimique des
bactries.
Doin diteurs, 1987.
MARCHOU B., LEMOZY J.-
Infections streptocoques (Streptococcus pneumoniae exclu).
Editions Techniques Encycl. Md. Chir., (Paris-France), Maladies
Infectieuses Pdiatrie, 8-009A-10 et 4-250-A-20, 1993, 20p.
MARE L.-
Contribution lassurance de la qualit dans un laboratoire danalyse : cas
du laboratoire de Chimie Analytique et Toxicologie de la Facult de
Mdecine et de Pharmacie.
NDIAYE M.L.-
Validation de mthodes de contrle microbiologique de diffrents
mdicaments antibiotiques.
Thse Pharm., Dakar, 2003, n54 : 23.
NDOUR M.A. NG.-
Les mycoplasmes dans les infections urognitales de la femme Dakar :
rsultats prliminaires.
Thse Pharm., Dakar,1988, n57.
NOVICK R.P.-
Staphylococci.
In Microbiology, 4th ed., 1990 : 539-560.
PAPIEROK G., PAUTRAT G., ESCARGUE L.C.-
Les mycoplasmes : leur place en microbiologie.
Revue Franaise des Labo., 1992, n244.
PHARMACOPEE INTERNATIONALE.-
Normes de Qualit.
OMS, 1988, 3me d. Vol. 3 : 17, 134, 161.
PILET C., BOURDON J.L., TOMA B., MARCHAL N.-
Famille des Mycoplasmataceae.
Bactriologie Mdicale et Vtrinaire, 1987 : 353-359.
POTEL G., BARON D.-
Infections staphylocoques.
EMS, Mal. Infect. 8001 A10, 1990 : 18p.
NEYRET C., LELIEVRE H., LINA G., VANDENESCH F. and ETIENNE J.-
BIBLIOGRAPHIE
111
Evaluation of a commercial test kit for rapid detection of S. aureus in
blood cultures.
Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1997, 16 : 15-166.
RUOFF K.L.-
Streptococcus.
In : PP Murray, E.Y. Barron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover and R.H. Yolken
(eds) Manual of Clinical Microbiology, 6
th
ed.
Am. Soc. for Microbiol., Washington, 1995 : 299-307.
SCHLEGEL L., BOUVET A.-
Streptocoques et genres apparents.
Bull. Soc. for Microbiol., 1998.
STAGER C.E. and DAVIS J.R.-
Automated systems for identification of microorganisms.
Clin. Microbiol. Rev., 1992, 5 : 302-327.
TAYLOR D., ROBINSON.-
Infections due to species of Mycoplasma and Ureaplasma : an update.
Clinical Infections diseases, 1996, 23 : 671-684.
THOUVENOT D., BOSSHARD S.-
Les Mycoplasmes
Manuel de Bactriologie Clinique, 1992, 2 : 1205-1218.
VANDAMME P., POT E., FALSEN E., KERSTERS K. and DEVRIESE L.A.-
Taxonomic studies of lancefield streptococcal group C, G and L
(Streptococcus dysgalactiae) and proposal of S. Dysgalactiae subsp. Equi
similis subsp.
Nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46 : 774-781.
VASSAULT A., DUMONT G., LABBE D.-
Dfinition des critres de qualit dune mthode danalyse.
Le Moniteur Internat, 1992, 26 . 30-33.
VASSAULT A., MOLLARD J.F., NAUDIN C., DUMONT G., AZZEDINE M.C., BAILLY M.
et coll.-
Dfinition et description dune technique de validation (document C).
Ann. Biol. Clin., 1986, 44 . 746-55.
VASSAULT A., GRAFMEYER D., NAUDIN C., DUMONT G., BAILLY M., HENRY J.,
GERHARDT M.F., GEORGES P. et coll.-
Protocole de validation de techniques (document B).
Ann. Biol. Clin., 1986, 44 . 686-745.
VASSAULT A., MOLLARD J.F., NAUDIN C., DUMONT G., AZZEDINE M.C., BAILLY M.
112
et coll.-
Dictionnaire des termes lusage de la validation des techniques
(glossaire) (document A).
Ann. Biol. Clin., 1986, 44 . 679-685.
WEINSTEIN M.P., MIRRETT S., VAN PETT L., Mc KONNON M., ZIMMER B.L.,
KLOSS W. and RELLER L.B.-
Clinical importance of identifying coagulase negative staphylococci
isolated from blood cultures : evaluation of Microscan rapid and dried
overnight gram positive panals versus a conventional reference method.
J. Clin. Microbiol., 1998, 36 : 2089-2092.
YORK M.K., BROOKS G.F. and FISS E.H.-
Evaluation of the autoscan-W/A rapid system for identification and
susceptibility testing of Gram negative fermentative bacilli.
J. Clin. Microbiol., 1992, 30 : 2903-2910.
BIBLIOGRAPHIE
113

Bakhoum Iphigenie

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Bakhoum Iphigenie

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

UNVERSTE CHEKH ANTA DOP DE DAKAR

FACULTE DE MEDECNE, DE PHARMACE ET D'ODONTO-STOMATOLOGE

20E est un systme qui permet de faire le diagnostic d'espces des

20E comporte 20 microtubes contenant des substrats dshydrats.

Vous aimerez peut-être aussi