Vous êtes sur la page 1sur 522

BACTERIOLOGIE CLINIQUE

Nous tenons remercier les laboratoires LEDERL, qui pour cette nouvelle dition, comme pour la prcdente, ont contribu la diffusion de cet ouvrage.

BACTERIOLOGIE CLINIQUE
^>P^153^ EXCLUS DU PRT

Professeur JEAN LOUP AVRIL C.H.U. Rennes

Professeur HENRY DABERNAT


C.H.U. Toulouse

Professeur FRANOIS DENIS


C.H.U. Limoges

Professeur HENRI MONTEIL


C.H.U. Strasbourg

2^ dition

Les auteurs remercient les collaborateurs qui ont particip la correction de cette nouvelle dition : Y. PIEMONT, A. LE FAOU, B. JAULHAC, B. RIOT (qui ont profondment remani certains chapitres), R. MINCK, J.M. SCHEFTEL, D. RAOULT, C. DELMAS, M. MOUNIER et P.Y. DONNIO. Nos remerciements s'adressent galement au Professeur J. ORFILA, au Professeur A.L. COURTIEU qui nous a fourni les photographies en microscopie balayage et Ph. LEBERT, M.F. PRERE, Ph. GAUTIER et M. SAUZIRE, auteurs de nombreuses photographies. Nous associons ces remerciements les Socits BIOMRIEUX et Diagnostics-PASTEUR qui nous ont autoriss reproduire certains de leurs documents. Nous remercions particulirement Madame M. HOEHN qui a assur Strasbourg la lourde charge du secrtariat de cette deuxime dition.

La loi du 11 mars 1957 n'autorisa que les "copies ou reproductions strictement rserves l'usage priv du copiste et non destines une utilisation collective". Toute reprsentation ou reproduction, Intgrale ou partielle, faite sans le consentement de l'diteur, est Illicite.

COPYRIGHT 1992

EDITION MARKETING
EDITEUR DES PREPARATIONS GRANDES ECOLES MEDECINE 32, ru* Bargu 75015 PARIS

ISBN 2-7298-9218-4

AVANT-PROPOS

Les antibiotiques et l'hygine n'ont pas fait disparatre la pathologie infectieuse. La frquence et le pronostic de flaux comme la typhode, la tuberculose ou la poliomylite ont chang. Mais une nouvelle pathologie infectieuse existe. De nouveaux agents infectieux ont t dcouverts rcemment. Citons les Legionella (1977), Borrelia burgdorferi (1982) et rcemment Chiamydia pneumoniae etAfipiafelis. L'infection par le virus de l'immunodficience humaine (V.I.H.) est elle-mme l'origine de nombreuses infections bactriennes nosocomiales : salmonelloses, nocardioses, tuberculoses et infections mycobactries atypiques. Beaucoup de malades qui n'auraient pas survcu il y a quelques dcennies se trouvent aujourd'hui, grce au progrs de la mdecine et de la chirurgie, dans nos hpitaux. Ces malades, du fait de leur pathologie ou d'un traitement immunosuppresseur, sont particulirement sensibles aux infections. Finalement, c'est bien souvent d'infections nosocomiales dues des bactries opportunistes (Pseudomonas, Acinetobacter, Serratia etc.), non pathognes pour un individu sain, qu'ils meurent. L'isolement puis l'identification d'une bactrie pathogne est un acte particulirement satisfaisant car, lui seul, il apporte un diagnostic tiologique et permet un traitement parfaitement adapt. On connat la relation qui existe entre la prcocit du traitement d'une maladie infectieuse et le succs thrapeutique. Pendant longtemps, les bactriologistes ont t confronts une donne fondamentale de la physiologie : dans les meilleurs des cas il faut 18 heures pour qu'une souche bactrienne forme des colonies. Les techniques progressent et permettent dans certains cas d'viter cet cueil. C'est un souci constant en bactriologie clinique de raccourcir le dlai de la rponse du laboratoire et par l mme le dlai avec lequel le malade reoit un traitement adapt. L'automatisation y contribuera. L'objectif de cet ouvrage est de prsenter de faon synthtique, mais prcise et sans vouloir tre exhaustif, les donnes classiques comme les donnes les plus rcentes concernant le diagnostic, le traitement et la prvention des infections bactriennes. Ce livre, Bactriologie Clinique, tait initialement destin tre un outil de travail pour nos collaborateurs, internes en biologie. Notre souhait aujourd'hui est qu'il soit utile tous ceux qui sont concerns par l'infection. Les auteurs.

TABLE DES MATIERES

Section 1 Chapitre 1 Chapitre II Chapitre ni


t

Les cocci Gram positif Staphylococcus Streptococcus. Enterococcus Streptococcus pneumoniae Les Neisseriaceae

9 31 55
67 67 68 95

Section II

Classification des Neisseriaceae Chapitre IV Le genre Neisseria Chapitre V Moraxella. Branhamella Chapitre VI Acinetobacter Section III Chapitre VII Chapitre VIII Chapitre IX Chapitre X Section IV Bacilles Gram positif arobies Corynebacterium Listeria Erysipelothrix rhusiopathiae Bacillus

102 109 109 122 131 135 149 149 152 160 166 184 192 196 205 205 224 233

Enterobacteriaceae

Gnralits sur les Enterobacteriaceae Chapitre XI Escherichia coli Chapitre XII Shigella Chapitre XIII Salmonella. Citrobacter Chapitre XIV Klebsiella. Enterobacter. Serratia Chapitre XV Proteus. Providencia. Morganella Chapitre XVI Yersinia Section V Autres bacilles Gram ngatif aro-anarobies

Chapitre XVII Les Vibrions Chapitre XVIII Aeromonas. Plesiomonas Chapitre XIX Pasteurella

TABLE DES MATIRES

Chapitre XX Chapitre XXI Section VI Chapitre XXII Chapitre XXIII

Haemophilus Bacilles Gram ngatif croissance difficile Bacilles Gram ngatif arobies stricts

241 254 265 265 283 289 296 305 314 321 325 325 330 334 371 385 389 389 390 410 422 431 431 433 443 452 463 463 473 482 490 501 502 502 505 507

Pseudomonas Autres bacilles non fermentants PLANCHES COULEUR Chapitre XXIV Campylobacter- Helicobacter Chapitre XXV Brucella Chapitre XXVI Legionella Chapitre XXVII Bordetella Chapitre XXVIII Francisella Section VII Bactries anarobies

Gnralits sur les bactries anarobies strictes Chapitre XXIX Cocci anarobies Chapitre XXX Clostridium Chapitre XXXI Bacilles Gram ngatif anarobies Chapitre XXXII Bactries des vaginoses Section VIII Mycobactries

Gnralits sur les Mycobactries Chapitre XXXIII Bacilles de la tuberculose Chapitre XXXIV Autres Mycobactries, dites atypiques Chapitre XXXV Mycobacterium leprae Section IX Spirochtes

Gnralits sur les Spirochtes Chapitre XXXVI Treponema Chapitre XXXVII Leptospira Chapitre XXXVIII Borrelia Section X Chapitre XXXIX Chapitre XL Chapitre XLI Chapitre XLII Bactries particulires Mycoplasma. Ureaplasma Rickettsia Chiamydia Actinomycetes

Bibliographie Gnrale

Annexes
Maladies dclaration obligatoire Liste des centres de rfrence Index

SECTION 1 COCCI A GRAM POSITIF

Chapitre 1 LES STAPHYLOCOQUES

HISTORIQUE
Les Staphylocoques ont t dcouverts dans un pus par Pasteur en 1880. En 1883, Ogston a cr le nom de Staphylocoque pour dcrire ces grains (kokkos) groups en amas irrguliers la faon d'une grappe de raisin (staphylos). En 1884, Rosenbach a obtenu des cultures pures de ces bactries. Il a scind le genre Staphylococcus en deux groupes selon que les colonies taient blanches ou dores.

1 - CARACTRES GNRAUX DES STAPHYLOCOQUES A - Position taxonomique et classification La famille des Micrococcaceae est compose de trois genres de cocci Grani positif en amas qui diffrent par leur G + C % : Staphylococcus (30 39 %), Micrococcus (65 - 75 %) et Planococcus (48 - 52 %). Ce dernier genre n'est rencontr qu'en bactriologie marine. Les espces appartenant ces trois genres possdent une catalase et se dveloppent en arobiose. Les cocci Gram positif en amas qui se dveloppent uniquement en anarobiose sont dnomms Peptococcus et seront traits avec les bactries anarobies. Le genre Staphylococcus occupe une place trs importante en pathologie humaine et animale. Le genre Micrococcus a un pouvoir pathogne pratiquement nul. Nanmoins des souches de microcoques sont frquemment isoles en bactriologie mdicale. Il s'agit alors de contaminants qu'il faut distinguer des staphylocoques. Les caractres qui permettent de distinguer les genres Staphylococcus et Micrococcus sont indiqus dans le tableau I.

10

Section I- LES COCCI GRAM POSITIF

TABLEAU 1 CARACTERES PERMETTANT LA DIFFRENCIATION ENTRE STAPHYLOCOQUES ET MICROCOQUES Caractres Composition en bases l'ADN G+C (mol %) Prsence de rsidus glycine dans le pont interpeptidique du peptidoglycane Acide teichoque de paroi Cytochromes c et d Arrangement cellulaire Type respiratoire Fermentation du glucose Croissance en anarobiose (thioglycolate) Acidification du glycrol Lysostaphine (disque 100 [ig) Lysozyme (disque 50 |^g) Oxydase (cytochrome c) Nitrofurantone (disque 300 |^g) Bacitracine (disque 0,02 U) Compos 0/129 (disque 0,5 mg) Staphylocoques 30-39 + + amas, paires aro-anarobie" +(-)* +(-) +(-) S(R) R -(+)c -(+) -(+) R(S) S + R($15mm) S(10-25mm) S(20-36mm) + amas, ttrades arobie strict*' Microcoques 66-75

-(+)d
S(>15mm) R R (6-10mm)

-() espces ou souches prsentant un caractre diffrent a : S. hominis est arobie strict et S. saccharotyticus anarobie strict b ; Micrococcus kristinae et M. varions peuvent crotre en anarobiose c : M. kristinae, M. varions peuvent fermenter le glucose d : S. sciuri, S. lentus, S. caseolyticus ont une cytochrome c oxydase

Au sein du genre Staphylococcus, on distingue d'aprs la classification de Kloos et Schleifer plus de 20 espces. Un certain nombre d'entre elles sont trouves chez l'homme, d'autres sont prsentes chez les animaux ou dans les aliments (viandes, produits laitiers...). Parmi les espces retrouves chez l'homme : - trois espces occupent une place privilgie : 5. aureus, S. epidermidis et S. saprophyticus, - les autres, plus rarement impliques en pathologie humaine, sont : S. hominis, S. haemolyticus, S. warneri, S. capitis, S. saccharolyticus, S. auricularis, S. simulons, S.cohnii, S.xylosus, S. intermedius, S. lugdunensis et S . schleiferi. Il est classique d'opposer S. aureus qui produit une coagulase et est souvent pathogne, aux autres staphylocoques, non producteurs de coagulase et plus rarement responsables d'infections. B - Habitat et pidmiologie II s'agit de germes trs rpandus dans la nature (air, eau, sol). Les staphylocoques, en particulier les espces S. aureus et S. epidermidis, font partie de la flore normale

Chapitre 1 - Staphylococcus

11

de nombreux individus qui sont des porteurs asymptomatiques . Cependant ces souches peuvent tre l'origine d'auto-infections ou contaminer d'autres individus. On peut estimer que 20 75 % des sujets sont porteurs de S. aureus : porteurs persistants, porteurs occasionnels, ou transitoires ; l'oppos, certains individus sont non porteurs . Les staphylocoques peuvent tre trouvs particulirement dans les fosses nasales antrieures (S. aureus : 30 - 40 %, S. epidermidis 30 - 100 %). On peut galement les isoler de la peau (S. epidermidis 85 - 100 %) et surtout des zones chaudes et humides de celle-ci (creux axillaire, prine) o l'on peut galement trouver S. aureus. n n'est pas rare d'isoler S. aureus des selles. La transmission est surtout interhumaine directe (contact, dissmination manuporte, partir du nez notamment) ou indirecte par l'intermdiaire des aliments ou du milieu extrieur. Le nouveau-n est rapidement colonis par S. aureus aprs l'accouchement et, plus tard, l'enfant peut tre contamin au sein d'une collectivit ; la contamination interhumaine est trs variable, certains individus tant de dangereux dissminateurs , alors que d'autres sujets ne transmettent pratiquement jamais leurs souches.

SCHMAl VOS DE TRANSMISSION DES STAPHYLOCOQUES

II - STAPHYLOCOCCUS AUREUS A - Pouvoir pathogne


J. Pouvoir pathogne naturel

Les infections S. aureus sont trs frquentes et apparaissent sous des aspects cliniques trs varis.

12

Section I - LES COCCI GRAM POSITIF

al Les staphylococcies cutanes, sous-cutanes et muqueuses - S. aureus peut tre l'origine d'infections cutanes superficielles ou profondes. L'infection superficielle se traduit par un imptigo, un onyxis ou une folliculite. L'infection profonde est reprsente par des abcs intrafolliculaires de toute la gaine du poil appels furoncles, ou par des infections des canaux des glandes sudoripares appeles hidrosadnites. L'anthrax est un conglomrat de furoncles et la staphylococcie maligne de la face en est une localisation particulirement grave. Furonculose et hidrosadnite peuvent tre rcidivantes. Ces rcidives sont parfois lies des facteurs dclenchants : diabte, surmenage... On observe aussi des infections cutanes associes la prsence de cathters ainsi que des psoriasis ou des eczmas surinfects par S. aureus, mais sans signes cliniques d'infection. - Des rashes scarlatiniformes font partie du syndrome de choc toxique li la prsence de souches productrices de la toxine du syndrome de choc toxique ou de certaines entrotoxines. Des rashes sont aussi lis la prsence de toxine pyrogne. - Le syndrome de Lyell staphylococcique ou Maladie de Ritter von Rittershain ou syndrome des enfants bouillants est li la scrtion d'une toxine staphylococcique, l'exfoliatine ou pidermolysine, qui provoque la desquamation de la couche superficielle de l'pidmie. - Au niveau des muqueuses, S. aureus peut tre impliqu dans des phlegmons de l'amygdale, des sinusites ou des otites parfois rcidivantes. bl Localisations viscrales S. aureus Elles surviennent soit isolment, soit dans le cadre d'une septicmie patente : - staphylococcies osseuses : l'ostomylite aigu est une affection de l'enfant ou de l'adolescent : elle touche classiquement les os longs et peut devenir chronique . Les infections osseuses staphylococciques post-chirurgicales sont trs proccupantes. - staphylococcies pleuropulmonaires : les formes du nourrisson sont trs frquentes et graves. Les formes de l'adulte sont plus rares et peuvent apparatre aprs une virose telle la grippe. - staphylococcies urognitales : les pylonphrites staphylocoques sont assez frquentes ; S. aureus peut aussi entraner la formation d'abcs isols du rein ou des phlegmons prinphrtiques. - staphylococcies neuromninges : elles sont rares et domines par les mningites observes surtout en milieu neuro-chirurgical (valves). S. epidermidis est alors souvent isol. Les mningites ne doivent pas tre confondues avec l'pidurite staphylococcique, le pus tant alors localis dans l'espace pridural. Des abcs du cerveau peuvent tre rencontrs. - l'endocardite staphylococcique s'observe notamment chez les patients porteurs de valves cardiaques artificielles. Chez les drogus, ce sont souvent des endocardites du cur droit. cl Septicmies S. aureus Les staphylococcmies sont causes et entretenues par un foyer infectieux primaire compliqu de thrombophlbite ; ce sont des infections frquentes, d'une gravit proccupante. L'volution est maille de mtastases septiques.

Chapitre 1 - Stapkylococcus____________________________________________________13

Portage asymptomatique - peau - nez, bouche - yeux - intestin - vagin, urtre -

Infections contigues furoncle, anthrax, abcs, arthrites, ostomylites. sinusites, otites, mastodites, pneumonies >infections orbitaires entrocolites cystites, prostatites, cervicites, salpingites

source mconnue

BACTERIEMIES ou SEPTICEMIES - contamination externe : personnel, instruments,... Localisations mtastadques - osseuses - pulmonaires - cutanes, musculaires - cardiaques, rnales - nerveuses - autres SCHEMA 2 LES PRINCIPALES INFECTIONS STAPHYLOCOCCIQUES

dl Toxi-infections alimentaires

- Elles sont dues l'ingestion d'entrotoxines (A et E), prformes dans l'aliment, rsistant aux sucs digestifs et pour certaines la chaleur, entranant des troubles d'apparition prcoce (moins de 3 heures) avec vomissements, diarrhe, dshydratation et absence de fivre. - L'volution est bnigne, sauf en cas de pertes hydro-lectrolytiques importantes (sujets gs, nourrissons). - Le staphylocoque doit tre recherch dans l'aliment. - La recherche de l'entrotoxine contenue dans les aliments ou produite par la souche isole est possible dans des laboratoires spcialiss. et Entrocolites aigus - Elles surviennent au dcours d'une antibiothrapie et sont dues la prolifration de S. aureus antibiorsistant et producteur d'entrotoxine. - Ces staphylocoques doivent tre recherchs dans les selles. - Les laboratoires spcialiss peuvent dceler si les staphylocoques isols sont producteurs ou non d'entrotoxine. // Syndrome de choc toxique (TSS) II associe fivre, hypotension, rash maculaire rythmateux suivi d'une desquamation scarlatiniforme et souvent de diarrhe. Les hmocultures sont striles. Il est li l'action de la toxine staphylococcique, TSST-1 (Toxic Shock Syndrome Toxin-1), ou, semble-t-il, de certains srotypes d'entrotoxine. Ce syndrome a t dcrit en 1978 aux ILS.A. comme la consquence d'une prolifration vaginale de S. aureus chez des femmes utilisant des tampons priodiques. Des souches responsables de TSS peuvent tre galement isoles de lsions diverses. La grande frquence des TSS aux U.S.A. entre 1978 et 1982 n'a pas t observe en Europe.

14

Section I- LES COCCI GRAM POSITIF

2. Pouvoir pathogne exprimental II est ncessaire d'injecter 5.106 UFC de S. aureus sous la peau pour produire une infection en peau saine chez l'homme ; par contre 100 bactries suffisent sur une zone de suture ou sur une peau comportant des lsions prexistantes. Aucun animal de laboratoire n'est capable de reproduire les diffrents aspects de la maladie humaine. Cependant le lapin est l'animal le plus sensible : l'injection sous-cutane de S. aureus produit un abcs qui gurit spontanment et l'injection intraveineuse conduit la mort en 4 10 jours avec des abcs viscraux (reins surtout). B - Physiopathologie S. aureus peut devenir pathogne la suite de diverses circonstances : - pntration du germe dans l'organisme, le plus souvent aprs rupture de la barrire cutane (blessures, interventions chirurgicales, brlures, dermatoses, injections, cathters,...) ou au niveau d'un follicule pileux. - rupture de l'quilibre hte-bactrie la suite de circonstances favorisant l'infection : virose (grippe, rougeole), antibiothrapie slectionnant une souche de S.aureus, dficits immunitaires, diabte, alcoolisme... Il s'ensuit une multiplication bactrienne avec production d'enzymes et de toxines correspondant l'expression de la virulence du germe. Ceci explique l'extension de l'infection qui peut aboutir une septicmie. Schmatiquement, plusieurs tapes peuvent se succder dans lesquelles sont impliques diverses substances d'origine staphylococcique : - envahissement local : hyaluronidase, exfoliatine, - ncrose cellulaire : protases, lipases, estrases, DNases, phosphatases, toxine alpha (et bta, gamma, delta), - diminution des dfenses locales : leucocidine, capsule, protine A, - foyer de thrombophlbite rgionale : coagulase, - embols septiques : fibrinolysine. En raison de ses nombreuses toxines et enzymes, S. aureus dtruit les cellules de l'organisme et produit du pus. Il est ainsi le type mme du germe pyogne. C - Substances excrtes par S. aureus Elles sont particulirement nombreuses chez S. aureus. Les dterminants gntiques sont connus pour la plupart de ces substances (Tableau II). I. Toxines de S. aureus - les hmolysines : leurs principales proprits sont regroupes dans le tableau III : - l'alpha-hmolysine ou alpha-toxine staphylococcique est de nature protique, thermostable, antignique, induisant la formation d'anticorps neutralisants. Elle est cytotoxique et cytolytique pour une grande varit de types cellulaires. Elle semble s'insrer dans la membrane cytoplasmique des cellules-cibles et permet le passage de molcules de petite taille. - la bta-hmolysine est thermolabile. Elle agit comme une sphingomylinase de type C et donne une hmolyse accrue en prsence de souches de Streptococcus agalactiae : c'est le CAMP-test (du nom de leurs dcouvreurs : Christie, Atkins, Munsch-Petersen) - la gamma-hmolysine comporte deux facteurs 1 et II agissant en synergie.

Chapitre 1 - Slaphylococcus

_________________________15

TABLEAUn DTERMINANTS GNTIQUES DE QUELQUES PROTINES EXTRACELLULAIRES DE STAPHYLOCCCUS AUREUS Enzyme ou toxine Bta-lactamase Coagulase Exfoliadne A Exfoliadne B Entrotoxine A Entrotoxine B Entrotoxine C Entrotoxine D Entrotoxine E Hmolysine alpha Hmolysine bta Hmolysine gamma Hmolysine delta Lipase Pigment Staphylokinase Staphylococcine Protine A TSST-1 (toxine du choc toxique) Gne clone + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Chromosome + + + +

Plasmide + + + + +

+ + + + + + + +

TABLEAU m PROPRITS DES HMOLYSINES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Lyse des hmades de

mouton
lapin cheval homme ltale

+++ +++ +++ + + +

+++ + + +

+++ +++ +++ + +

++ ++ +++ +++ + + +

Action

cronque

dermonlyrique sur leucocytes

Andgnicit

Ceux-ci sont antigniques et le cholestrol inhibe leur action. Le mode d'action molculaire de cette toxine reste inconnu. - la delta-hmolysine contient des acides amins hydrophobes et hydrophiles et agit comme un dtergent sur les membranes. la leucocidine de Panton Valentine dtruit trs spcifiquement les polynuclaires et les macrophages de l'homme et du lapin. La leucocidine

16_____________________________________________Section I - LES COCCI GRAM POSITIF

purifie, provoque une dermoncrose chez le lapin. L'effet toxique sur les leucocytes serait d une modification de la permabilit cationique. On distingue 2 constituants F et S agissant en synergie. - les entrotoxines : elles sont responsables d'intoxications alimentaires et sont caractrises par leur masse molculaire comprise entre 27 800 et 34 100 daltons, leur point iso-lectrique et leur srotypie. Elles sont au nombre de 7 : A, B, Cp C^. 3, D et E. Les srotypes A, B et D sont les plus frquents dans les intoxications alimentaires. Certaines de ces entrotoxines ont un effet mitogne sur les lymphocytes T. Certaines (Ent B) sont des protines plus thermostables que les autres. Elles rsistent aux enzymes protolytiques. La dose minimale toxique se situe aux environs de 1 (lg pour 100 g d'aliments. La dtection des toxines dans les aliments, les matires fcales ou les bouillons de culture s'effectue par une technique immunologique'(immunodiffusion, agglutination, radio-immunologie, ELISA). La possession d'un gne d'entrotoxine n'est pas exceptionnelle. On retrouve une ou plusieurs de ces toxines chez environ la moiti des souches hospitalires, ce qui rend dlicat le rattachement d'un syndrome clinique l'isolement d'une souche entrotoxinogne. - les toxines pidermolytiques (ou exfoliatines) sont produites par certaines souches de S. aureus (5 %). Ce sont des protines d'un poids molculaire de 27 000 daltons et antigniques ; 30 40 % des souches du groupe phagique II produisent ces toxines, soit 5 % des souches hospitalires. On distingue 2 srotypes A et B : le gne codant le srotype A est chromosomique (90 % des exfoliatines) et celui codant le srotype B est plasmidique (4 5 % des exfoliatines). Les 2 srotypes peuvent tre produits par une mme souche. Ces toxines (A ou B) entranent un clivage intra-pidermique. Le mode d'action au niveau molculaire reste inconnu. Ces toxines peuvent tre mises en vidence sur le souriceau nouveau-n, par contre-immunolectrophorse ou ELISA. Les souches toxinognes sont particulirement responsables d'infections nonatales et infantiles : syndrome de Lyell, imptigo bulleux staphylococcique... - les toxines pyrognes. Il existe deux toxines pyrognes, mitognes, aspcifiques et antigniques d'un poids molculaire de 12000 daltons rparties en deux srotypes A et B. L'effet pyrogne est observ sur le lapin. Ces toxines sont impliques dans les fivres scarlatiniformes staphylococciques. - toxine du syndrome de choc toxique (TSST). Au cours de ce syndrome on observe notamment un rash rythmateux avec ou sans desquamation. Les staphylocoques responsables produisent une toxine (TSST-1) sensible aux enzymes protolytiques, antignique et d'une masse molculaire de 20 000 daltons ; ce syndrome a galement t associ la production d'entrotoxines ; cette toxine est produite par 90 % des souches isoles dans les syndromes de choc toxique et par 11 % des souches hospitalires tout-venant. - "Succinic oxidase factor". Cette toxine inhibe l'oxydation du succinate par les mitochondries isoles du foie de souris. 2. Enzymes de S. aureus Ces enzymes ont un intrt pathognique et/ou diagnostique important.

Chapitre 1 - Staphylococcus

17

al Coagulase libre S. aureus est capable d'excrter une protine provoquant la coagulation du plasma humain ou de lapin (prlev sur citrate, oxalate, hparine ou EDTA) et appele coagulase libre . Un staphylocoque produisant cette toxine sera identifi comme S. aureus. Mais 2 espces observes en pratique vtrinaire peuvent produire cette enzyme : S. intermedius et S. hyicus. La formation du coagulum ne ncessite pas la prsence de calcium, elle n'est pas active par le fibrinogne purifi, mais a besoin d'une globuline voisine de la prothrombine (coagulase-reacting-factor). Cette coagulase est antignique (7 groupes antigniques) et entrane l'apparition d'anticorps inhibant l'activit biologique. Elle joue un rle dans la formation de thrombophlbites suppures et inhiberait la phagocytose. Au laboratoire, la dtection de la coagulase s'effectue en mettant en prsence du plasma de lapin et la souche tudier dans un tube 37C ; la prise en masse du mlange est ralise en 3 6 ou parfois en 24 heures ; la coagulation peut tre suivie d'une dissolution du caillot par suite de l'action de la staphylokinase. bl Coagulase lie ou dumping factor ou facteur d'affinit pour le fibrinogne A ct de cette coagulase libre , on reconnat une coagulase insoluble, lie la surface des germes et galement appele dumping factor. Elle se lie au fibrinogne et est responsable de l'agrgation sur lame des staphylocoques en prsence de srum ; ce facteur d'affinit pour le fibrinogne peut tre mis en vidence par contact de la souche tudier avec des hmaties de mouton ou des particules de latex recouvertes de fibrinogne ; une agglutination apparaissant en quelques secondes est trouve chez 98 % des souches de S. aureus. Ce dumping factor ne dgrade pas le fibrinogne en fibrine. Cependant, ce test peut tre positif pour certaines espces de staphylocoques coagulase ngatifs, telles S. lugdunensis et S. schleiferi. cl Fibrinolysine ou staphylokinase Cette enzyme est un activateur du plasminogne (action semblable celle de la streptokinase), agissant sur le plasma humain et de lapin. Cette activit est mise en vidence sur des plaques de glose contenant de la fibrine (zone d'claircissement). Cette substance thermolabile est antignique. Elle dissout les caillots et pourrait jouer un rle dans la formation d'embols septiques. dl Hyaluronidase Cette enzyme thermolabile hydrolyse l'acide hyaluronique, elle fluidifie la substance fondamentale du tissu conjonctifet peut tre recherche par viscosimtrie. el Nuclase La nuclase (DNase) de S.aureus (ou thermonuclase) est thermostable, alors que celle des autres espces bactriennes est thermolabile. L'activit enzymatique est mise en vidence sur milieu base d'ADN avec du bleu de toluidine (halo ros) ; la reaction peut tre rendue plus spcifique par sro-inhibition de la nuclase de S. aureus, recherche qui peut tre pratique en 4 heures.

18

___

_________Section 1 - LES COCCI GRAM POSITIF

// Autres activits enzymatiques Des activits lipasiques, estrasiques, protasiques peuvent tre mises en vidence (milieu l'oeuf de Baird-Parker), de mme qu'une activit phosphatasique ; ainsi il existe 2 phosphatases (acide et alcaline) qu'il est facile de rechercher. D - Structure et antignes Plusieurs substances de la paroi des staphylocoques jouent un rle dans les ractions immunologiques. 1. Le peptidoglycane Staphylocoques et microcoques possdent des peptidoglycanes qui diffrent entre eux par leurs acides amins. La structure du peptidoglycane de S. aureus est bien connue : le diaminoacide prsent est la L-lysine. Les staphylocoques sont lyss par une endopeptidase, la lysostaphine, qui clive la liaison glycyl-glycine prsente dans le pont interpeptidique, mais ils rsistent gnralement l'action muramidasique du lysozyme. 2. Les acides teichoques La paroi des staphylocoques comporte des polyolphosphates (polyribitol ou polyglycrol-phosphate) substitus par des hexoses.
polyol S. aureus S. epidermidis ribitol glycerol substituant N-actylgiucosamine ou glucose

Les microcoques contiennent des acides teichoques sans ribitol ou glycerol. Les acides teichoques de S. aureus sont aussi appels polysaccharide pA. Dans certaines conditions les acides teichoques peuvent tre remplacs par des acides teichuroniques (N-actyl D-fucosamine, acide N-actyl D-mannosaminuronique en polymres chez S. aureus). Les acides teichoques jouent un grand rle sur les interactions entre bactries et cellules et sur fixation des bactriophages ; de plus ils sont antigniques. Ils sont lis de faon covalente aux chanes de peptidoglycane. 3. Polysaccharides de surface Ces antignes de surface ont t dcrits chez des souches capsules. Cette capsule peut se former de faon plus abondante lors de la croissance de S. aureus en prsence de srum dans un milieu faiblement glose. Ces antignes sont aussi dcelables sur bon nombre de souches dites non capsules, mais porteuses de polysaccharides identiques en moindre quantit. Certains de ces polyosides empchent l'activation de la voie alterne du complment et protgent ainsi la bactrie de la phagocytose et de l'action bactricide du srum. Une classification de ces polysaccharides en 8 types capsulaires a t propose et deux types, 5 et 8, recouvrent 70-80 % des souches responsables de septicmies ; ces travaux peuvent dboucher sur la dtection d'antignes solubles staphylococciques.

Chapitre 1 - Staphylococcus

19

4. Protine A II s'agit d'une protine (PM 42 kDa) antignique, insoluble l'tat natif et constitutive de la paroi de S. aureus. Elle fixe (schma 3) la fraction Fc des immunoglobulines humaines IgGl, 2 et 4, laissant la partie Fab libre. In vitro, on peut ainsi aisment fixer la surface de S. aureus des immunoglobulines (par ex. anti-mningocoque ou anti-pneumocoque) pour dtecter les antignes correspondants dans les cultures ou les produits pathologiques ; il s'agit de la coagglutination. N.B. : la fixation des IgG sur la protine A est fonction de l'espce animale d'o proviennent les IgG et aussi des sous-classes d'IgG considres : par exemple, les IgG de mouton ou de chvre se fixent peu sur la protine A.

SCHMA 3 S. AUREUS SENSIBILIS AVEC UNE IMMUNOGLOBULINE

5. Antignes de type et srotypie. Toutes les souches de S. aureus possdent des facteurs antigniques de surface utiliss dans des classifications. Il existe prs de 30 facteurs antigniques et deux classifications principales. Dans le systme de Pillet, 13 srums sont utiliss ; les srotypes les plus frquents sont les I, II, III et 18 ; en France 10 % des souches sont non typables dans ce systme. Le systme d'Oeding permet une meilleure approche de la structure antignique (mosaque) des souches, mais est de ralisation technique plus difficile ; les antignes sont dsigns par les sigles a4, a5, bl, cl,hl... 6. La lysotypie Cette mthode est utilise pour comparer les souches de S. aureus isoles au cours d'pidmies hospitalires. Elle consiste soumettre la souche tester une srie de 23 bactriophages. La lyse de la souche par un bactriophage est conditionne par l'existence au niveau de la paroi d'un rcepteur spcifique pour ce phage. Certaines combinaisons lytiques ont lieu plus frquemment que d'autres, ce qui a permis de dfinir des groupes phagiques : groupes I, II, III, IV (non observ chez l'homme) et V. Les groupes 1 et III sont les plus frquents chez l'homme.

E - Diagnostic bactriologique d'une infection S. aureus 1. Les prlvements Ils doivent tre effectus avant toute antibiothrapie et pratiqus avec une asepsie rigoureuse : non seulement pour les hmocultures, les LCR, les urines, mais aussi

20

Section I-LES COCCI GRAM POSITIF

pour les pus, les biopsies, les aspirations bronchiques, les couvillonnages. Il faut viter la contamination du produit pathologique par des souches de Staphylococcus aureus et de S. epidermidis souvent prsentes sur la peau. La rptition des hmocultures permet de trancher en faveur d'une septicmie ou de souillures. Les bactriologistes peuvent aussi tre amens rechercher et dnombrer les staphylocoques dans les aliments, les eaux, ou dans l'air en milieu hospitalier. 2. Examen direct Les staphylocoques sont des cocci Gram positif, de 0,8 1 u.m de diamtre, disposs en amas, en diplocoques, en courtes chanettes, voire en grappes typiques. Ils sont immobiles, asporuls, parfois capsuls. L'observation de cocci Gram positif en courtes chanettes ou en amas dans un pus permet souvent d'voquer un staphylocoque.
3. Caractres culturaux

S. aureus crot abondamment sur milieu glose (colonies de 1 2 mm de diamtre) ; certaines souches produisent un pigment jaune-orange, mais cette production est irrgulire. La culture est obtenue en 18 24 heures 37C (culture possible de 10 45C) sur milieux ordinaires. S. aureus pousse en prsence de fortes concentrations salines (milieu slectif de Chapman 7,5 % de NaCl). Le pH optimal est de 7,0 7,5. Il existe, des variants exigeants en facteurs de croissance : thiamine, acide panthotnique... Pour les produits monomicrobiens, l'isolement est facile en bouillon, ou en milieu solide non slectif (trypticase-soja, Mueller-Hinton, glose au sang). Pour les produits pathologiques polymicrobiens ou les aliments, on doit recourir des milieux slectifs comme le milieu de Chapman (milieu hypersal + mannitol) ou milieu de Baird-Parker au tellurite (utilis surtout en microbiologie alimentaire).
4. Type respiratoire

S. aureus est un germe arobie-anarobie facultatif. Quelques souches exigent du CO^ pour crotre. Toutes les souches produisent une catalase.
5. Identification

En 18 24 heures sur milieu glose riche, on observe des colonies de 1 2 mm de diamtre produisant parfois un pigment jaune et constitues de cocci Gram (+) en amas, catalase (+). Sur milieu de Chapman, S. aureus provoque une acidification (virage au jaune) du mannitol ; sur milieu de Baird-Parker, 5. aureus forme des colonies noires (rduction du tellurite) avec un halo clair (protolyse) et, plus tardivement, une opacification dans le halo (lipase). Sur les colonies suspectes, on recherchera la classique coagulase ou une inhibition de la nuclase thermostable l'aide d'anticorps. Des tests de dpistage rapide existent galement (recherche du facteur d'affinit pour le fibrinogne et recherche de protine A). Mais il existe quelques faux positifs et faux ngatifs avec ces tests. S'il s'agit de l'espce S. aureus, l'identification est parfois complte dans une perspective pidmiologique par des galeries plus pousses, par la srotypie ou par la lysotypie. A noter : - que l'isolement de certaines souches de S. aureus, partir d'hmocultures notamment, peut parfois tre difficile (endocardite, suppurations chroniques),

Chapitre 1 - Staphylococcus____________________________________________________21

car certaines souches donnent des microcolonies d'apparition lente dont la croissance peut tre amliore par l'addition de facteurs de croissance. - que la recherche de toxines : entrotoxines, exfoliatine est rserve ce jour des laboratoires spcialiss, mais que des recherches d'entrotoxines par des techniques d'agglutination passive de particules de latex ou par ELISA, directement dans les produits sont maintenant utilises, notamment en bactriologie alimentaire. - que le terme de staphylocoque pathogne (tout comme celui de staphylocoque dor) doit tre proscrit : S. aureus isol de la peau ou des muqueuses (portage) n'est pas pathogne, alors que S. epidermidis peut, dans certaines circonstances, tre pathogne.
6. Diagnostic diffrentiel

- Micrococcus. Ce germe est spar des staphylocoques par son type respiratoire, par son incapacit oxyder le glycrol (1 %) en prsence d'rythromycine (0,4 (ig/ml) et par sa rsistance 200 u.g/ml de lysostaphine (voir Tableau I). - Autres espces de staphylocoques : il faut noter que certaines souches de S. aureus peuvent ne pas produire de coagulase libre en raison d'une mutation. Chez d'autres souches de S. aureus, le facteur d'affinit pour le fibrinogne peut tre masqu par la prsence d'une capsule polysaccharidique. Des espces de staphylocoques autres que 5. aureus peuvent tre pigmentes particulirement la primoculture : S . saprophyticus, S . hominis, S. haemolyticus... D'autres espces peuvent aussi tre hmolytiques (S. haemolyticus, S. warneri, S. schleiferi...) Enfin des espces autres que S. aureus peuvent pousser sur milieu de Chapman et acidifier le mannitol (S. cohnii, S. saprophyticus,...). - Stomatococcus. Ce germe, catalase ngative ou faible, ne crot pas sur milieu hypersal, n'est pas hmolytique et ses colonies de consistance lastique adhrent la glose. 7. Diagnostic rapide II n'existe pas actuellement de diagnostic rapide et fiable d'infection S. aureus par recherche d'antignes solubles. Les meilleurs antignes candidats pour ce type de dpistage seraient reprsents par les polysaccharides de surface des staphylocoques. 8. Diagnostic indirect II a actuellement peu de valeur pratique. Le titrage des antistaphylolysines alpha peut prsenter un intrt dans des infections profondes ou chroniques (osseuses notamment), le taux normal tant infrieur ou gal 2 UI par ml. La valeur de cette raction srologique est actuellement conteste. La recherche d'anticorps anti-acides teichoques ou anti-peptidoglycane par contre-immuno- lectrophorse ou diffusion en gel peut avoir des indications en cas d'endocardites ou de complications mtastatiques hmocultures ngatives ou de foyers infectieux inaccessibles la culture, mais on ne dispose pas ce jour d'antigne bien standardis.

22

Section I- LES COCCI GRAM POSITIF

III - STAPHYLOCOQUES COAGULASE NGATIFS A - Identification Les staphylocoques coagulase ngatifs ne sont identifis compltement que lorsque les circonstances de leur isolement indiquent qu'ils sont potentiellement en situation de jouer un rle de pathogne. Les tableaux IV et V indiquent les caractres bactriologiques qui permettent de faire le diagnostic d'espce.
TABLEAU IV CARACTRES DIFFRENTIELS DES PRINCIPALES ESPCES DE STAPHYLOCOQUES AYANT UN ROLE POTENTIELLEMENT PATHOGNE Caractre Coagulase DNase thermostable Rsistance la novobiocine (disques 5 u.g) Nitrate-rductase Phosphatase D-mannitol (acidification) S. aureus + + + + + S. epidermidis S. saprophyticus +8 + +

(a) Diamtre de la zone d'inhibition < 16 mm

A propos de la croissance en anarobiose, de l'hmolyse et du test la novobiocine, trois remarques doivent tre faites. 1. tude de la croissance en anarobiose (inoculation par 0,5 ml de bouillon 0,5 unit Me Farland). S. hominis ne pousse quasiment qu'en arobiose (bouillon thioglycolate). S. saccharolyticus ne pousse qu'en anarobiose. 5. haemolyticus et S. capitis croissent beaucoup mieux en arobiose qu'en anarobiose. 2. tude de la vitesse d'apparition de l'hmolyse L'hmolyse de S. haemolyticus est tardive (aprs plus de 24 heures d'tuve souvent). 3. Test la novobiocine S. saprophyticus est rsistant cet antibiotique. Ce test est utile sur des souches isoles d'urines. Mais d'autres staphylocoques peuvent rsister aussi la novobiocine (S. cohnii, S. xylosus). En pratique, S. hominis, S. haemolyticus et S. simulons reprsentent 5 20 % des staphylocoques coagulase-ngatifs isols chez l'homme. B - Signification clinique des staphylocoques coagulase-ngatifs Certaines espces (S. epidermidis, S. hominis, S. saccharolyticus, S. capitis et S. auricularis) sont trouves de faon constante sur la peau ou les muqueuses des orifices naturels. Les autres espces y sont rencontres de faon inconstante et la densit de ces populations bactriennes est souvent faible. Il existe une adaptation cologique de 5. capitis au cuir chevelu et de S. auricularis au conduit auditif externe.

Chapitre I-StapAytococci

____

_______________________23

TABLEAUV TABLEAU D'IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES (Galerie API-STAPH de API-SYSTEM) Pourcentages de ractions positives aprs 24 h 35-37C Galerie API-STAPH Staph. aureus Staph. epidermidis Staph. saprophyticus Staph. cohnii Staph. xylosus 1 Staph. xylosus 2 Staph. haemolydcus 1 Staph. haemolydcus 2 Staph. hominis 1 Staph. hominis 2 Staph. wameri Staph. capitis Staph. simulans Staph. hyicus* Staph. sciuri* Staph. lentus Micrococcus spp Micrococcus varians 0 GLU FRU 0 100 100 0 100 100 0 100 100 0 100 100 0 100 100 0 100 100 0 100 1 1 0 100 0 100 100 0 100 100 0 100 100 0 100 100 0 100 100 0 100 100 0 100 100 0 100 100 11 16 0 0 100 81 PAL 98 92 8 33 22 89 50 40 50 5 12 1 1 VP 99 75 95 99 94 75 60 6 90 35 MNE 99 60 MAL 93 89 LAC TRE 90 96 74 2 MAN 85 1 XLT MEL 1 1 0 1

2 17
99 89 1 1 1 70 50

99 75
27 88 99 99 99 99 99

99 0
5 98 88 88 19 19 5

94 92
72 98 95 95 99 99 100

99 92
88 96 50 50 25 1 60

1 33
1 26 1 1 0 0 0

1 0
1 48 0 0 0 0 0

94

13

30

85 99 40 99 4 18

1 1 72 67 4 0

99 95 9 78 0 54

99 80 90 90 0 22

99 1 100 100 0 0

0 0 0 0 0 0

0 0 2 99 0 0

NIT Galerie API-STAPH 99 Staph. aureus 56 Staph. epidermidis Staph. saprophyticus 3 Staph. cohnii 0 Staph. xylosus 1 77 Staph. xylosus 2 87 Staph. haemolydcus 1 93 Staph. haemolydcus 2 98 99 Staph. hominis 1 Staph. hominis 2 95 Staph. wameri 17 Staph. capitis 99 99 Staph. simulans Staph. hyicus* 50 Staph. sciuri* 100 100 Staph. lentus Micrococcus spp 31 Micrococcus varians 100 Galerie API-STAPH Staph. aureus Staph. epidermidis Staph. saprophyticus Staph. cohnii Staph. xylosus 1 Staph. xylosus 2 Staph. haemolydcus 1 Staph. haemolydcus 2 Staph. hominis 1 Staph. hominis 2 Staph. wameri Staph. capitis Staph. simulans Staph. hyicus* Staph. sciuri* Staph. lentus Micrococcus spp Micrococcus varians

RAF XYL SAC MDG 0 0 96 1 1 0 100 11 0 0 100 1 33 0 1 1

NAG ADH URE 98 71 54 29 51 75 54 4 95 1 1 1

1 21 0 0
0 0 0

99 99 0 0
0 0 0

99 99 99 99
100 100 100

5 1 45 1
3 80 1

5 93 96 5
5 95 1

5 6 94 10
92 5 93

11 90 10 90
96 80 94

99
25 75 36 11 LSTR 0 0 0 0 0 0 0 0 0

99 93 65 85
0 0 36 45

0
0 0 1 89 0 0

0
0 0 1 33 4 0

20
99 100 100 100 4 0

1
1 1 1 1 0 0

1
99 85 99 99 0 0

60
85 99 1 1 4 0

15
85 60 1 1 18 93

* Souches d'origine vtrinaire 0 10 % ractions positives 20 79 % ractions variables 80 100 % ractions positives

0 0 0 0 0 0 0

100 100

0 : Tmoin ngadf ; Acidificadon = GLU, glucose ; FRU, fructose ; MNE, mannose ; MAL, maltose ; LAC, lactose ; TRE, trhalose ; MAN, mannitol ; XLT, xylitol ; MEL, mlibiose ; RAF, raffinose ; XYL, xylose ; SAC, saccharose ; MDG, methylD-glucoside ; NAG, N-acetyl-glucosamine ; NIT, Nitrate-reductase ; PAL, a-naphtyl-phosphate ; VP, Voges-Proskauer ; ADH, Arginine dihydrolyse ;
URE. urase. LSTR. Rsistance la Ivsostanhinp.

24

Section I-LES COCCI GRAM POSITIF

Les staphylocoques coagulase ngatifs ont longtemps t considrs comme dpourvus de pouvoir pathogne et comme de simples contaminants de prlvements dfectueux. Aujourd'hui il est clair qu'au moins deux espces, S. epidermidis et S. saprophyticus, sont des bactries opportunistes potentiellement pathognes. Les principales infections dues des staphylocoques coagulase ngatifs, ainsi que leur place en pathologie sont indiques dans les tableaux VI et VIL
TABLEAU VI PRINCIPALES INFECTIONS DUES AUX STAPHYLOCOQUES COAGULASE NEGATIFS

- Infections sur matriel tranger : cathters intravasculaires shunts et greffes d'hmodialyse shunts de drivation du LCR cathters de dialyse pritonale prothses valvulaires cardiaques prothses vasculaires prothses articulaires sondes et lectrodes de pacemaker - Endophtalmie aprs chirurgie oculaire - Endocardites sur valve native - Ostomylite - Infodons urinaires - Infections chez les sujets immunodprims

TABLEAU VU ROLE DES STAPHYLOCOQUES COAGULASE NEGATIFS (SCN) DANS LES INFECTIONS SUR MATERIEL ETRANGER Matriel implant Frquence des SCN parmi les agents infectieux responsables

Cathter veineux Prothse valvulaire Prothse vasculaire Shunt drivation LCR Prothse hanche Cathter dialyse pritonale 1. S. epidermidis

30 - 55 % 11 - 27 % 12 - 20 % 30% 12 - 15 % 20 - 40 %

II peut tre responsable d'infections de prothses vasculaires ou articulaires, de valves cardiaques, de valves de drivations du LCR. Il est galement impliqu dans la survenue de pritonites conscutives des dialyses pritonales, d'endocardites subaigus chez les drogus, d'endophtalmies et d'infections diverses particulirement chez les immunodprims. L'aptitude de cette espce coloniser la surface des polymres (cathters, prothses), et les cellules serait lie l'abondante capsule polysaccharidique produite par ce germe. 2. S. saprophyticus Cette espce a un nom particulirement mal choisi puisqu'elle peut tre responsable d'infections urinaires qui ont la particularit de s'observer chez des

Chapitre 1 - Slaphylococcus________________________________________________________25

jeunes femmes habituellement non hospitalises. Cette espce serait responsable de 5 10 % des infections urinaires en raison de son aptitude adhrer l'pithlium urinaire. 3. Les autres espces Elles ont un pouvoir pathogne trs occasionnel ou mme discutable. Pour affirmer leur rle dans une infection, il est ncessaire d'isoler la souche plusieurs reprises en l'absence d'une autre espce bactrienne potentiellement pathogne. C - Facteurs toxiques labors par les staphylocoques coagulase - ngatifs Ces staphylocoques peuvent laborer des hmolysines de type delta, et parfois une coagulase lie, une fibrinolysine, une leucocidine, une DNase. Pratiquement, les souches isoles d'infections (plaies, hmocultures, abcs) produisent plus frquemment un ou plusieurs de ces facteurs de virulence que les souches isoles de sujets sains. IV - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE DES INFECTIONS STAPHYLOCOQUES A - Traitement antibiotique Les antibiotiques ont modifi le pronostic des infections graves comme la staphylococcie maligne de la face. Les infections systmiques staphylocoques, que ce soit S. aureus ou S. epidermidis, doivent tre traites par une antibiothrapie bactricide. Cette bactricidie est gnralement obtenue en associant une pnicilline du groupe M un antibiotique d'une autre famille. La rsistance d'une souche toutes les bta-lactamines justifie l'emploi d'un antibiotique comme la vancomycine ou la teicoplanine qui sont constamment actifs, mais sont aussi plus lentement bactricides et plus coteux. 1. Le problme des bta-lactamines al La scrtion de pnicillinases Description du phnomne Aujourd'hui prs de 90 % des souches de staphylocoques isoles en milieu hospitalier et en milieu extra-hospitalier rsistent la pnicilline G par production de pnicillinases qui ouvrent le cycle bta-lactame de la molcule et inactivent l'antibiotique. Ces pnicillinases sont extra-cellulaires, inductibles et gnralement codes par des plasmides. Elles inactivent les pnicillines G et V, les aminopnicillines, les carboxypnicillines et les uridopnicillines. Par contre elles ont peu d'affinit pour la mticilline, l'oxacilline, la cloxacilline et toutes les cphalosporines qui restent actives sur ces souches productrices de pnicillinases. Ces pnicillinases sont inhibes par l'acide clavulanique. Dtection de la rsistance enzymatique La production de pnicillinase est dtecte en observant sur l'antibiogramme standard la zone d'inhibition autour d'un disque de pnicilline G. Elle se traduit par une diminution du diamtre d'inhibition par rapport une souche sensible, non

26

Section 1 - LES COCCI GRAM POSITIF

productrice de pnicillinase. Une souche sensible prsente un grand diamtre d'inhibition avec une bordure floue, appele zone fantme, qui correspond une lyse des bactries. Une souche rsistante par production de pnicillinases donne une zone d'inhibition plus petite bord net. A la priphrie de cette zone d'inhibition se trouvent des colonies bien dveloppes appeles colonies squatters . En pratique le disque de pnicilline G est suffisant sur l'antibiogramme pour dtecter la rsistance toutes les pnicillines. Les souches possdant une pnicillinase doivent tre considres comme rsistantes ces antibiotiques. On ne doit pas rendre un rsultat de sensibilit comme "intermdiaire". Lorsqu'un doute persiste sur le fait qu'une souche produise ou non une pnicillinase, sa dtection peut tre faite par test de Gots, test acidimtrique, ou par un test iodomtrique ou plus simplement par le test la nitrocfine. bl La rsistance intrinsque ou rsistance htrogne la mticilline Description du phnomne Ce mcanisme de rsistance non enzymatique aux bta-lactamines a t observ ds 1961, poque de l'introduction de la mticilline en thrapeutique. Les souches qui le possdent sont dites rsistantes htrognes la mthicilline ou mti R . Chez une souche mti R, seule une faible proportion des bactries est capable d'exprimer la rsistance et de crotre en prsence de mticilline. Les souches mti R doivent toujours tre considres comme rsistantes toutes les bta-lactamines, y compris aux cphalosporines de 3e gnration et l'imipnme. Elle sont galement productrices de pnicillinases. Elles sont habituellement rsistantes d'autres antibiotiques : aminosides, ttracyclines et macrolides. De 10 40 % des souches hospitalires de S. aureus isoles en France sont mti R. Leur frquence parmi les souches d'origine extra-hospitalire est faible. Cette rsistance est la consquence de modifications des protines enzymatiques intervenant dans la synthse du peptidoglycane de la paroi bactrienne. Il existe chez S. aureus au moins quatre PLP (Protines de Liaison la Pnicilline) encore appeles PBP (Penicillin Binding Protein). Chez les souches mti R on observe une diminution de l'affinit des PBP pour les bta-lactamines et la synthse d'une PBP anormale, la PBP 2a dont l'affinit pour les bta-laetamines est faible. Dtection de la rsistance htrogne II existe des souches rsistantes homognes haut niveau la mticilline. Leur dtection par antibiogramme ne pose pas de problme. Plus souvent la rsistance est htrogne et seule une faible fraction des bactries est capable d'exprimer sa rsistance dans des conditions standards de culture. Pour favoriser l'expression de cette rsistance la mticilline sur antibiogramme il est ncessaire de placer un disque de mticilline (ou d'oxacilline qui est plus stable) : - soit sur une bote de glose de Mueller-Hinton incube entre 25 et 30C et observe aprs 24 et 48 heures. - soit sur une bote de glose de Mueller-Hinton hypersale (5 % de NaCl) et incube 37C. Dans ces conditions, la rsistance htrogne se traduit par la prsence de petites colonies dans la zone d'inhibition autour du disque. Ces colonies sont mieux visibles aprs une incubation de 48 heures Une rsistance la mticilline doit faire considrer la souche comme rsistante toutes les bta-lactamines. Les exprimentations cliniques ont montr que ces souches taient effectivement rsistantes aux cphalosporines. En pratique, sur l'antibiogramme il n'est utile de tester qu'un seul disque : mticilline ou oxacilline. La rsistance htrogne s'exprimant mal autour des disques de cphalosporines, il est donc inutile de les employer.

Chapitre 1 - Staphylococcus

27

En cas de doute sur la mise en vidence de la rsistance intrinsque par antibiogramme il est intressant d'employer la technique de dilution en glose. Une dilution de la souche tester (spot contenant 104 CFLJ) est ensemence sur une bote de glose de Mueller-Hinton 5 % de NaCl contenant 10 mg/1 de mticilline ou 6 mg/1 d'oxacilline. La croissance de la souche sur cette bote aprs 24 48 h 35C la fait considrer comme rsistante toutes les bta-lactamines. cl La tolrance Les bta-lactamines sont des antibiotiques bactricides. Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) et les concentrations minimales bactricides (CMB) sont normalement voisines. Le rapport CMB/CMI est de l'ordre de 1 2. La tolrance est un mcanisme de rsistance particulier o la CMI est normale mais o la souche n'est lyse que par des CMB trs suprieures la CMI. Une souche est dite tolrante lorsque la CMB est au moins 32 fois suprieure la CMI. Ce phnomne concerne tous les antibiotiques intervenant dans la biosynthse de la paroi (bta-lactamines, mais aussi vancomycine, fosfomycine) avec parfois des tolrances croises comme entre les bta-lactamines et la vancomycine. Cette tolrance est lie un systme peptidoglycane-hydrolase intrinsque inoprant (dfectif). La tolrance est phnotypique, c'est--dire rversible et instable. Les souches de S. aureus tolrantes sont surtout rencontres dans les endocardites ; la frquence actuelle ainsi que la signification c-linique de telles souches sont mal tablies.

Glose MH non hypersalc 37C

Glose MH hypersale 37C ou glose HM non hypersale 30C

SCHMA 4
RSISTANTS HTROGNES

2. Les autres antibiotiques

al Les aminosides

Ils peuvent tre modifis par diverses enzymes staphylococciques : phosphotransfrases, nuclotidyltransfrases et actyltransfrases. Les souches rsistantes la gentamicine sont aussi rsistantes la tobramycine et la kanamycine (phnotype KTG) et prsentent une sensibilit diminue la ntilmicine et l'amikacine, quels que soient les diamtres d'inhibition observs pour ces 2 derniers antibiotiques. De plus, la CMB de l'amikacine est beaucoup plus leve chez ces souches. En pratique, les souches de S. aureus rsistantes la gentamicine doivent tre considres comme rsistantes tous les aminosides usuels (sauf la streptomycine et la nomycine qu'il faut tester sparment). Les souches rsistantes la tobramycine et la kanamycine (phnotype KT) sont rsistantes aussi l'amikacine et la nomycine mais restent sensibles la gentamicine et la ntilmicine. Les souches prsentant le phnotype K Nm (rsistance la kanamycine et la nomycine) sont galement rsistantes l'amikacine.

28

Section I- LES COCCI GRAM POSITIF

Ces souches rsistantes aux aminosides (particulirement le phnotype KTG) sont le plus souvent mti R. bl La vancomycine et la teicoplanine Constamment actives sur les S. aureus mme mti R, elles sont utilises uniquement en milieu hospitalier, particulirement dans les endocardites et les infections graves. La sensibilit des staphylocoques coagulase ngative la teicoplanine est moins constante et doit tre vrifie au laboratoire. cl Les macrolides En milieu hospitalier, environ 25 % des souches de S. aureus rsistent l'rythromycine et un pourcentage un peu plus faible rsiste aux lincosamides (lincomycine, clindamycine). Moins de 5 % des souches sont rsistantes aux synergistines (pristinamycine, virginiamycine). La rsistance peut tre constitutive, c'est--dire non induite, et concerne les macrolides, lincosamides et streptogramines B (Sg) (rsistance MLSg). Les streptogramines A (S^) ne sont pas atteintes et la synergie entre S/^ et Sg persiste in vitro ; la sensibilit la pristinamycine et la virginiamycine semble donc conserve. Certaines souches de S. aureus prsentent une rsistance aux MLSg induite par l'rythromycine ou l'olandomycine. Ces souches sont sensibles certains macrolides (spiramycine, josamycine, midcamycine), aux lincosamides et aux streptogramines A et B. Par contre elles sont rsistantes l'rythromycine et l'olandomycine. L'association de traces d'un de ces deux derniers antibiotiques l'un des autres antibiotiques du groupe MLS induit une rsistance MLSg identique au type constitutif. Le phnotype de rsistance isole la lincomycine seule ou associe la rsistance aux streptogramines A (LS^) est encore rarement rencontr en France. dl Le chloramphnicol, les cyclines et le cotrimoxazole Ils ne peuvent tre considrs comme des antistaphylococciques de choix. el La rifampicine Elle reste trs active mais doit toujours tre utilise en association pour viter la slection de mutants rsistants. // Autres antibiotiques Ils viennent prendre une place intressante parmi les antibiotiques antistaphylococciques, mme pour traiter les souches mti R, condition d'tre utiliss en association ; il s'agit de : - l'acide fusidique - la fosfomycine (95 100 % de souches sensibles) - les fluoroquinolones (pfloxacine, ofloxacine, ciprofloxacine...). En pratique, l o l'antibiothrapie bactriostatique est suffisante (infection ORL, cellulites, furoncles,...) on peut utiliser des produits du type pristinamycine, mais pour les infections graves (septicmies, endocardites, pneumopathies, ostomylites, choc toxique,...) on doit obtenir un effet bactricide et on peut utiliser : - si la souche est mti S, une association bta-lactamine (oxacilline ou cfalotine) et aminoside,

Chapitre 1 - Staphylococcus

29

- si la souche est mti R, des associations vancomycine et aminoside combines ou non la rifampicine, ou bien pfloxacine associe la fosfomycine ou un aminoside ou bien parfois cfotaxime-fosfomycine. Le choix est alors guid par les tudes d'activits bactricides des associations in vitro, et ventuellement par l'tude du pouvoir bactricide du srum sur la souche implique. Les souches appartenant des espces autres que S. aureus sont frquemment multirsistantes et mti R (35 66 % des souches) ; elles sont toutes sensibles la vancomycine. Signalons que la fosfomycine est toujours inactive sur S. saprophyticus. Les plus grandes difficults thrapeutiques sont rencontres avec les endocardites ou les mningites S. epidermidis et, dans ces cas, l'tude in vitro d'associations est ncessaire. A noter enfin que certaines souches de staphylocoques peuvent acqurir des rsistances vis--vis d'antiseptiques notamment mercuriels, ce qui peut favoriser la diffusion de telles souches en milieu hospitalier. B - Prophylaxie 1. Individuelle Le portage sain ne constitue pas un danger pour le sujet lui-mme. Mais chez un sujet porteur de furonculose chronique, il faut liminer ce portage. Lors d'une lsion staphylococcique volutive, il faut viter une septicmie. Des essais de vaccins base de staphylocoques ou d'anatoxine n'ont pas dbouch sur des rsultats convaincants.
2. Collective

II conviendrait thoriquement d'viter l'emploi de porteurs de germes dans la restauration collective. La lutte contre les staphylocoques hospitaliers est un problme fondamental d'hygine hospitalire fond sur l'observation des rgles d'asepsie, l'ducation du personnel et la rationalisation de l'emploi des antibiotiques.

BIBLIOGRAPHIE
BRUN Y., FLEURETTE J-, FOREY F., Micromethod for biochemical identification of coagulase-negative staphylococci . J . Clin. Microbiol., 1978, 8, 503-508. BRUN Y., BES M. Mthodes diagnostiques des Staphylocoques coagulase ngatifs , Md. Mal. Infect., 1990, 20, n hors srie, 16-23. EL SOLH N., Infections staphylococciques lies la production de toxines bactriennes . Gaz. Md. de France, 1983, 90, 3877-3888. FLEURETTE J., Staphylocoques et Microcoques in Bactriologie Mdicale. Le Minor et J. Vron, Ed., Mdecine-Sciences Flammarion, 1990, 773-794. GOULLET P., Les toxines staphylococciques et leur action pathogne . Nouv. Presse Md., 1981, 10, 2163-2165. KLOOS W.E., SCHLEIFER K.H., Simplified scheme for routine identification of human Staphylococcus species . J. Clin. Microbiol., 1975, 1, 82-88. LEPORT C., PERRONNEC C., VILDE J.L., Les infections staphylocoques coagulase ngative. Facteurs lis l'hte , Md. Mal. Infect., 1990, 20, n hors srie, 46-51.

30

Section I- LES COCCI GRAM POSITIF

LYON B.R., SKURRAY R., Antimicrobial rsistance of Staphylococcus aureus : Genetic basis . Microbiol. Rev., 1987, 51, 88-134. MELCONIAN A.K., FLEURETTE J., BRUN Y., Studies on staphylococci from toxic shock syndrome in France 1981-1983 . J . Hyg. Camb., 1985, 23-29. SEWELL C.M., CLARRIDGE J.E., YOUNG E.J., GUTHRIE R.L., Clinical significance of coagulase-negative staphylococci . J . Clin. Microbiol., 1982,16, 236-239. VACHON F., REGNIER B., Les infections staphylocoques mticilline-rsistants . Monographie de la srie : Problmes actuels de Pathologie infectieuse et de Ranimation. Librairie Amen, 1984. WINSTON D.J., DUDNICK D.W., CHAPIN M., et al., Coagulase-negative staphylococcal bacteremia in patients receiving immunosuppressive therapy . Arch. Intern. Med., 1983, 143,
32-36.

A signaler : le numro de la Revue du Praticien (1982, tome XXXII) sur les Infections Staphylocoques et le N spcial Les staphylocoques - coagulase ngatifs et leur pathologie , Md. Mal. Infect., Mars 1990, 20, N Hors srie.

Chapitre n STREPTOCOCCUS - ENTEROCOCCUS

HISTORIQUE
En 1874, le chirurgien viennois Christian Bilroth observe dans des lsions d'rysiple un micro-organisme en forme de chanettes. En 1875, Louis Pasteur observe ce micro-organisme dans les scrtions vaginales et le sang de malades atteintes de fivre puerprale, mais ds 1869 Strasbourg Coze et Feitz avaient dj observ, lors d'une pidmie de fivre puerprale, de nombreux "points" disposs en chanettes dans le sang d'une femme dcde. En 1884, Rosenbach dcrit avec prcision Streptococcus pyogenes. Au dbut de ce sicle, Schottmuller fait une relation entre le caractre hmolytique des souches et le pouvoir pathogne ; puis Brown utilise l'hmolyse comme critre de classification. En 1933, Rebecca Lancefeld tablit la classification moderne des streptocoques base sur les proprits andgniques des hydrates de carbone.

1 - CARACTRES GNRAUX DES STREPTOCOQUES Le genre Streptococcus rassemble des espces bactriennes qui ont en commun un certain nombre de caractres.
1. Leur morphologie

Ce sont des cocci Gram positif, sphriques ou ovodes, disposs en paire pour former des diplocoques et pouvant se prsenter sous forme de chanettes parfois longues, ils ne sporulent pas.

32

Section 1 - LES COCCI GRAM POSITIF

2. Leurs proprits mtaboliques - Ils ne possdent ni catalase ( la diffrence des staphylocoques), ni oxydase ( la diffrence des Neissria). - Ils peuvent se dvelopper en arobiose, ont un mtabolisme fermentatif et sont considrer comme des anarobies tolrant l'oxygne. Des bactries anarobies strictes ont la mme morphologie et appartiennent au genre Peptostreptococcus. Le genre Streptococcus regroupe de nombreuses espces. L'une d'elles Streptococcus pneumoniae, en raison de son importance clinique et de ses particularits sera envisage sparment. Parmi les autres, il en est qui partagent des points communs particuliers qui leur ont valu d'tre rassembles dans un nouveau genre : Enterococcus. Enfin, il a t rcemment propos de regrouper les streptocoques lactiques dans le genre Lactococcus. Le tableau ci-dessous regroupe les caractres bactriologiques qui permettent de distinguer Streptococcus pneumoniae des autres streptocoques.
TABLEAU 1 S. pneumoniae Capsule Pathognicit souris Structure Ag groupe Classification Ag. Sensibilit optochine Lyse par la bile Hmolyse +(a) ' +(a) capsulaire Lund +(b) +(b) Autres streptocoques et entrocoques gnralement +ou polysaccharide C Lancefield a, P et y

(a) sauf souches R et quelques exceptions (b) sauf 10 % des souches.

II - CLASSIFICATION II n'existe pas de critre unique qui permette de classer les diffrentes espces du genre Streptococcus. La classification fait appel l'tude de trois types de caractres bactriologiques. 1. L'hmolyse Elle permet de distinguer des souches a, p ou non hmolytiques (y). Ce critre ancien n'a plus aujourd'hui qu'une valeur d'orientation.
2. La classification de Lancefield (1933)

Elle s'appuie sur des critres immunologiques qui permettent de dtecter des antignes spcifiques de groupe. La plupart des espces de streptocoques, notamment bta-hmolytiques, possdent dans leur paroi un polysaccharide C dont la composition et les proprits antigniques permettent de dfinir des groupes srologiques. La classification de Lancefield distingue 20 groupes srologiques (dsigns par des lettres de A H et de K W). Certaines espces sont dpourvues de cet antigne polysaccharidique ; ce sont souvent des souches non hmolytiques ou donnant une hmolyse dite a viridans.

Chapitre n - Streptococcus Enterococcus_______________________________________________33

Elles ne peuvent donc pas tre classes par la mthode de Lancefield. Ces streptocoques non groupables sont classs en espces grce l'tude de leurs caractres culturaux et mtaboliques. 3. Caractres culturaux et mtaboliques Ils permettent de classer les espces non groupables par la mthode de Lancefield, mais aussi au sein de certains groupes de Lancefield de reconnatre diffrentes espces : c'est le cas par exemple du groupe C qui est constitu de 4 espces :
S. equi, S. equisimilis, S. dysgalactiae et S. zooepidemicus.

4. Rcemment il est apparu que les classifications devaient tenir compte d'autres critres tels que le GC%, la comparaison des ARN ribosomaux 16S, l'hybridation ADN-ADN, la composition de la paroi (type murne) et le type des mnaquinones (Schleifer et Klipper-Balz). D a dcoul de ces lments combins aux critres prcdents que les Streptococcus devaient clater en trois genres : Streptococcus stricto sensu, Enterococcus et Lactococcus. Au sein des Streptococcus on distingue les streptocoques pyognes, les streptocoques de la flore buccale et les autres (Tableau II).
TABLEAU H CLASSIFICATION DES STREPTOCOCCUS-ENTEROCOCCUS ET LACTOCOCCUS d'aprs Schleifer et coll. adapt ESPCES (Groupes) streptocoques pyognes S. pyognes (A) S. dysgalactiae (equisimilis ) (C,G,L) S. equi (C) S. agalactiae (B) streptocoques oraux de la flore buccale Groupe "S. oralis" "S. milleri", anginosus constellatus, intermedius S. sanguis (H,W) (S. mitis) S. oralis S. pneumoniae S. mutons, rattus...

S. salivarius (K) Groupe "S. mutons" autres streptocoques (S. bovis 1 S. equinus) (D) S. suis (R,S,RS,T) S.porcinus(E,P,U,V) (S. uberis) E.faecalis (D) 3 biotypes E.faecium (D) 3 biotypes E. durons (D) 2 biotypes E. avium (D)

entrocoques

lactocoques

L. lactis, L. raffinolactis (N)

III - HABITAT Les streptocoques sont ubiquitaires. Certains d'entre eux sont rencontrs dans le milieu extrieur. Ils peuvent survivre longtemps dans celui-ci ; ainsi la dcouverte d'entrocoques dans les eaux ou les aliments signe une contamination fcale d'origine humaine ou animale.

34

Section 1 - LES COCCI GRAM POSITIF

D'autres sont plus fragiles et vivent l'tat commensal au niveau des tguments ou des muqueuses de l'homme ou des animaux. Les entrocoques et des streptocoques viridans plus rsistants sont des commensaux constants des voies digestives et de la flore buccale. La prsence normale de streptocoques au niveau cutano-muqueux explique qu'ils peuvent contaminer frquemment des prlvements et constituer des souillures. Rcemment une pidmie d'infections S. pyogenes d'origine alimentaire a t dcrite. IV - PHYSIOPATHOLOGIE A - Rle de l'adhrence Le dveloppement d'une infection streptococcique dpend des capacits d'adhrence de la bactrie la surface des cellules de l'organisme. Les bactries se fixent au niveau des surfaces cellulaires grce aux fimbriae, aux protines de surface, aux acides lipoteichoques, peut-tre aux protines M. Ces structures jouent un rle important dans l'adhrence des streptocoques. Ainsi pour les streptocoques A, les anticorps dirigs contre les antignes de groupe, de type ou les acides teichoques diminuent l'adhrence. Pour les streptocoques buccaux, les polymres de haut poids molculaire, tels les dextranes ou lvanes (PM > 200 000), jouent un rle important dans la fixation de ces streptocoques (S. sanguis...) aprs bactrimie au niveau du tissu cardiaque ou sur place au niveau de la plaque dentaire (5. mutons...). Pour cette dernire espce, la synthse de dextrane se fait partir du glucose ou du saccharose sous l'influence de glucosyltransfrase ou de fructosyltransfrase. On a pu montrer par des endocardites exprimentales une relation entre l'aptitude produire du dextrane et l'aptitude provoquer une endocardite. L'adhsion au niveau des tissus cardiaques requiert un nombre minimal de bactries. Cette fixation est rapide et les bactries sont dans les 24 heures recouvertes de fibrine, ce qui les protge de la phagocytose. Seules les bactries de surface sont mtaboliquement actives. Celles qui sont enchsses dans les vgtations ou la fibrine ont une activit diminue, elles sont donc plus difficiles dtruire par les antibiotiques. La production de dextrane par les streptocoques buccaux (S. mutans et S. sanguis) permet ces espces d'adhrer l'mail des dents et favorise l'adhsion d'autres espces bactriennes grce aux fibres polysaccharidiques de surface que sont les glycocalyx . Cela explique que si S. sanguis et S. mutons reprsentent 90 % de la flore de la plaque, d'autres espces notamment anarobies sont prsentes. Les dextranes et lvanes prsents sont dgrads par les bactries de la plaque. Ils sont mtaboliss en entrant dans le cycle des fermentations, avec production d'acides pyruvique, lactique, propionique, butyrique... qui entranent la destruction des cristaux d'apatite de l'mail, qui sera suivie d'une dsorganisation organique de l'mail, donc de carie. B - Le rhumatisme articulaire aigu (RAA) Pour expliquer le rhumatisme articulaire aigu d au streptocoque de groupe A. (S. pyogenes) deux thories existent :
L La premire thorie autoimmune est argumentes par :

- L'existence d'une priode de latence entre l'infection streptococcique et le dveloppement du rhumatisme.

L'exagration de la rponse anticorps chez les sujets avec RAA par rapport aux autres. La raction des anticorps antistreptococciques A vis--vis des myofibrilles et des valves cardiaques avec dpt d'immuncomplexes et de complment au niveau de ces structures, ainsi que des neurones subthalamiques et des noyaux cauds du systme nerveux central. De mme on retrouve un accroissement du taux des immunoglobulines et une diminution des taux de Cl, C4 et C3 dans le liquide synovial des sujets prsentant une polyarthrite rhumatode.
TABLEAUffl RACTIONS CROISES ENTRE STREPTOCOQUE A ET TISSUS HUMAINS Structures impliques Streptocoque A___________Tissus Humains Sarcolemne et Paroi Membrane cellulaire Subsarcolemne Noyaux cauds et subthalamiques Antigne de groupe A Glycoprotines des valves Acide hyaluronique Tissus articulaires.

2. La seconde thorie d'hypersensibilit

Les lymphocytes T sensibiliss pourraient ragir avec les antignes streptococciques et relcher des lymphokines en quantit exagre. Plaident en faveur de cette hypothse, l'augmentation de la rponse lymphocytaire prolifrative lors des pousses du RAA mais galement une association de cette rponse avec une prdisposition gntique de certaines individus lie aux groupes tissulaires (HLA-A 35). Toutefois c'est la thorie d'une maladie autoimmune qui est le plus souvent avance. C - La glomrulonphrite post-streptococcique La physiopathologie de la glomrulonphrite aigu post-streptococcique est explique par diverses thories : - Le mcanisme le plus souvent invoqu est le dpt de complexes immuns antigne-anticorps dans les capillaires de la membrane basale glomrulaire, - la formation d'anticorps provoquerait des altrations des protines de l'hte ou des antignes glomrulaires. - les ractions croises entre glomrules et streptocoques nphritognes existent. - un effet toxique direct des toxines ou produits d'origine streptococcique sur les membranes basales glomrulaires peut intervenir. - la persistance de formes latentes (forme L) aprs pisode initial a aussi t invoque. Mais aucune de ces hypothses ne suffit elle seule pour expliquer la pathognse des glomrulonphrites post-streptococciques. Ces quelques exemples donnent une ide de la complexit de la physiopathologie des infections streptococciques. V - POUVOIR PATHOGENE A - Streptococcus pyogenes (groupe A) La pathologie est trs varie et la physiopathologie complexe ; on peut distinguer arbitrairement :

36_____

Section I-LES COCCI GRAM POSITIF

-Les manifestations locales et rgionales : ORL -angines rythmateuses ou rythmato-pultaces - abcs priamygdaliens, adnites cervicales, adnophlegmons - rhinites, sinusites, otites suppures, mastodites

cutanes
- rysiple, imptigo - cellulite, fasciites ncrosantes, myoncrose - surinfections de plaies et de brlure, d'ulcres - vulvovaginites, anites, redites - rythme noueux -Les manifestations gnrales - prcoces : scarlatine, septicmies, endocardites (rares), localisations suppures articulaires, pleuropulmonaires, mninges... des "toxic shock syndroms" like ont t signals. - post-streptococciques : rhumatisme articulaire aigu avec ou sans cardite, glomrulonphrite, chore. - les streptocoques des groupes C et G ont un pouvoir pathogne analogue au groupe A. Les complications post-streptococciques sont plus rares. B - Streptococcus agalactiae (groupe B) - Infections prinatales : Au moment de l'accouchement 1 2 % des enfants sont coloniss, soit au moment du travail (infection ascendante) soit lors de l'accouchement, mais seulement 1 enfant sur 10 fera une infection. L'enfant peut prsenter : une forme prcoce grave, survenant avant le 10e jour de la vie, avec dtresse respiratoire, parfois septicmie et mningite. une forme tardive apparaissant aprs le 10e jour, souvent mninge. - Autres infections pouvant tre observes chez l'adulte : - osto-arthrites, - infections urinaires, gnitales, cutanes, - pleuropneumopathies, - septicmies, endocardites, mningites. C - Entrocoques, streptocoques du groupe D et streptocoques non groupables dits viridans - Bactrimies et septicmies sans localisations pyognes (espces diverses dont E. faecalis) - Endocardites : certaines espces sont impliques en priorit (tableau IV) notamment S. sanguis, S. mitis, S. mutons, S. bovis (cette dernire espce est souvent retrouve associe des tumeurs coliques). - Infections urinaires (entrocoques, principalement E. faecalis). - Caries dentaires (S. mutons, S. salivarius, S. sanguis, S. milleri...)

Chapitre V - Streptococcus - Enlerococcus

37

D - Autres streptocoques Diffrents srogroupes peuvent tre retrouvs dans des septicmies, des endocardites, des mningites (en particulier S. suis isol lors de mningites chez des charcutiers).
TABLEAU IV FRQUENCE RELATIVE DES DIFFRENTS STREPTOCOQUES IMPLIQUS DANS DES ENDOCARDITES INFECTIEUSES, D'APRS DEUX STATISTIQUES PORTANT SUR UN ____________________GRAND NOMBRE DE CAS____________________ Etienne Paricer 1982 1978 S. Groupes A-B-C-G Groupe D - E.faecalis - E. bovis S milleri S. mitis S. mutons S salivarius S sanguis S.inclassables 5,1 15,6 9,6 5,2 16,5 2,7 1,7 36,6 7,0 5,0 5,7 17,3 5,4 13,2 14,2 1,8 23,7 7,9

VI - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A - Morphologie Les streptocoques et les entrocoques se prsentent sous forme de cocci Gram positif. La taille de chaque lment est infrieure 2 (im ; elle varie avec les espces. Les cocci sont ronds ou ovalaires, le grand axe tant alors dans le sens de la chanette. En cas de souffrance (antibiotiques, mutants dficients) des formes pseudobacillaires ou monstrueuses peuvent tre observes, elles prennent parfois mal le Gram. Les lments sont groups en chanettes plus ou moins longues (de 2 plus de 50 cocci) ; la division se faisant perpendiculairement l'axe de la chane. Les lments sont * souvent rapprochs en diplocoques au sein de la chane. Ils sont immobiles ( l'exception de quelques entrocoques :E. casseliflavus, E. gallinarum). Une capsule peut tre observe avec certaines espces. B - Caractres culturaux 1. Conditions de culture - Une atmosphre enrichie en CO^ favorise les primocultures. - La temprature optimale est de 37C, mais les entrocoques poussent aussi
45C.

- Le pH optimal est de 7,3. Les entrocoques peuvent crotre en bouillon un pH atteignant 9,6. Un pH acide est nfaste la croissance de la plupart des streptocoques en effet, il se produit une acidification secondaire d'o l'intrt du milieu tamponn de Todd - Hewitt.

38

Section I- LES COCCI GRAM POSITIF

2. Aspect des colonies La quasi totalit des espces se dveloppent bien sur milieux riches type glose Columbia. Aprs 24-48 heures de culture, les colonies des streptocoques de groupe A, C et G ont un diamtre de 0,5 mm ; elles sont transparentes, translucides, en dme (S). Celles du groupe B sont plus larges (S), parfois pigmentes en jaune-orange en anarobiose. Celles du groupe D (entrocoques) sont souvent larges 0,5-1 mm, plus opaques, et souvent blanchtres et peuvent ressembler des colonies de staphylocoques. Celles des espces non groupables ont des tailles variables allant de 0,1 0,5 mm, ont des aspects mucodes et brillants, elles sont parfois translucides. A noter que les streptocoques des groupes A, C et G peuvent donner des petites colonies minutes , tout comme les streptocoques du groupe F. 3. L'hmolyse L'tude de l'hmolyse autour des colonies sur glose 5 % de sang (de mouton ou de cheval) permet une premire orientation diagnostique. - Description On distingue : - L'hmolyse a : incomplte avec verdissement du milieu ; - L'hmolyse P : totale avec claircissement de la glose autour des colonies (diamtre 3-4 mm). L'hmolyse observe en milieu arobie est due l'action de la streptolysine S. Cette hmolyse est nette en 24 48 heures, quelquefois aprs sjour 4C. Une hmolyse bta en cocarde avec hmolyse totale distance de la colonie et hmaties intactes au contact de la colonie est parfois observe. - L'absence d'hmolyse (y). - Facteurs influenants - L'atmosphre d'incubation : l'anarobiose favorise l'hmolyse bta de certains streptocoques A. - La composition du milieu : le glucose empche l'apparition de l'hmolyse sur glose au sang frais avec les streptocoques de groupe A, caractre utilis des fins de diagnostic. Le nucleinate de sodium, par contre accentue l'hmolyse : - L'paisseur du milieu joue galement un rle dans la visualisation de l'hmolyse.

- Camp-test
En mettant en prsence une souche de streptocoque B (produisant une protine extracellulaire appele Camp-factor) et un Staphylococcus aureus produisant une bta-hmolysine, on observe au point de rencontre des deux substances une zone d'hmolyse complte avec un aspect en caille.
4. Milieux slectifs

Beaucoup de produits contenant des streptocoques tant polymicrobiens, il est utile de recourir des milieux slectifs. Ces milieux permettent parfois d'orienter vers un diagnostic de groupe ou d'espce (milieux hostiles pour les groupes D par exemple). On dispose de milieux slectifs d'enrichissement ou d'isolement. - milieu l'azide de sodium (inhibe les Gram -) et au cristal violet (inhibe les staphylocoques) ; deux milieux sont employs pour la recherche des entrocoques dans les eaux : le milieu de Rothe et le milieu de Litsky.

Chapitre n - Sireplococcus - Enterococcus

39

milieu de Todd-Hewitt modifi pour isoler les streptocoques B, milieux ac. nalidixique + gentamicine ou polymyxine cristal-violet.
TABLEAUV TESTS DE PRIDENTIFICATION Groupe D GROUPE Hmolyse Bile-esculine NaCl 6,5 % Bacitracine Hippurate Optochine A B c G P a-P P P - - - (+) S (R) (R) (R) - + - R R R R Enterococcus Streptococcus** S. viridans 5'. pneumoniae

a* + +
R (-) R

a + R R

a (-) (S) (-)


R

a (S) S

* P pour E.faecalis var. zymogenes ; ( ) quelques exceptions ; S=sensible ; R= rsistant ** S. bovis, S. equinus

C - Diagnostic de prsomption Cinq caractres combins permettent une pridentification avec une approximation intressante (Tableau V), ce sont : 1. L'hmolyse dont l'aspect a ou p a t dcrit plus haut
2. Le test ble-esculine

Le milieu bile-esculine contient 40 % de bile. Il ne doit pas tre confondu avec le milieu l'esculine, qui ne doit pas tre utilis comme test de prsomption. La culture et le noircissement du milieu bile-esculine est trs spcifique des streptocoques de groupe D. Parmi les streptocoques viridans, des souches bile-esculine positives peuvent s'observer avec Streptococcus mutons. 3. Le bouillon 6,5 % de NaCl .

Le test de tolrance au NaCl permet de distinguer les entrocoques des autres streptocoques de groupe D. Mais il n'est pas trs spcifique puisqu'environ 80 % des streptocoques de groupe B montrent ce caractre.
4. La sensibilit la bacitracine

Ce test a t trs critiqu car c'est une preuve mal standardise : la charge des disques n'est pas toujours prcise par les fabricants ; la densit de l'inoculum varie ; le diamtre de la zone d'inhibition considr comme significatif, n'est pas toujours le mme. Maxted, qui a dcrit ce test, n'a pas dfini le diamtre de la zone d'inhibition. Si l'on retient toute zone d'inhibition quelqu'en soit le diamtre, la presque totalit des streptocoques du groupe A est sensible la bacitracine. 5. L'hydrolyse de l'hippurate de sodium Presque tous les streptocoques du groupe B hydrolysent l'hippurate de sodium. Mais ce caractre est trouv avec certains streptocoques de groupe D et quelques Streptococcus viridans. Il faut souligner au sujet de ces tests de prsomption, que la totalit des Listeria donne une raction positive sur le milieu bile-esculine et que deux tiers des souches

4 0 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ S e c t i o n 1 - LES COCCI GRAM POSITIF

de Listeria hydrolysent l'hippurate. La recherche de la catalase est donc importante pour l'identification d'un streptocoque. D - Diagnostic de certitude L'identification prcise d'un streptocoque repose sur l'tude de ses caractres antigniques et sa classification dans les groupes de Lancefield. Pour les espces dpourvues d'antigne de groupe l'identification repose uniquement sur l'tude des caractres physiologiques et mtaboliques.
1. Structure antignique et classification sroogique al Antignes structuraux

Leur localisation est indique sur le schma d'un streptocoque-entrocoque idal (figure 1)
*- CAPSULE (ac. hyaluronique) COUCHE PROTEINIQUE (antignes M, T, R) CARBOHYDRATE MUCOPEPTIDE MEMBRANE CYTOPLASMIQUE (acide teichoque) CYTOPLASME (nucloprotinc)

PAROI CELLULAffiE

''^^J FIGURE 1 REPRSENTATION SCHMATIQUE DES COMPOSANTS CELLULAIRES DES STREPTOCOQUES DU GROUPE A (Modifi d'aprs R.M.KRAUSE)

a) Antignes capsulaires : Diffrentes catgories d'antignes peuvent tre distingues selon leur composition : - acide hyaluronique : streptocoques du groupe A (S. pyogenes), et certains streptocoques du groupe C (S. equi et S. zooepidemicus). - polysaccharides et protines spcifiques de type pour les streptocoques de groupe B - dextranes retrouvs chez certains reprsentants du groupe D (S. bovis I) ou non groupables (S. sanguis, S. mutons) ou lvanes (S. salivarius). P) Antignes lis la paroi : Les antignes de groupe ont permis la classification de Lancefield, ils sont : - soit polysaccharidiques : polyoside C des groupes A-B-C-E-F-G-H-K-L-M-OP-R-S-T-U-V. - soit base d'acides teichoques : groupes D et N. Les antignes de groupe ont t particulirement bien tudis, pour les groupes A et C : polymres de rhamnose-N-actylgIucosamine, avec des variants et pour le groupe B : rhamnose-N-actylgIucosamine-galactose. Pour le groupe D, les antignes de groupe ne seraient peut-tre pas situs dans la paroi, mais seraient prsents dans la membrane cytoplasmique ou le cytoplasme.

Chapitre n - Streptococcus - Enlerococcus

41

Les antignes de type sont en position souvent plus externe que les antignes de groupe ; ils sont situs dans la couche paritale externe pour le groupe A ; ils sont - soit de nature protique : protines M (lie aux pili), R, T parfois associes de l'acide lipoteichoque, - soit de nature polysaccharidique par exemple pour le groupe D et pour certains streptocoques non groupables (S. mutans). En profondeur on trouve une couche interne qui correspond au peptidoglycane ou mucopeptide (chanes de N-actylgiucosamine-acide N-actylmuramique relies par des ttrapeptides). y) Antignes cytoplasmiques Le cytoplasme contient un ensemble complexe nucloprotique ; les acides teichoques des groupes D sous forme libre ou lie aux lipides, soit ce niveau, soit au niveau de la membrane cytoplasmique. Cas particuliers Streptocoques du groupe A : Les antignes structuraux ont t particulirement bien tudis (Figure 1). Parmi les antignes intressants en pidmiologie et pour la physiopathologie, on retrouve : - Les protines M qui confrent , . une rsistance la phagocytose . une spcificit de type (plus de 75 types), certains lis la pathologie (Tableau VI).
TABLEAU VI RELATION ENTRE TYPE DE STREPTOCOQUE A ET TABLEAUX CLINIQUES Entit clinique Types Tous0 Scarlatine RAA Tous GlomruloInfection initiale 12,14,18 - pharynge : nphiit49, 2, 31, 52, 55, 57, 60 - cutane : aigu 49 et 13 autres types Erysiple si lysogniss par un phage induisant la toxine rythrogne

La connaissance des proprits chimiques des protines M, de leur rle et de leur place dans une perspective vaccinale a progress rcemment (Fischetti). - Les protines T qui peuvent tre communes plusieurs types M. De plus les types M peuvent possder plusieurs types T. -Le facteur d'opacit du srum (SOF) a t rvl chez 16 types M. Le typage antignique des streptocoques A comporte donc le type M, le type T et le type SOF. Streptocoques du Groupe B : La srotypie repose sur la connaissance des antignes polysaccharidiques et protiques constitutifs, comme cela ressort du tableau emprunt Geslin (Tableau VII) ; cette srotypie a fait l'objet de propositions internationales de nomenclature : le type le deviendrait le type la/c ; et de nouveaux types ont t proposs : type IV et NT1 notamment... Cette srotypie a un intrt pidmiologique et pronostique. Ainsi chez les nouveau-ns le type 1 provoquerait une infection nonatale rapide, avec mortalit leve, alors que le type III provoquerait des infections diffres avec mortalit moindre.

42

Section I- LES COCCI GRAM POSITIF

TABLEAU Vn FORMULES ANTIGNIQUES DE STREPTOCOCCUS AGALACTIAE (GROUPE B) Srotypes . Antignes polysaccharidiques la, labc Ib, labc la, labc n m ' Andgnes protiques (R ou X) Ibc, (R ou X) Ibc, (R ou X) (Ibc), (R ou X) (Ibc), (R ou X) R, (Ibc) X, (Ibc) (Ibc)

la Ib le II m R X NT (1) (1) Non typable ( ) Facultatif

bl Antignes extracellulaires

Certains streptocoques produisent des substances extracellulaires dont certaines sont antigniques ; elles ont t particulirement tudies pour le streptocoque de groupe A (figure 2).

FIGURE 2 COMPOSANTS EXTRACELLULAKES LIBRS PAR LES STREPTOCOQUES DU GROUPE A

Parmi les antignes extra-cellulaires on retrouve : - la toxine rythrogne responsable de l'ruption observe dans la scarlatine et produite par les souches lysognes - la streptolysine 0 (oxygne labile), - la dsoxyribonuclase sous 4 formes antigniques : A, B, C et D. - les hyaluronidase, streptokinase, diphosphopyridine-nuclotidase... 2. tude des caractres physiologiques et mtaboliques Elle permet d'identifier des espces dpourvues d'antignes de groupe. Elle permet aussi au sein de certains groupes srologiques de reconnatre diffrentes espces. a/ Les caractres utiliss sont : - des caractres physiologiques, avec tude - de la croissance 10C et 45C en milieu sal ou pH 9.6 en prsence d'antibiotiques ou d'antibactriens - de la rsistance au chauffage - de la rduction du tellurite ou du ttrazolium

Chapitre n - Streptococcus - Enierococcus

_______________43

* des caractres biochimiques, en tudiant les mtabolismes : * glucidiques . l'attaque de certains sucres aide l'identification. Il s'agit d'un mtabolisme fermentatif (homofermentatif) ; le produit principal final de l'attaque du glucose tant l'acide D-lactique avec ou sans formation d'actone (VP) ; les sucres utiliss sont surtout le lactose, le mannitol, le sorbitol ; l'hydrolyse de l'esculine et de l'amidon peut tre recherche. . la production de glucanes (dextranes ou lvanes) est recherche sur milieu hypersaccharos. * protiques avec recherche d'hydrolyse de la glatine, de l'arginine. * la recherche de certaines enzymes est pratique : galactosidase, DNAse etc. bl Subdivision des groupes C et D L'tude de ces caractres permet de porter des diagnostics d'espce, voire de biotype au sein de certains srogroupes tel : . le groupe C : avec 4 espces (Tableau VIII) . le groupe D du genre Enterococcus ou non (Tableau IX).
TABLEAU Vffl CARACTRES QUI PERMETTENT D'IDENTIFIER AU SEIN DES STREPTOCOQUES DU SROGROUPE C LES DIFFRENTES ESPCES S. equisimilis S. zooepidemicus S . equi S. dysgalactiae Hmolyse Bta Bta Bta Non hmolytique Lactose var. + " + Trhalose + + Sorbitol + var. Origine Homme Animale Animale

Cheval

Animale Vache

L'espce E. faecalis peut elle-mme tre subdivise en trois sous-espces : E.faecalis var. zymogenes a une hmolyse bta, E. faecalis var. liquefaciens liqufie la glatine et E.faecalis var. faecalis n'a aucun des deux caractres cits. D'autres Enterococcus ont t dcrits : E. gallinarum, E. casseliflavus (tous deux mobiles), E. malodorus, E. hirae, E. mundtii (ces deux derniers pigments en jaune comme E. casseliflavus). cl Classification des streptocoques dpourvus d'antigne de groupe ou streptocoques viridans (streptocoques oraux)
TABLEAUK DIAGNOSTIC D'ESPCE AU SEIN DU GROUPE D (STREPTOCOCCUS ET ENTEROCOCCUS) Genre Enterococcus Espce faecalis* faecium durons avium D Groupe de Lancefield D D DetQ + + + + Croissance 45C + + + 10C + Rsistance au tellurite de K + + + Hydrolyse arginine glatine V** + + Fermentation sorbitol + glycrol +' + arabinose + + + mannitol Hydrolyse de l'amidon Production glucane * var. zymogenes bta-hmolydque, ** var. liquefaciens : gela tine+ Streptococcus bovis equinus D D + + . -

i vn + + +

44

Section I - LES COCCI GRAM POSITIF

Les streptocoques dpourvus d'antigne de groupe sont habituellement appels viridans bien que certains d'entre eux ne soient pas hmolytiques. Ils sont aussi appels non groupables, mais lors des essais de groupage par la mthode de Lancefield un anneau est parfois observ avec le groupe H, K ou E. Ces streptocoques sont responsables d'environ la moiti des cas d'endocardites lentes. Les caractres permettant de les identifier sont montrs dans le tableau X. Il existe d'autres espces de streptocoques oraux tels S. anginosus, S. constellatus, S. intermedius, S. oralis et rcemment S. vestibularis (Coykindall, Schleifer).
TABLEAUX SCHMA RDUIT D'IDENTIFICATION DES STREPTOCOQUES NON GROUPABLES (D'aprs HORODNICEANU ET DELBOS) S. S. S. S. mitis sanguis II sanguis 1 milleri Fermentation des sucres Lactose Raffinose Inuline Mannitol Hydrolyse de l'arginine Hydrolyse de l'esculine Actone Production de dextrane Production de levane Croissance sous CO^ S. mutons S. salivarius

S.
morbillorum

+ var
-e

+ +

+ var + + + -^

+
e + + + -

+ + + +
.e +

+ + + + var + -

e e

var
-c -e

var + var

-e
-e

var

var

(e) : quelques exceptions

L'aspect des colonies sur un milieu glose saccharose 5 % permet de reconnatre les souches qui produisent des dextranes ou des levanes, caractre utile au diagnostic. L'emploi d'un bouillon 5 % de saccharose est intressant pour le diagnostic de S. sanguis qui provoque une glification du milieu et pour S. mutons qui forme un dpt adhrent aux parois et au fond du tube. Des streptocoques non groupables, il faut rapprocher les streptocoques dficients, galement dsigns comme : thiol-dpendants, dpendants en vitamine B6 ou pyridoxal. Ces souches cultivent souvent en bouillon alors qu'elles sont incapables de cultiver sur milieu glose. Il est habituellement possible d'obtenir une culture sur glose en pratiquant un test de satellitisme. La souche de streptocoque dficient est ensemence par flottage sur une bote de glose au sang, la manire d'un antibiogramme. Sur cette bote on effectue ensuite une strie avec une culture de Staphylococcus aureus. Le streptocoque dficient se dveloppe au contact de la culture de S. aureus dont il utilise les produits de catabolisme qu'il est incapable de synthtiser lui-mme. Les rcents travaux taxonomiques proposent de distinguer 2 espces chez les streptocoques dficients : S. defectius et S. adjacens.

Chapitre n - Streptococcus - Enlerococcus

45

VII - DIAGNOSTIC DIRECT A - Prlvements et cultures 1. Hmocultures Elles sont pratiques dans un contexte clinique de septicmie ou d'endocardite. On doit pratiquer entre 6 et 10 hmocultures sur 48 heures en utilisant 2 types de flacons : arobies et anarobies (coeur-cervelle, Schaedier). L'emploi de milieux enrichis permettant la culture de streptocoques dficients (enrichis en groupements thiols) est parfois utile. Les repiquages doivent tre effectus aprs recherche de trouble ou de microcolonies, avant toute agitation, sur milieux riches en sang, sang cuit en atmosphre CO^ou anarobie. Si la morphologie est vocatrice, on peut cultiver les streptocoques dficients en satellitisme d'une strie de staphylocoque et sur milieux spciaux. Presque toutes les espces de streptocoques ou d'entrocoques peuvent tre retrouves. L'interprtation de l'hmoculture avec une seule hmoculture positive contenant un streptocoque non hmolytique est dlicate. 2. Liquide cphalo - rachidien Le streptocoque de groupe B est le plus souvent isol chez le nouveau-n. Le liquide est en rgle purulent, mais la culture peut parfois tre positive en l'absence de raction cellulaire, notamment chez les nouveau-ns. L'ensemencement sur glose au sang sous CO^ favorise la croissance. L'isolement dans un LCR d'un entrocoque ou streptocoque non groupable doit tre interprt avec prudence, en dehors d'un contexte particulier, ou d'isolements rpts, notamment si l'examen direct est ngatif. 3. Urines Les infections urinaires streptocoques des groupes D et B ne sont pas exceptionnelles. Les entrocoques sont des contaminants frquents des urines, aussi la bactriologie quantitative a-t-elle un intrt tout particulier ; l'isolement ncessite le recours une glose au sang. 4. Prlvements pharyngs Les prlvements doivent tre pratiqus avec un abaisse-langue, sous contrle visuel. L'couvillonnage est effectu au contact des amygdales, de la muqueuse pharynge et/ou des zones purulentes ou cryptiques. Si l'couvillon ne peut pas tre plac en milieu de transport ou de survie, il doit tre achemin rapidement aprs avoir t humect pralablement avec du srum physiologique. La recherche est essentiellement oriente vers les streptocoques bta-hmolytiques de groupe A. La mise en vidence d'entrocoques ou de streptocoques non groupables est normale, ces bactries faisant partie de la flore commensale. On peut utiliser des milieux d'enrichissement paralllement aux milieux slectifs d'isolement. 5. Prlvements cutans La recherche de streptocoques bta-hmolytiques non seulement A, mais aussi C et G doit tre systmatique dans les dermatoses en gnral, l'rysiple en particulier, soit par couvillonnage simple, soit par couvillonnage au niveau de l'orifice de biopsie. Tous les streptocoques peuvent tre retrouvs dans les pus ou collections purulentes, mais les entrocoques et les streptocoques non groupables sont des lments de la flore cutane normale et contaminent frquemment les prlvements locaux.

46

Section 1 - LES COCCI GRAM POSITIF

6. Prlvements gnitaux Les streptocoques P hmolytiques A et B doivent tre recherchs. 7. Prlvements priphriques Ils sont surtout pratiqus chez les nouveau-ns, pour apprcier la colonisation nonatale. Les examens systmatiques comportent la recherche du streptocoque B dans : - les frottis amniotiques, frottis de liquide gastrique, - les frottis placentaires, - les prlvements superficiels : anus, yeux, bouche, cutans... 8. Autres prlvements On peut tre amen rechercher les streptocoques dans : - les valves cardiaques au cours d'interventions post-endocardites, ou d'autopsies, - les eaux, les aliments pour dtecter une contamination fcale (entrocoques). B - Dmarche diagnostique L'examen direct de certains prlvements : pus, liquides de ponction, LCR... peut en visualisant des cocci en chanettes tre vocateur de streptocoques. De mme cette morphologie observe sur les cultures, et des colonies typiques, jointe l'observation du type d'hmolyse permet une orientation du diagnostic. Schmatiquement : 1. Si l'on se trouve devant des colonies bta-hmolytiques, on procde immdiatement un groupage dans le systme de Lancefield, en procdant successivement : - une extraction de l'antigne de groupe : non plus par la technique classique de Lancefield (extraction HC1), ou la formamide ou l'autoclave (rserv certains groupes D), mais plutt par technique chimique telle l'extraction nitreuse, ou par extraction enzymatique (pronase B, ou enzyme de Streptomyces albus, voire association de cette enzyme avec le lyzozyme : 37C ou 45C durant 30 120 minutes selon les recommandations du fabricant). - une mise en vidence de l'antigne de groupe, assez rarement actuellement par test de prcipitation en tube capillaire ou en contreimmunoelectrophorse, mais plutt par raction d'agglutination en mettant en prsence l'extrait avec des particules sensibilises avec des anticorps antigroupes A, B, C, D, F et G fixs soit sur des Staphylococcus aureus porteurs de protine A (coagglutination), soit sur des particules de Latex. 2. Si les colonies ne sont pas bta-hmolytiques, on peut se trouver en prsence d'hmolyses incompltes ne donnant une hmolyse bta qu'en prsence de toxine staphylococcique (Camp test pour les groupes B). Le plus souvent les colonies alpha-hmolytiques (yiridans) ou non hmolytiques correspondent des streptocoques du groupe D ou non groupables. On peut alors procder une galerie d'orientation (Tableau IV), voire directement une galerie d'identification pour arriver au diagnostic d'espce. On utilise soit des galeries classiques, soit des galeries prtes l'emploi (API strep...), compltes par l'tude des caractres culturaux, de la production de dextranes, lvanes, et par la recherche d'antignes de groupe (extraction la formamide, la chaleur) pour le groupe D en particulier, et la recherche des groupes plus rares autres que A, B, C, F, G...

Chapitre n - Streplococcus - Enterococcus

47

C - Diagnostic antignique - L'immunofluorescence a t prconise sur talement direct pour la recherche des streptocoques A et B. Cette technique a connu peu de dveloppement en France. - La recherche d'antignes de groupe B est intressante pour le diagnostic des infections nonatales en recherchant les antignes solubles dans le LCR, le srum ou les urines. La recherche d'antignes extractibles directement sur prlvements gnitaux est l'tude. - La recherche d'antignes du groupe A peut tre effectue directement sur prlvement pharyng aprs extraction soit nitreuse, soit enzymatique, par raction d'agglutination (coagglutination ou Latex) avec des rsultats rapides (10 30 minutes) ; plus rarement par technique ELISA. Vffl - DIAGNOSTIC INDIRECT Les ractifs actuellement commercialiss permettent de doser des anticorps dirigs essentiellement contre les streptocoques de groupe A ; toutefois il existe des reactions croises avec d'autres streptocoques bta-hmolytiques. Les principales toxines et enzymes induisant des anticorps dosables, les proprits de ces enzymes, le principe de leur dosage et les taux normaux sont regroups dans le tableau XI. Remarques concernant cette srologie : - il existe chez tout sujet sain un taux variable d'anticorps, - les seuils considrs comme pathologiques varient assez souvent selon les kits, les fabricants et les units adoptes, - les antistreptolysines 0 s'lvent plus aprs infection des muqueuses qu'aprs infection cutane. Le taux normal ne dpasse pas 100 UI/ml chez l'enfant en ge prscolaire et chez l'adulte 200 UI/ml. Les srums hyperlipmiques peuvent donner des taux faussement positifs d'ASLO en raison de la prsence de lipoprotine et de cholestrol, un traitement par le sulfate de dextrane, permet de pallier cette difficult. Une lvation significative des ASLO atteint son maximum en 3 4 semaines et demande 2 4 mois pour revenir la normale. L'observation d'une lvation du titre a plus d'intrt que l'observation d'un titre lev isol. Les antistreptodornases B (ADNases B) sont de plus fidles tmoins d'une infection cutane streptocoques A que les ASLO : elles sont en effet leves dans 89 % des cas contre 36 % pour les ASLO. Dans les infections pharynges, les ASLO tout comme les ANADases sont plus souvent leves que les ADNases B. Les ASH s'lvent plutt dans les infections d'origine cutane. Le choix le plus judicieux d'une association est ASLO plus ADNAses B qui conduit 98 % d'efficacit diagnostique. Ainsi les ractions srologiques les plus utilises actuellement sont ASLO et ADNases B ; les autres (ANADases, ASH et ASK) sont trs peu pratiques et semblent d'ailleurs d'un intrt mineur. Certaines ractions de dpistage par agglutination passive permettent la dtection simultane de plusieurs anticorps, c'est le cas du Streptozyme- Le test est considr comme positif si l'agglutination est observe pour une dilution du srum suprieure ou gale au 1/lOOme. Ce type de test permet un diagnostic prliminaire rapide mais il n'est pas toujours efficace pour la dtection des ADNases B. Le dosage des anticorps dirigs contre le streptocoque de groupe B n'est pas encore pratiqu couramment. Ralis sur le srum des futures mres, il aurait

48

Section I - LES COCCI GRAM POSITIF

TABLEAU XI SUBSTANCES ANTIGNIQUES LABORES PAR LES STREPTOCOQUES DU GROUPE A, COMMUNAUTS ANTIGNIQUES, PRINCIPE DU DOSAGE DES ANTICORPS ET SEUILS DES VALEURS PATHOLOGIQUES ENZYMES Streptolysine 0 Streptocoques producteurs Groupes A, C, G (nombreuses souches de streptocoques A) Groupe A : toutes les souches plus quelques autres groupes (CG) Groupes A, C, G : nombreuses souches Groupes B et F : quelques souches Groupe A : surtout types 4 et 22 Groupe B, C et G : quelques souches Groupe A : certains types (3-4-12) Groupe C et G : quelques souches Proprits Anticorps spcifiques

- Toxique cytolytique Antistreptolysine 0 (rythrocytes...) (ASLO) - Inactive par l'oxygne - Active sous forme rduite Dpolymrise l'ADN Antidsoxyribonuclase (ADNase) ou Antistreptodornase B Antistreptokinase(ASK)

Dsoxyribonuclase ou Streptodomase Streptokinase ou Fibrinolysine

- Action fibrinolytique (active le plasminogne en plasmine) Hydrolyse l'acide hyaluronique

Hyaluronidase

Antistreptohyaluronidase (ASH)

NicotinamideAdnineDinucloridase

Clive le co-enzyme 1 NAD

Antistreptonicotinamide Adninedinuclotidase (ANADase)

ENZYMES Streptolysine 0 Dsoxyribonuclase ou Streptodomase Streptokinase ou Fibrinolysine Hyaluronidase

Dosage par neutralisation Hmolyse des GR lapin ou homme Dpolymrisation de l'ADN Fibrinolyse Dpolymrisation de l'acide hyaluronique

Seuil des valeurs pathologiques S 250 U.I.

S 400 Units > 150<J Christensen > 15 000 units turbidimtriques

NicodnamideAdnineDinucloddase

Scission du NAD

l50UKeUner

Chapitre n - Streplococcus - Enlerococcus

49

l'intrt de prvoir quels sont les nouveau-ns bnficiant d'une protection d'origine maternelle par transmission transplacentaire d'anticorps. Grce l'obtention de certains antignes streptococciques purifies, il a t possible de raliser, seulement titre de recherche, des srodiagnotics dans un contexte d'endocardite ( E. faecalis notamment) ou d'immunoprophylaxie dans les infections nonatales streptocoque du groupe B chez les femmes enceintes. IX - TRAITEMENT A - Prventif: - la vaccination contre les streptocoques de groupe B fait l'objet de recherches ; de mme contre le groupe A des tudes utilisant comme antigne vaccinant des protines M sont en cours. - la prvention des caries par vaccination est galement envisage. L'antibioprophylaxie est recommande pour prvenir les endocardites conscutives des extractions dentaires et pour viter les complications post-streptococciques. B - Curatif ; Sensibilit aux antibiotiques Les bactries du genre Streptococcus sont longtemps restes sensibles la plupart des antibiotiques. L'apparition depuis quelques annes de souches rsistantes aux antibiotiques classiquement utiliss tels que les pnicillines, les macrolides et apparents (2 % de rsistances pour le groupe A 6 18 % pour le groupe B et 47 % pour E. faecalis), le chloramphnicol et les cyclines, oblige une surveillance attentive de ces rsistances, tant dans une perspective pidmiologique que curative. 1. Mthodes d'tude al L'antibiogramme classique II est effectu en utilisant un milieu de Mueller-Hinton additionn de 5 % de sang et un inoculum obtenu par dilution d'une culture en bouillon, inoculum lourd (groupes A,C,F et G), lger (groupes B et D) ou intermdiaire (non groupables). Une incubation de 18 heures 37C en atmosphre de CO-, est ralise. ^ bl Dtermination du niveau de rsistance aux aminosides Deux techniques peuvent tre utilises : - soit une technique de diffusion avec des disques chargs 250 )J,g pour la gentamicine et 500 p.g pour la streptomycine. Les rsistances haut niveau donnent un diamtre infrieur respectivement 10 et 12 mm, bas niveau suprieur respectivement 14 et 18 mm. - soit une glose coeur-cervelle avec 5 % de srum de cheval dans laquelle on a incorpor une concentration finale de 1 000 et 2 000 mg/1 de l'aminoside tudier. Une souche qui se dveloppe sur le milieu a une rsistance haut niveau l'aminoside considr. cl Dtection de la tolrance Pour les streptocoques considrs comme limites ou rsistants la Pnicilline, ou pour les entrocoques, il peut tre ncessaire (endocardites notamment) de

50

SwttonI-LES COCCI A GRAM POSITIF

dterminer la CMI et la CMB en milieu liquide. On peut ainsi dceler les souches tolrantes la Pnicilline c'est--dire pour lesquelles le rapport CMI/CMB est suprieur 32. Les souches rellement rsistantes s'observent surtout parmi les streptocoques non groupables et les entrocoques. Une mthode simple de dtection de la tolrance peut tre faite sur la boite d'antibiogramme. Elle consiste, aprs lecture de l'antibiogramme, placer dans la zone d'inhibition de la pnicilline un disque contenant une bta-lactamase. Aprs une nouvelle incubation de 18 heures, la croissance de la bactrie dans la zone d'inhibition, l o la bta-lactamase a dtruit la pnicilline, signifie que la pnicilline n'a pas eu une action ltale sur la souche.
souche tolrante souche non tolrante

FIGURES DTECTION RAPIDE DE LA TOLRANCE. (Pase = disque de pnicillinase, PEN = disque de pnicilline)

Dtection rapide de la tolrance. Pase = disque de pnicillinase PEN = disque de pnicilline 2. tat actuel de la sensibilit des streptocoques Les streptocoques sont gnralement sensibles aux pnicillines et aux macrolides. Ils sont rsistants aux polymyxines et souvent aux quinolones. Il existe une rsistance naturelle aux aminosides qui sont inactifs seuls, mais ont souvent une action synergique avec les pnicillines. D'une faon gnrale les cphalosporines sont moins actives que les pnicillines. Les streptocoques ont un comportement vis--vis des antibiotiques qui diffre selon les espces. D'une faon gnrale, les entrocoques sont plus rsistants. al Streptocoques du groupe A Toutes les souches de streptocoques du groupe A sont sensibles la pnicilline G. La CMI est situe entre 0,005 mg/1 et 0,02 mg/1. La pnicilline G est l'antibiotique de choix pour la prophylaxie et le traitement des infections streptocoque du groupe A. Les macrolides et apparents sont les antibiotiques utiliser en cas d'allergie la pnicilline G. Les souches rsistantes ces antibiotiques sont exceptionnelles en France, alors que cette rsistance est frquente dans d'autres pays. Les cyclines ont une activit variable selon les souches. Le pourcentage de streptocoques du groupe A rsistant ces antibiotiques est situ entre 20 et 30 %. bl Streptocoques du groupe B Cette espce est lgrement moins sensible la pnicilline G que le groupe A. La CMI de 50 % des souches se situe 0,03 mg/1. Ces souches sont donc quand mme bien accessibles un traitement par les pnicillines. Les macrolides et apparents sont actifs dans la majorit des cas, mais environ 5 % des souches sont rsistantes ces produits.

Chapitre n - Streptococcus Enterococcus

_____

51

En ce qui concerne l'action des cyclines on observe deux populations : 80 % des souches sont rsistantes aux cyclines ; les autres sont sensibles. cl Streptocoques du groupe D Les entrocoques (E.faecalis, E. faecium etE. durans) sont relativement plus rsistants aux antibiotiques. Or, pour traiter les endocardites il est indispensable d'avoir un traitement bactricide. Les pnicillines sont moins actives vis--vis des entrocoques que vis--vis des autres streptocoques. La CMI de la pnicilline G comme celle de l'ampicilline se situe entre 1 et 8 mg/1. Les souches de E. faecium sont les plus rsistantes. Au cours des endocardites, une activit bactricide est obtenue en associant une forte dose de pnicilline un aminoside. La CMI de la streptomycine vis--vis des entrocoques est gnralement comprise entre 25 et 100 mg/1. Cette rsistance de bas niveau la streptomycine permet cet antibiotique d'avoir une action synergique avec la pnicilline. Dans un certain nombre de cas, qui peut atteindre 20 % avec E.faecalis, il existe un haut niveau de rsistance aux aminosidesrexpliqu par l'acquisition d'une enzyme modificatrice voisine de' celle dtecte chez S. aureus (plutt que par une mutation chromosomique rare). Pour ces souches, la CMI de la streptomycine est trs leve, elle est toujours nettement suprieure 1 000 mg/1. On n'observe plus d'activit synergique de l'association pnicilline et streptomycine. L'association de la pnicilline avec un autre aminoside demeure, en rgle gnrale, synergique vis--vis de ces souches. Cependant, des souches de E.faecalis hautement rsistantes la gentamicine ont t dcrites. En pratique, avant les rsultats des examens de laboratoire, l'association pnicilline et gentamicine est souvent prfrable l'association classique pnicilline et streptomycine. Si l'association pnicilline et aminoside n'est pas utilisable, un traitement bactricide est souvent obtenu en associant l'rythromycine et une cycline. L'action bactricide de cette association sur la souche d'entrocoque traiter doit tre vrifie au laboratoire.'En l'absence de possibilit d'utiliser ces deux types d'association, il reste employer un traitement comportant de la vancomycine ou la teicoplanine voire la rifampicine. Quant S. bovis, sa sensibilit aux antibiotiques le rapproche des streptocoques dits viridans bien que quelques souches hautement rsistantes aux aminosides aient t observes. dl Streptocoques viridans Les streptocoques viridans ont un pouvoir pathogne limit en dehors des endocardites. Leur sensibilit la pnicilline G est bonne. Les CMI sont comprises entre 0,06 et 0,5 mg/1. Aussi, il a t propos des traitements utilisant la pnicilline seule. Il semble difficile d'tablir des attitudes rigides en matire de traitement des endocardites streptocoques. Considrant la gravit de la maladie, toute souche de streptocoque isole au cours d'une endocardite doit faire l'objet d'une tude complte de sa sensibilit aux antibiotiques, mme si elle appartient une espce rpute sensible. De plus la recherche d'associations d'antibiotiques bactricides et synergiques in vitro est absolument ncessaire. En effet, au sein d'espces sensibles quelques souches ont parfois une rsistance inhabituelle. * 3. Surveillance du traitement d'une endocardite Les examens de laboratoire permettent d'apprcier si le traitement antibiotique est bactricide et bien adapt. Ces examens sont :

52

Section I- LES COCCI GRAM POSITIF

- la recherche de la ngativation des hmocultures ; - le dosage des antibiotiques pour avoir des taux efficaces, mais non toxiques (aminosides, vancomycine, teicoplanine) ; - l'tude du rapport efficace, taux srique/CMI ou CMB ; - la dtermination du pouvoir bactricide du srum (PBS). Il est satisfaisant si une dilution au moins gale au 1/16 laisse un nombre de bactries survivantes infrieur ou gal l%o des bactries ensemences (la standardisation de cette technique pose toujours un problme).

BIBLIOGRAPHIE
AVRIL J.L, PLAISANCE J.J, Caractres culturaux et biochimiques des streptocoques. tat actuel de la sensibilit aux antibiotiques , M d. Mal. Infect. 1980,10, 627-632. BOHACH G.A., FAST D.J., NELSON R.D., SCHLIEVERT P.M., Staphylococcal and streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses . Cru. Rev. Microbiol., 1990,17, 251-272. BOUVET A., GRIMONT F-, GRIMONT P.A.D., Streptococcus defectivus sp. nov. and Streptococcus adjacens sp. nov. nutritionaly variant streptococci from human clinicial spcimens. Int. J. Syst. Bacteriol., 1989,39, 290-294. CALDERWOOD S.A., WENNERSTER C., MOELLERING R.C., KUNTZ L.J., KROGSTAD D.J, Rsistance to six aminoglycosidic aminocyclitol antibiotics among enterococci : prevalence, volution and relationship to synergism with penicillin . Antimicrob. Agents Chemother, 1977,12, 401-405. COYDENDALL A.L., Classification and identification of th viridans streptococci , Clin. Microbiol. Rev., 1989, 2, 315-328. DELMAS P., FREYNEY J., Les Streptocoques , Lyon Md., 1989, 40, 353-369. TIENNE J., REVERDY M.E., MOUREN C., FLEURETTE J., tude bactriologique de cent vingt cinq endocardites infectieuses streptocoque , Path. Biol., 1982, 30, 707-710. FACKLAM R.R., PADULA J.F., THACKER L.G., WORTHAM E.C., SCONYERS B.J., Presumptive identificafion of group A, B and D Streptococci , Appl. Microbiol., 1974, 27, 107-113. FACKLAM R.R., Physiological diffrenciation of viridans Streptococci ,J. Clin. Microbiol., 1977,5,184-201. FISCHETTI V.A., Streptococcal M protein : molecular design and biological behavior , Clin. Microbiol. Rev., 1989, 2, 285-314. HORODNIEANU T., DELBOS F., CHABBERT Y.A., Caractristiques des souches de Streptococcus mutons isoles d'endocardites subaigus et sensibilit aux antibiotiques , Ann. Microbiol., (Inst. Pasteur), 1977,128 A, 205-216. HORODNIEANU T., BOURGUELERET L., ELSOLH N., BIETH G-, DELBOS F., High-Level plasmid-borne rsistance to gentamicin in Streptococcus faecalis subsp. zymogenes , Antimicrob. Agents Chemother, 1979,16, 686-689. HORODNIEANU T., DELBOS F., Group D streptococci in human infections : identification and sensibility to antibiotics , Ann. Microbiol., (Inst. Pasteur), 1980, 131 B, 131-155. MOELLERING R.C., KORZENIOWSKI O.M., SANDE M.A., WENNERSTEN C.B., Species-specific rsistance to antimicrobial synergism in Streptococcus faeciwn, and Streptococcus faecalis , /. Infect. Dis., 1979, 140, 203-209. ROTTA J., Some aspects on streptococci and streptococcal disease , Revue de l'Institut Pasteur de Lyon, 1982,15, 313-334. RUOFF K.L., Rcent taxonomic changes in th genus Enterococcus , Eur. J . Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1990, 9, 75-79. SCHEFTEL J.M., LAPLANCHE G., FREYDIERE M.-H., GROSSHANS E., Etude de la dtermination simultane des antistreptolysines 0 et des antistreptodomases B au cours des infections streptococciques cutanes , Ann. Dermatol. Venereol. (Paris), 1982,109, 1031-1036. SCHEIFER K.H., KILPPER-BALZ R., Molecular and chemotaxonomic approaches to th classification of streptococci, enterococci and lactococci : a review , System. Appl. Microbiol., 1987,10, 1-19. WANNAMAKER L.W., Streptococcal toxins , Rev. Infect. Dis, 1983, SuppI 4, S723-S732.

Chapitre n - Streptococcus - Enterococcus

53

ANNEXE
Autres cocci Gram positif Genre Aerococcus Aerococcus viridans II s'agit de cocci Gram positif, disposs en ttrades ou en amas. Sur glose au sang, les colonies sont entoures d'une hmolyse verdtre. A. viridans se distingue des

streptocoques et des staphylocoques par le type respiratoire microarophile. La


catalase est variable. Longtemps considr comme un simple arocontaminant, A. viridans se comporte parfois comme un opportuniste responsable d'infections hospitalires chez des malades fragiliss. Les causes favorisantes sont : diabte, immunodpresseurs, thylisme et stase vsicale. Peu sensible la pnicilline G, A. viridans est trs sensible l'ampicilline, aux cphalosporines et au trimthoprime. La sensibilit la gentamicine est faible.
BRAUER C., MONTEIL H., Aerococcus viridans, bactrie opportuniste en milieu hospitalier , Md. Mal. Infect., 1983,13, 283-286.

Genre GemeUa Deux espces sont dcrites : G. haemolysans et G. morbillorum. \ L'espce type Cemella haemolysans a t isole dans des cas d'endocardite infectieuse. On la trouve galement dans le tractus respiratoire suprieur, les yeux et l'intestin. Il s'agit de bactries anarobies, immobiles, pouvant apparatre Gram (-), isoles ou groupes en paires ou courtes chanettes. Elles sont catalase (-) et oxydase (-). G. haemolysans cre une hmolyse des rythrocytes de lapin ou de cheval. Cette bactrie est bien sensible aux antibiotiques usuels sauf aux aminosides et aux sulfamides.
CHATELAIN R., CROIZE J., ROUGE P., et al. Isolement de Gemella haemolysans dans 3 cas d'endocardite bactrienne , Md. Mal. Infect., 1982,12, 25-30.

Genres Leuconostoc - Pediococcus Les genres Leuconostoc et Pediococcus sont caractriss par une rsistance de haut niveau la vancomycine (> 512 ug/ml). Leuconostoc peut se comporter comme un pathogne opportuniste et Pediococcus peut tre slectionn et isol notamment dans les selles chez des sujets subissant une antibiothrapie lourde. Quelques caractres d'orientation permettent de distinguer ces genres (tableau I).
EDLINGER, C., PETIT, J.C.., Bactries Gram positif, catalase-ngatives rsistantes la vancomycine. La lettre de l'infectiologue, 1990, 5, 655-664.

54

Section I-LES COCCI GRAM POSITIF

TABLEAU 1 CARACTERES D'ORIENTATION PERMETTANT DE DISTINGUER LES GENRES ENTEROCOCCUS, PEDIOCOCCUS, LEUCONOSTOC, LACTOBACILLUS ET STREPTOCOCCUS Enterococcus Vancomycine Pediococcus R + Leuconostoc R + Lactobacilus R/S + d Streptococcus S

Gaz PYR*

S(1!oR) + +

LAP**

.a +

* PYR : Pyrolodony - naphtylamidase ** LAP : Leucine aminopeptidase a: Seul S.pyogenes est +

Genre Stomatococcus Stomatococcus mucilaginosus Stomatococcus mucilaginosus est isol dans prs de 10 % des prlvements bucco-pharyngs ensemencs sur glose au sang. Ce germe, souvent mconnu, hte saprophyte de la gorge et de la bouche, est parfois responsable d'infections opportunistes ou de bactriennes transitoires. C'est pourquoi les principaux caractres d'identification de ce germe ne doivent pas tre ignors : il s'agit de cocci Gram positif en amas, produisant un abondant matriel capsulaire, ayant une activit catalasique faible ou nulle, rduisant les nitrates en nitrites, hydrolysant l'esculine et la glatine et produisant de l'actone. Ces bactries croissent sur glose au sang ou sur milieu columbia, mais pas en prsence de 5 % de NaCl. Elles forment des colonies blanches, non hmolytiques et adhrant la glose.
HADOU T., LOMBARD C., PIEMONT Y., PREVOST G., Stomatococcus mucilaginosus : une bactrie souvent mconnue mais frqemment rencontre , Md. Mal. Infect., 1990,20,490-492.

Chapitre ffl STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

HISTORIQUE
Isol de la salive en 1880 par Pasteur, S. pneumoniae reste, malgr sa sensibilit aux antibiotiques, la premire place parmi les causes de mortalit par maladie infectieuse dans les pays dvelopps. La dcouverte en 1910 des diffrents types srologiques de S. pneumoniae avait permis l'emploi d'antisrums spcifiques qui furent le premier traitement efficace de la pneumonie pneumocoque. L'tude de la physiologie de cette bactrie a conduit des dcouvertes capitales qui ont ouvert la voie la biologie molculaire. En 1928, Griffith a montr qu'une souche R (rough) non capsule et non pathogne pour la souris de S. pneumoniae pouvait tre transforme en une souche S (smooth), capsule et pathogne. En 1944, Avery, Mac Leod et Mac Carthy tablirent les bases de la gntique bactrienne en montrant que l'ADN est le facteur transformant chez les pneumocoques.

I - HABITAT Le pneumocoque colonise frquemment les voies respiratoires de l'homme puisqu'il y aurait jusqu' 70 % de porteurs pharyngs sains ; on peut parfois le retrouver au niveau des muqueuses gnitales. C'est un germe transmis par voie arienne : la transmission est presque toujours directe par l'intermdiaire des gouttelettes de Pflgge. Le germe, rput fragile, survit peu dans le milieu extrieur. C'est un germe essentiellement humain, il est trs rarement isol chez les animaux. II - PHYSIOPATHOLOGIE Les dcouvertes de ces dernires annes clairent certains faits observs en pathologie infectieuse, mais ne rglent pas tout. Pendant longtemps, on a pens que la capsule tait responsable du pouvoir pathogne (Avery : pouvoir pathogne exprimental sur la souris). La souche S capsule tuait la souris, la souche R non capsule tait inoffensive. Ce n'est plus tout fait exact : on peut avoir deux souches capsules du srotype 3 qui ont la mme composition chimique du polysaccharide, l'une virulente, l'autre non virulente pour la souris ; la capsule n'est donc pas le seul support de virulence. La capsule protge S. pneumoniae de la phagocytose.

56

Section I-LES COCCI QRAM POSITIF

L'volution de la maladie est lie directement aux taux d'antignes capsulaires circulants et l'absence d'anticorps ; on sait que dans les infections pneumocoques la voie alterne du complment est active et que les acides teichoques de la paroi provoqueraient un clivage du C3 en sous units C3a et C3b ; il en rsulterait une baisse du taux de C3 et du facteur B. L'une des consquences serait une coagulation vasculaire dissmine. Une agrgation des polynuclaires neutrophiles peut s'observer, elle est lie une altration des membranes de ceux-ci probablement sous l'influence de la pneumolysine. Cette altration des polynuclaires entrane une leucostase dans les capillaires pulmonaires responsable d'hypoxie et de dcompensation cardio-respiratoire. Leucopnie et cytopnie rachidiennes sont de mauvais pronostic dans les infections pneumocoque. III - POUVOIR PATHOGNE A - Exprimental La souris est l'animal de choix, l'inoculation intrapritonale de pneumocoques capsuls entrane la mort de la souris. A l'autopsie on observe des germes capsuls dans le sang et sur les empreintes d'organes (foie...). Cette inoculation a t utilise pour isoler les germes partir des produits pathologiques et pour identifier des souches isoles. On utilise de moins en moins cette inoculation la souris. Ce pouvoir pathogne pour la souris n'est pas constant, certains srotypes (tel le 14) sont peu pathognes, de mme que les souches en phase R. B - Naturel Les infections pneumocoques peuvent atteindre des sujets jusque-l en bonne sant ; mais elles sont plus frquentes et plus graves chez les patients prsentant certains terrains immunologiques (agammaglobulinmie, splnectomie, traitements immunodpresseurs), mais aussi chez des patients l'immunit perturbe tels que drpanocytaires, sujets gs... La mortalit crot avec l'ge, le retard l'hospitalisation, l'existence de tares associes (diabte, aplasie, cirrhose, nphrite, cancers...)... Les localisations les plus frquentes sont ORL, surtout chez l'enfant type d'otites ou de sinusites ; elles peuvent constituer des portes d'entre pour des infections plus graves. 1. La pneumonie franche lobaire aigu Elle est trs fbrile, s'accompagne d'un point de ct thoracique avec crachats rouilles et signes de condensation pulmonaire ; ct de ce tableau classique le pneumocoque intervient dans les surinfections pulmonaires post-virales (grippe par exemple). Dans les pneumopathies la mortalit moyenne est de 20 % ; cette mortalit est plus leve lorsque les hmocultures sont positives. 2. Les mningites pneumocoques Elles surviennent tout ge mais surtout chez le nourisson et le vieillard. Elles sont primitives ou secondaires un foyer ORL ou un traumatisme crnien ; elles sont

Chapitre m - Streptococcus pneumoniae

__

57

caractrises (en dehors des signes classiques de mningites purulentes) par un dbut brutal foudroyant, des troubles neuro-vgtatifs svres, un syndrome mning franc. Le pronostic est svre, la mortalit est de l'ordre de 30 %. 3. Les autres localisations Elles ne doivent pas tre mconnues, mme si elles sont rares : pritonites gangrnes cutanes endocardites, arthrites infections gnitales...
LE PNEUMOCOQUE EN CHIFFRES II est responsable en France de : - 50 % des otites - 50 % des pneumopathies bactriennes - 20 % des mningites bactriennes - 10 15 % des septicmies En Europe il provoque : par an 800 infections/100 000 habitants dont 500 otites 300 pneumonies 1,5 mningites avec 20 dcs/100 000 habitants par an.

IV - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A - Morphologie A l'examen microscopique, le pneumocoque a un aspect en diplocoque, en flamme de bougie, en 8 et en courtes chanettes. Les diplocoques et les chanettes capsules sont Gram positif.
Cependant, il faut savoir que l'aspect n'est pas toujours aussi vocateur. Par exemple, si l'environnement est carence en magnsium, on peut observer des chanettes relativement longues. Le mme phnomne se produit en prsence d'anticorps dirigs contre le srotype capsulaire. Dans certains cas, si le malade est sous traitement, on peut voir des pneumocoques prendre des formes pseudobacillaires. Dans certains produits pathologiques fibrineux et dans les cultures anciennes, le pneumocoque prend mal le Gram et peut apparatre Gram ngatif. Particulirement belle aprs inoculation la souris, la capsule est gnralement visible dans les produits pathologiques, mais parfois plus discrte (Fig. 1, 2). La capsule est plus visible sur une prparation l'encre de Chine. La synthse de la capsule varie selon le stade de la courbe de croissance du germe. La synthse capsulaire est optimale en fin de phase exponentielle et dans la phase de plateau. Quand les pneumocoques se multiplient intensment, on distingue mal les capsules ; ces polysaccharides capsulaircs sont relargus dans le milieu, ils sont aussi librs dans les produits pathologiques, d'o le terme d'exoantignes solubles parfois utilis pour les dsigner.

58

Section 1 - LES COCCI GRAM POSITIF

FIGURE 1

FIGURE 2

B - Caractres culturaux
L'intervalle de temprature permettant la culture va de 25 42C. En routine, on cultive le germe entre 35 et 37C. Les cultures sont possibles pour des pH situs entre 6,5 et 8,3, le pH optimal tant de 7,8. Les pneumocoques en culture sont sujets une autolyse spontane ; il conviendra donc de chercher limiter cette autolyse. Les milieux employs seront riches, par exemple glose + sang de mouton 5 %. Sur ce milieu, le germe dveloppe une hmolyse de type alpha, comme ses proches parents, les streptocoques verdissants. Certaines souches exigent du CO^ en primo-culture. L'anarobiose stricte est encore meilleure pour leur dveloppement et on peut considrer que la glose au sang place en anarobiose est un milieu slectif qui favorise le pneumocoque. A l'examen macroscopique, les colonies se prsentent sous forme de petites colonies transparentes, rondes, de 0,5 1,5 mm de diamtre. Une ombilication au centre de la colonie correspond un dbut d'autolyse. Le srotype III prsente des colonies muqueuses d'un diamtre de 3 mm, semblables celles des Klebsiella. Cet aspect muqueux est d l'exubrance des capsules. Dans les conditions d'anarobiose stricte, les colonies sont bombes et de taille 2 3 fois suprieure celles observes en arobiose, et l'hmolyse n'apparat pas. Par contre, si on abandonne la boite 30 mn en atmosphre normale, une hmolyse alpha apparatra. En anarobiose, en prsence d'antibiotiques modifiant la paroi (pnicilline, vancomycine), il apparat une hmolyse bta (voir photo). C - Caractres biochimiques Le pneumocoque ne possde ni catalase, ni peroxydase, ce qui induit l'accumulation de peroxyde d'hydrogne responsable en partie de son autolyse. Les autres caractres sont : . nitrate : . glatine : . lait toumesol : acidifi et coagul, . fermentation des sucres : acidification du glucose, du lactose, du raffinose, du saccharose... Deux caractres sont plus intressants : . esculine : . inuline : Ces caractres ne sont gure recherchs pour l'identification du germe. L'inuline, par contre, a servi diffrencier le pneumocoque des autres streptocoques, mais un certain nombre de streptocoques verdissants peuvent fermenter aussi l'inuline : Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus uberis.

Chapitre III - Streplococcus pnewnomae

59

L'identification formelle de pneumocoque repose sur trois critres : - la sensibilit l'optochine, et en cas de doute : - la lyse par la bile, - la mise en vidence d'une capsule. 1. Sensibilit l'optochine (thylhydrocuprine, driv proche de la quinine) Des disques de 5 mm de diamtre sont chargs de 5 f-lg d'optochine, dose calcule pour provoquer, sur une culture de pneumocoques sur glose au sang, une zone d'inhibition dont le diamtre est compris entre 12 et 35 mm. On peut lire sur les notices des fabricants que les streptocoques, par contre, sont rsistants l'optochine et se multiplient jusqu'au contact du disque. Cette distinction n'est pas toujours aussi vidente. En fait, 0,5 5 % des pneumocoques sont rsistants l'optochine et quelques streptocoques verdissants sont inhibs par l'optochine. Il convient donc d'tre nuanc et de tenir compte du diamtre de la zone d'inhibition : la plupart des pneumocoques en phase S (smooth) ou R (rough) ont une zone de diamtre suprieure 15-20 mm. Pour un diamtre infrieur 15 mm, il est ncessaire de pratiquer des tests complmentaires. 2. La lyse par la bile ou phnomne de Neufeld On procde une culture en bouillon et on centrifuge. Les germes sont remis en suspension dans un tampon pH 7 et on ajoute quelques gouttes de solution de dsoxycholate de Na de 2 10 % ; en quelques minutes, le tube s'claircit. Les sels biliaires activent l'autolysine des pneumocoques.
3. Mise en vidence de la capsule

II faut disposer d'un srum antipneumococcique polyvalent, dirig contre tous les types capsulaires. La raction peut s'effectuer soit partir des cultures, soit partir des produits pathologiques. L'antigne capsulaire peut-tre rvl par "gonflement" capsulaire si les cocci sont visibles, soit par technique immunologique telle que contre-immuno- lectrophorse (Cffi) ou technique d'agglutination. D - Les antignes pneumococciques 1. Les antignes capsulaires Ils peuvent tre mis en vidence par gonflement capsulaire, contre-immunolectrophorse ou agglutination. La composition chimique de certains srotypes est bien connue. Ds 1913, on reconnaissait 4 srotypes. En 1939, on en avait dcouvert 32. Puis les recherches sur la mise au point d'un vaccin ont relanc l'intrt pour les srotypes et deux nomenclatures ont t proposes, l'une amricaine, l'autre danoise. C'est la classification danoise de Lund qui a prvalu ; elle recouvrait 83 groupes ou types capsulaires diffrents. Elle comprend 27 antignes de type et 19 groupes contenant au total 56 antignes de type. Le Statens Srum Institut de Copenhague produit un omnisrum et 9 srums pools de A 1 et 46 srums monovalents. La dtermination du type ou du groupe complte l'identification de la souche. Les pneumocoques possdent des antignes autres que ces antignes polysaccharidiques capsulaires.

60

Section I - LES COCCI A GRAM POSITIF

2. Les antignes somatiques

La substance C, spcifique d'espce, qui est un polysaccharide constitu d'acide teichoque? peut parfois contaminer les polysaccharides capsulaires et peut tre responsable de ractions croises. Sa composition chimique est analogue au polyoside C des streptocoques mais elle est diffrente du point de vue antignique. L'antigne R, de nature protique, est souvent inapparent, car masqu par l'antigne capsulaire. L'antigne M est un antigne de nature protique spcifique de type assez proche de l'antigne M des streptocoques du groupe A. E - Les toxines A ct de ces antignes capsulaires et somatiques, le pneumocoque labore des toxines dont la plupart sont galement antigniques : la pneumolysine, la neuraminidase, la hyaluronidase, le principe producteur de purpura. 1. La pneumolysine Responsable de l'hmolyse de type alpha, c'est une toxine oxygne sensible, active par les groupements thiols, sensible au cholestrol, cytolytique, au mme titre que la streptolysine 0. Elle semble trs lie au corps bactrien et est localisation intra-cytoplasmique. La pneumolysine a t purifie, elle a un PM de 35 kDa ; par ailleurs son gne a t clone et squence. Elle lyse les hmaties de lapin, de cobaye et les hmaties humaines ; elle lyse galement des globules blancs. Son effet comme leucocidine est connu depuis longtemps : les mningites purulentes les plus graves ont une cytorachie faible. Elle dtruit galement les plaquettes et son effet toxique s'exerce sur d'autres cellules, en particulier celles de l'il. Elle prsente un seul type antignique et est transformable en anatoxine, d'o des applications possibles.
2. La neuraminidase

De nombreuses souches l'isolement sont productrices de cette toxine qui a pour cible les acides sialiques. Purifie et injecte par voie intra-pritonale la souris, elle provoque des lsions hpatiques et rnales et, par voie intra-crbrale, entrane des symptmes neurologiques. 3. La hyaluronidase Elle peut jouer un rle au point de vue pathognique, mais probablement moindre que celui jou par les deux prcdentes toxines. 4. Le principe producteur de purpura (PPP) II est connu depuis 1926, mais en 1981, on a montr qu'une enzyme intervenait, soit dans la gense, soit dans la libration de ce principe : il s'agit de la N-actylmuramyl-1-alanine-amidase. Cette substance n'est pas antignique, mais pourrait reproduire soit le purpura, soit des hmorragies internes.

Chapitre ni - Streptococcus pneumoniae

________________________________61

V - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE DES INFECTIONS PNEUMOCOCCIQUES A - Diagnostic direct


*

L'isolement du germe est en gnral facile en l'absence de traitement pralable. 7. Les prlvements Les diffrents chantillons prlever pour porter un diagnostic de mningite, septicmie ou pneumopathie pneumocoques figurent dans le tableau I.
TABLEAUI PRLVEMENTS A EFFECTUER DANS LES PRINCIPALES INFECTIONS PNEUMOCOCCIQUES. MNINGITE Examen direct Cultures sur glose au sang en atmosphre de CO; ou de prfrence en anarobiose LCR aprs centrifugation prolonge LCR et Sang SEPTICMIE PNEUMOPATHIE Crachat Liquide pleural Crachat, aspirations bronchiques,ponctions transtrachales, Sang, Liquide pleural

Sang

Recherche d'antignes ( discuter)

LCR Srum Urines

Hmocultures Srum Urines

Srum Urines Liquide pleural

Crachat

al Les scrtions tracho-bronchiques Les crachats sont frquemment contamins par des pneumocoques pharyngs. Les ponctions trans-trachales et les aspirations protges ont nettement amlior la qualit du prlvement donn au bactriologiste. L'examen direct est primordial. Il faut en effet, noter l'abondance du germe et la cytologie. On a propos de faire une bactriologie quantitative pour diffrencier les pneumocoques de la cavit pharynge et ceux de l'arbre respiratoire, mais l'interprtation n'est pas toujours aise. En plus de ces prlvements, il faut effectuer des hmocultures lors des pneumopathies aigus.
bl Les hmocultures

Elles sont malheureusement trop souvent ngliges au cours des pneumopathies, alors qu'elles permettent, dans ce contexte, de porter un diagnostic tiologique formel (quand elles sont positives). La bactrimie au cours des pneumopathies est parfois tellement massive que l'examen de frottis sanguins peut rvler la prsence de pneumocoques. Les hmocultures poussent rapidement ; dans 85 % des cas elles sont positives ds le deuxime jour, il est recommand de repiquer rapidement les flacons pour viter l'autolyse des germes. Quand on souponne un pneumocoque on peut centrifuger le bouillon (10 mn 2 000 rpm) et pratiquer une recherche d'antignes solubles sur le surnageant (Slidex-Pneumo-Kit).

62

StcttonI-LES COCCI GRAM POSITIF

cl Les liquides de ponction - LCR : le transport du LCR doit se faire rapidement et au chaud. Dans les mningites pneumocoque il existe souvent une leucocytorachie importante, et l'examen direct est souvent positif puisque le nombre de germes va. de 3.105 5.107 UFC/ml selon les auteurs et les pays. Une forte densit microbienne combine une cytorachie faible sont de mauvais pronostic. - Liquides pleuraux : l'examen direct est parfois vocateur. - Liquides pritonaux, liquides articulaires peuvent permettre l'isolement de ce germe. dl Pus et prlvements divers Le pneumocoque est souvent l'origine d'otites, de sinusites, il peut tre retrouv partir de divers pus et mme de prlvements gnitaux (urtraux, vaginaux...). 2. La culture Elle peut facilement tre obtenue soit par ensemencement de milieux liquides (bouillons), soit de milieux solides (glose au sang) rendus slectifs par l'addition de gentamicine ou d'acide nalidixique. Ces milieux sont placs en atmosphre de CO^ ou en anarobiose ; certaines souches sont mme anarobies strictes l'isolement. Les primocultures sont parfois lentes et peuvent demander 48 heures 37C. L'identification des colonies (le plus souvent plates voire ombiliques, plus rarement muqueuses - srotype 3 - classiquement alpha-hmolytiques mais qui donnent une hmolyse bta en anarobiose en prsence de vancomycine), se fera grce l'preuve l'optochine et la lyse par la bile, ainsi que par la caractrisation des antignes capsulaires (CIE ou agglutination). 3. La recherche des antignes solubles Elle peut se faire sur produits pathologiques (LCR, srum, urines, liquides pleuraux, pus...) soit directement (CIE), soit aprs traitement pralable pour les ractions d'agglutination : chauffage 3 mn 100C pour LCR et urines, soit dcomplmentation (30 mn 56C) pour le srum ; en agglutination on ne tient compte que des agglutinations nettes car les particules tant trs charges (83 srotypes) ont une lgre tendance l'auto-agglutination. Un kit de diagnostic permettant la recherche des antignes pneumococciques par technique ELISA vient d'tre commercialis. Il faut noter que : - certains srotypes non chargs lectriquement ne peuvent pas tre dtects en CIE. - il existe des communauts antigniques entre S. pneumoniae et les streptocoques de groupe C. - on peut srotyper directement les souches sur le produit pathologique par l'tude du gonflement capsulaire, CIE ou agglutination, en utilisant successivement les srums pools puis monovalents. Cette srotypie ralise sur souche ou sur produit pathologique a un intrt pidmiologique vident. B - La srologie Elle pourrait constituer un moyen de diagnostic des infections pneumococciques, mais rtrospectif. Elle connat un regain d'intrt car elle permet de voir comment un sujet rpond une infection pneumocoque ou comment il va ragir la vaccination antipneumococcique. En pratique, elle est rserve des travaux de recherche. Elle consiste doser :

Chapitre ni - Streptococcus pnewnomae

63

- les anticorps anti-enzymes : anti-pneumolysines, anti-hyaluronidases, - les anticorps anti-capsulaires : mais le dosage des anticorps anti-polysaccharidiques est difficile (83 srotypes diffrents). Pour le dosage de ces anticorps, on dispose de techniques anciennes : - ractions d'agglutination, - ractions de gonflement de la capsule, - ractions de prcipitation par lectro-immuno-diffusion, qui sont remplaces par deux techniques qui ont les mmes performances : - la technique radioimmunologique (RIA) a servi de mthode de rfrence pendant la dure de la mise au point du vaccin, - la technique ELISA a fait l'objet de nombreux travaux. En pratique on a recours deux approches diffrentes : dosage des anticorps antipolysaccharidiques (difficile en raison de la multitude des srotypes) et dosage des anticorps antihmolysine (pneumolysine) plus prometteur, ce dosage pourrait rendre des services dans une perspective de diagnotic. Pour ces ractions srologiques, il est indispensable de disposer d'un srum prcoce et d'un srum tardif et de vrifier la monte des anticorps. VI - SENSIBILIT DES PNEUMOCOQUES AUX ANTIBIOTIQUES L'tude de la sensibilit des pneumocoques n'est pas toujours simple. L'idal serait de dterminer la CMI de chaque antibiotique pour chaque souche de pneumocoque, ce qui est pratiquement impossible en routine. L'antibiogramme doit tre ralis, sous rserve de respecter quelques rgles prcises. A - Technique de l'antibiogramme pour le pneumocoque - Une colonie isole est d'abord cultive en bouillon enrichi en srum ascite pendant 18 heures, - on prlve 4 8 gouttes de ce bouillon que l'on place dans 10 ml d'eau distille, - on ensemence par inondation un milieu de Mueller-Hinton additionn de 5 % de sang de cheval ou de mouton, - on dpose les disques d'antibiotiques et on incube pendant 18 h en atmosphre de CO,, - on procde ensuite la lecture des diamtres des zones d'inhibition. B - Rsultats Les principaux problmes concernent la pnicilline G : le pneumocoque se situe souvent, pour cet antibiotique, dans les zones de sensibilit intermdiaire, alors qu'en dilution, la souche est sensible. On peut contourner cette difficult. En effet, il faut savoir que les CMI de l'oxacilline vis--vis du pneumocoque sont 30 fois plus leves que la CMI de la pnicilline G. Autrement dit, si le diamtre de la pnicilline G est faible ou en zone intermdiaire, il est prfrable de mesurer le diamtre autour de l'oxacilline (charge 5 p.g) avant de rpondre pour la pnicilline G (Tableau II). Ceci doit tre systmatiquement excut et l'on doit rpondre lorsqu'une souche est rsistante l'oxacilline, que toutes les bta-lactamines sont rsistantes. Comme pour tous les streptocoques les aminosides sont inefficaces;, Les cphalosporines ne sont pas plus actives que la pnicilline G ; les cphalosporines de la troisime gnration (cfotaxime, ceftriaxone) ont toutefois des CMI assez basses (0,001 - 0,06 mg/1).

64

Section 1 - LES COCCI QRAM POSITIF

TABLEAUn INTERPRTATION DE L'ANTIBIOGRAMME POUR LES BTA-LACTAMINES Pnicilline G CMImg/1 0,003 - 0,06 0,01 - 1 1,0 -10 Pnicilline G diamtre en mm 38-40 28-35 28 Oxacilline diamtre en mm >28 10-15 <10 Rponse Souches sensibles Souches intermdiaires Souches rsistantes toutes les bta-lactamines

Le premier cas de rsistance la ttracycline a t signal en 1962. En 1967, des rsistances l'rythromycine et la lincomycine apparaissent et, la mme anne, on signale l'isolement d'une souche rsistante la pnicilline G. En 1970, des publications dcrivent des souches rsistantes au chloramphnicol. En 1977, Johannesbourg, des souches rsistantes aux P lactamines, l'rythromycine, la clindamycine, aux ttracyclines, au chloramphnicol et l'association trimthoprimesulfamthoxazole ont t isoles. En France, la rsistance vis--vis des synergistines est en progression, elle est stable pour le chloramphnicol (5 6 %), pour les ttracyclines depuis 1986 (environ 20 %) et le cotrimoxazole (13 16 %) ; mais la rsistance est rgulirement croissante pour l'rythromycine passant de 18,9 % en 1984 23,6 % en 1988. Au niveau mondial, la rpartition des souches rsistantes la pnicilline est trs irrgulire (Figure 1 selon Klugman) ; en France cette rsistance la pnicilline G est en progression, l'ensemble des souches sensibilit anormale (CMI =0,1 mg/1) approche 5 % (3 % pour les souches invasives, 6 % pour les souches non invasives), ces souches anormales se rpartissent entre souches de moyenne sensibilit (4,5 %) et souches rellement rsistantes (0,5 %). Les mcanismes des rsistances aux antibiotiques du pneumocoque commencent tre mieux compris. Pnicilline : la rsistance non transfrable, non lie la production d'une bta-lactamase est d'origine chromosomique et due des modifications des PLP. Macrolides : la rsistance croise macrolides-lincosamides-streptogramines B (phnotype rsistant M.L.Sg) est essentiellement due une mthylation de l'ARNr 23S qui diminue l'affinit des MLS pour le ribosome. On a dmontr pour certaines souches que le chromosome portait un "transposon conjugatif" codant pour une enzyme APH (3') responsable de la rsistance haut niveau la kanamycine associe la rsistance pour le M.L.Sg et les ttracyclines, cet lment est transmis de faon stable la descendance et joue probablement un rle dans la diffusion de la rsistance. Chloramphnicol : cet antibiotique est inactiv par une chloramphnicol-acyltransfrase inductible non lie un dterminant plasmidique.

VII - VACCINS ANTIPNEUMOCOCCIQUES A - Composition Pour faire face aux rsistances aux antibiotiques et pour empcher la mortalit qui reste leve mme avec l'aide d'un traitement antibiotique actif, on a mis au point un vaccin anti-pneumococcique. Il n'tait pas possible d'incorporer les 83 srotypes dans le vaccin. On a donc choisi les srotypes d'aprs leur plus grande frquence. Les vaccins actuels ont 23 valences qui correspondent aux types suivants de Streptococcus

tre ni - Sireptococcus pneumoniae

________65

pneumoniae : 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F. Dans ce vaccin 23 valences, il y a 25 u,g de chaque polysaccharide. Il est protecteur vis--vis de 90 % des souches isoles en France et en Europe. On a dmontr que les polysaccharides purifis des pneumocoques induisent la formation des anticorps. Ces anticorps se fixent sur la capsule, ils attirent les cellules phagocytaires et favorisent ainsi l'ingestion bactrienne, c'est--dire l'opsonisation. Les fabricants ont d doser les anticorps avant et aprs la vaccination. Il fallait, pour chaque valence, vrifier qu'il y avait une monte des anticorps entre un srum prcoce et un srum tardif. On peut considrer qu'un vaccin est acceptable si on a une monte des anticorps au moins de quatre fois vis--vis des diffrents antignes contenus dans le vaccin pour 80 % des sujets. B - Efficacit immunologique du vaccin Lors d'tudes rcentes ralises avec les vaccins commerciaux, on a dmontr que 90 % des sujets avaient une multiplication par 4 du taux de leurs anticorps. Le vaccin est administr en une fois. Il serait protecteur pour trois ans, mais il n'est pas efficace chez les enfants de moins de 2-3 ans. Il n'y a pas d'immunit croise entre les 14 srotypes. On peut noter que le srotype 6 est trs peu immunogne. Il est conseill de ne pas revacciner avant 5 ans, une revaccination prcoce peut donner lieu des effets indsirables. On observe des checs : - chez les jeunes enfants, chez les sujets gs, - dans les maladies de Hodgkin, - aprs splnectomie, aussi est-il prfrable de vacciner les candidats la splnectomie avant celle-ci, - dans les syndromes nphrtiques o les rsultats sont souvent discordants, - dans les hmopathies, la rponse n'est pas toujours bonne ; par contre, elle est correcte chez les drpanocytaires.

BIBLIOGRAPHIE
CADOZ M., ARMAND J., MICHEL J.P-, MICHEL M., DENIS F., SCHIFFMAN G-, A new 23 valent pneumococcal vaccine : immunogenicity and reactogenicity in adults . J . Biol. Standardization, 1985,13, 261-265. DENIS F., FLEURETTE J., LAURENS G., MOULIN A., MOUNIER M., ORFILA J., REVERDY M.E., A latex agglutination technique for rapid direct identification of pneumococci in blood cultures , Eur. J . Clin. Microbiol, 1984, 3, 321 - 322. DENIS F., SAULNIER M., CHIRON J.P., Diagnostic tiologique rapide des mningites purulentes par agglutination passive inverse de particules de latex et par contre-immunolectrophorse . Bull. Org. Mond. Sant, 1981, 59, 143-151. GESLIN P., Rapport du Centre National de Rfrence du Pneumocoque (1988), Bull. Epidem. Hebdomad., 1990, n 17, 74-75. GESLIN P., FREMAUX A., SISSIA G., S. pneumoniae et infections bronchopulmonaires. Diagnostic microbiologique, sensibilit aux antibiotiques . Rev. Fr. Lab., 1990, n 204, 37-44. KLUGMAN K.P., Pneumococcal rsistance to antibiotics , Clin. Microbiol. Rev., 1990, 3, 171-196. LUND E., HENRICHSEN J., Laboratory diagnosis, serology and epidemiology of S. pneumoniae, in Methods in microbiology , 1978, vol. 12, Acadmie Press, Ed. London, New York, San Francisco. PATHOLOGIE ET BIOLOGIE, n spcial Pneumocoque, 1979, tome 27., ROBBINS.J.B., AUSTRIAN R., LEE C.J., RASTOGI S.C., SCHIFFMAN G., HENRICHSEN J., MADELA P.H., BROOME C.V., FACKLAM R.R., TIESJEMA R.H., PARKE J.C., Considrations for formulating th second gnration pneumococcal polysaccharide vaccine with emphasis on th cross reactive types within groups , J . Infect. Dis., 1983,148, 1136-1159.

SECTION II NEISSERIACEAE

CLASSIFICATION DES NEISSERIACEAE


Cette famille comprend classiquement les genres : I Neisseria II Moraxella III Acinetobacter IV Kingella V Oligella Le genre Acinetobacter est rattach cette famille, mais ses caractres sont trs diffrents de ceux des autres Neisseriaceae (absence d'oxydase et de nitrate rductase). Par contre, Branhamella et Moraxella sont proches gntiquement bien que la morphologie les diffrencie. Ils ont t runis au sein d'un mme genre (Moraxella) avec deux sous-genres (Moraxella et Branhamella). Au genre Oligella, nouvellement cr, sont rattaches les souches antrieurement dsignes comme Moraxella urethralis. Cette famille est htrogne et des remaniements taxonomiques sont attendre.
MORAXELLA Neisseria Morphologie division pnicilline oxydase nitrate rd. G + C% cocci 2 plans S + 47-52 sous-genre Branhamella cocci 2 S + + 40-45 sous-genre Moraxella coccobacille 1 S + 40-46 Acinetobacter coccobacille 1 R
-

Kingella bacille 1 S + + 47-55

39-47

Chapitre IV LES NEISSERIA

CARACTRES GNRAUX Les Neisseria sont des cocci Gram ngatif, associs en diplocoques, parfois en ttrades, et immobiles. Bactries arobies strictes, mtabolisme uniquement respiratoire (une respiration des nitrates et/ou des nitrites est possible). Ils sont toujours catalase (+) et possdent une cytochrome C oxydase. Leurs potentialits mtaboliques sont limites. Ce sont des htes habituels des muqueuses de l'homme et de l'animal. Ils peuvent tre cultivs sur les milieux usuels (glose au sang). A l'isolement, N. meningitidis ncessite du CO^ mais cette exigence se perd au repiquage. N. gonorrhoeae est l'espce la plus exigeante et ncessite des milieux riches et du CO^ pour sa culture. La temprature de culture optimale est de 35 37C. Le gonocoque et le mningocoque poussent de 30 38C. Les autres Neisseria peuvent se dvelopper temprature ambiante (20C).

NEISSERIA GONORRHOEAE
HISTORIQUE
Le gonocoque a t observ pour la premire fois par Neisser en 1879 dans un pus urtral et en 1882 Leistikov et Loeffler ralisent la premire culture sur srum coagul. C'est l'agent de la blennoragie connue depuis la plus haute antiquit puisque la premire description a t faite en 2637 av. J.-C. par l'empereur chinois Huang Ti. Considre longtemps comme une forme clinique de la syphilis (Hunter), la gonococcie a t individualise par Ricord en 1830. Considre longtemps comme la maladie sexuellement transmise (MST) la plus rpandue, la gonococcie a laiss la place aux infections vnriennes Chiamydia trachomatis. Cependant, les infections gonocoque posent un problme de sant publique qui se complique par l'augmentation rgulire de leur rsistance aux antibiotiques.

1 - HABITAT ET PIDMIOLOGIE C'est un parasite strict de l'homme, hte des muqueuses des voies gnitales de l'homme et de la femme et dont la transmission est presque exclusivement sexuelle.

Chapitre IV - Le genre Neisseria

__

_____

___

69

Le problme pidmiologique est simple en apparence : - l'homme est le seul rservoir de germes ; - le gonocoque est sensible aux antibiotiques. De 1955 au dbut des annes 1980, il y a eu une recrudescence des gonococcies avec augmentation de la rsistance du gonocoque. Depuis, l'incidence de la gonococcie est en nette diminution en raison d'une meilleure prvention lie l'pidmie du SIDA. A - Facteurs favorisant la dissmination Dans une ville, la prvalence d'infection est leve dans les quartiers bas niveau socio-conomique, o les gonococcies sont endmiques. A partir de ce "noyau" l'infection s'tend aux autres quartiers de la ville o les cas observs sont sporadiques et la prvalence est faible. Les gonococcies sont favorises par l'urbanisation, les voyages (tourisme, voyages d'affaire), la promiscuit, les saisons (t). Chez les individus, les infections sont lies une facilit, une prcocit et une multiplicit des rapports sexuels. Elles sont aussi favorises par l'utilisation de contraceptions hormonale ou instrumentale qui s'accompagnent de l'abandon des moyens physiques classiques. Comme toutes les MST, les gonococcies sont plus frquentes dans les villes en particulier celles qui sont des lieux de passage (port). B - Certains facteurs individuels jouent un rle important dans cette dissmination

- L'existence de formes asymptomatiques (femmes) non dpistes ; - La susceptibilit individuelle : pour la femme tous les rapports avec un partenaire atteints de blennorragie sont supposs infectants, mais chez l'homme, seuls 20 % le sont. C - Evolution actuelle Une nette dcroissance du nombre d'isolements de souche de gonocoque est observe en France depuis 1980 (voir schma). Cette dcroissance semble se ralentir car les campagnes de prvention n'atteignent pas la totalit de la population risque.
Evolution trimestrielle du nombre de souches de gonocoques isoles parle reseau RENAGO (1988-1989} nb dg souches 130 'm _____ ____ _

source : Bulletin pidmiologique Hebdomadaire n 12/1990

70

Section H - LES NEISSERIACEAE

II - POUVOIR PATHOGNE A - Adulte 1. Infections locales gnitales - Chez l'homme : la blennorragie est une urtrite antrieure aigu avec coulement de pus parfois abondant et une dysurie (chaude-pisse). Elle survient aprs une incubation de 1 15 jours (3 5 en gnral). Elle gurit sans traitement en 15 jours 6 mois. Cette urtrite peut tre subaigu (5 15 %) et parfois asymptomatique. Des complications sont possibles : infections ascendantes (orchite, pididymite, prostatite). Les infections rptes peuvent entraner un rtrcissement de l'urtre. - Chez la femme : c'est le plus souvent une cervicite, en gnral cliniquement muette (80 % des cas) avec parfois des pertes purulentes ou une urtrite. Les complications possibles sont une infection ascendante avec pyosaipynx entranant une obstruction tubaire en l'absence de traitement. Les infections chez la femme peuvent persister 6 mois. Elles sont la source principale de dissmination du gonocoque. 2. Infections locales extra-gnitales lies aux habitudes sexuelles Une infection pharynge est en gnral asymptomatique, un rythme ou une amygdalite pouvant l'accompagner. Les infections anales touchent environ 4 % des consultants (femmes ou homosexuels masculins). En gnral, elles sont asymptomatiques avec parfois un tnesme, une proctite avec scrtions mucopurulentes dans lesquelles le gonocoque peut tre mis en vidence. Les infections oculaires sont plus rares. 3. Infections dissmines Elles reprsentent 1 3 % des gonococcies. Elles ont pour origine l'une des localisations prcdentes. La septicmie peut entraner des arthrites (polyarthralgie, arthrite purulente), des lsions cutanes (maculo-papules parfois ncrotiques des extrmits), une endocardite (rare, mais grave), une mningite (exceptionnelle). B - Chez l'enfant Chez le nouveau-n : ophtalmie purulente pouvant entraner la ccit. La contamination se fait au moment de l'accouchement, lors du passage dans les voies gnitales. Prophylaxie : la mthode de Cred (instillation de collyre au nitrate d'argent ou un antibiotique non sensibilisant) est obligatoire la naissance en France. Les infections gonococciques des enfants posent toujours des problmes mdico-lgaux (inceste, viol...). III - PHYSIOPATHOLOGIE Elle est mal connue, mais un modle thorique a t dvelopp avec les tapes suivantes : - attachement aux cellules pithliales - invasion active par endocytose - dveloppement de l'infection sous l'pithlium.

Chapitre IV - Le genre Neisseria

71

N. gonorrhoeae possde des rcepteurs pour la transferrine et la lactoferrine et il est capable d'en extraire le fer ncessaire sa croissance. A ce stade si des anticorps sont produits, les bactries sont opsonises, phagocytes avec formation de pus. Les gonocoques intra-leucocytaires ne sont pas viables. Les facteurs qui pourraient jouer un rle dans le pouvoir pathogne sont : - lespili - les facteurs d'attachement - les protases clivant les IgA; - la rsistance l'action bactricide du srum. IV - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A - Morphologie Dans un pus urtral N. gonorrhoeae se prsente sous l'aspect de diplocoques Gram (-), 0,7 x 1 |J.m de diamtre avec une face plane, une face arrondie rniforme et accols par leur face plane en grains de caf . Ils sont intracellulaires, dans le cytoplasme des polynuclaires ou extracellulaires. En culture ils sont polymorphes avec des formes gantes (autolyse), isols, en diplocoques ou en ttrades. B - Caractres culturaux La culture est difficile en raison des multiples exigences mtaboliques. Le CO^ est ncessaire la croissance du gonocoque. La temprature optimale de croissance est de 35 37C. Il est sensible aux acides gras contenus dans la glose (addition d'hmine, de sang, ou d'amidon pour prvenir cette toxicit). Il est sensible aux mtaux lourds. L'exigence en cystine est caractristique de l'espce. Certaines souches sont exigeantes en glutamine, thiamine ou thiamine pyrophosphate. Ces composs devront tre ajouts au milieu aprs strilisation (PolyVite X, Supplment G...). Le fer est indispensable. La croissance de N. gonorrhoeae est inhibe par certaines espces (streptocoque hmolytique de groupe B, levures). Aussi ajoute-t-on les antibiotiques dans le milieu de culture slectif (milieu VCF ou VCN) : - vancomycine qui inhibe les bacilles Gram (+) et cocci Gram (+), - colistine qui inhibe les bacilles Gram (-), - fngizone ou nystatine qui inhibe les levures, - parfois du cotrimoxazole qui inhibe le Proteus (prlvements anaux). Ces produits inhibent 2 5 % des souches de gonocoques mais permettent son isolement dans les prlvements plurimicrobiens (prlvements vaginaux). Kellogg a dcrit 4 types de colonies selon leur aspect en transillumination oblique sur un milieu translucide. A l'isolement les types 1 et n (colonies de petite taille) correspondent aux souches virulentes porteuses de pili.

72

Section II - LES NEISSERIACEAE

Aprs repiquage les type III et IV (colonies plus larges) correspondant aux bactries ayant perdu leurs pili deviennent prdominantes et finissent par tre seules prsentes.
C - Vitalit

Elle est faible. Le gonocoque ne supporte pas la dessication, il faut donc faire un ensemencement immdiat sur milieux slectifs ou utiliser des milieux de transport. Le milieu de Smart au thioglycolate et au charbon activ permet la survie de la bactrie 24 48 heures. Le Transgrow Mdium est un milieu de culture en flacon hermtique contenant 10 % de CO^. On peut expdier immdiatement le prlvement ensemenc ou aprs une prculture de 18 24 h. C'est le meilleur systme de transport disponible. La conservation des souches peut se faire en glose ascite (environ 15 jours) mais il vaut mieux utiliser la lyophilisation et surtout la conglation -80C en bouillon glycrine contenant du srum de cheval. Le gonocoque est inhib par le coton des couvillons (hypochlorite...). Il faut utiliser pour les prlvements des couvillons en alginate de calcium ou en dacron. D - Structure antignique Les protines de membrane externe : 3 protines majeures ont t dcrites. PI qui prsente deux types principaux PI^ et PIg au sein desquels il est possible de dfinir de nombreux srovars grce l'utilisation d'anticorps monoclonaux. Une classification des souches a t propose et elle est utilise actuellement pour les tudes pidmiologiques. La protine PU est variable non seulement d'une souche l'autre mais prsente aussi des variations pour une mme souche qui se traduisent par une modification de l'aspect des colonies. La protine PIII est stable et elle est prsente galement chez Neisseria meningitidis. Les pili possdent galement une grande diversit antignique. Leur prsence est lie l'aspect des colonies la surface de la glose, la mobilit par glissement, la comptence pour la transformation et la virulence (attachement aux cellules pithliales, rsistance la phagocytose). N.B. Il existe galement un facteur d'attachement diffrent des pili. E - Immunit La variabilit antignique des souches de gonocoque peut expliquer la chronicit des infections non traites et l'absence de protection contre les rinfections. Elle permet aussi de comprendre les difficults de la mise au point d'un vaccin malgr les multiples tudes. Les infections gonococciques dissmines sont lies une dficience en certains composants du complment, en particulier C6, C7 et C8. Celle-ci entranerait une prdisposition aux infections Neisseria. F - Pouvoir pathogne exprimental Les modles dvelopps sont artificiels : chambre sous-cutane chez le cobaye ou la souris, culture d'organe. Cependant ils ont permis de connatre le droulement de l'infection locale et servent pour les tudes de virulence des souches ou les tudes de protection passives.

Chapitre IV - Le genre Neisseria

73

V - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE A - Prlvements 1. Chez l'homme Le prlvement sera effectu dans l'urtre antrieur sur 2 3 cm avec un couvillon en alginate de calcium, ou une goutte de pus sera prleve au mat avec une ose. Il est possible de ractiver l'infection en faisant boire de la bire la veille au patient. Les prlvements seront effectus le matin avant toute miction.
2. Chez la femme

Le prlvement sera fait : - dans l'endocol ou ventuellement dans les culs de sac postrieurs (aprs pose d'un spculum sans lubrifiant) - l'orifice matique, soit par couvillonnage, soit en exprimant une goutte de pus en pressant l'urtre contre la symphyse pubienne. - ventuellement l'orifice des glandes de Bartholin ou de Skne. 3. Dans les deux sexes anus : prlvement avec un couvillon dans le canal anal (sur 5 cm) pharynx : piliers de l'amygdale peau : grattage de lsions, biopsie liquides articulaires par ponction hmoculture. Dans tous les cas il faut ensemencer immdiatement les milieux de culture ou utiliser un milieu de transport. B - Examen direct La prsence de diplocoques Gram ngatif intra et extra-cellulaires dans un pus d'urtrite aigu permet le diagnostic de gonococcie dans au moins 90 % des cas. Par contre, pour les autres prlvements, seule la culture est fiable. C - Ensemencement et culture - chantillon mono-microbien (urtre, sang, pus...) ; sur un milieu non slectif. - chantillon pluri-microbien (gorge, vagin) sur milieu slectif, type VCF. Le diagnostic de gonocoque est tabli sur les caractres suivants : - la croissance sur milieu slectif de cocci Gram (-) - l'aspect des colonies - l'oxydase rechercher soit avec un disque imprgn du ractif chlorhydrate de ttramthyl-paraphnylne-diamine, soit en inondant la bote avec le ractif en repiquant les colonies suspectes ds qu'elles deviennent ross. - l'acidification des sucres : seul le glucose est acidifi. Cette acidification peut tre recherche sur milieu cystine-tryptic agar (milieu CTA) ou l'aide de galeries commercialises, prtes l'emploi. La recherche directe de N. gonorrhoeae dans les prlvements peut tre faite par des techniques immunologiques (ELISA, immunofluorescence directe). Leurs rsultats sont tout fait satisfaisants chez les hommes, mais leur sensibilit est faible

74

Section n - LES NEISSERIACEAE

chez les femmes quand on les compare la mise en culture. Des techniques mettant en jeu des sondes d'ARN ou d'ADN sont actuellement l'tude. Ces techniques de diagnostic direct ne permettent pas la ralisation d'antibiogramme. Ce dernier est indispensable car la rsistance des souches aux 6-lactamines et aux cyclines est de plus en plus frquente. Etant donn son faible cot, la mise en culture du prlvement est prfrable. Par contre le diagnostic conventionnel de N. gonorrhoeae par les caractres biochimiques peut tre remplac par des mthodes rapides : - immunologiques : elles mettent en jeu des anticorps monoclonaux (coagglutination de staphylocoque porteur de protine A, utilisation d'anticorps marqus la fluorescine ) - enzymatique : recherche de l'hydroxyprolylaminopeptidase spcifique. N.B. N. kochii est une Neisseria qui ressemble N. gonorrhoeae au point de vue biochimique. En culture, il forme de grosses colonies pigmentes. Isole d'urtrites en Egypte, cette bactrie est considre comme une sous-espce de N. gonorrhoeae. D - Diagnotic srologique Depuis l'abandon de la gono-raction il n'y a pas actuellement de diagnostic srologique de la gonococcie. VI - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES A - Mthodes d'tude L'antibiogramme doit tre ralis de prfrence sur le milieu GC mdium base supplment, translucide (milieu de Kellogg). On utilise la technique des disques par diffusion en milieu glose en respectant certaines rgles concernant l'inoculum et la charge des disques. Six antibiotiques doivent tre tests : - pnicilline et/ou ampicilline, - chloramphnicol, - doxycycline (ou une autre ttracycline semi-synthtique), - rythromycine (ou un autre macrolide), - spectinomycine (apparent aux aminosides), - rosoxacine (quinolone). Pour les souches productrices de bta-lactamase, il peut tre intressant de rechercher la sensibilit une cphalosporine de 3e gnration (cfotaxime). L'observation d'une culture au contact du disque de pnicilline permet de suspecter une souche productrice de bta-lactamase. Cette enzyme doit tre systmatiquement recherche par l'une des mthodes suivantes : - acidimtrie avec des bandelettes imprgnes de pnicilline G et d'un indicateur de pH, l'acide pnicilloque form modifie de pH du milieu ; - la mthode de rfrence la nitrocfine (cphalosporine chromogne) : son hydrolyse par la pnicillinase entrane la formation d'un compos pourpre ; - la mthode l'iode : dcoloration du papier imprgn d'amidon et color par le lugol car l'acide pnicilloque a une plus grande affinit pour l'iode que l'amidon ; - la mthode Gots sur bote de ptri avec une souche indicatrice sensible la pnicilline (Sarcina).

Chapitre IV - Le genre Neisseria

_____

____________________________________75

B - tat actuel de la sensibilit aux antibiotiques A la diffrence des autres Neisseria, le gonocoque est rsistant aux aminosides in vitro. Il est cependant sensible in vivo. Un aminoside est rserv au traitement de la gonococcie : la spectinomycine (CMI : 8-32 mg/1). Peu de souches sont rsistantes cet antibiotique. En rgle gnrale le gonocoque est sensible la pnicilline (CMI = 0,03 mg/1), mais cette sensibilit diminue rgulirement et le pourcentage des souches rsistantes (CMI > 0,25 mg/1) s'lve rgulirement. La rsistance chromosomique est due gnralement une modification de la membrane externe ; elle porte alors sur plusieurs antibiotiques simultanment (par exemple, pnicilline, ampicilline, ttracyclines, rythromycine). La rsistance plasmidique, due un plasmide codant une bta-lactamase de type TEM 1, a t rapporte dans tous les pays du monde. Elle est trs frquente dans les pays anglophones. En France elle concerne 1 10 % des souches de gonocoques, selon la rgion. La rsistance plasmidique la pnicilline donne une CMI trs leve (CMI > 32 mg/1) la diffrence de la rsistance chromosomique (CMI = 2-4 mg/1). Rcemment une rsistance de haut niveau la ttracycline a t dcrite dans plusieurs pays. Elle est d'origine plasmidique. VII - LE TRAITEMENT A - Traitement curatif II doit tre : - efficace, - sans effets secondaires, - pouvoir tre prescrit tous les patients, - agir rapidement pour briser la chane de contamination, - ne doit pas masquer une autre MST (syphilis) ou alors la traiter galement. Le plus souvent de nombreux antibiotiques peuvent tre utiliss. Les recommandations actuelles du CDC sont les suivantes : - Pour une urtrite aigu ou une cervicite ceftriaxone 250 mg IM en une fois suivi de doxycycline 250 mg par jour pendant 7 jours (pour traiter galement une ventuelle infection Chiamydia trachomatis. La spectinomycine (2 g IM en une fois) ou la ciprofloxacine (500 mg per os en une fois) peuvent galement tre administres. Dans les rgions faible prvalence de souches productrices de B-lactamase, on peut utiliser l'amoxicilline (3 g per os) associe au probenecid (1g per os) en une fois. - Pour une salpingite cfoxitine 2 g IV toutes les 6 heures pendant au moins 48 heures plus ,,doxycycline 20 mg prjour per os pendant 10 14 jours. - Pour une infection dissmine ceftriaxone 1g par jour ou cfotaxime 3 g par jour pendant 7 jours. Les traitements courts suffisent en gnral pour gurir une gonococcie.

76

Section H-LES NEISSERIACEAE

B - Traitement prophylactique II n'existe pas de vaccin. Il ne faut pas faire de traitements antibiotiques systmatiques ; ils comportent plus de risques qu'ils n'apportent de rsultats et entranent une augmentation de la rsistance des souches aux antibiotiques. La prophylaxie sera essentiellement individuelle (antiseptiques vaginaux, condom, hygine, mfiance) ou gnrale (ducation, information, dpistage, visite priodique des sujets risque).

NEISSERIA MENINGITIDIS
Anciennement appel N. intracellularis, le mningocoque a t dcouvert par Weichselbaum en 1887 dans Je LCR d'un sujet atteint de mningite aigu. Proche du gonocoque, il est responsable de mningites purulentes aigus (mningite crbrospinale = MCS) et de septicmies gravissimes. Son isolement dans les prlvements pharyngs est frquent. Depuis quelques annes il est isol de prlvements gnitaux et exceptionnellement de prlvements anaux. 1 HABITAT ET PIDMIOLOGIE

Hte exclusif de l'homme, N. meningitidis est isol habituellement de prlvements rhinopharyngs II existe 3 srogroupes principaux : A, B et C qui ont les mmes caractristiques pidmiologiques. Leur rpartition est diffrente et la prdominance suivante est observe Afrique, Sahel, pourtour mditerranen A Amrique du Nord et du Sud AetC Europe occidentale B
Distribution mensuelle des cas dclars d'infection mningocoque par srogroupe (Janvier 1988-mars 1990) FRANCE
Kare de cas

source : Bulletin Epidmiologique Hebdomadaire n 26/1990

Depuis quelques annes, les isolements de srogroupe C sont plus frquents en Europe et la prvalence du srogroupe B augmente en Amrique Latine o il provoque des pidmies. Le srogroupe Y provoque des atteintes isoles souvent srieuses. Les autres srogroupes ne sont qu'exceptionnellement en cause dans les mningites. Les infections mningocoque prsentent des variations saisonnires : (hiver, saison froide) favorises par la surpopulation (promiscuit, manque d'hygine, collectivits fermes) responsable de l'essaimage du germe. Dans les villes par

Chapitre IV - Le genre ^eissena

77

exemple elles surviennent dans les quartiers bas niveau socio-conomique. En Afrique, la saison sche correspond une sdentarisation de la population, lie une augmentation de la promiscuit. Le portage pharyng II diminue avec l'ge ; chez les sujets de 15 30 ans il v a environ 10 % de porteurs sains. Le portage est parfois long (6 mois). Le nombre de cas de mningite par rapport au taux de portage est trs faible (1 pour 10 000). Cette frquence leve de portage traduit une transmission facile du germe par voie arienne. Cette transmission est capricieuse et on ne sait pas dceler les sujets rceptifs. L'entourage du malade et le personnel soignant font rarement une mningite, mme s'ils sont porteurs de germe. Ceci explique que le traitement du portage peut tre considr comme inutile car le germe peut avoir disparu avant le traitement et la souche hberge n'est pas forcment la mme que celle du malade. En dpit des difficults pour apprhender l'pidmiologie du mningocoque, on peut dicter quelques rgles simples de prophylaxie : - le diagnostic de la maladie avec identification prcise du germe et groupage sont indispensables. - l'interrogatoire est ncessaire pour essayer de trouver une cause dclenchante. - les mesures d'hygine sont prconiser pour les sujets contacts : viter la fatigue, le stress, faire une surveillance mdicale, vacciner si le mningocoque en cause appartient au groupe A ou C et faire une prophylaxie mdicamenteuse en milieu ferm. Certaines mesures sont inutiles : la dsinfection pharynge, la dsinfection des locaux, la recherche de portage dans l'entourage, la prophylaxie de masse, l'viction scolaire des frres et soeurs et le traitement du portage en milieu ouvert. II - POUVOIR PATHOGNE DE N. MENINGITIDIS A - Mningite crbro-spinale Elle fait suite une infection pharynge qui est souvent muette. 1. La forme mningitique Elle est observe le plus souvent chez l'enfant avant 5 ans et l'adolescent. C'est une urgence mdicale : le diagnostic doit tre prcoce, le traitement immdiat ; la ponction lombaire fait le diagnostic.
Rpartition par ge et par sexe des infections mnmgocoque (1989) (entre 0 et 25 ans)

source : Bulletin pidmiologique Hebdomadaire n 26/1990


89 12 13 16 17 ZO 21 2< Z'3

3inascul in (efninin Classes o ge (2 ans)

78

Section II-LES NEISSEMACEAE

Du point de vue clinique : le trpied mningitique (les trois signes caractristiques de la mningite) est compos de l'association de cphales, de vomissements et d'une raideur mninge (signe de Kemig), associs une fivre, une photophobie et des arthralgies. Ces signes peuvent tre masqus par un traitement antibiotique intempestif, insuffisant (mningite dcapite) rendant le diagnostic difficile. Le tableau est diffrent chez le nourrisson : hypotonie, trouble du comportement, convulsions et hyperthermie. Sans traitement la maladie est mortelle, mais une antibiothrapie prcoce et bien conduite amne une gurison sans squelle dans la majorit des cas. Le purpura fulminons de Henoch (ou syndrome de Waterhouse-Friderichsen) avec collapsus est une forme foudroyante proche des formes septicmiques suraigus. 2. La forme septicmique La mningite n'est pas observe ou c'est un lment secondaire du tableau. Les signes cliniques associent une temprature 40C, un tat gnral altr, avec cyanose, un purpura, des arthralgies. L'volution se fait vers l'tat de choc et un dcs rapide parfois en quelques heures (purpura fulminons). B - Infections locales Elles se traduisent par des infections pharynges (angine rythmateuse), des infections respiratoires banales (service de ranimation), des infections vnriennes, rares : (urtrites, proctites) chez les homosexuels. La bactrie peut tre isole en l'absence de tout signe clinique. III - PHYSIOPATHOLOGIE II est admis que le germe pntre dans le rhinopharynx par voie arienne, provoquant une infection locale en gnral inapparente qui persiste plusieurs mois. Cette contamination est immunisante et l'immunit confre est protectrice. La raison de survenue d'une infection systmique est inconnue. Une infection locale (virale, par exemple) peut favoriser le dveloppement du germe et son essaimage partir du rhinopharynx. Cette diffusion se fait par voie hmatogne (on a abandonn la notion de passage travers la lame crible de l'thmode sauf aprs traumatisme crnien). Une septicmie accompagne toujours la mningite et peut tre observe seule dans les formes graves. Le germe peut se fixer dans les mninges (cette affinit reste inexplique) mais aussi dans les articulations, les poumons, la peau,... La mningite est une inflammation des mninges avec exsudt purulent et hyperleucocytose. La multiplication de la bactrie est extra-cellulaire et aprs phagocytose le mningocoque n'est plus viable. Les manifestations secondaires des formes fulminantes sont dues, sans doute, l'endotoxine. La virulence du germe est lie la capsule. Le srogroupe Y est particulirement virulent. La survenue d'infections mningocoques peut tre lie un dficit en facteurs du complment.

Chapitre IV - Le genre Neisseria_____________________________________________________79

IV -

CARACTRES BACTRIOLOGIQUES

A - Morphologie Diplocoque Gram (-) en grains de caf. B - Caractres culturaux Les souches sont exigeantes en CO^ l'isolement, mais elles peuvent tre cultives sur des milieux plus simples que le gonocoque (glose chocolat). Cependant, pour les prlvements pharyngs, un milieu slectif (glose l'hmine avec VCF) est indispensable pour son isolement. Une meilleure culture est obtenue avec les milieux riches. Les conditions de culture sont les mmes que pour le gonocoque. Il pousse de 30C 385 C, mais la croissance est meilleure que celle du gonocoque : colonies de 1 2 mm de diamtre aprs 24 h : colonies bombes, luisantes. Les variations d'aspect dcrites pour le gonocoque ne sont pas retrouves chez le mningocoque. L'exigence en fer est galement observe. C - Vitalit, conservation des souches C'est une bactrie fragile et sensible aux variations de temprature, au froid et la dessication. Il faut donc prendre les mmes prcautions que pour le gonocoque : ensemencement immdiat pour LCR et hmoculture et milieu de transport pour les autres prlvements. - Conservation : lyophilisation ou conglation -80 C - Transport : milieu de Stuart (au charbon activ) ou milieu l'oeuf de Vandekerkove. D - Caractres biochimiques Oxydase (+), gamma-glutamyl-transfrase (y GT) (+). Acidification du glucose et du maltose, Rduction des nitrites par 68 % des souches. L'exigence en cystine est rare. E - Structure antignique La nature du polysaccharide de la capsule permet de distinguer 13 srogroupes : les plus frquents sont A, B, C, W135, X et Y, les autres (29E, Z, H, I, K, L) sont isols plus rarement. La spcificit antignique est lie la structure du polysaccharide : - srogroupe A = 2 actamido-2 doxy-D-mannopyranosyl - srogroupe B = acide N-actylneuraminique - srogroupe C = acide N-actyl-0-actylneuraminique Ces antignes permettent d'obtenir chez le lapin des immunsrums homologues qui agglutinent les souches de mningocoques. Ces antignes sont rpandus dans la nature et entranent des reactions croises avec d'autres espces. (Ex. srogroupe B= E. coli Kl). Un faible pourcentage des souches n'est pas agglutinable avec les srums existants et certaines sont autoagglutinables. Des souches polyagglutinables sont

80

Section II-LES NEISSERIACEAE

parfois mises en vidence, mais il est alors souvent possible de mettre en vidence un srogroupe dominant. Ces srogroupes sont trs utiles pour le diagnostic et pour les tudes pidmiologiques. Leur tude a permis la mise au point des vaccins anti-mningocoques A et C. Le polysaccharide du groupe B est peu immunogne et ne permet pas le dveloppement d'une immunit protectrice. Dans les M.C.S. en France : le srogroupe B est prdominant, le srogroupe C est moins frquent, A et Y sont rares. X et 29E sont exceptionnellement isols. Les srogroupes de N. meningitidis ont t subdiviss en srotypes. Ceux-ci correspondent des spcificits antigniques portes par 5 protines de la membrane externe. Ces srovars sont dfinis par l'utilisation d'anticorps monoclonaux donnant le "profil antignique des souches". Exemple : c ; 2a ; P1.2 (Srogroupe C ; srotype 2a, sous-type P1.2). Les srotypes 2a et 2b sont frquemment associs des manifestations pathologiques. Il existe une autre classification utilisant les profils lectrophortiques de 13 enzymes mtaboliques ("Multilocus enzyme gnotype"). Cette mthode permet galement une trs fine discrimination des souches de mningocoque. Certains profils lectrophortiques (ET) sont observs chez des souches virulentes. Par exemple, des souches ET-5 ont t suivies dans plusieurs pays europens depuis 1975. F - Immunit Le portage permet le dveloppement d'une immunit protectrice. Les adultes sont en gnral protgs et la maladie frappe l'enfant et l'adulte jeune. Avant 3 6 mois, le nourrisson est protg par les anticorps maternels. Cette immunit est spcifique de groupe. G - Pouvoir pathogne exprimental Aucun animal de laboratoire n'est spontanment sensible au mningocoque : - singe : une mningite est observe aprs injection intrathcale - souris : l'injection pritonale avec de la mucine permet le dveloppement d'une infection - rat nouveau-n : une injection intra-pritonale provoque l'apparition d'une septicmie et d'une mningite. Ces modles ne renseignent pas sur la physiopathologie des infections mais ils sont utiliss pour les tudes de virulence des souches ou de protections passives. V - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE A - Les prlvements En raison de la fragilit de la bactrie ils doivent tre transports sans dlai et l'abri du froid au laboratoire. Chez l'homme sain : - prlvements pharyngs - prlvements ano-gnitaux (cf. gonocoque) Chez le malade : - ponction lombaire. C'est toujours un examen d'urgence. - hmoculture, aprs dsinfection soigneuse de la peau.

Chapitre IV - Le genre Neisserta

ol

ventuellement ; ponction de liquide articulaire, aspiration transtrachale pour le diagnostic de pneumonie mningocoque. Chez le malade suspect d'infection mningocoque, le diagnostic peut tre orient cliniquement (purpura), mais il ne sera affirm que par la bactriologie. B - Examen du LCR Aspect macroscopique Le LCR est en gnral trouble. Il peut rester clair si la ponction lombaire a t faite prcocement avant la survenue d'une raction cellulaire importante. Cytologie La mningite purulente se caractrise par la prsence de plusieurs centaines d'lments cellulaires par mm3, en prdominance des polynuclaires. Cette raction cellulaire s'accompagne d'une hyperprotinorachie et d'une hypoglycorachie. Examen du culot de centrifugation (15 minutes 2 500 g). Il montre des dplocoques Gram (-) intra-cellulaires (dans les polynuclaires) ou extra-cellulaires. L'examen de la lame doit tre soigneux car les germes peuvent tre en petit nombre. Dans environ un tiers des mningites crbro-spinales il n'est pas vu de germes l'examen direct. Mise en culture Elle doit tre faite sur des botes rchauffes 37C, ensemences abondamment (plusieurs gouttes de LCR). Les milieux de choix sont la glose au sang et la glose chocolat incubes dans une atmosphre de 5 10 % de CO^. L'ensemencement d'un bouillon peut avoir pour intrt de diluer des antibiotiques ventuellement prsents dans le LCR. Recherche d'antignes dans le surnageant de centrifugation Le diagnostic rapide (agglutination de particules de latex sensibilises, ou contreimmuno-lectrophorse) permet une rponse (mningocoque A, B ou C, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae) dans certaines mningites dcapites par les antibiotiques. L'hmoculture doit tre ralise systmatiquement. Un cocci Gram (-) dans une hmoculture ou un LCR lors d'un tableau infectieux svre est presque toujours un mningocoque. Le lendemain le diagnostic prsomptif sera obtenu en agglutinant les colonies suspectes (oxydase (+)) avec les immunsrums spcifiques. Ce diagnostic sera confirm par l'tude des caractres biochimiques. C - Recherche d'un portage La recherche de mningocoque chez un sujet contact se fera par ensemencement d'un frottis rhinopharyng sur milieu slectif. Les colonies suspectes seront identifies comme ci-dessous. D - Examen des colonies suspectes. 1. Diagnostic diffrentiel II pose peu de problmes. les colonies poussent sur VCF ONPG (-) ; diagnostic diffrentiel avec N. lactamica.

- yGT(+)

82

Section II-LES NEISSERIACEAE

- acidification du glucose et du maltose (les souches maltose (-) sont exceptionnelles) - agglutination par immunsrum spcifique.
2. Agglutination sur lame

C'est la technique usuelle de dtermination. L'utilisation d'une culture de 24 heures sur glose au sang (ou Mueller Hinton) est prfrable. Si aucune agglutination n'est observe une suspension paisse est chauffe au bain-mari (100C) pendant 10 mn et on refait l'essai d'agglutination. Cette agglutination doit tre rapide, en quelques secondes. Il ne faut pas tenir compte des agglutinations tardives. Les srums spcifiques des groupes A, B, C, 29E, W 135, X, Y, Z sont commercialiss. Le typage des antignes protiques du mningocoque est rserv aux centres spcialiss. VI - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES Elle est semblable celle du gonocoque, mais sans augmentation de rsistance avec les annes, sauf pour les sulfamides. Les CMI sont plus leves que celles observes avec le gonocoque mais le mningocoque reste sensible la pnicilline (CMI = 0,25 mg/1). Un faible pourcentage de souches sensibilit diminue la pnicilline a t observ, mais celles-ci sont exceptionnelles en France. Par contre, la sensibilit aux sulfamides a diminu et actuellement 50 % des souches appartenant aux groupes B, C et 60 80 % de celles appartenant au groupe A sont rsistantes. Ces souches restent sensibles au cotrimoxazole. Aussi l'intrt des sulfamides dans la prophylaxie de la mningite est faible. Une souche productrice de bta-lactamase a t dcrite ; elle a t isole dans un frottis de col, associe une souche de gonocoque productrice de bta-lactamase. Le transfert du plasmide au mningocoque est vraisemblable ; cette observation est reste unique. VII - TRAITEMENT

A - Traitement curatif pnicilline 30 MU/jour pour les adultes 8 MU/jour pour les enfants ou ampicilline 12-15 g/jour pour les adultes 200-300 mg/kg/jour pour les enfants en perfusion continue pendant 15 jours. L'utilisation de probncide augmente la concentration intra-rachidienne et ralentit l'limination de l'antibiotique. On peut utiliser une cphalosporine dite de 3e gnration (cfotaxime...), le thiamphnicol (pays en voie de dveloppement)... Les traitements adjuvants sont la rhydratation, l'alimentation parentrale, les anticonvulsivants (nourrisson). Dans les formes gravissimes (tat de choc, CIVD...) une ranimation mdicale intensive est ncessaire. Le traitement antibiotique par voie intra-fhcale est exceptionnel et rserv aux formes avec faible raction cellulaire.

Chapitre IV - Le genre Neisserm

83

B - Traitement prophylactique II se fait dans l'entourage immdiat du malade. En milieu ferm (caserne, lyce) le risque de contamination est lev. En milieu ouvert, il est inutile sauf pour rassurer l'entourage. La spiramycine tait l'antibiotique recommand par les autorits sanitaires. La rifampicine est aujourd'hui prfre (voir circulaire ci-dessous). La vaccination ne concerne que les souches des groupes A et C. Elle consiste en une injection de 50 |J.g de polyoside purifi qui induisent l'apparition d'anticorps protecteurs. Elle a permis d'enrayer l'pidmie au Brsil de 1973 en 6 jours. La vaccination est efficace pendant 2 ans, elle n'entrane pas de raction. Le vaccin se conserve 12 mois 4C. Des vaccins contre le mningocoque du srogroupe B sont actuellement utiliss Cuba et sont l'tude en Amrique du Sud. Dans ces pays surviennent depuis peu des pidmies dues ce srogroupe qui prsentent les mmes caractristiques que celles dues au srogroupe A ou C. Ces vaccins utilisent des complexes protiques de la membrane externe et tant donn la multiplicit des srovars, les srotypes les plus frquemment isols dans la rgion vacciner doivent tre utiliss. La protection fournie semble satisfaisante.

ANNEXE
En raison du climat souvent motionnel qui entoure les cas de mningite crbrospinale et des implications mdico-lgales possibles, nous reproduisons ci-dessous la circulaire relative l'attitude observer en prsence de cas de mningite.
PROPHYLAXIE DES INFECTIONS MNINGOCOQUE
Circulaire DGS/PGE/1 C du 5 fvrier 1990

Le mningocoque est une bactrie responsable d'environ 30 % des mningites bactriennes en France. La mortalit de cette infection est loin d'tre ngligeable malgr la sensibilit de la bactrie aux antibiotiques. Une prophylaxie bien conduite dans l'entourage d'un cas doit permettre d'viter la survenue de cas secondaires. Cependant, l'pidmiologie de cette infection est souvent mal connue et les ractions naturelles d'angoisse provoques par cette maladie dans la population peuvent entraner des difficults lors de l'application de ces rgles de prophylaxie. Cette situation conduit parfois des prescriptions inutiles et coteuses. la lumire de l'analyse des donnes de surveillance et d'un travail bibliographique sur l'pidmiologie et la prvention des infections mningocoque, il a paru ncessaire de procder une mise jour de la conduite tenir face un cas d'infection mningocoque. La prsente circulaire, qui se substitue celles du 28 janvier 1 980 et du 13 fvrier 1987, est un document technique destin d'une part, aux mdecins-inspecteurs de la sant qui sont amens prendre et expliquer sur le terrain les mesures de prophylaxie et d'autre part, aux praticiens hospitaliers qui prennent en charge les malades.

84

Section H-LES NEISSERIACEAE

Ce document comporte trois parties : - les deux premires parties exposent les arguments qui permettent de justifier les mesures recommandes : pidmiologie des infections mningocoque et principes de la prvention des cas secondaires; la troisime partie dtaille la conduite tenir en pratique chez le malade et chez les sujets contacts du malade. Par rapport aux recommandations antrieures, cette circulaire apporte trois nouveaux lments : la ncessit de donner un traitement antibiotique prophylactique au malade la sortie de l'hpital, la modification de l'antibiotique propos en chimioprophylaxie et enfin une meilleure dfinition de la conduite tenir en milieu scolaire. Je vous demanderais de bien vouloir diffuser aux mdecins de Sant publique et aux praticiens hospitaliers ce document qui devrait permettre de mieux affronter dans l'avenir des situations parfois difficiles grer. I. PIDMIOLOGIE DES INFECTIONS MNINGOCOQUE La mningite mningocoque et les mningococcmies sont des maladies dclaration obligatoire (dcret n 86-770 du 10-6-1986). Les critres de dclaration sont les suivants : isolement de N. meningitidis dans le LCR et/ou le sang ou prsence d'antignes solubles de cette bactrie dans le LCR, le sang ou les urines. 1. Incidence. - Depuis 1945, l'incidence des infections mningocoque dclares en France connat des fluctuations entre 1 et 4 pour 100 000 habitants. Depuis 1982, elle baisse de faon rgulire et constante pour atteindre 1 pour 100000 habitants en 1988. Cette incidence est trs diffrente selon l'ge. Les taux d'incidence par tranche d'ge exprims pour 100000 sont les suivants : < 1 an : 8,2; 1-4 ans : 3,6; 5-9 ans : 2,0; 10-14 ans : 0,8; 15-19 ans : 1,4; 20 ans et plus : 0,2. 2. Tendances annuelles, pidmies et saisonnalit. II semble que l'incidence des infections mningocoque suive un rythme avec des pics survenant tous les dix ans environ. Des pidmies locales, rgionales, voire nationales (Brsil) peuvent apparatre. Les srogroupes A et C sont le plus frquemment responsables de ces pidmies. Les variations saisonnires en France montrent une frquence accrue du mois de fvrier au mois d'avril, except en 1 988 o le pic de frquence a eu lieu en dcembre. 3. Srogroupes. - Le srogroupe est bas sur l'identification immunologique de polyosides capsulaires du mningocoque. Le srogroupe B est prdominant en France et reprsente 60 % des cas d'infection mningocoque. Cependant, de nets changements dans la rpartition par srogroupe des cas sont survenus depuis 1 975. Le srogroupe B connat depuis 1980 une diminution progressive. Le srogroupe C est en augmentation lente et est en cause maintenant dans presque 1 cas sur 3. 4. Srotypes et sous-types. Indpendamment du srogroupe, il existe des marqueurs antigniques dont l'intrt pidmiologique est d'identifier avec prcision une souche donne et d'affirmer donc la similitude des souches lors des foyers de cas groups. Cinq protines de membrane externe permettent de dfinir des srotypes et des sous-types. Ces srotypes et soustypes sont identiques pour les srogroupes B, C, Y, W 135. En France, les srotypes prdominants sont le 4, la. 14,15 pour le srogroupe B et 2a pour le C. Les sous-types prdominants sont le P 1.2, P 1.6, P 1.7. Une formule antignique, vritable carte d'identit de la souche, peut alors tre dfinie en combinant srogroupe, srotype et sous-type, par exemple : C : 2a : P 1.2. Plusieurs tudes ont confirm la virulence particulire du srotype 26 pour le srogroupe B et des srotypes 2, 15, 16 pour les srogroupes B et C.

Chapitre IV - Le genre Neisseria_________________________________________________85

5. Ltalit et facteurs pronostiques. Le taux de ltalit des infections mningocoque en France est relativement constant depuis 1 985 et varie entre 8 et 10 /o. Le taux de ltalit dpend : du srogroupe : il est plus important pour le srogroupe C et plus faible pour le srogroupe A; - du srotype : il existe une plus forte mortalit pour les mningocoques B type 2 b que les autres types de mningocoque B; d'autres facteurs : la survenue d'une septicmie mningocoque et/ou d'un purpura fulminans, un ge infrieur 1 an ou suprieur 50 ans sont des facteurs de risque de mortalit. 6. Portage rhinopharyng et infection. La transmission du mningocoque se fait essentiellement par les scrtions rhinopharynges mises lors de la toux ou de la parole. La bactrie se loge alors sur la paroi postrieure du rhinopharynx. L'acquisition du mningocoque est asymptomatique ou entrane une simple pharyngite non spcifique. Dans la grande majorit des cas, le sujet s'immunise en fabriquant des anticorps protecteurs et devient porteur sain. Dans un petit nombre de cas, l'infection diffuse par voie sanguine et provoque une infection systmique : mningite ou mningococcmie.

a. Rle du portage
Immunisation. Chez les sujets porteurs sains, 92 % dveloppent des anticorps contre la souche porte et 80 % contre au moins une autre souche virulente par immunisation croise. Ces anticorps atteignent un taux assurant une protection environ 7 14 jours aprs l'acquisition de la souche (maximum 1 mois). Avant l'ge de 6 mois, l'enfant est habituellement protg par les anticorps maternels. La majorit des adultes a rencontr le mningocoque et possde des anticorps assurant sa protection contre les souches les plus frquentes. Le nombre de sujets non protgs est maximal vers l'ge de 1 3 ans, expliquent la plus grande frquence de cas cet ge. Grce l'immunisation croise, les souches peu pathognes ou pathognes et peu virulentes pourraient jouer un rle important dans l'immunisation des sujets contre des souches plus virulentes appartenant d'autres srogroupes. De mme, l'acquisition de Neisseria lactamica, souche trs rarement pathogne, pourrait par le mme phnomne protger le sujet contre N. meningitidis. L'acquisition de N. lactamica se fait pendant l'enfance, et le taux de portage diminue quand l'ge augmente (21 % de sujets porteurs 18 mois, puis diminution progressive jusqu' 2 % 14-17 ans). Infection systmique. Le facteur de risque de dveloppement d'une infection systmique n'est pas le statut de porteur mais l'acquisition rcente du portage. Les srogroupes A, et dans une moindre mesure C, ont une virulence plus importante que le B et sont plus rarement retrouvs chez les porteurs sains. Dure du portage, d/ai entre /'acquisition du mningocoque et /'apparition de /a maladie. La dure du portage est longue : 5 1 5 semaines, voire 9 16 mois dans certains cas. Les infections systmiques se dveloppent dans les 7 jours suivant l'acquisition du portage. Les sujets porteurs de la bactrie depuis plus de 7 jours ont gnralement dvelopp des taux suffisants d'anticorps protecteurs. b. tudes de portage. Les tudes ralises sur le taux de portage trouvent des rsultats assez diffrents d'une tude l'autre probablement en raison de techniques diffrentes de prlvement. En effet, N. meningitidis est retrouve uniquement sur la paroi postrieure du rhinopharynx et non sur les amygdales. Le taux de portage d'une souche chez les sujets asymptomatiques dpend troitement de sa virulence et de sa transmissibilit.

86

Section II-LES NEISSERIACEAE

Taux de portage de la population gnrale. Ce taux est variable selon l'ge : d'environ 10 % l'ge de 0 14 ans, il augmente un taux de 30 % 15-20 ans puis diminue ensuite. Taux de portage en milieu familial. Le taux de portage varie selon qu'il y a eu un cas de mningococcie dans la famille ou non. Le taux de portage dans une famille sans cas varie de 2 1 8 %. Ce taux passe 10-50 % si un cas survient dans la famille. Une fois sur deux, le sujet introduisant le mningocoque dans la famille est un adulte masculin. Les contacts non familiaux des cas (amis, voisins immdiats), ainsi que les sujets contacts des porteurs sains (contacts secondaires) ont un taux de portage de la souche non significativement diffrent de celui de la population gnrale. Taux de portage en milieu scolaire. Le taux de portage en milieu scolaire, en dehors de la survenue de cas dans l'cole est d'environ 23 /o. Lors de la survenue d'un cas dans une cole, le taux de portage de l'ensemble de l'tablissement n'augmente pas significativement. Dans les classes des cas, le taux de portage est plus important (environ 40 /o). Les lves assis prs d'un cas la cantine ont un risque plus important d'acqurir la bactrie. Une tude a trouv un taux de portage plus lev dans les classes dans lesquelles les lves sont assis moins d'un mtre l'un de l'autre que dans le reste de l'cole. Taux de portage en milieu militaire. Lors du dbut du service, le taux de sujets porteurs varie de 0 33 %, il augmente avec les semaines d'entranement pour atteindre environ 80 /o aprs 5 semaines. 7. Facteurs favorisant la transmission du mningocoque. - Plusieurs facteurs pouvant faciliter la transmission du mningocoque ont t mis en vidence. Certains sont bien tablis, d'autres prtent encore discussion : la promiscuit est un facteur bien connu pour favoriser la transmission de la bactrie. La contagion est favorise, dans une famille, si le nombre de personnes est lev dans un espace restreint et si plusieurs personnes dorment dans la mme pice; les sujets exposs aux scrtions oropharynges du malade ( flirts ou partenaires sexuels) ont un risque plus lev d'acqurir la bactrie; des conditions socio-conomiques dfavorables sont galement un facteur de risque de transmission du mningocoque, probablement par une promiscuit plus troite entre les sujets ; il existe galement une incidence plus leve en zone urbaine qu'en zone rurale; une infection virale des voies respiratoires est vraisemblablement un facteur de risque d'acquisition du mningocoque, mais ce point reste discut. Il existe une relation entre les courbes d'incidence des syndromes grippaux et des infections mningocoque, en dehors d'un effet de saisonnalit. Les viroses respiratoires pourraient favoriser l'mergence d'une mningococcie de deux faons : soit en favorisant l'acquisition du mningocoque par transmission conjointe lors de la toux, soit en favorisant le passage du porteur sain de mningocoque l'infection proprement dite, par fragilisation du terrain. 8. pidmiologie des cas secondaires. a. Dfinition d'un cas secondaire. Un cas secondaire se dfinit comme un cas d'infection mningocoque survenant chez un sujet contact d'un cas avec un dlai suprieur 24 heures. Les cas secondaires sont rares : 3 % des cas de mningococcie en France en 1 987-1988. Les cas groups survenant dans un dlai infrieur 24 heures sont dfinis comme des cas coprimaires et reprsentent 3 % de l'ensemble des mningococcies en France.

Pupitre IV - Le genre N e i s s e r i g _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 8 7

b. Taux d'attaque secondaire en milieu familial et scolaire. Dans les familles o au moins un cas est survenu, le taux d'attaque secondaire s'chelonne entre 2 et 4/1000 en priode d'endmie et 60/1000 en priode pidmique. Le risque de survenue d'un cas est dans ces familles de 500 800 fois suprieur au taux d'incidence de la population gnrale en priode non pidmique. Le risque est multipli par 76 dans les crches et 23 dans les coles maternelles. Le risque n'a t valu pour les coles primaires et secondaires que lors de l'pidmie brsilienne : les classes des cas n'avaient pas un taux d'incidence plus important que la population gnrale. c. Dlai de survenue des cas secondaires. Prs de 60 % des cas secondaires apparaissent dans la semaine suivant le cas index, et 87 % dans les 1 5 jours. De rares cas peuvent apparatre de 3 8 mois aprs le cas index, mais le lien avec le cas index peut tre indirect par l'intermdiaire de porteurs sains.

II. PRINCIPES DE LA PRVENTION DES CAS SECONDAIRES 1. Populations cibles La prophylaxie des infections mningocoque a deux objectifs : empcher l'acquisition de la bactrie et/ou l'infection chez les sujets en contact troit avec un cas; rompre la chane de transmission d'une souche virulente en empchant sa diffusion secondaire une population susceptible (jeunes enfants) par des porteurs sains. / Pour rpondre ces objectifs, 3 groupes cibles peuvent tre individualiss : les sujets vivant au domicile du malade ou ayant dormi dans la mme pice que lui dans les 10 jours prcdant l'hospitalisation; les sujets ne vivant pas au domicile du malade mais ayant eu des contacts proches et rpts avec le cas dans les 10 jours prcdant l'hospitalisation ; les collectivits de jeunes enfants (crches, maternelles). De plus, les cas eux-mmes devront faire l'objet d'une chimioprophylaxie aprs le traitement curatif administr l'hpital. En effet, ce traitement s'est rvl inefficace pour liminer le portage rhinopharyng, et ces sujets risquent de transmettre ultrieurement une souche virulente des sujets contacts. La prophylaxie doit tre applique le plus rapidement possible aprs le diagnostic car son intrt diminue avec le temps. Idalement, elle doit tre entreprise le jour mme ou le lendemain du diagnostic. Il s'agit d'une vritable urgence prventive . 2. Chimioprophylaxie L'antibiotique choisi doit tre efficace sur N. meningitidis et en doit pas crer d'mergence de souches rsistantes. Il doit atteindre des concentrations salivaires suprieures la Concentration Minimale Inhibitrice pour N. meningitidis. Son action doit tre rapide et prolonge dans le temps. Il ne doit pas dcapiter une ventuelle mningite. Il doit tre bien tolr et avec peu de contre-indications. Il doit tre d'un emploi pratique avec un traitement de courte dure. La pnicilline, l'ampicilline et l'rythromycine n'atteignent pas des concentrations locales suffisantes et sont inefficaces sur le portage. De nombreuses souches de N. meningitidis sont rsistantes aux sulfamides, qui sont donc contre-indiqus dans cette indication. La minocyc/ine entrane des effets secondaires vestibulaires dans de nombreux cas et est contre-indique chez le jeune enfant et la femme enceinte. Il n'existe pas un recul suffisant pour valuer convenablement des antibiotiques plus rcents tels que la ceftriaxone ou la ciprofloxacine.

88

Section II-LES NEISSERIACEAE

La spiramycine atteint des concentrations salivaires satisfaisantes. Elle a trs peu de contre-indications et d'effets secondaires, mais la dure du traitement est relativement longue (5 jours). Cet antibiotique ne passe pas la barrire hmato-mninge. La spiramycine est efficace pour rduire le portage court terme (1 5 % des sujets restent porteurs 2 jours aprs la fin du traitement), mais il existe une racquisition importante puisque 1 2 jours aprs la fin du traitement, 41 % des sujets sont porteurs (ce taux est de 75 % pour les sujets hbergeant un mningocoque C). Il n'existe pas d'essai clinique satisfaisant permettant d'affirmer qu'elle limine le portage rhinopharyng aprs un dlai de plus de 1 5 jours aprs son administration. Deux cas d'infections mningocoque aprs une chimioprophylaxie correctement prise ont t rapports en France. La rifampicine s'est rvle efficace, dans des essais cliniques rigoureux, pour rduire le portage (75 % 98 % de succs, selon les tudes, une semaine aprs le traitement). Le taux de racquisition est faible : environ 10% au bout de 11 mois. La concentration salivaire est suffisante pour liminer la bactrie. Il existe trs peu d'effets secondaires aux doses employes dans cette indication. Son emploi est peu contraignant (2 jours) et les contre-indications sont rares, surtout chez les moins de 1 8 ans qui forment la majorit des sujets risque. La rifampicine est largement utilise dans les pays anglo-saxons depuis les annes 70. Malgr cette large utilisation, l'apparition de souches rsistantes aprs chimioprophylaxie ne parat pas avoir d'incidence pratique. L'mergence de souches rsistantes in vitro aprs traitement prophylactique existe chez 1 10% des sujets, mais seulement 0,1 5 % des souches isoles partir de malades, de 1 975 1 980 aux tats-Unis, se sont rvles rsistantes la rifampicine. Son utilisation comme traitement de la tuberculose a t un argument contre son emploi comme moyen prophylactique. Cependant, il n'a jamais t dmontr qu'une prescription de courte dure puisse induire l'apparition de BK rsistants. De plus, le risque de prescription de rifampicine but prophylactique chez un tuberculeux dont le diagnostic n'aurait pas t fait, a t estim aux tats-Unis environ 1 sur 100 millions. 3. Vaccination Un vaccin anti-mningocoque A+C est commercialis en France. Le vaccin est strictement spcifique des srogroupes contre lesquels il est conu. Il n'existe pas de vaccin contre le mningocoque B. L'injection du vaccin est suivie par une ascension du taux d'anticorps atteignant un seuil protecteur en 5 8 jours. La vaccination s'est rvle efficace pour une protection individuelle chez environ 90 % des sujets vaccins. Le vaccin est efficace ds l'ge de 3 mois pour le srogroupe A et partir de 1 an pour le C. La protection optimale pour les deux srogroupes est obtenue aprs l'ge de 18 mois et augmente avec l'ge. La dure de protection est assez faible pour les deux srogroupes (3 ans environ, et moins chez les enfants de moins de 1 8 mois). Les effets secondaires du vaccin sont rares (2 %) et consistent en un rythme au point d'injection et/ou une fivre modre. Il n'existe aucune contre-indication au vaccin, y compris pendant la grossesse. Ht. ACTUALISATION DES RECOMMANDATIONS FRANAISES 1. Conduite tenir chez le malade : le malade doit tre hospitalis en urgence ds la suspicion du diagnostic; l'hpital, les examens offrant le maximum de chance d'isoler la bactrie et d'identifier le srogroupe doivent tre effectus : ponction lombaire, hmocultures, prlvement au niveau du rhinopnarynx postrieur (si possible avant antibiothrapie), recherche d'antignes solubles dans le L.C.R., le sang et les urines. En cas de dcs avant la ponction lombaire, celle-ci doit tre pratique en post mortem pour affirmer le diagnostic et identifier le srogroupe;

Chapitre IV - Le genre Neisserig_____________________________________________________89

le srogroupage de la souche doit tre effectu sans exception ds l'isolement de la bactrie. La souche doit tre systmatiquement envoye pour srotypie au Centre national de rfrence du mningocoque (Dr Riou, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur-Roux, 7 5 7 2 4 Paris Cedex 15, tl.:45688330); le cas doit tre dclar par tlphone au mdecin de la D.D.A.S.S. ds l'isolement du mningocoque. Le srogroupe doit galement tre communiqu par tlphone au mdecin de la D.D.A.S.S. ds son obtention. Le questionnaire de dclaration doit tre soigneusement rempli et adress la D.D.A.S.S., juste avant la fin de l'hospitalisation (ou aprs le dcs); la suite de l'antibiothrapie but curatif, le malade doit bnficier d'un traitement antibiotique prophylactique selon les mmes modalits que pour les sujets contacts (voir ci-dessous). Il pourra rintgrer une collectivit scolaire ds la fin de ce traitement. 2. Conduite tenir chez les sujets contacts du malade a. Dfinition des sujets contacts Les mesures de prophylaxie doivent tre proposes aux sujets contacts dfinis de la faon suivante (rcapitule dans l'organigramme joint en annexe) : En ville : personnes vivant au domicile du malade ou ayant dormi dans la mme pice que le malade dans les 10 jours prcdant l'hospitalisation; personnes exposes aux scrtions oropharynges du malade dans les 10 jours prcdant son hospitalisation : camarades de jeux habituels du malade, flirts ou partenaires sexuels d'un cas adolescent ou adulte, sujets ayant partag une soire dansante avec le malade; personnes ayant pratiqu des manuvres de ranimation impliquant un contact troit avec les scrtions oropharynges du malade (bouche-bouche, intubation trachale).

Dans les pouponnires, crches et tablissements d'enseignement ou d'du} cation publies ou privs
Dans les tablissements scolaires, l'arrt du 3 mai 1989 prcise que les mesures de prophylaxie sont prises l'initiative de l'autorit sanitaire reprsente par la D.D.A.S.S. Dans les crches et les pouponnires, les mesures de prophylaxie sont prises par la D.D.A.S.S. en liaison avec le mdecin responsable de l'tablissement. En pratique, les parents des enfants concerns par la prophylaxie seront destinataires d'une note recommandant une consultation mdicale et rappelant les mesures prendre pour leur enfant. Pouponnires, crches, coles maternelles tant donn la promiscuit troite existant dans ces tablissements et l'ge des enfants, les mesures de prophylaxie seront proposes la fois aux enfants et au personnel. Aucun nouvel arrivant ne sera admis avant la fin du traitement. coles primaires, collges, lyces On peut distinguer trois circonstances : survenue d'un seul cas : la prophylaxie sera propose exclusivement aux sujets ayant eu un contact frquent avec le malade : camarades habituels de jeux ou d'tude, voisins immdiats habituels de rfectoire, au maximum toute la classe; survenue de plusieurs cas dans /a mme classe : la prophylaxie sera propose l'ensemble de la classe et ne devra pas tre tendue au reste de l'tablissement; survenue d'autres cas dans l'tablissement : lors de la survenue d'un deuxime cas dans une classe diffrente de celle du premier'malade, les rgles de prophylaxie ne seront pas tendues l'ensemble de l'tablissement et concerneront uniquement les lves des 2 classes et les camarades habituels de jeux, d'tude ou les voisins immdiats habituels de rfectoire des malades. Les mesures de prophylaxie ne seront proposes l'ensemble de l'tablissement que lorsque 3 cas ou plus surviennent dans cet tablissement dans

90__________________________________

Section II-LES NEISSERIACEAE

au moins 2 classes diffrentes, avec un intervalle maximal d'un mois entre le premier et le dernier cas. Internats Outre les sujets dfinis ci-dessus, les voisins de dortoir du malade seront concerns par des mesures prophylactiques. Universits Une prophylaxie sera propose exclusivement aux camarades habituels dui malade. Dans les collectivits d'adultes Les rgles de prophylaxie seront recommandes exclusivement en cas de survenue d'au moins un cas secondaire dans la collectivit et ne devront s'appliquer qu'aux sujets ayant des contacts frquents avec l'un des cas. b. Rgles de prophylaxie dans l'entourage d'un cas Les mesures prophylactiques sont d'autant plus efficaces qu'elles sont institues rapidement. Elles ne prsentent plus qu'un intrt limit si elles sont prises plus de 8 jours aprs le diagnostic. Chimioprophylaxie Pour les sujets contacts dfinis ci-dessus, une Chimioprophylaxie sera propose selon le schma suivant : rifampicine pendant 2 jours la dose suivante : adulte : 600 mg deux fois par jour, enfant de 1 mois 1 2 ans : 10 mg/kg deux fois par jour, enfant de moins de 1 mois : 5 mg/kg deux fois par jour. PERSONNES CONCERNES PAR LES MESURES DE PROPHYLAXIE

Chapitre IV - Le genre Neisserig ___________________________________________

91

Les contre-indications sont les suivantes : grossesse, maladie hpatique svre, alcoolisme, porphyries, hypersensibilit la rifampicine. Une prcaution d'emploi concernant le port de lentilles de contact est signaler en raison du risque de coloration dfinitive de ces lentilles. Les effets secondaires sont mineurs : coloration orange des urines et de la salive; interaction avec les contraceptifs oraux; en cas de contre-indication la rifampicine : spiramycine pendant 5 jours la dose suivante : adulte : 3 millions d'U.I. deux fois par jour, enfant : 75 000 U.l./kg deux fois par jour.

Vaccination
Quand un mningocoque du groupe A ou C est isol chez le malade, ds lors que le srogroupe est connu, une vaccination sera propose conjointement la chimioprophylaxie, pour les sujets contacts : gs de 3 mois ou plus pour le mningocoque A; gs de 1 an ou plus pour le mningocoque C. Il n'y a pas de contre-indication cette mesure, y compris lors de la grossesse. La vaccination ne se substitue, en aucun cas, la chimioprophylaxie dont elle relaie l'effet protecteur. Information et surveillance mdicale Les sujets contacts et les sujets appartenant la mme collectivit que le malade devront tre informs sur la maladie et les mesures prendre. Une surveillance mdicale des sujets contacts sera institue pendant les 1 5 jours suivant l'application des mesures prophylactiques. Les sujets contacts et les sujets appartenant la mme collectivit que le malade devront consulter un mdecin si des symptmes vocateurs apparaissent.

Mesures inutiles et viter


La dsinfection rhinopharynge, le prlvement rhinopharyng des sujets contacts sont inutiles. L'viction scolaire ou l'isolement des sujets contacts n'est pas recommand. tant donn la fragilit du mningocoque, la dsinfection ou la fermeture d'un tablissement, y compris scolaire, sont des mesures tout fait inutiles et injustifies. L'extension des mesures de prophylaxie des populations plus larges que celles dfinies ci-dessus doit tre vite. Cette extension n'a pas de justification pidmiologiquement dmontre tout en reprsentant un cot pour la collectivit. Ces recommandations ont reu l'approbation du Conseil suprieur d'hygine publique de France, section Prophylaxie des maladies . Vous voudrez bien me faire part des difficults rencontres dans l'application de cette circulaire.
Le directeur gnrai de la Sant,

Pr J.-F. GIRARD

source : Bulletin pidmiologique Hebdomadaire n 7/1990

LES AUTRES NEISSERIA


Ce sont des germes commensaux des voies ariennes suprieures de l'homme et de l'animal qui sont parfois responsables d'infections pulmonaires et de septicmies, souvent sur des terrains dbilits.

92

Section II - LES NEISSERIACEAE

1 - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES (Tableau I) Ce sont des cocci Gram (-) associs en diplocoques ou en ttrades, mtabolisme oxydatif. N . elongata est un bacille Gram (-) qui est rattach aux Neisseria sur des arguments gntiques et biochimiques. Les Neisseria cultivent 20C et peuvent tre isols sur les milieux usuels. Elles produisent un verdissement de la glose au sang. Deux espces poussent sur milieu slectif (rsistance la colimycine) et acidifient le glucose et le maltose et peuvent poser un problme de diagnostic diffrentiel avec N. meningitidis : Neisseria lactamica est la seule espce qui acidifie le lactose et N. polysacchareae ne possde pas de y GT et synthtise des polysaccharides sur milieu saccharose. N. cinerea peut tre isol sur milieu slectif mais ne pousse pas au repiquage sur ce milieu. Par ailleurs, seul un petit nombre de souches parmi les autres espces de Neisseria possde cette caractristique. II - POUVOIR PATHOGNE Ces espces sont exceptionnellement responsables d'infections caractrises. Les infections broncho-pulmonaires sont les plus frquentes et permettent d'isoler N. perflava, N. sicca, N. mucosa. Des septicmies ont t dcrites, parfois avec des endocardites (N. sicca le plus souvent) ; les mningites sont rares. III - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE Plusieurs types de prlvements peuvent permettre l'isolement de ces Neisseria : - frottis de nez et de gorge - crachats - liquides pleuraux - hmocultures - ventuellement LCR. Le diagnostic bactriologique ne devrait pas poser de problme. - A l'examen direct : prsence de cocci Gram (-) (si le prlvement est purulent, prsence de diplocoques intra-cellulaires). - L'aspect en culture est utile pour le diagnostic (pigment, hmolyse, colonies sches ou muqueuses,...). Les caractres biochimiques permettant l'identification sont peu nombreux : ONPG, acidification des sucres, rduction des nitrates, ^Gt. Le diagnostic diffrentiel avec le mningocoque ne se pose gnralement pas. IV - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES Ces espces rsistantes aux pnicillines M et aux lincosamines, sont en gnral sensibles aux mmes antibiotiques que les cocci Gram (+).

TABLEAU 1

DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE SIMPLIFI DES NEISSERIA ET BRANHAMELLA

GENRES et ESPCES I. Neisseria N gonorrhoeue N meningitidis

PRINCIPAUX CARACTRES Croissance Pigments Hydrolyse des glucides Tributyrine yGT Synthse polysur milieux Glu Mal Fru Sac ONPG saccharides slectifs + + + sauf heidelb + + + + (lger) + + + + + + + + + + + + +

AUTRES CARACTRES ET REMARQUES Importance de l'antibiogramme Recherche de p-lactamase Agglutination groupes A, B, C, X, Y, Z 29 E, W135 Respiration des nitrates (dgagement d'azote partir de N03) Ncessit d'une tude attentive de la morphologie des colonies. Rduit les nitrites, pas les nitrates. Rduit les nitrites, pas les nitrates. Rarissime Diagnostic diffrentiel important avec le mningocoque Rduit les nitrates.

N. polysacchareiie N. mucosa

N. subflava var. subflava var.flava var. perflava N. sicca N.flavescens N. lactamica II. Branhawlla B. catarrhalis

) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

Section II- LES NEISSERIACEAE

BIBLIOGRAPHIE
Revue gnrale : KNAPP J.S., Historical perspectives and identification oNeisseria and related species . Clin. Microbiol. Rev., 1988, 1, 415-432. Neisseria gonorrhoeae BRITIGAN B.E., COHEN M.S., SPARLING P.F., Gonococcal infection : a model of molecular pathogenesis . N. Engl. J . Med., 1985, 312, 1683-1694. RIOU J.Y., GUIBOURDENCHE M., YVERT F., Ecologie des Neisseria gonorrhoeae . Md. Mal. Infect., 1985, 9 bis, 481-490. Treatment Guidelines, Sexually Transmitted Diseases, U.S. Department of Heaith and Human Services, Public Heaith Service, Centers forDisease Control.1989. Neisseria meningitidis ASHTON F.E., RYAN A., DIENA B. and JENNINGS H.J., A new serogroup (L) oNeisseria meningitidis . J . Clin. Microbiol. 1983 ,Y1, 722.727. FRASCH C.E., Status of a Group B Neisseria meningitidis Vaccine . Eur. J . Clin. Microbiol., 1985, 4,533-536. PELTOLA H., Meningococcal disease : still with us . Rev. Infect. Dis., 1983, 5, 71-91. A signaler : - Le numro spcial de Mdecine et Maladies infectieuses de 1984, Tome XTV, consacr au mningocoque et sa pathologie. - Le numro spcial de Antonie van Leeuwenhoek Journal of Microbiology, 1986, vol 52, n3, International symposium on th emerging pidmie of meningococcal disease in N.W. Europe . Autres Neisseria MARTIN P., GUIBOURDENCHE M. et RIOU J.Y., A propos des Neisseria et Branhamella trouves en localisation inhabituelle . Ann. Biol. Clin. 1981, 39, 273-278. RIOU J.Y., GUIBOURDENCHE M. and POPOFF M.Y., A new taxon in th genus Neisseria. Ann. Microbiol., (Inst. Pasteur), 1983,134 B, 257-267.

Chapitre V MORAXELLA - BRANHAMELLA

Ce sont des bactries en forme soit de coccobacilles (Moraxella), soit de cocci (Branhamella). Les bacilles sont trs courts et arrondis, parfois coccodes. Ils se prsentent habituellement en paires ou en courtes chanettes, souvent pliomorphes, ils montrent des variations de taille, de longueur et sont frquemment sous forme filamenteuse dans les cultures. Les cocci se prsentent isols ou en paire et leur morphologie est identique celle des Neisseria. Les Moraxella, immobiles l'examen direct l'tat frais (absence de flagelles), sont cependant capables de dplacement par glissement ou par saccades lorsqu'ils sont en contact avec une surface approprie (chambre huile de Pichaud et sur milieu semi-solide : Barker et Maxted). Cette mobilit est lie la prsence de pili. Ils sont Gram (-) mais ils se dcolorent difficilement. Ils peuvent tre capsuls. Ils sont arobies stricts, certaines espces respirent les nitrates en anarobiose. Ils possdent une cytochrome C oxydase et en gnral une catalase. Ils ne produisent pas de pigment, ne produisent pas d'acide partir des hydrates de carbone et sont sensibles la pnicilline. Ce sont des bactries chimio-organotrophes avec des exigences nutritives complexes, et dont les facteurs de croissance sont en gnral inconnus. La temprature optimale de croissance se situe entre 33 et 35C. Ce sont des saprophytes habituels des muqueuses de l'homme et des animaux sang chaud. Leur pouvoir pathogne est en gnral limit, sauf sur terrain dbilit o ils se comportent comme des pathognes opportunistes.

MORAXELLA
HISTORIQUE
Morax (1896) et Axenfeld (1897) ont individualis la conjonctivite due un diplobacille srophile dans le groupe mal dfini des conjonctivites catarrhales. Ils ont cultiv la bactrie et montr son pouvoir pathogne. A. Lwolff (1939) cre le genre Moraxella pour le sparer iSHaemophilus.

96

Section II - LES NEISSERIACEAE

1 - CLASSIFICATION DES ESPCES - NOMENCLATURE Le regroupement du genre Moraxella en deux sous-genres Moraxella et Branhamella a t effectu sur la base d'tudes gntiques. L'ancienne dnomination de Moraxella oxydase (-) correspond actuellement au genre Acinetobacter. Dans le sous-genre Moraxella, trois espces sont troitement lies du point de vue gnomique M. lacunata, M. bovis, M. non liquefaciens. M. osloensis, M. phenyipyruvica, M. atlantae ont plus- de diffrences gntiques entre elles et diffrent des autres Moraxella. M.urethralis s'carte beaucoup de ces espces et a t rattache au genre Oligella, un nouveau genre dans la famille des Neisseriaceae. Il est propos de rassembler Branhamella et Moraxella en une nouvelle famille, les Branhamaceae. II - CARACTRES GNRAUX Sur milieu glose les colonies sont irises. La culture en bouillon prsente un trouble homogne avec un voile en surface o l'on retrouve les mmes formes courtes que sur glose. A l'isolement, le meilleur milieu de culture est constitu par la glose au sang qui permet de satisfaire les exigences nutritives complexes des Moraxella. En dehors de M. lacunata, les autres espces peuvent tre cultives sur glose nutritive contenant de l'extrait de levure. La srophilie de M. lacunata s'explique par un besoin en acide olique. Elle peut tre reproduite en eau peptone o la croissance est proportionnelle la concentration en tween 80 (ester d'ac. olique). Un milieu minral simple contenant un sel d'ammonium comme source d'azote et de l'actate comme source de carbone est suffisant pour permettre la croissance de M. osloensis et 0. urethralis, caractre utile pour leur identification. Cependant ce type de milieu ne permet pas leur isolement. M - MORAXELLA LACUNATA A - Morphologie Dans le pus conjonctival : gros btonnets droits, trapus extrmits arrondies, groupes surtout en diplobacilles, parfois isols ou en courtes chanettes au milieu de polynuclaires et de cellules pithliales. En culture : plus polymorphes, diplobacilles, gros diplocoques. Prsence de corpuscules mtachromatiques. B Caractres culturaux et identification srophile : ne pousse jamais sur milieu ordinaire milieu d'isolement : glose au sang, glose chocolat - glose srum : en 24 h 35 37C, petites colonies ayant souvent moins de 1 mm, gristres, semi-transparentes, grossissant par la suite avec un centre saillant et une priphrie plus mince. - srum coagul : ds 24 h petites cupules de liqufaction caractristiques, ( lacunes ) qui augmentent par la suite. Le srum est progressivement liqufi.

Chapitre V - Moranella - BranhaimUa__________________________________________________97

- glatine + srum 37C : liqufaction - lait + srum (arobiose) culture, parfois coagulation. C Pouvoir pathogne naturel C'est l'agent de la conjonctivite subaigue diplobacillaire dcrite par Morax. Contagieuse, non pidmique, non saisonnire^peu frquente, bnigne, le plus souvent bilatrale ou le devenant secondairement, elle volue volontiers vers la chronicit. Elle est caractrise par un accolement matinal des paupires, une lgre scrtion mucopurulente, une rougeur limite habituellement au rebord palpbral et l'angle interne de l'il (caroncule), rarement complique. Une kratite peut tre observe (ulcre grave, serpigineux avec hypopion). C'est une complication bactrienne ventuelle du trachome. Elle est gurie rapidement par les collyres au sulfate de zinc ou aux antibiotiques. L'extrme sensibilit de ce germe aux antiseptiques et aux antibiotiques fait que M. lacunata n'est plus que trs rarement isol. La classification actuelle rassemble M. lacunata et M. liquefaciens (M. duplex var. liquefaciens) qui taient distingues auparavant sur trois seuls critres (culture plus facile et plus rapide et srophilie non obligatoire) et pouvoir pathogne plus prononc pour ce dernier.
IV - MORAXELLA BOVIS (anc. M. duplex var. bovis)

Cette espce a t dcrite par Hauderoy et coll. en 1937 puis par Bovre en 1979. A - Caractres bactriologiques Protolytiques : glatine et srum coagul liqufis Lait : coagul et peptonis Hmolytique Ne rduit pas les nitrates Pas d'urase La prsence de srum favorise la culture. B - Pouvoir pathogne C'est l'agent de la krato-conjonctivite infectieuse des bovids rpandue dans le monde entier. Une espce tout fait semblable appele M. equi est isole chez les chevaux. V - MORAXELLA NON LIQUEFACIENS
(M. duplex var. non liquefaciens)

Cette espce a t dcrite par Scarlett en 1916 puis par Bovre en 1979. Les colonies sur glose au sang ont 2 3 mm aprs 48 heures. Certaines sont trs muqueuses et non hmolytiques, ces colonies bombes et coulantes peuvent faire penser Klebsiella.

98

Section II-LES NEISSERIACEAE

A - Caractres bactriologiques - La glatine et le smm ne sont pas liqufis - Nitrates rduits en nitrites ^~ - Urase prsente chez quelques rares souches. B - Habitat Dans le tractus respiratoire de l'homme, il est habituel dans les fosses nasales, qui est probablement son principal habitat naturel, il est prsent dans la gorge et les crachats. C - Pouvoir pathogne II est encore incertain. Il pourrait tre un agent de surinfections secondaires et de certains cas de bronchites purulentes. Isol dans des cas de mningites, de septicmies, les preuves formelles de son rle pathogne ne sont pas toujours apportes. VI - MORAXELLA PHENYLPYRUVICA Cette espce a t dcrite par Bovre et Henriksen en 1967. Les colonies sur glose au sang sont assez petites : 0,5 1 mm aprs 24 heures. La croissance est lente, difficile, la prsence de srum l'amliore. Le nom de l'espce vient du fait que l'acide phnyipyruvique est le produit de dsamination de la phnylalamine et du tryptophane. A - Caractres bactriologiques - Habituellement non hmolytique, mais on peut noter un verdissement de la glose autour des colonies. - Nitrates habituellement rduits en nitrites - Glatine et srum coagule non liquifis - Urase habituellement prsente - Trs sensible la pnicilline, des souches rsistantes ont t dcrites qui possdent une bta-lactamase. B - Habitat II est mal connu. Des souches sont isoles des voies gnito-urinaires, des urines, du sang, du LCR, de pus, de diffrentes lsions. Un abcs du cerveau a t dcrit. C - Pouvoir pathogne II est sans doute faible, et mal connu l'heure actuelle. VII - MORAXELLA OSLOENSIS Cette espce a t dcrite par Bovre et Henriksen en 1967, et isole Oslo pour la premire fois. On peut mettre en vidence des inclusions de poly-bta hydroxybutyrate (PHB) en cultivant les germes sur un milieu appropri contenant une source d'azote en quantit limitante.

Chapitre V - Morcaella - Branhamella_________________________________________-__'

Ce germe est souvent capsul, les colonies sont lisses, souvent opaques. La croissance est assez facile. Il n'a pas d'exigences spciales et peut tre cultiv sur un milieu minral simple avec de l'actate comme source de carbone. A - Caractres bactriologiques Non hmolytique Srum coagul et glatine non liqufis Rduction des nitrates par la moiti des souches Urase rarement prsente Pas de dsamination de la phnylalanine Citrate rarement utilis Moins sensible la pnicilline que les autres espces, certaines souches sont rsistantes et possdent une bta-lactamase. B - Habitat II est mal connu. Cette espce peut tre isole de l'appareil gnito-urinaire, du sang, du LCR, du tractus respiratoire suprieur. C - Pouvoir pathogne II est probablement faible. Quelques souches ont t isoles dans des cas d'infections svres. VIII - MORAXELLA ATLANTAE Cette espce a t dcrite par Bovre et coll. en 1976. Les colonies sont petites s'incrustant parfois dans la glose. Cette espce est rarement isole du sang, du LCR, de la rate. Son habitat et son pouvoir pathogne ne sont pas dfinis. IX - OLIGELLA (Moraxella urethralis) Sur la base d'tudes gntiques M. urethralis a t rattache au nouveau genre Oligella o l'on distingue deux espces : 0. urethralis et 0. ureolytica. A - Caractres bactriologiques Absence de rduction des nitrates Rduction des nitrites Peut tre cultiv sur milieu minral simple avec de l'actate Prsence d'inclusions de poly-bta hydroxybutyrate Trs sensible la pnicilline B - Habitat Cette espce est isole du tractus gnito-urinaire, de l'urine et de l'appareil gnital de la femme. Son pouvoir pathogne est mal connu, elle peut tre isole chez des sujets immunodprims.

100

Section II- LES NEISSERIACEAE

PRINCIPAUX CARACTRES D'IDENTIFICATION DES ESPCES DES GENRES MORAXELLA et OLIGELLA MORAXELLA Caractre Srophilie Hmolyse Oxydase Catalase Liqufacdon srum coagul et glatine Urase (Christensen) Nitrate rductase Citrate Phnylalamme dsaminase Croissance en milieu minral + actate Pnicilline (sensibilit) OLIGELLA

lacunota bovis non lique- atlantae phenyl- osloensis wethralis ureolyfaciens pyruvica rica + + +f + +

+ +f

+ +

+ +f

+ +f

+ +

+ +

+ +

+ -

+ (+) +

+ +

(+)

+ (+)

+ +

+ +

f = faible, (+) = la plupart des souches sont positives

BRANHAMELLA
Seule espce de Branhamella isole chez l'homme, B. catarrhalis tait appele auparavant Neisseria catarrhalis et a t spare des autres Neisseria en 1970. Trois autres espces de Branhamella ont t rcemment dcrites. Elles sont isoles chez l'animal : B. caviae (chien), B. ovis (mouton), B. cuniculi (lapin). Bien que prsentant des caractres communs avec les Neisseria : cocci Gram (-), oxydase (+), catalase (+), les Branhamella n'ont aucune parent gntique avec ce genre. L'opportunit de leur rattachement aux Moraxella dans le sous-genre Branhamella est actuellement discut. 1 - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE Le diagnostic de cette espce sera port sur les caractres suivants : absence d'acidification des hydrates de carbone absence de pigment, et de synthse de polysaccharides croissance sur milieux usuels hydrolyse de la tributyrine production de lipase et de DNase rduction des nitrates et des nitrites ni hmolyse ni verdissant de la glose au sang. Un faible pourcentage des souches est rsistant la colimycine et crot sur le milieu VCF. La rsistance de la vancomycine permet la fabrication de milieux slectifs.

Chapitre V - Moraxella - Branhamella______________________________________________1U1

II - POUVOIR PATHOGNE n est actuellement mieux connu. Le rle de B. catarrhalis a t montr dans : - les infections broncho-pulmonaires : chez les personnes ges, avec une insuffisance respiratoire (silicose, emphysme) ou cardiaque gauche ; chez les prmaturs, les patients immunodprims... - les infections ORL de l'enfant (otites moyennes, sinusites, rhinopharyngites) - les septicmies et les mningites (exceptionnelles) - les infections oculaires et vnriennes (rares). Ces infections sont courantes en milieu hospitalier. La prsence concomitante de B. catarrhalis producteur de B-lactamase et de Streptococcus pneumoniae ou d'Haemophilus influenzae sensibles la pnicilline dans les voies respiratoires a permis de dvelopper la notion de pouvoir pathogne indirect : B. catarrhalis protgerait les autres agents pathognes respiratoires de l'action de l'antibiotique permettant la prolongation de l'infection maigre un traitement a priori suffisant par ampicilline ou amoxicilline. Dans ce cas un traitement par une cphalosporine orale est justifi. Cependant, il faut noter que B. catarrhalis est souvent le seul agent pathogne isol au cours d'pisodes infectieux. Pour le moment, il n'a pas t mis en vidence de facteurs de virulence chez cette bactrie. B. catarrhalis est souvent isol de l'oro-pharynx de l'enfant mais il est peu frquent chez l'adulte. III - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES B. catarrhalis est en rgle gnrale sensible aux antibiotiques. Mais actuellement plus de la moiti des souches possde une B-lactamase hydrolysant les pnicillines. Cette enzyme est constitutive et le gne port par le chromosome. Inactive sur la cloxacilline et les cphalosporines, elle est inhibe par l'acide clavulanique. B. catarrhalis est sensible aux macrolides et aux cyclines. Il est rsistant au trimthoprime.

BIBLIOGRAPHIE
CATLIN B.W., Branhamella catarrhalis : an organism gaining respect as a pathogen . Clin. Microbiol. Rev., 1990, 3, 293-320. DENAMUR E., AUBRY P., LAURANS G-, SCHMIT J.L., MUIR J.F., EB F., ORFILA J., Pneumonies alvolaires Branhamella catarrhalis de l'adulte. Revue de la littrature. A propos de huit cas personnels . Md. Mal. Infect., 1987, 12, 701-707. HADDAD J., LE FAOU A., SIMEONI U., MESSER J. Branhamella catarrhalis en pathologie infectieuse pulmonaire nonatale . Pdiatrie, 1985, XXXX, n 7, 553-556. ROSSAU R., KERSTERS K., FALSEN E., JANTZEN E., SEGERS P., UNION A., NEHLS L., DE LEY J. Oligella, a new genus including Oligella urethralis comb. nov. (formerly Moraxella urethralis) and Oligella ureolytica sp. nov. (formerly CDC group IVe) : relationship to Taylorella equigenitalis and related taxa . Int. J . Syst. Bacteriol., 1987, 37, 198-210. Le supplment 3, Drugs, 1986, volume 31, est consacr 5. catarrhalis.

Chapitre VI ACINETOBACTER

HISTORIQUE
En 1911 Beijerinck a dcrit un germe isol du sol, Micrococcus calcoaceticus. En 1939 De Bord publie un travail prliminaire sur un groupe de coccobacilles Gram (-) proches des Neisseria qu'il considre comme la tribu des Mimae (Mima polyphorma). En 1940 Audureau dcrit une espce qu'elle rapproche des Moraxella, sans avoir leurs exigences nutritives, sous le nom de Moraxella I w o f f i . De nombreux auteurs ont essay d'imposer leur vision du genre c'est ainsi que les synonymes sont : - Pour les espces formant de l'acide partir du glucose : Herellea vaginicola. De Bord 1942 Bacterium anitratum, Schaub et Hauber 1948 Neisseria winogradskyi, Lemoigne et coll. 1952 Achromobacter anitratum, Acinetobacter anitratum, Brisou et Prvt 1954 Moraxella glucidolytica, Pichaud 1956
B5W

- Pour les espces ne donnant pas d'acide partir du glucose : Alcaligenes haemolysans, Henriksen 1937 Moraxella Iwoffi, Audureau 1940 Mima polymorpha, Acinetobacter I w o f f i , Brisou et Prvt 1954 Achromobacter haemotyticus, var. alcaligenes 1962 Achromobacter citroalcaligenes. Baumann, Doudoroff et Stanier en 1968 ont propos de runir toutes ces varits dans une seule espce et un seul genre Acinetobacter calcoaceticus.

1 - CLASSIFICATION - NOMENCLATURE II s'agit de coccobacilles, courts, souvent en diplocobacilles, immobiles, Gram ngatif. Ce sont des arobies stricts, souvent encapsuls, ne rduisant pas les nitrates, catalase (+), oxydase (-). Prototrophes, ils peuvent crotre sur un milieu minral avec une source de carbone simple. GC 39 47 moles %. La dernire dition (1984) du Bergey's Manual reconnait une seule espce, Acinetobacter calcoaceticus, avec 7 phnotypes (Ap A^, A.y, Bp By 83, 84). Toutefois il n'est pas rare de trouver dans certains manuels une distinction entre diverses varits ou biotypes : A. calcoacticus var. anitratus, var. haemolyticus, var. alcaligenes, var. Iwoffi. La dernire dition du Manual of Clinical Microbiology prfre retenir deux sous-espces : A. calcoaceticus subsp. anitratus et subsp. Iwoffi qui correspondent en fait aux ralits de la bactriologie mdicale courante.

Chapitre VI - Acinetobacter

103

En 1986, Bouvet et Grimont se basant sur des tudes d'hybridation ADN-ADN ont dcrit 12 gnospecies. Ce nombre est aujourd'hui d'une vingtaine. Les caractres phnotypiques des six plus frquents d'entre eux sont montrs dans le tableau I. A. baumannii est l'espce la plus souvent isole en milieu hospitalier. II CARACTRES GNRAUX, PHYSIOLOGIQUES ET MTABOLIQUES

Les colonies ont 1 2 mm de diamtre en 24 heures, elles sont lisses souvent muqueuses, blanc-jauntre et d'aspect butyreux.
Les nitrates ne sont pas rduits en nitrites ou alors trs rarement et trs lentement. Certaines souches acidifient sans production de gaz le glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, lactose. Le glucose est oxyd en acide gluconique, les glucides sont oxyds en acides hexoniques et pentoniques par une aldose dshydrognase non spcifique. Les Acinetobacter capables d'utiliser le glucose comme source de carbone et d'nergie dgradent ce compos uniquement selon la voie d'Entner-Doudoroff. La possibilit pour certains Acinetobacter (glucidolytica} de former de l'acide en arobiose partir du glucose est lie la prsence chez ces souches d'une glucose-dshydrognase qui oxyde le D.glucose en D.gluconolactone et la possibilit pour certaines souches de crotre aux dpens du glucose, est fonction de leur possibilit de dgrader l'acide gluconique. L'oxygne est l'accepteur terminal d'lectrons pour la forme particulaire de cette enzyme qui est absente chez les souches non saccharolytiques. Acinetobacter ressemble aux Pseudomonas par le fait qu'il peut utiliser une large varit de composs organiques comme source de carbone et d'nergie. Il n'exige pas de facteurs de croissance particuliers et peut crotre dans un milieu minral simple avec une seule source de carbone et d'nergie. Les voies mtaboliques utilises par ce germe pour la biosynthse ou la dgradation des composs aromatiques, des hydrocarbures, du 2-3 butanediol sont semblables celles des Pseudomonas (Joni 1978). Beaucoup 'Acinetobacter sont capables de dgrader des hydrocarbures de C8 C20, en les utilisant comme sources de carbone et d'nergie : par exemple, le n-hexadcane est transform en acide hexadcanoque. Toutes les enzymes du cycle de Krebs et du cycle du glyoxalate sont prsents. Certaines souches utilisent le citrate d'autres pas. Acinetobacter contient une chane respiratoire fonctionnelle de transporteurs d'lectrons (cytochromes a^ a^ o d et b, le cytochrome c est absent). Dans les conditions habituelles de l'identification bactriologique, Acinetobacter ne rduit pas les nitrates en nitrites, mais les sels d'ammonium, les nitrates et les nitrites peuvent servir de sources d'azote. Cultiv en prsence de sels d'ammonium Acinetobacter produit une glutamate dshydrognase lie au NADP. Cultiv en prsence de nitrate ou de nitrite Acinetobacter synthtise une nitrate rductase assimilatrice molybdne de 96 kDa. Certaines souches S'Acinetobacter produisent des exoenzymes : lipase, glatinase, hmolysine (phospholipase C). Gutnick et Rosenberg ont propos en 1977 de leur faire jouer un rle dans la solution des problmes de pollution causs par les transpons de ptrole et dans la dcomposition des huiles de vidange de moteurs. Acinetobacter produit un mulsifiant polyanionique et utilise des composs chlores biphnyls, proprits qui pourraient tre utilises dans le contrle des polluants.

III - HABITAT ET PIDMIOLOGIE Bactrie ubiquitaire, Acinetobacter se trouve principalement dans le sol et l'eau (doue, marine), les eaux d'gouts, isole parfois dans le lait et les produits laitiers, dans les aliments. Elle est trs frquemment isole chez l'homme : peau, salive, urine, conjonctive. Elle figure parmi les bactries de la flore rsidente normale du revtement cutan. Les sources d'infections nosocomiales Acinetobacter sont nombreuses en milieu hospitalier. Cette bactrie a la facult de coloniser de nombreux matriels : respirateurs, humidificateurs, lavabos, savons et antiseptiques. Elle peut tre vhicule par les mains du personnel soignant et la majorit des infections sont

104

Section II - LES NEISSERIACEAE

acquises l'hpital. Le fait que les Acinetobacter soient frquemment isols de la peau des malades hospitaliss, mais aussi de sujets normaux ne permet pas de dire avec certitude s'il s'agit de germes commensaux ou de contaminants.
Des immunsrums marqus la fluorescine dirigs contre les antignes capsulaires peuvent servir de marqueurs pidmiologiques pour rechercher la source d'une infection nosocomiale. La dtermination du lysotype des souches est galement utilise dans des laboratoires trs spcialiss. J.F. Vieu utilise deux systmes de lysotypie. Le premier schma comprend 21 bactriophages spcifiques et permet de distinguer actuellement 112 lysotypes, les souches non-typables variant entre 25 35 %. Un deuxime schma complmentaire du premier permet de limiter 20 % cette proportion et de subdiviser les souches non typables en 20 sous-types et un groupe de souches insensibles. L'utilisation de la lysotypie a permis de montrer qu'il existe en milieu hospitalier des foyers pidmiques dus au mme lysotype, la ralit des substitutions de flore par des souches d'Acinetobacter de lysotypes diffrents et le caractre ubiquitaire de certains lysotypes dans divers hpitaux en France alors que d'autres ont une localisation gographique limite. Un systme de biotypie a t dvelopp par P.M.J. Bouvet pour A. bawnannii.

IV - POUVOIR PATHOGNE NATUREL Les Acinetobacter sont parfois considrs uniquement comme des contaminants des prlvements. Ils sont cependant dans un certain nombre de cas (o il faudra discuter l'origine de l'infection) responsables de mningites graves, de septicmies, de pleursies, de conjonctivites, de sinusites, de suppurations cutanes, d'infections urinaires, d'ulcrations intestinales, de pricardites. Lorsque Acinetobacter est isol dans les hmocultures, le foyer initial est souvent un cathter ou s'est constitu la suite d'une intervention de chirurgie digestive. On peut observer une bactrienne ou une septicmie vraie, ceci souvent sur un terrain dbilit. Il s'agit de malades fragiliss par une intervention chirurgicale majeure, un traumatisme, le grand ge. Dans les infections urinaires, une cause mcanique est souvent retrouve (adnome prostatique, grossesse, sondage). Les mningites peuvent tre secondaires une manuvre chirurgicale ou un traumatisme, ou primitives. Le diagnostic diffrentiel rigoureux avec les Neisseria s'impose. Dans les cas authentiques de mningites Acinetobacter, le pronostic est mauvais. Les suppurations Acinetobacter peuvent survenir notamment en chirurgie osseuse par surinfections de plaies provenant de la pose de prothses (hanche), de broches, d'enclouages. Dans les infections respiratoires Acinetobacter peut tre isol lors de pleursies, de pneumonies, dans les crachats et aspirations de malades de ranimation. V - PHYSIOPATHOLOGIE Le pouvoir pathogne naturel 'Acinetobacter est faible et il faut injecter de fortes doses l'animal pour observer des manifestations pathologiques ou un effet ltal. C'est avant tout l'effondrement des dfenses immunitaires qui favorise la colonisation et les surinfections chez les malades des units de soins intensifs. Il est vraisemblable que les polysaccharides capsulaires s'opposent la phagocytose chez les sujets dficients en anticorps opsonisants et en cellules phagocytaires. Comme pour toute bactrie Gram ngatif, l'endotoxine est responsable du choc septique.

Chapitre VI - Acimtobacter_______________________________________________________105

VI - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A - Identification (Tableau I) L'identification d'Acinetobacter est base tout d'abord sur les caractres morphologiques : diplobacilles Gram (-), souvent polymorphes avec des formes allonges filamenteuses. Cette morphologie ne doit pas les faire confondre avec Neisseria. La culture est facile sur les milieux usuels. Certaines souches ont une odeur dsagrable ; quelques rares souches sont hmolytiques sur glose au sang. Ils sont tous oxydase ngative et immobiles. Les principaux caractres tudier sont : - absence de rduction des nitrates - acidification du glucose - croissance en bouillon diffrentes tempratures (44C, 41C et 37C) - citrate de Simmons - recherche de B-xylosidase et d'une ^GT - glatinase Le diagnostic diffrentiel se fait facilement avec Neisseria, Moraxella et les autres bacilles Gram ngatif arobies. Les marqueurs pidmiologiques (srotypes, lysotypes) d'Acinetobacter ne sont pas disponibles au niveau d'un laboratoire courant, il est ncessaire de s'adresser un Centre de Rfrence.
TABLEAUI PRINCIPAUX CARACTRES DE DIFFRENTIATION DES ACJNETOBACTER
TEST

A. calcoaceticus A. baumannii A. haemolyticus A.junii + + -

A.johnsonii A . l w o f f i i I-]

Acidification du Glucose y glutamyltransfrase P xylosidasc Bouillon 44C Bouillon 41C Bouillon 37C Lactate (utilisation) Citrate Simmons Malonate (utilisation) Hmolyse Glatinase

+ + + + -

M + M + + + + + + -

. d

. [+1 + + d

+ l+l + [+1

+ + + +

d = caractre variable ; [+] et [-] = exceptions ces caractres.

B - Structure antignique Acinetobacter, germe ubiquitaire, est complexe du point de vue de sa structure antignique de surface. Plusieurs sries de travaux ont mis en vidence des groupes srologiques diffrents. Marcus en 1969 en utilisant des anticorps marqus la fluorescine montre l'existence de 28 srovars chez les souches saccharolytiques, mais galement d'autres srovars chez les souches ne produisant pas d'acide par oxydation du glucose. Adam l'aide d'immunsrums prpars avec des bactries chauffes ou formoles distingue 41 facteurs K par agglutination sur lame et 40 groupes 0 par hmagglutination indirecte. Certaines parents antigniques ont t dcrites entre le polysaccharide capsulaire de certaines souches d'Acinetobacter et les streptocoques B,

106

Section H - LES NEISSERIACEAE

G, le pneumocoque type 23. De mme des ractions croises s'observent entre des anticorps ant-ChIamydia et un antigne soluble non dialysable et thermostable d'Acinetobacter. C - Immunit Le sujet sain rsiste parfaitement la colonisation et l'infection par cette bactrie. Seuls les malades immunodprims sont frquemment coloniss et occasionnellement infects. Il est probable qu'il existe des mcanismes naturels de dfense contre Acinetobacter mais les parts respectives de l'immunit naturelle et de l'immunit acquise sont inconnues. On sait que l'htro-polysaccharide capsulaire et le lipo-polysaccharide sont antigniques. Il est possible que la rsistance naturelle l'infection soit en partie lie l'existence de ractions croises entre les antignes capsulaires d'Acinetobacter et ceux des streptocoques B et G et de S. pneumoniae type 23. VII - TRAITEMENT Le traitement des surinfections dues Acinetobacter est souvent difficile en raison de la multirsistance de ce germe. Au cours des annes, l'volution vers la rsistance plusieurs antibiotiques s'est faite rgulirement. Celle-ci est sous la dpendance de facteurs chromosomiques (production de bta-lactamases donnant une rsistance d'emble leve aux bta-lactamines) et de facteurs plasmidiques codant pour la rsistance pidmique aux aminosides.
En 1983, une bta-lactamase de type TEM 1 (pi = 5,4) a t mise en vidence chez A. calcoaceticus ; elle est inhibe par l'acide clavulanique et le sulbactam. Ceci peut indiquer une voie thrapeutique et la ncessit de rechercher l'activit des associations avec ces inhibiteurs de bta-lactamases. En 1982, une souche d'Acinetobacter multirsistante responsable d'une pidmie dans un service de soins intensifs produisait une cphalosporinase et une pnicillinase de type TEM 2 et tait rsistante de nombreux aminosides selon un phnotype de rsistance plasmidique frquemment observ dans cet hpital chez les bactries Gram ngatif. La transmission de la rsistance aux aminosides, au chloramphnicol et aux sulfamides tait lie un transposon de 16 Md provenant d'un plasmide conjugatif R de la flore hospitalire. Les phnotypes de rsistance aux aminosides, trs divers, s'expliquent par l'existence d'enzymes modifiant les aminosides en particulier 3'-phosphoiransfrase (APH 3'), 3 N-actyltransfrase du type 1 (AAC3), 6'N-actyltransfrase (AAC6'), 3"adnyltransfrase (AAD3"). En 1983 un plasmide autotransfrable, d'origine exogne, pour la rsistance au chloramphnicol, aux aminosides, l'ampicilline, aux sulfamides et au trimthoprime a t caractris.

Les Acinetobacter sont trs rsistants la majorit des antibiotiques. Les nouvelles bta-lactamines n'apportent pas dans l'ensemble un gain substantiel d'activit. Les CMI 50 de la meziocilline, aziocilline, cefoprazone, ceftriaxone sont leves et seules la ticarcilline et la pipracilline se distinguent parmi les molcules commercialises avec environ 60 et 20 % de souches sensibles. Parmi les nouveaux antibiotiques on constate une activit notable de la ceftazidime et surtout de l'imipnme qui est parfois le seul antibiotique actif. L'activit des aminosides reste trs variable sur les souches hospitalires 'Acinetobacter. La gentamicine accusait alors une baisse d'activit en raison de l'augmentation de son utilisation. Les chiffres publis des CMI 50 ne refltent pas la situation actuelle o l'on constate un nombre important de souches rsistantes l'un ou plusieurs aminosides : gentamicine, tobramycine, ntilmicine, amikacine. L'amikacine et la tobramycine sont, en gnral, les plus actives. Les nouvelles quinolones amnent certainement pour cette espce une possibilit thrapeutique nouvelle. L'acide nalidixique avait une certaine activit mais

Chapitre VI - Aanetobacter______________________

__

107

l'apparition de quinolones de deuxime gnration (pfloxacine, norfloxacine, ofloxacine, ciprofloxacine) augmente le nombre de souches atteintes avec des valeurs de CMI relativement basses. L'utilisation de certaines de ces quinolones par voie gnrale constitue un progrs dans le traitement des infections Acinetobacter. L'association trimthoprime-sulfamthoxazole et la rifampicine peuvent tre parfois efficaces. Acinetobacter est sensible aux polymyxines.

BIBLIOGRAPHIE
BAUMANN P., DOUDOROFF M., STANR R.Y., A study of th Moraxella group , J. BacterioL, 1968, 95, 58-73 et 1520-1541. BERGOGNE-BEREZIN E., JOLY-GUILLOU M.L., VIEU J.F., Epidemiology of nosocomial infections due to Acinetobacter calcoaceticus , J. Hosp. Infect., 1987, 10, 105-113. BOUVET P.J.M., GRIMONT P.A.D., Taxonomy of th genus Acinetobacter with th rcognition of Acinetobacter baumannii sp. nov., Acinetobacter haemolyticus sp. nov., Acinetobacter johnsonii sp. nov. and Acinetobacter junil sp. nov. and emended description of Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter Iwoffii . Intem. J. Syst. BacterioL, 1986, 36,
228-240.

DENIS F., BEAREZ M.C., Importance en pathologie humaine et sensibilit aux antibiotiques des Acinetobacter (Moraxella oxydase-) . Md. Mal. Infect., 1972, 2, 349-371. JONI E., Genetics and physiology of Acinetobacter , Ann. Rev. MicrobioL, 1978, 32, 349-371. MONTEIL H., RASOAMANANJARA D., Autres bacilles Gram ngatif et antibiotiques , in l'Antibiogramme (P. Courvalin et coll. d.) 1985, MPC-VIDEOM, pp. 127-132. GILARDI G.L., Identification of miscellaneous glucose non-fermenting Gram-negative bacteria , in G. L. GILARDI (d.) : Glucose Non-fermenting Gram-negative Bacteria, in Clinical Microbiology CRC Press, West Palm Beach, 1978. JOLY-GUILLOU M.L., BERGOGNE-BEREZIN E., VIEU J.F., Epidmiologie et rsistance aux antibiotiques des Acinetobacter en milieu hospitalier . Presse Md., 1990,19, 357-361. SANTOS FERREIRA M.O., VIEU J.F., KLEIN B., Phage-types and susceptibility to 26 antibiotics of nosocomial strains of Acinetobacter isolated in Portugal, J. Int. Md. Res., 1984, 12, 364-368. TOWNER K.J., BERGOGNE-BEREZIN E., FEWSON C.A., Th biology of Acinebacter, Taxonomy, Clinical importance, Molecular relevance , Plnum Press, New York, 1991.

108

Section II - LES NEISSERIACEAE

ANNEXE
KINGELLA
Ce genre a t dcrit par Henriksen et Bovre en 1976. Se prsentant en paires ou en courtes chanettes, ce bacille Gram ngatif a tendance rsister la dcoloration. Immobile, selon les critres habituels, il peut possder des fimbriae et montrer une mobilit par saccades. Bactrie arobie ou anarobie facultative, oxydase (+) catalase (-), elle pousse (mieux en arobiose qu'en anarobiose) sur glose au sang o la croissance est faible. GC % = 47 55. Deux types de colonies sont habituellement distingues sur glose au sang : - les unes s'talent, creusent la surface de la glose (le diagnostic diffrentiel avec Eikenella corrodons peut se poser), possdent des fimbriae et la mobilit saccade. - les autres sont lisses et convexes sans autres proprits. Trois espces sont dcrites : Kingella kingae, K. denitrificans, K. indologenes. Ces espces saprophytes des muqueuses et du tractus respiratoire suprieur sont peu frquemment isoles, mais sans doute mconnues la plupart du temps. K. kingae peut tre isole dans des crachats et lors de surinfections osseuses, de septicmies et d'endocardites. C'est une espce trs sensible aux bta-lactamines, aux aminosides, aux macrolides et aux ttracyclines. K. denitrificans pose essentiellement un problme de diagnostic diffrentiel avec N . gonorrhoeae (il cultive sur milieu slectif). Le plus souvent isol du tractus respiratoire suprieur, il peut galement se trouver dans des prlvements rectaux ou gnitaux, dans des hmocultures. C'est galement une espce trs sensible aux antibiotiques.

SECTION ffl BACILLES A GRAM POSITIF AROBIES

Chapitre VU CORYNEBACTERIUM
GNRALITS SUR LES CORYNEBACTRIES
La diphtrie est devenue exceptionnelle dans les pays riches, mais elle persiste dans les pays pauvres. Malgr sa raret en France et en raison de la gravit, il est indispensable que les laboratoires de bactriologie soient capables d'identifier Corynebacterium diphtheriae. Avec les progrs de la bactriologie, on reconnat d'autres corynbactries qui peuvent tre pathognes-opportunistes lors des hospitalisations au long cours, notamment chez des sujets immunodprims. 1 - CLASSIFICATION ET NOMENCLATURE La plupart des taxonomistes s'accordent pour restreindre le genre Corynebacterium aux seuls organismes : dont la paroi contient - de l'acide mso-diaminopimlique - de l'arabinose, du galactose -des chanes d'acides mycoliques relativement courtes (22 38 atomes de carbone) - u n G C % d e 5 1 59 ; qui sont pour la plupart anarobies facultatifs. Il existe des relations entre les corynbactries (humaines et animales), les mycobactries et les Nocardia (ac. mso-diaminopimlique, arabinose, galactose, ac. mycoliques). Les limites du genre Corynebacterium sont assez floues, avec certains reprsentants du groupe des corynformes , notamment Brevibacterium (ac. msodiaminopimlique (+), GC % 60-64), Arthrobacter, Microbacterium...). Il a t propos rcemment de sortir du genre Corynebacterium les espces C. haemolyticum, C. equi, C. pyogenes ; C. haemolyticum devenant Arcanobacterium haemolyticum, C. equi : Rhodococcus equi et C. pyogenes : Actinomyces pyogenes. De mme, on a propos de classer un certain nombre de corynformes dans le genre Oerskovia.

110

Section III - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

II - HABITAT ET RPARTITION C. diphtheriae est une bactrie strictement humaine qui colonise essentiellement le rhinopharynx, plus rarement la peau. Il existe des porteurs sains. C. xerosis et C. pseudodiphtheriticum sont des htes normaux de l'homme. D'autres espces peuvent tre pathognes la fois pour l'homme et les animaux. C. ulcrons et C. bovis sont retrouvs chez les vaches (mastites), C. pseudotuberculosis chez le mouton et le cheval, C. pyogenes chez le chat, le mouton et le porc, C. equi chez le cheval, le porc et le chat. D'autres corynbactries ou corynformes peuvent tre trouves dans les eaux (C. aquaticum), le sol ou les plantes.

CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE
HISTORIQUE
- En 1821, Bretonneau a individualis la diphtrie et en a signal l'aspect contagieux. - En 1883, Klebs dcrit le bacille dans les fausses membranes d'angines diphtriques et en 1884, Loeffler isole la bactrie, puis montre son pouvoir pathogne exprimental pour le cobaye. -En 1888, Roux et Yersin montrent qu'une toxine thermolabile est scrte dans le milieu de culture par C. diphtheriae et que cette toxine, inocule l'animal, reproduit les manifestations gnrales de la diphtrie. - En 1890, Behring et Kitasato immunisent des animaux avec de la toxine modifie et montrent le pouvoir neutralisant du srum de ces animaux vis--vis de la toxine diphtrique. - En 1923, Gaston Ramon prpare un vaccin avec une toxine modifie par la chaleur et le formol, l'anatoxine diphtrique.

I - PHYSIOPATHOLOGIE

C. diphtheriae se multiplie prfrentiellement dans les couches superficielles de certains pithliums : rhinopharynx, plus rarement larynx ou peau ; on peut aussi le retrouver au niveau des conjonctives. La multiplication s'accompagne d'adnopathies satellites, mais n'entrane pas de bactrimie. Les enzymes et la toxine produites, provoquent localement une raction inflammatoire avec formation d'un exsudt pais : la fausse membrane. La toxine diffusant distance du sige de la multiplicaiton bactrienne, par voie sanguine, va atteindre diffrents tissus, bloquer la synthse des protines dans les cellules cibles, et tre responsable de complications (cardiaques, nerveuses,...). II - POUVOIR PATHOGNE A - Exprimental Un certain nombre d'animaux sont sensibles C. diphtheriae, ou plutt sa toxine. C'est le cas du singe, du cheval et du lapin, mais le cobaye est l'animal de choix. L'inoculation sous-cutane de 1 ml de culture pure de C. diphtheriae un cobaye, provoque l'apparition rapide d'un dme local, glatineux, fibrino-hmorragique, riche en bacilles, suivi d'une adnopathie et de la mort de l'animal en 2 4 jours. A l'autopsie, on constate l'absence de germes dans le sang et les organes, et une surrnalite hmorragique due la toxine. L'injection intra-dermique de toxine

Chapitre Vn - Corynebacterium

}. 11

produit un effet ncrotique. La toxine possde galement un effet cytotoxique observ in vitro sur cellules humaines ou animales.

B - Naturel
La transmission de C. diphtheriae d'homme homme est : - le plus souvent directe par l'intermdiaire de gouttelettes salivaires (de malades ou de porteurs sains), ou par contact avec des plaies contamines. - plus rarement indirecte par l'intermdiaire d'objets, de poussires ou d'aliments souills. Il s'agit d'un germe rsistant plusieurs mois sur les objets ou dans les fausses membranes dessches. Dans la diphtrie, on reconnat l'intrication de deux types de manifestations : - locales : lies la multiplication du germe au niveau de la porte d'entre, - gnrales : lies la toxinognse responsable des formes malignes. 1. Diphtries communes Le rle de la toxine reste ici au second plan condition toutefois qu'un diagnostic rapide permette l'instauration d'une srothrapie prcoce, sans dlai. Localisation pharynge : c'est l'angine diphtrique commune ou angine fausses membranes (amas fibrineux infiltrs de polynuclaires et de bacilles diphtriques). Aprs une incubation silencieuse de 2 5 jours, survient une priode d'invasion insidieuse marque par un malaise gnral, une temprature (38C) et une dysphagie qui prcdent la priode d'tat caractris par : - une angine fausses membranes : enduits blancs, gristres, en fausses membranes adhrentes, cohrentes, se reproduisant in situ en quelques heures aprs ablation (extensives). Ces fausses membranes peuvent envahir les amygdales, mais aussi les piliers du voile, et engainer la luette en doigt de gant ; mais l'angine n'est pas toujours aussi typique (rythmateuse, pultace, pseudo-gangreneuse). - un coryza discret et des adnopathies cervicales modres, accompagnent cette angine fausses membranes. - les signes fonctionnels (dysphagie) et gnraux restent l'arrire plan (pleur, tachycardie, fivre modre). Dans cette forme, si la srothrapie est institue rapidement, l'volution sera bnigne. Toutefois en l'absence de traitement et parfois d'emble, on se trouve devant les diphtries graves voire malignes. D'autres localisations se rencontrent : - la forme larynge ou croup est soit primitive, soit associe la forme pharynge ; elle comprend classiquement trois phases : la phase dysphonique (modification de la toux et de la voix), la phase dyspnique et la phase asphyxique. - plus rares sont les autres localisations (nasales, conjonctivales, sophagiennes, cutanes, vaginales. 2. Diphtries malignes Elles sont caractrises par l'importance : - des signes locaux (fausses membranes confluentes, muqueuse hmorragique, baleine ftide) - des signes rgionaux (jetage sro-sanglant, adnopathies cervicales donnant un aspect du cou proconsulaire) - des signes gnraux.

112

Section III - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

La mort peut survenir en quelques heures ou, aprs une amlioration passagre, plus tardivement dans le cadre du syndrome secondaire de Marfan (avec signes cardiovasculaires, rnaux, digestifs) Les complications dues la toxine peuvent survenir plus ou moins tardivement dans l'volution de la diphtrie. Il s'agit : - de myocardite qui succde une diphtrie grave ou maligne, parfois une forme commune tardivement traite ; - des paralysies favorises par l'ge (adulte), par la gravit de la diphtrie initiale, et l'absence ou le retard de la srothrapie. On observe dans l'ordre chronologique : la paralysie du voile du palais (2e semaine), la paralysie de l'accommodation, la paralysie des membres, d'autres paralysies peuvent tre observes (nerfs crniens...). La gravit de l'infection est en rapport avec le retard mis pour instaurer le traitement, mais aussi avec l'existence de souches plus toxinognes que d'autres (souches gravis) et des infections associes (streptocoques)... 3. Diphtries cutanes Jusqu' ces toutes dernires annes, les diphtries cutanes pures avec formation de pseudomembranes ncrotiques au niveau de la lsion avaient surtout t signales en zone tropicale, or ces formes ne sont pas l'exclusivit de pays en voie de dveloppement ; des pays tels que l'Allemagne, la Hollande, la Sude pour l'Europe et aussi le Canada et les USA en ont rapportes (en 1975, aux USA 56 % de toutes les souches de C. diphtheriae avaient t isoles partir de prlvements cutans) ; il faut penser ces formes en France en sachant que parfois C. diphtheriae est associ S. aureus ou S. pyogenes. II! - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A - Caractres morphologiques C. diphtheriae se prsente sous forme de bacilles de 1-8 um / 0, 3-0, 8 u.m, droits ou lgrement incurvs, avec des extrmits arrondies ou renfles (aspects en haltres ou en massues). Les souches plus toxinognes dites gravis contiennent des bacilles plus courts que les autres (intermedius et mitis). Ces bacilles sont Gram positif mais ils sont facilement dcolors par l'alcool. On peut colorer spcifiquement les granules mtachromatiques (coloration d'Albert, d'Emst-Neisser, de Del Vecchio) ou corps de Babes-Emst, contenus dans les extrmits renfles des bacilles ; ces granules sont des rserves de polyphosphates ou grains de volutine. Ces bacilles sont caractriss par leur groupement, qu'on les observe dans les fausses membranes (aspects en lettres ou petits amas) ou en culture (gros amas en paquets d'pingles, en palissades, caractres chinois, en chiffres romains ou lettres majuscules : L, M, N, V, ...).

Chapitre Vu - Corynebactenum

113

Ce mode de groupement s'explique par une sparation incomplte au moment de la division bactrienne car il existe un point d'attache entre les bacilles. Des formes d'involution granuleuses ou ramifies peuvent tre observes dans les cultures vieillies.
Structure de C. diphtheriae '" On distingue : a) une paroi forme de 4 couches visibles en microscopie lectronique : couche externe irrgulire, couche centrale non homogne faite de 2 couches denses spares par une couche de faible densit aux lectrons. Le peptidoglycane de type 1 contient de l'acide mso-diaminopimlique, avec pont interpeptidique D-alanyl-acide diaminopimlique. On trouve aussi dans les parois : - un polysaccharide ou arabinogalactane (antigne 0 de Lautrop), donnant des ractions croises avec les Mycobacterium et les Nocardia. - des acides gras, acides corynmycoliques et corynmycoliniques - un glycolipide toxique ou Cord Factor b) en surface, on trouve des antignes K de nature protique, qui jouent un rle dans l'immunit et l'hypersensiblilit, et qui sont utiliss pour la classification srologique. c) un cytoplasme contenant : - des lipides associs aux nombreux msosomes - des granulations mtachromatiques, ou grains de volutine - des organelles inhabituels dans les souches toxinognes.

B - Caractres culturaux C. diphtheriae est une espce arobie-anarobie facultative, possdant une catalase, des cytochromes a, b, c, mais pas d'oxydase. La culture est obtenue une temprature optimale de 36-37C et un pH optimal 7,4. La culture peut tre obtenue sur milieux ordinaires, mais la croissance : - sur milieu enrichi est meilleure (glose au sang, milieu de Mueller-Hinton, srum coagul de boeuf ou de cheval, milieu de Loeffler ou au srum de boeuf coagul), o l'on observe des colonies de 1-3 mm, lisses, gristres, crmeuses en 16 24 heures - sur glose au sang rvle une hmolyse bta qui permet une premire orientation - sur milieux slectifs, peut tre ncessaire. On utilise classiquement des milieux contenant du tellurite de potassium, sur lesquels C. diphtheriae donne des colonies noires en rduisant le tellurite en tellure ; mais la culture sur glose au sang l'acide nalidixique donne de bons rsultats. Les colonies sont visibles en 16 heures sur milieux enrichis et en 48 heures sur certains milieux slectifs. Elles prennent un aspect diffrent sur glose au sang contenant du tellurite, selon le type de souches : - gravis, grosses colonies R crneles ( mamelon central) - intermedius, petites colonies lisses ou rugueuses - mitis, grosses colonies S bombes et brillantes. Si pour la culture les souches sont assez peu exigeantes (facteurs de dpart : acide olique, source de carbone et d'nergie, facteurs de croissance variables avec les souches), elles le sont pour la toxinognse o la cystine et l'acide glutamique sont essentiels. D'autres acides amins interviennent ainsi qu'une faible acidification (maltose), une agitation et surtout la concentration en fer (taux optimal 0,14 u.g/ml). Il existe une corrlation entre le fer, la porphyrine et la production de toxine (on dispose, pour obtenir une bonne toxinognse, de milieux empiriques, semisynthtique ou synthtiques).

114

Section III - BACILLES GRAM POSITIF AEROBIES

Si le bacille rsiste bien l'abri de l'air, il est dtruit par la chaleur, la lumire, les antiseptiques et les antibiotiques. De plus, il est concern par le phnomne d'antibiose, son dveloppement tant inhib par diverses espces bactriennes (staphylocoques par exemple). C - Caractres biochimiques Pour porter un diagnostic de C. diphtheriae, il importe de diffrencier cette espce des autres bactries corynmorphes , frquentes au niveau du rhinopharynx de l'individu normal. La seule possession d'une catalase et d'une nitrate rductase ne suffit pas pour carter toutes ces autres espces (Tableau I).
TABLEAU 1 CARACTRES DIFFRENTIELS DES PRINICIPALES ESPCES DE CORYNEBACTERIES Corynebacterium C. diphtheriae C. pseudotuberculosis C. pseudodiphtheriticum (hofmannii) C. ulcrons C. xerosis C. jeikeium A. haemotyticum A. pyogenes Catalase Hmolyse p + + + + + + + V (+) Nitrate rductase + V + + Urase + + + Attaque des sucres Glucose Saccharose + + + + + + V V + V

+faible +

L'tude du mtabolisme glucidique est important ; on peut utiliser des milieux spciaux, milieux liquides enrichis au srum (tel le milieu de HISS) ; il y a fermentation sans production de gaz du glucose, de la dextrine, du galactose, du maltose. Il n'y a pas d'attaque du saccharose, du lactose du mannitol. L'tude du mtabolisme protique donne des renseignements complmentaires : urase (-) (recherch sur milieu de Lange), indole (-), glatinase (-) et FLS (+). On signale des hmolysines non diffusibles, une neuraminidase. D - Bactriophages n existe un grand nombre de souches lysognes ou porteuses de phages dfectifs. Un systme de lysotypie a t dvelopp avec 22 lysotypes. Des tudes ont port sur des bactriocines ou coryncines, et une bactriocinotypie a t propose. E - Caractres antigniques La structure antignique de C. diphtheriae est htrogne. On distingue des antignes 0 thermostables polyosidiques (de groupe) et des antignes K thermolabiles protiques (de type). Les tudes antigniques sont discordantes selon les auteurs, et n'ont pas dbouch sur une nomenclature internationale.

Chapitre VII - Corynebactenum

115

IV - TOXINE DIPHTRIQUE La toxine diphtrique est l'une des toxines bactriennes qui a t le plus tudie. Sa structure et les mcanismes cellulaires et molculaires de son action figurent parmi les plus connus. La production de toxine par C. diphtheriae est lie l'tat de lysognie des souches qui hbergent le phage bta porteur du gne Tox. Ce bactriophage ADN bicat- naire s'intgre sous forme de prophage dans le chromosome bactrien. Les souches non lysognes (Tox-) ne produisent pas de toxine mais peuvent tre virulentes. Infectes par un bactriophage Tox+ elles synthtisent et excrtent la toxine. La toxinognse est fonction de la teneur en fer du milieu de culture, elle est optimale lorsque cette concentration est basse. Il existe un rpresseur cod par le gnome bactrien qui ne serait actif qu'associ au fer agissant comme corpresseur. Ce rpresseur a t partiellement purifi, c'est une protine contenant du fer qui, en prsence de ce mtal, se lie l'ADN. La toxine diphtrique est une exotoxine, protine d'environ 58 kDa dont le gne a t clone dans E. coll. La squence nuclotidique a t dtermine et traduite ; ainsi la squence des 535 acides amins est connue. Sous l'action de la trypsine, la toxine est hydrolyse en deux fragments A et B, ces deux polypeptides restent unis par un pont disulfure. Le fragment A (d'environ 21 kDa) NH^ terminal possde l'activit enzymatique. Le fragment B (d'environ 37 kDa) COOH terminal se fixe sur le rcepteur cellulaire. Le premier fragment contient la squence signal intervenant dans la scrtion de la toxine par la bactrie. La chane B possde une rgion riche en acides amins hydrophobes responsables de l'insertion de la toxine dans la membrane de l'endosome et par consquent du passage de la chane A de l'endosome vers le cytoplasme. Le 148e acide amin est probablement le sige du site actif.

SCHMA 1 ACTIVATION DE LA TOXINE DIPHTRIQUE PAR LA TRYPSINE EN PRSENCE DE THIOL La rgion en noir, COOH-terminal, est charge positivement et reconnat les rcepteurs la surface des cellules sensibles. La rgion en blanc, fragment A, NH2-terminal, est la partie active de la molcule et est masque si la toxine est intacte. La rgion en pointills est la partie hydrophobe de la molcule.

La toxine diphtrique agt comme une enzyme. Elle inactive le facteur d'longation EF2 composant essentiel dans la synthse protique qui permet la translocation du polypeptidyl-t RNA du site accepteur A au site donneur P du ribosome de la cellule eucaryote. La toxine catalyse le transfert sur EF2 de l'ADP ribose du NAD selon la formule suivante : NAD+ + EF2 -> ADP-Ribosyl-EF2 + Nicotinamide + H-1-.
(actif) (inactif)

Les anticorps dirigs contre le fragment A inhibent l'action de la toxine (ADP ribosylation) dans un systme de traduction in vitro. Au contraire, les anticorps dirigs contre le fragment B, inhibent l'action sur les cellules mais pas sur les ribosomes.

116

Section m - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

La toxine diphtrique est donc une molcule spcialise trs active dont l'action enzymatique est porte par le fragment A. Une seule molcule est ltale pour la cellule. Elle altre la synthse des protines en quelques heures. En 1989, Chang a montr que la toxine diphtrique provoquait des lsions de l'ADN lies une activit nuclasique et entranait une cytolyse qui n'est pas la simple consquence d'une inhibition de la synthse protique. Titrage de la toxine diphtrique H peut tre ralis in vivo et in vitro. In vivo : - dtermination du pouvoir ltal (dose minimale mortelle, DMM ; dose ltale 50 %, DL 50) - neutralisation du pouvoir ltal (L+, LO) - neutralisation du pouvoir dermo-ncrotique chez le cobaye - titrage en cultures cellulaires In vitro : - floculation initiale (techniques de Ramon, de Dean et Webb ; dtermination de la dose floculante LF) - prcipitation en milieu glose. V - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE Le diagnostic bactriologique de la diphtrie repose sur l'isolement de C. diphtheriae, c'est le diagnostic direct (schma 2).
couvillonnage de fausses membranes ,0iuafl V Ul / ^ Immunofluorescence Coloration . . . mtachromarique" '

Prsomption Slectif : 24-48 heures Tellurite acide nalidixique

Certitude

Galerie de confirmation

Toxinognse sur cobaye

Toxinognsc m vitro Test d'Elek

Corynebacierium diphtheriae

SCHMA 2 MTHODES D'ISOLEMENT ET D'IDENTIFICATION DE CORYNEBACTERIUMDIPHTHERIAE A PARTIR D'UNE GORGE

Chapitre VII - Corynebactenum

117

A - Prlvements Le prlvement de gorge pour la recherche de C. diphtheriae, doit tre pratiqu devant toute angine fausses membranes, mais de mme que les angines diphtriques sont parfois atypiques, les angines fausses membranes peuvent avoir d'autres causes qu'il importe de rechercher paralllement et systmatiquement (association fuso-spirillaire, angine pyognes, candidoses, mononuclose infectieuse, hmopathies malignes...). Le prlvement doit tre effectu sous contrle visuel et avant tout traitement : - les fausses membranes prleves l'couvillon ou la pince au niveau du pharynx (ou du larynx lors de la trachotomie) - couvillonnage la priphrie de la fausse membrane (amygdale, voile, luette) - plus rarement couvillonnage nasal, de srosits cutanes ou conjonctivales, en fonction du tableau clinique. Le prlvement doit tre achemin au laboratoire sans dlai, avant desschement ; il doit comporter au moins deux couvillons (examen direct et culture). B - Examen direct On procdera sur les frottis - une coloration de Gram classique, ventuellement de Gram avec dcoloration prolonge, la recherche de bacilles la morphologie vocatrice. - une coloration d'Ernst-Neisser pour la recherche de corpuscules mtachromatiques. - l'examen en immunofluorescence est signal par certains auteurs. Press par le clinicien, qui demande un diagnostic rapide, le microbiologiste pourra tout au plus indiquer ce stade : prsence ou absence de bacilles diphtrimorphes l'examen direct, en sachant que la vision de tels bacilles correspondra plus souvent sous nos latitudes C. pseudodiphtheriticum ou C. xerosis qu' des C. diphtheriae. Le clinicien ne doit pas attendre un rsultat bactriologique, s'il y a suspicion clinique il commencera sans retard le traitement spcifique, sans attendre les rsultats de la culture. C - Culture C'est une tape importante. On a dcrit des techniques rapides donnant un diagnostic prsomptif en 4 et 5 heures, couvillon plong dans du srum coagul, dans du sang tellure... (techniques de Folger, de Manzullon, de Sohier). Elles ne sauraient remplacer les techniques classiques avec cultures sur deux types de milieux. Les cultures sur milieux riches (milieu de Loeffler ou dfaut Mueller-Hinton ou glose au sang) donnent une culture en 12 18 heures. Les cultures sur milieux slectifs, surtout les milieux au sang tellure (Clauberg, Hoyie) ou agar-cystine-tellurite sur lesquels C. diphtheriae donne des colonies noires, (mais aussi quelques diphtrimorphes ou streptocoques) et dfaut, glose au sang l'acide nalidixique ou acide nalidixique/colistine. La rsistance de C. diphtheriae. et des autres corynbactries la fosfomycine peut tre utile, les gloses au sang pouvant tre rendues slectives par ajout d'un disque de fosfomycine (200 u.g). Aprs une incubation de 18 48 heures on observe les colonies, procde un Gram, ventuellement une coloration mtachromatique et une recherche de catalase (si les milieux ne contiennent pas de sang). Sur les colonies suspectes, on ralise une galerie d'identification (nitrate-rductase, attaque des sucres, hydrolyse de l'ure) pour diffrencier C. diphtheriae des autres corynbactries (Tableau I). Une galerie rcemment commercialise (API-Coryne) utilise 20 caractres.

118

Section ffl - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

Il est essentiel d'ensemencer en mme temps un bouillon (milieu riche du type cur-cervelle) qui permettra ensuite de raliser le pouvoir pathogne exprimental. Une srotypie, une lysotypie, ou une bactriocinotypie peuvent tre ralises sur les souches de C. diphtheriae dans des laboratoires spcialiss. Rcemment, Rappuoli a pu, par une technique d'hybridation, obtenir une classification gnomique des souches, permettant une analyse pidmiologique trs fine et peut-tre une dissociation de la toxinognse et des facteurs de virulence. D - Recherche du pouvoir toxinogne H est indispensable de prouver que la souche de Corynebacterium isole est un C. diphtheriae producteur de toxine. Cette recherche peut tre ralise selon deux mthodes : in vivo : - soit par la mise en vidence du pouvoir ltal par inoculation au cobaye (inoculation par voie sous-cutane d'un bouillon de culture un cobaye de 300 g environ non protg et un autre cobaye ayant reu 250 units de srum antidiphtrique 2 heures avant l'injection ; l'animal non protg meurt en 2 4 jours). Il est ncessaire de faire l'autopsie de l'animal (oedmes viscraux, hmorragies des surrnales). - soit par recherche du p o u v o i r d e r m o - n c r o t i q u e aprs injection intradermique sur les flancs rass d'un cobaye. in vitro : - raction d'immunoprcipitation en gel (Test d'Elek). On ensemence paralllement sur la surface du milieu glose la souche tudier entre 2 souches de rfrence (Tox+ et Tox-), puis on dpose perpendiculairement une bande de papier filtre imbibe de srum antitoxine diphtrique (schma 3). On observe l'apparition d'arcs de prcipitation, qui, s'ils sont spcifiques, doivent rejoindre les arcs observs avec la souche Tox+. Le dlai de lecture est de 1 6 jours.

bandelette charge de srum antitoxine arcs non spcifiques arc spcifique

SCHMAS TEST D'ELEK AVEC SOUCHE 1 DE RFRENCE TOXINOGNE souches 2 et 3 tudier, la 2 est toxinogne, la 3 ne l'est pas.

E - Diagnostic indirect II n'existe pas de srodiagnostic permettant de porter a posteriori un diagnostic de diphtrie. Par contre, on peut mesurer l'immunit antitoxique et non antimicrobienne. Elle peut tre :

Chapine VII - Corynebacterium

119

passive : transplacentaire (nourrissons de moins de 6 mois) obtenue par srothrapie (transitoire), active : du fait d'une infection naturelle, typique ou occulte, ou bien obtenue grce la vaccination. L'immunit peut tre teste par : le dosage des antitoxines sriques, la raction de Schick : une injection intradermique de 0,1 ml de toxine diphtrique produit une raction inflammatoire locale (plus de 1 cm en moins de 36 heures) chez les sujets n'ayant pas d'antitoxines ; l'injection de 0,1 ml de toxine par voie intradermique chez un sujet immunis n'entrane pas de raction. VI - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES Les antibiotiques ont peu d'effet sur l'volution de la maladie, mais le traitement de l'entourage et des porteurs permet de limiter la diffusion du germe. La ralisation d'un antibiogramme est importante car des rsistances aux antibiotiques ont t signales rcemment. On utilise pour l'antibiogramme, ou pour la dtermination des CMI, le milieu de Mueller-Hinton, additionn de 5 % de sang de mouton. Pour certaines souches intermedius ou mitis, on a recours au milieu trypticase-soja, enrichi avec 10 % de srum de veau foetal. C. diphtheriae est sensible la pnicilline, l'rythromycine et la majorit des antibiotiques actifs sur les germes Gram positif ; cependant, des souches rsistantes l'rythromycine, la clindamycine, aux ttracyclines ont t rencontres. Ainsi, 86 % des souches indonsiennes et 5 % des souches africaines rsistent aux ttracyclines. Un support plasmidique de la rsistance de C. diphtheriae l'rythromycine a t dcrit. VII - TRAITEMENT - PROPHYLAXIE Tout sujet suspect de diphtrie doit tre hospitalis d'urgence. A - Traitement curatif II repose sur trois lments essentiels : - srothrapie : elle reste le traitement indispensable, elle doit tre aussi prcoce que possible, ds que le diagnostic est souponn sans attendre le rsultat bactriologique. C'est une thrapeutique d'urgence. Elle doit comporter une injection unique, maximale d'emble (IM ou SC) de 2 000 5 000 units par kg avec un maximum de 120 000 units. - antibiothrapie : systmatiquement associe, par la pnicilline G ou l'rythromycine (50 mg/kg/j durant 15 jours) selon la situation des rsistances locales. - repos strict au lit pendant plusieurs semaines. En fonction des tableaux cliniques, on aura recours des traitements spcifiques : croup (trachotomie, corticothrapie), traitements symptomatiques (rhydratation,...), traitement de myocardite, des paralysies...

120

Section IH - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

B - Traitement prventif II repose essentiellement sur la vaccination par l'anatoxine qui est de la toxine dtoxifie par le formol 4 %c et par la chaleur (39 45C pendant 1 mois). La vacination est obligatoire en France. Elle comporte 3 injections successives 1 mois d'intervalle, suivies d'un rappel 1 an, puis tous les 5 ans. Le vaccin existe galement en association DT, DT coq, DT coq polio. Les ractions vaccinales sont minimes. Il existe des contre-indications temporaires (eczma, pyodermites, affections aigus, ractions tuberculiniques rcentes) ou permanentes (affections chroniques graves, tuberculose, noplasies). En fait la seule vraie contre-indication est la nphropathie grave. On trouve au bout de 5 ans 70 % de sujets protgs et 50 % aprs 10 ans. Rcemment un vaccin anti-diphtrique synthtique a t obtenu. Il est constitu de : - un fragment peptidique situ la jonction des deux fragments A et B de la toxine diphtrique, il s'agit d'une boucle de 16 acides amins (PM 1 600) synthtise in vitro constituant l'antigne, - une molcule porteuse carrier faite d'une chane peptidique synthtique poly-D-alanine-poly-L-lysine, - un adjuvant synthtique ou muramyl-dipeptide. Les essais sur l'animal montrent un pouvoir immunogne. D'autres mesures collectives sont respecter en cas de diphtrie : - la dclaration de la diphtrie est obligatoire (n 6) - cette maladie ncessite : l'isolement du malade, la dsinfection en cours et en fin de maladie, le dpistage et un traitement des porteurs de germes dans l'entourage, une viction scolaire pour le malade durant 30 jours aprs la gurison clinique et pour l'entourage de 7 jours s'il n'est pas correctement vaccin. Malgr ces mesures le bacille diphtrique et la diphtrie n'ont pas compltement disparu. Une enqute rcente sur le portage effectue en Grce a montr que 0,8 % des enfants taient porteurs. Entre 1979 et 1983, 363 cas de diphtrie ont t enregistrs en Europe, soit 0,2 cas par anne et par million d'habitants. Chaque anne, le nombre de diphtries identifies dpasse 100 cas pour la Turquie et 1000 cas pour l'URSS. En France, la diphtrie a presque disparu (figure 1), on a toutefois recens 12 cas entre 1984 et 1987. En Sude, o la couverture vaccinale tait suprieure 95 % une pidmie est survenue. Aux USA, on considre que seulement 50 % des adultes sont correctement vaccins. Ces faits doivent inciter la vigilance tant sur le plan de la vaccination (rappel chez les adultes) que du diagnostic.

LES AUTRES CORYNBACTRIES


L'incidence d'infections opportunistes dues des bactries corynformes est croissante alors que les diphtries diminuent. Certaines espces sont ainsi rencontres chez des sujets immunodprims. Il s'agit de : C. xerosis, C. pseudodiphtheriticum (C. hofmannii), C. equi (Rhodococcus equ), C. matruchotii (Bacterionema matruchoti) ainsi que des groupes dfinis par le CDC d'Atlanta comme D2, A4, G2... D'autres espces sont isoles au cours d'infections chez des sujets non immunodprims. Ce sont : C. ulcrons, C. haemolyticum (Arcanobacterium haemolyticum), C. pseudotuberculosis (C. ovis) et C. minutissimum.

Chapitre Vu - Corynebacterium

______________________________________________________121

Il n'est pas question de passer en revue ici la pathologie induite par ces diffrentes espces, seuls quelques points seront dvelopps. C. ulcrons. : il peut tre responsable de pharyngites exsudatives et de tableaux pseudo-diphtriques. Les souches peuvent produire deux toxines dont l'une est neutralise par l'antitoxine diphtrique, la seconde serait une phospholipase D. C. pseudotuberculosis (C. ovis) : cette espce a t signale dans des lymphadnites granulomateuses et dans une pneumonie. C. xerosis : on a signal ce germe dans des endocardites sur valve, dans des bactrimies et des pneumonies chez des sujets immunodprims. C. pseudodiphtheriticum (C. hofmannii) : cette espce a pu tre l'origine d'infections sur prothses et d'une infection fatale chez un transplant rnal. C.jeikeium (ex groupe JK) : a t trouve dans diverses infections septicmiques, pritonales, gnito-urinaires, mninges et endocardites. Elle est prsente l'tat normal sur la peau et peut coloniser jusqu' 25 35 % des patients hospitaliss. Aprs coloration, cette espce apparat sous forme de bacilles Gram positif parfois trs courts voquant des streptocoques. L'antibiogramme rvle des rsistances multiples, certaines souches ne sont sensibles qu' la vancomycine. C. minutissimum : peut tre isol de la peau dans les cas d'rythrasma. C. pyogenes (Actinomyces pyogenes) - C. haemolyticum (Arcanobacterium haemolyticum) C. haemolyticum a t dcrit dans des exsudais membraneux pseudo-diphtriques, mais galement dans des septicmies et des abcs divers. Il apparat vraisemblable que ce groupe de bactries est appel avoir une place croissante en pathologie. Elles sont slectionnes par les antibiothrapies, favorises par les instrumentations (cathters) et par les terrains immunodprims. Il importe donc de savoir les reconnatre au mme titre que C. diphtheriae qui garde une place part sur le plan historique et sur le plan de la gravit.

BIBLIOGRAPHIE
BEH, 1987, n 52, 207. BROOKS R., Guidelines for th laboratory diagnosis ofdiphtheria , Monographie Organisation Mondiale de la Sant, 1981, 7, 27 p. CHANG M.P., BALDWIN R.L., BRUCE C., WIENIESKI B.J., Second cytotoxio pathway of diphtheria toxin suggested by nuclease activity , Science, 1989, 246, 1165-1168. COLLIER R.J., Diphtheria toxin : mode of action and structure , Bact. Reviews, 1975, 39,
54-85.

COYLE M.B. and LIPSKY B.A., Coryneform bacteria in infections diseases : clinical and laboratory aspects , Clin. Microbiol. Rev., 1990, 3, 227-246. DENIS F., PRINCE-DAVID M., M'BOUP S., DIOPMAR I., Antibiotic rsistance of Corynebacterium diphtheriae in West Africa , J . Infect., 1983, 7, 279-281. FRENEY J., DUPERRON M.T., COURTIER C., HANSEN W., ALLARD F., BOEUFGRAS J.M., MONGET D., FLEURETTE J., Evaluation ofAPI Coryne in Comparison with conventional methods for identifying coryneform bacteria , J . Clin. Microbiol., 1991, 29, 38-41. KWANTES W., Diphtheriae in Europe , J . Hyg. Camb., 1984, 93, 433-437. LIPSKY B.A., GOLDBERGER A.C., TOMPKINS L.S., PLORDE J.L., Infections caused by non diphtheria Corynebacteria , Rev. Infect. Dis., 1982, 4, 1220-1235. PAPPENHEIMER A.M., Th diphtheria bacillus and its toxin : a model System , J . Hyg. Camb., 1984, 93, 397-404. RAPPUOLI R., PERUGINI M., FALSEN E., Molecular epidemiology of th 1984-1986 outbreak ofdiphtheria in Sweden , New Engl. J . Med., 1988, 318, 12-14. THOMPSON J.S., GATES-DAVIS D.R., YONG D.C.T., Rapid microbiochemical identification of Corynebacterium diphtheriae and other medically imponant corynebacteria , J . Clin. Microbiol., 1983, 18, 926-929.

Chapitre VIII LISTERIA

HISTORIQUE
Listeria monocytogenes, espce-type du genre Listeria (du nom du chirurgien anglais Lord Lister) a t dcrite en 1926 par Murray ; la bactrie a t isole lors d'une pizootie atteignant des lapins et des cobayes qui prsentaient une forte augmentation des monocytes circulants et des lsions de ncrose hpatique. Cette bactrie a t isole ensuite chez diffrentes espces animales domestiques et sauvages. Chez l'homme, elle a t initialement isole lors d'une mningite chez un adulte ainsi que dans diffrentes circonstances pathologiques jusqu' ce que en 1933 Burn montre son rle dans l'infection en priode no-natale. Les travaux de Seeliger ont par la suite soulign la place importante de L. monocytogenes en pathologie humaine.

1 - CARACTRES GNRAUX DU GENRE Le genre Listeria regroupe de petits bacilles Gram positif de forme rgulire, courts, bouts arrondis parfois incurvs (0,4-0,5 x 0,5-2 p.m) isols ou en courtes chanes prsentant un arrangement en palissade et en lettres comme les corynbactries, avec par- fois des formes filamenteuses (6 - 20 p-m) dans les vieilles cultures. Ils sont non sporuls, non capsuls et mobiles 20-25C par des flagelles pritriches. Ce sont des bactries aro- anarobies facultatives. La temprature optimale de culture est comprise entre 30 et 37C, mais la culture est possible de 1 45C. Sur glose au sang elles donnent des colonies hmolytiques lisses, translucides, gris-bleu, (espces pathognes). Elles ont les caractres suivants : catalase positive, oxydase ngative ; glucose ferment avec production d'acide lactique ; esculine et hippurate hydrolyses, ractions rouge de mthyle et Voges-Proskauer positives ; pas de production d'indole, ni de SFL, pas d'hydrolyse de l'ure. Il existe des types antigniques dfinis par des antignes 0 et des antignes H.

Chapitre VOl-Listeria

_____

______________________123

II - POSITION TAXONOMIQUE ET NOMENCLATURE La position taxonomique du genre Listeria n'est pas dfinitivement tablie. Il s'agit d'un genre distinct sans relation avec les Corynbactries, mais rapprocher avec les donnes de la taxonomie numrique, de la srologie, de la biochimie et l'tude des acides nucliques des genres Bacillus, Erysipelothrix, Lactobacillus et Streptococcus (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, 1986). Des tudes taxonomiques rcentes, biochimiques et par hybridation DNA-DNA ont permis de prciser la place des diffrentes espces dans le genre qui s'est enrichi de nouvelles espces. Le genre Listeria comprend des espces pathognes pour l'homme ou l'animal et des espces non pathognes. L. monocytogenes est la seule espce pathogne la fois pour l'homme et l'animal. Les autres espces sont : L. ivanovii (ex srovar 5 de L. mocytogenes, pathogne pour l'animal, mais rarement rencontre chez l'homme) ; L. innocua (non pathogne) ; L. welshimeri (non pathogne) ; L. seeligeri (non pathogne). Deux espces L. grayi (isole chez le chinchilla) et L. murrayi (prsente dans le sol) de classification incertaine, ont t proposes pour former le genre Murraya avec deux espces M. grayi subsp. grayi et M. grayi subsp. murrayi . L'espce L. denitrificans est exclue du genre Listeria pour tre transfre dans le groupe Jonesia.
TABLEAU 1 CARACTRES DIFFRENTIELS DES ESPCES DU GENRE USTERIA ET DE L. GRAYI ET L. MURRAYI L. monocytognes Hmolyse CAMP-test S. aureus R. equi Acidification D xylose L rhamnose mannitol a mthyl D mannoside Nitrates rductase Pathogne pour souris Pouvoir pathogne naturel Srovars + + + + + + + Animaux homme m&,j2h l/2c,3a,3b 3c,4a,4b, 4ab,4c,4d 4e,7 + Ovins 5 d + 6a,6b, 4ab, s.nd. 6a,6b l/2b,4c 4d,6b s.nd. + d + + + d + + L. ivanovii ++ L. innocua L. welshimeri L. seeligeri +(faible) + L. h. grayi* murrayi* -

s.n.d. = srovar non dsign CAMP = pour Christie, Atkins, Munch-Peterscn (d'aprs J. ROCOURT, H. SEELIGER)

* Murraya

III - HABITAT ET PIDMIOLOGIE L. monocytogenes est une bactrie saprophyte et ubiquitaire. Largement rpandue dans la nature, elle a t isole dans le sol, l'eau, les vgtaux (ensilage) mais aussi dans le lait, la viande de poulet, les lgumes (choux) et dans les matires fcales de sujets sains (homme et nombreuses espces animales). La bactrie survit dans l'environnement naturel, rsiste des conditions hostiles et peut s'y multiplier mme basse temprature (proprit utilise comme mthode d'enrichissement).

124

Section m - BACILLES GRAM POSITIF AEROBIES

L'infection par L. monocytogenes ou listriose, maladie commune l'homme et l'animal, est une saprozoonose. La contamination humaine est le plus souvent ralise par voie digestive et plus rarement par voie oculaire, respiratoire ou cutane. La contamination est rarement directe au contact avec des animaux infects et concerne alors les sujets exposs (leveurs, vtrinaires) ; des cas de contamination interhumaine en milieu hospitalier (maternits) ont t dcrits parfois sous forme de petites pidmies. La contamination indirecte est le mode de contamination le plus frquent. L'homme entre en contact avec la bactrie prsente dans le milieu extrieur (sol, eau, excrtions animales) ou dans les aliments d'origine animale contamins (lait, viande, volailles, charcuterie, fromages...) ou d'origine vgtale (crudits, choux,...). Les cas de listriose humaine surviennent gnralement sous forme de cas sporadiques avec des variations saisonnires. Lors de contamination par ingestion de produits alimentaires contamins, de vritables pidmies ont t observes. Ce ft le cas en Anjou (156 cas entre 1975 et 1978), en Nouvelle Ecosse - due une salade de choux - (41 cas), Boston (49 cas) conscutifs l'ingestion de lait pasteuris ; des fromages pte molle ont t responsables de l'pidmie de Los Angeles en 1985 (142 cas) ou de celle de Suisse en 1987 (122 cas). A noter que L. monocytogenes a t isole de 4 % des chantillons de lait cru et de fromages, de 30 % de prlvements de produits cams, de 26 % de produits de la mer ou encore de 5 % de salades et lgumes premballs. Les numrations peuvent atteindre 100 1000 UFC/g de viande et mme 100 000 10 000 000 UFC/g pour les fromages ! La maladie humaine peut tre observe tous les ges de la vie avec cependant une rpartition des cas selon les tranches d'ge qui fait apparatre trois pics : un premier pic est observ avant l'ge de 1 an et correspond la listriose no-natale ; un pic entre 20 et 40 ans, ce qui correspond essentiellement aux cas maternels d'infection matemo-foetale ; enfin un troisime pic entre 60 et 80 ans, soulignant ainsi le rle du terrain. Chez l'animal la maladie est plus frquente pendant les saisons froides (hiver, dbut du printemps). Chez l'homme les cas sembleraient plus frquents en automne et au printemps. IV - POUVOIR PATHOGNE NATUREL L. monocytogenes est une bactrie pathogne pour l'homme et de nombreuses espces animales. A - Chez l'animal domestique Cette bactrie est responsable de diffrentes manifestations cliniques survenant en hiver et au printemps : avortement et mortinatalit chez les bovins et les ovins ; septicmies de l'agneau avant le sevrage ; encphalites chez diffrentes espces de ruminants ; conjonctivites et kratites purulentes ; mammites. Certaines de ces localisations favorisent la contamination humaine. B - Chez l'homme Le nombre de cas de listrioses observs a considrablement augment depuis les annes 1960. S'agit-il d'une meilleure connaissance de cette espce bactrienne ou

Chapitre Vffl - Listeria

125

d'une modification des conditions cologiques ayant favoris sa dissmination et augment les contacts avec l'homme ? En France, l'incidence serait de l'ordre de 11 15 cas par million d'habitants.
/. La listriose foeto-maternelle

La listriose no-natale peut exister sous deux grandes formes cliniques : - une infection prcoce se manifestant ds les premiers jours de la vie (premires heures, 5 premiers jours). Cette forme correspond une infection gnralise septicmique survenue avant la naissance. L'infection chez un enfant de faible poids ou n prmaturment se manifeste par un tat grave avec des formes septicmiques gnralises, avec ou sans atteintes mninges, les infections locales pulmonaires ou conjonctivales tant plus rares. La forme majeure est associe des foyers infectieux granulomateux multiples (d'o l'appellation : Granulomatosis infantiseptica). La mortalit est importante. - la forme tardive est une forme mninge comparable celle de l'adulte dont le pronostic est moins sombre. Chez la femme enceinte la maladie a pu tre discrte ou bnigne, fivre isole syndrome pseudo-grippal ou passe inaperue. Lorsqu'elle survient en dbut de grossesse elle entrane un avortement ; une infection plus tardive provoque un accouchement prmatur.
2. La listriose de l'adulte

Les formes de l'adulte concernent le plus souvent, mais pas de faon exclusive, les sujets ayant une dficience des dfenses immunitaires, en particulier de l'immunit cellulaire, lors d'hmopathies malignes, de cancers, ou au cours de traitements immunosuppresseurs, chez les diabtiques et les cirrhotiques, ainsi qu'au cours de la grossesse. L. monocytogenes dans ces cas peut tre considre comme une bactrie opportuniste. Il s'agit le plus souvent de formes neuro-mninges : mningites, mningoencphalites, ou encphalites. L'aspect du liquide cphalorachidien est trs variable et peut tre trompeur : aspect trouble avec une formule panache avec une cytologie en gnral modre (entre 100 et 500 lments par mm9), mais aussi liquide clair voquant une mningite virale ou une mningite tuberculeuse justifiant la mise en culture de tout LCR et la pratique systmatique d'hmocultures. Les formes septicmiques sont moins frquentes accompagnes ou non de localisations mtastatiques. Il existe aussi de rares formes localises : oculaires, cutanes, osseuses, pulmonaires ... surtout rencontres chez les sujets immunodprims ou, pour les formes cutanes sans atteintes systmiques, chez les personnes en contact avec des animaux infects. La mortalit des listrioses en France est de l'ordre de 30 %, il en a t de mme dans les pidmies observes rcemment dans le monde. V - PHYSIOPATHOLOGIE - FACTEURS DE VIRULENCE L. monocytogenes est une bactrie multiplication intracellulaire et sa virulence est lie sa possibilit de multiplication dans les macrophages. La bactrie produit une hmolysine, toxine protique extra-cellulaire ayant une parent antignique avec la streptolysine 0. Ltimolysine se lie au cholestrol et est responsable in vitro d'une activit cytotoxique sur diverses cellules eucaryotes en culture et in vivo de lsions du systme rticulo-endothlial et de l'effet ltal sur les animaux de laboratoire. Le rle de l'hmolysine dans la virulence de L. monocytogenes tait suspect en raison de l'absence de virulence des souches non hmolytiques.

126

Section III - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

Des tudes rcentes ont montr que l'hmolysine ou listriolysine est un facteur de virulence majeur intervenant dans la croissance intracellulaire de L. monocytogenes. La production d'hmolysine dans les vacuoles aprs phagocytose provoque la destruction des membranes cytoplasmiques, des lysosomes, de la membrane des vacuoles entranant la libration de fer dont la prsence stimule la croissance bactrienne. D'autres produits pourraient jouer un rle dans la virulence tels la phospholipase C et l'activit superoxide-dismutase. L'intemaline est une protine exprime en surface de la bactrie qui favorise sa phagocytose. A ce jour, seules deux espces : L. monocytogenes et L. ivanovii sont naturellement (L.ivanovii pour les animaux) et exprimentalement pathognes.

VI - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE A - Produits pathologiques La nature du prlvement est variable selon l'atteinte clinique et l'ge du malade. Chez le nouveau-n la bactrie peut tre recherche dans le liquide gastrique, le mconium, le LCR, le sang, les prlvements priphriques ; chez la mre les prlvements concernent le placenta, les lochies, le liquide amniotique. L'hmoculture est aussi indique lors de toute infection inexplique chez la femme enceinte. Dans les autres cas, la recherche est ralise au niveau du sang, du LCR, des lsions cutanes. La recherche dans les matires fcales permet de dceler les porteurs. La mise en culture immdiate est souhaitable, mais si cela est ncessaire la conservation est possible la temprature ambiante ou +4C en raison de la rsistance de la bactrie. L'incubation 4C peut tre utilise pour enrichir le milieu en Listeria (selles, enqutes pidmiologiques). Des tentatives de diagnostic rapide par recherche d'antignes solubles ont t menes par contre-immunolectrophorse ou ELISA ; les rsultats sont encore dcevants : en ELISA pour le type 4b, si la spcificit est de 100 %, la sensibilit est insuffisante car l'antigne est dtect dans seulement un quart des cas. B - Examen direct L. monocytogenes est un petit bacille Gram positif de 0,5 x 1-4 (im. Dans les produits pathologiques, L. monocytogenes est habituellement sous forme de bacille court et il existe des formes coccobacillaires en courtes chanes. Dans le liquide cphalorachidien o les bactries sont habituellement peu abondantes L. monocytogenes est intra ou extra-cellulaire. Des risques de confusion sont possibles l'examen direct mais doivent tre vits (les erreurs les plus frquentes sont : Corynebacterium, les streptocoques, voire Haemophilus si la dcoloration a t trop importante). Aprs culture en milieu liquide les bacilles peuvent tre plus longs et disposs en palissade. C - Caractres culturaux L. monocytogenes pousse sur les milieux usuels ; la croissance est favorise par la prsence de glucose (0,1 %), de srum (1 %) ou de sang (5 %). Le pH optimum est de 7 - 7,4. La croissance est obtenue en arobiose ou en microarophilie. La temprature optimale de culture est comprise entre 30 et 37C, les tempratures limites de croissance sont de 1C et 45C. A + 4C, L. monocytogenes a la proprit

Chapitre VIII - Lislena

127

de se multiplier plus rapidement que de nombreuses espces et cette proprit est utilise comme mthode d'enrichissement pour des produits contamins ou pluri-microbiens (mthode de Gray). La culture est possible sur milieux hostiles (hypersal, bili, au tellurite de potassium), sur glose Mac Conkey, mais pas en prsence d'azide de sodium. Sur glose nutritive (glose tryptose), aprs 18 heures 37C, les colonies sont petites, arrondies, translucides, gris bleut. Elles prsentent une iridescence bleu- vert caractristique lors d'un examen en lumire oblique (permettant de reprer les colonies lors de culture de produits polymicrobiens). Sur glose au sang (mouton, cheval, lapin), les colonies ont le mme aspect et sont entoures d'une troite zone d'hmolyse parfois ne dpassant qu' peine le bord de la colonie et rendue visible en dplaant la colonie. Le CAMP-test, utilis pour les streptocoques du groupe B, permet d'tudier les souches de Listeria ayant une hmolyse faible ou douteuse ; l'accentuation de l'hmolyse de S. aureus est observe pour L. monocytogenes et L. seeligeri et celle de Rhodococcus equi pour L. ivanovii (voir Tableau I). L. ivanovii produit habituellement une large zone ou de multiples zones d'hmolyse. Les souches non hmolytiques sont considres comme non pathognes. Des milieux slectifs ont t proposs pour la culture partir de l'environnement ou de produits pluri-microbiens ; ils contiennent des antibiotiques comme la colistine ou l'acide nalidixique (40 mg/1). Les diffrentes espces de Listeria sont des bactries mobiles. La mobilit est bien exprime 25C, mais trs faible ou nulle 37C. Elle est recherche en milieu liquide (culbutes et rotations l'examen microscopique) ou en milieu glose (ombrelle distance de la surface) aprs culture 25C. D - Caractres d'identification et pouvoir pathogne exprimental Les principaux caractres d'identification de L. monocytogenes sont la morphologie de la bactrie et l'aspect des colonies ; la mobilit 25C ; catalase positive ; l'hydrolyse de l'esculine (raction rapidement positive, obtenue en quelques heures donc important pour un diagnostic rapide de suspicion) ; l'acidification du glucose et de la salicine, du rhamnose ; absence d'acidification du mannitol, du xylose et de l'arabinose (tableau I). L'analyse d'lectrophortique enzymatique a montr que les pidmies taient bien dues au mme clone. Par ailleurs, une sonde correspondant au fragment d'ADN codant pour le gne de l'hmolysine p est apparu comme strictement spcifique de L. monocytogenes (Datta). L. monocytogenes et L. ivanovii sont pathognes pour la souris par voie intrapritonale. Le test d'Anton permet d'identifier les souches pathognes de L. monocytogenes. L'introduction dans le sac conjonctival de l'il de lapin ou de cobaye de 2-3 gouttes d'une suspension de bactries (prpare partir d'une culture de 18 heures, 3 gouttes dans 5 ml d'eau distille) provoque une conjonctivite purulente en 2 5 jours gurie par l'administration locale d'ampicilline. E - Diagnostic diffrentiel Le diagnostic diffrentiel des diffrentes espces de Listeria est prsent dans le tableau I. Les principaux caractres permettant de diffrencier Listeria d'espces voisines sont prsents dans le tableau II. Ces caractres concernent des bactries Gram positif (morphologie exclue). Il convient de tenir compte dans un diagnostic

128

Section m - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

diffrentiel des circonstances d'isolement. Les confusions les plus frquentes sont celles avec un streptocoque, une corynbactrie, ventuellement Haemophilus.
TABLEAU n PRINCIPAUX CARACTRES DIFFRENTIELS DE BACTRIES QRAM POSITIF (morphologie exclue) Listeria Coryn- Enterococcus Erysipelothrix Streptococcus monocytogenes bactries faecalis Lactobacillus rhusiopathiae Bacillus agalacaae Mobilit Granulations mtachromadques Spores Catalase Hmolyse Nitrate rductase Mannitol Esculine Ureasc SH; Test Anton +(25C) + + + . + + d +(-) . + . -ou+ + + + + -

-ou+

+ . . . -ou+ -

F - Classification : srotypes, lysotypes II existe des Ag 0 et des Ag H qui permettent de dfinir des srovars. Un mme srovar peut tre retrouv dans deux espces diffrentes (voir tableau 1 et diagnostic bactriologique). Les antignes somatiques (15 Ag 0 :1 XV) et flageiaires (5 Ag H : A E) permettent de dfinir 16 types srologiques ou srovars (Paterson, Seeliger, Donker-Voet) dans le genre Listeria. Ces srovars prsents dans le tableau III, sont : srovar 1/2 (a, b et c) ; srovar 3 (a, b et c) ; srovar 4 (a, ab, b, c, d, e, f et g) ; srovars 5, 6 et 7. A l'exception des souches du srovar 5 qui appartiennent l'espce L. ivanovi, il n'y a pas de corrlation troite entre l'espce et le srovar. Les espces L. grayi et L. murrayi sont apparentes entre elles mais n'ont pas de parent avec les autres espces du genre Listeria, aussi a-t-on propos de les classer dans un genre nouveau : Murraya. Les srovars l/2a, l/2b et surtout 4b (65 70 % des souches) sont le plus souvent rencontrs en France chez l'homme. Ces mmes srovars sont retrouvs chez l'animal ainsi que les autres srovars plus rares. En pratique, le typage, complment de l'isolement et de l'identification est ralis par agglutination sur lame l'aide d'anti-srums spcifiques. La lysotypie de L. monocytogenes est possible grce des lots de phages qui permettent de typer 54 % des souches de srovar 1/2 et 77 % des souches de srovar 4. Les phages ont une activit lytique spcifique de srovar dont la dtermination doit prcder toute lysotypie. La lysotypie, largie aux cinq espces de Listeria avec de nouveaux phages, n'a pas permis d'tablir de relation phagovar-srovar-hte-origine gographique.
G - Diagnostic indirect

La recherche d'anticorps dirigs contre les antignes 0 et H des types 1 et 4b est possible par agglutination lente en tube. La raction est comparable celle utilise pour les Salmonella : agglutination 0 granuleuse, agglutination H floconneuse. L'interprtation des rsultats devra toujours tenir compte du tableau clinique et du contexte pidmiologique car il existe des communauts antigniques entre Listeria, Staphylocoques et Entrocoques. L'lvation des anticorps agglutinants est souvent tardive et mme un taux lev (> 1/320) n'est pas significatif, des taux levs tant retrouvs chez des sujets sans antcdents de listriose.

Chapitre Vffl - Listeria

________________________129

TABLEAUffl SROVARITS DE LISTERIA MONOCYTOGENES. MURRAYA GRAYI ET ESPCES VOISINES


DESIGNAT10 N ANTIGENES 0 PATERSON SEELIGER DONKER VOET 1 2 1
4

ANTIGENES H

l/2a l/2b l/2c 3a 3b 3<4.1 4b 4e 4d 4e 4f 1 6 7

il (lin II fllll n fiin


11

II

(1111

A A JV

(III) (111)

(lin (lin

(III)

iv

rv

A A

(vi
V V

dm (III) (ni)
(111)

v (V) VI v vi

VI VI

vn

VII VIll

IX

ix

vn

Ltstenaspec

(iii) (iii)
(111) (III) (III)

v vi (V) vi

(VIH)

(IX)

vn
VD

L grayi^sy sra)i) (ssp murrayi)

VDl

vni

x x

xi
XI XII XII Xll Xll XIV XIV

XV

A A A A A A A A A A

B B B B B B B B B B B B B B B B

C D ' C C C C C C C C C C C E E D

Plus encourageant sont les rsultats obtenus en dosant les anticorps dirigs contre la listriolysine 0 (LLO), mme si cette enzyme comporte une antignicit croise avec streptolysine 0, pneumolysine et perfringolysine ; dans l'exprience de Berche : par titrage en dot blot, les anticorps anti LLO sont retrouvs un titre > 1/100 chez 96 % des patients et 12 16 % des contrles. Malgr ces progrs rcents, l'isolement des Listeria reste le meilleur moyen de diagnostic. VII - AUTRES ESPCES Les autres espces de Listeria sont elles aussi ( l'exception de L. grayi isole chez le seul chinchilla) largement distribues dans la nature. L. ivanovii est hmolytique et pathogne chez l'animal (ovins) et a t rarement rencontre chez l'homme. L. innocua et L. welshimeri ne sont pas hmolytiques et n'ont pas de pouvoir pathogne connu. L. seeligeri est faiblement hmolytique et dnue de pouvoir pathogne exprimental, mais un cas de mningite humaine chez un sujet sans dficit immunitaire a t dcrit. Ces espces sont prsentes dans le tableau I. VIII - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE L. monocytogenes est une espce sensible aux antibiotiques efficaces sur les bactries Gram positif. Les principaux antibiotiques actifs sont les bta-lactamines avec une bonne activit des pnicillines, surtout ampicilline, et une mauvaise activit des cphalosporines en particulier celles de troisime gnration. Sont aussi actifs, les aminosides (surtout gentamicine et tobramycine), les ttracyclines, l'rythromycine, le chloramphnicol. Les quinolones de seconde gnration ont une activit rduite sur L. monocytogenes. Des rsistances ont t rencontres vis--vis des pnicillines, de l'rythromycine, de la rifampicine et du sulfamthoxazole - trimthoprime. Le traitement de choix est l'association ampicilline + aminoglycoside qui permet d'avoir in vitro le meilleur effet bactricide. Il n'existe pas de vaccin permettant de confrer une protection tant chez l'homme que chez l'animal. Aussi la prvention repose essentiellement sur des mesures individuelles pour la contamination directe et la surveillance de la qualit des denres alimentaires, autant de mesures difficiles observer en raison de la distribution de la bactrie dans la nature et sa rsistance.

130

Section III - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

Il est recommand aux femmes enceintes et aux immunodprims d'viter l'ingestion de vgtaux crus, de lait cru ou mal pasteuris ainsi que des fromages frais ou pte molle.

BIBLIOGRAPHIE
AUDURIER A., BERCHE P., Listeria , in Bactriologie Mdicale, Le Minor L., Vron M., Flammarion, Paris 1990, 844-858. BEH,1987, n 8,39,48 BEH,1989, n 12,31,39BERCHE P., REICH K.A., BONNICHON M. et al., Dtection of antilisteriolysine 0 for serodiagnosis ofhuman listeriosis ., Lancet, 1990, i, 624-627. COURTIEU A.L., ESPAZE E.P., REYNAUD A.E., Listeriose, Compte-rendus du 9e symposium international sur les problmes de listerioses. Universit de Nantes, 1986. FARBER J.-M. PETERKIN P. I. * Listeria monocytognes, a food-bome pathogen , Microbiol. Rev., 1991, 55,'476-511. GAILLARD J.L., BERCHE P., SANSONNETTI P., Transposon mutagenesis as a tool to study th rle of hemolysin in th virulence of Listeria monocytognes , Infect. Immun., 1986, 52,
50-55.

GAILLARD J.-P., BERCHE P., FREHEL C., GOUIN E., COSSART P., Entry of L. monocytognes into Cell is mediated by Intemalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from Gram-positive cocci., Cell, 1991, 65, 1127-1141. GELLIN B.C., BROOME C.V., La listriose , J.A.MA., 14, 1989, 628-638. HUMBERT G., DUVAL C., FESSARD C., MEUNIER M., LEDOUX A., Aspects actuels des listerioses en France , ( propos d'une statistique de 824 cas), 1re partie, 2me partie, Listerioses de la femme enceinte et listerioses no-natales , Lyon mdical, 1977,237, 257-289 et
455-468.

REYNAUD A.E., ESPAZE E.P., COURTIEU A.L., valuation de l'activit des antibiotiques sur Listeria ,Path. Biol., 1986, 34, 1091-1095. ROCOURT J., Listeria et listriose humaine. La dcennie 1979-1989 Ann. Inst. Pasteur, 1990, 1, 25-30. ROCOURT J., CATIMEL B., Caractrisation biochimique des espces du genre Listeria , Zbl. Bakt. Hyg., 1985, A 260, 221-231. ROCOURT J., SEELIGER H.P.R-, Distribution des espces du genre Listeria ,Zbl. Bakt. Hyg., 1985, A 259, 317-330. SEELIGER H.P.R., Modem taxonomy of th Listeria group and relation to its pathogenicity , Clin. Invest. Med., 1984, 7, 217-221.

Chapitre IX ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE


HISTORIQUE
E. rhusiopathiae a t isol par Koch en 1878 et dcrit par Pasteur et Thuillier en 1882 comme tant la bactrie responsable de la maladie rouge du porc, maladie transmissible contre laquelle ils prparent un vaccin vivant attnu. Rosenbach, en 1884, a isol chez l'Homme, partir de lsions cutanes, une bactrie identifie comme celle dcrite par Pasteur et Thuillier. La maladie humaine a t dcrite par Baker la fin du sicle. La mise au point du srum anti-rouget ds 1891 et de vaccins avec des bactries vivantes virulentes ou attnues ont t, avant l're des antibiotiques, des moyens de lutte trs efficaces contre la maladie chez l'animal (le porc plus particulirement).

1 - CARACTRES GNRAUX DU GENRE E. rhusiopathiae est la seule espce du genre Erysipelothrix. Il s'agit d'un bacille fin, droit ou lgrement incurv, de taille variable : 0,2-0,4 x 2,5 [im de long pour la forme courte , mais pouvant se prsenter sous forme de longs filaments de plusieurs dizaines de prn. Les bactries sont non sporules, non capsules, immobiles, Gram positif, aro-anarobies facultatives et ngatives pour les tests catalase et oxydase. Elles prsentent une faible activit fermentative. Ce genre gntiquement homogne (G+C plOO entre 36-38) fait partie des bactries Gram positif non sporules de forme rgulire comme d'autres genres, Lactobacillus, Listeria, pouvant tre rencontrs chez l'homme. II - HABITAT ET PIDMIOLOGIE E. rhusiopathiae est une bactrie ubiquitaire largement distribue dans la nature. Elle peut tre isole chez les mammifres, les oiseaux et les poissons. Le porc (30 50 % de porteurs sains) est probablement l'espce la plus frquemment touche (rouget du porc), mais des pizooties peuvent aussi atteindre d'autres espces animales, mammifres domestiques et sauvages, oiseaux d'levage. Chez les poissons, la bactrie peut tre isole dans le mucus recouvrant la surface du corps, mais ne provoque pas d'infection. La bactrie est aussi prsente dans l'eau et le sol o elle semble persister plusieurs annes, performance remarquable pour une bactrie non sporule et en fait une bactrie tellurique . De mme, la bactrie persiste plusieurs annes dans les cadavres d'animaux et plusieurs mois dans les viandes fumes et sales.

132

Section m - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

La contamination humaine survient aprs contact avec des animaux infects. La maladie est avant tout professionnelle, lors de manipulation d'animaux ou de carcasses de porcs, de volailles, de poissons et donc observe chez des vtrinaires, bouchers, employs d'abattoirs, mais aussi leveurs et pcheurs. La porte d'entre cutane, au niveau des mains, est la plus frquente. Les portes d'entre buccale et digestive sont beaucoup plus rares. III - POUVOIR PATHOGNE NATUREL E. rhusiopathiae est l'agent du rouget du porc, maladie aigu septicmique avec des manifestations cutanes et articulaires ou subaigu et chronique avec des localisations l'endocarde et aux articulations. Chez l'homme, la forme la plus frquente est la forme cutane localise ou rysiplode de Baker et Rosenbach. Aprs une incubation courte de 2-3 jours, le point d'inoculation (petite plaie, excoriation) est le sige d'une zone rythmateuse, chaude, sensible, prurigineuse, donnant une impression de tension et de brlure. Cette zone s'tend progressivement, donnant un placard rouge vineux, lgrement en relief, mais plus clair et affaiss en son centre, bord par un bourrelet priphrique plus violac. La lsion localise la main peut concerner toute la face dorsale de la main et est accompagne d'adnopathies pitrochlennes et axillaires. Il n'y a jamais de suppuration et la gurison spontane peut tre observe en quelques semaines. Les formes septicmiques sont rares, survenant d'emble ou aprs une forme cutane. Elles sont le plus souvent associes une endocardite ou une arthrite septique et surviennent chez des sujets prdisposs. Les autres localisations (pulmonaires, mninges, pleurales) sont rares galement. Certains produits labors par E. rhusiopathiae sont susceptibles de jouer un rle dans la virulence du germe tels que hyaluronidase et neuraminidase. IV - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE Le diagnostic direct sera envisag, le diagnostic indirect ayant un intrt limit. A - Les produits pathologiques L'hmoculture est le prlvement essentiel lors de septicmie. Dans la forme cutane, s'il y a une phlyctne, on ensemence le liquide ; si la lsion est sche, la bactrie est localise au niveau du bourrelet dans les couches dermo-pidermiques et l'isolement du germe est difficile. Pour avoir les meilleures chances d'isoler la bactrie, il faut raliser un prlvement au bistouri au niveau du bourrelet (cte de melon, sans faire saigner). Le germe peut aussi tre isol partir du liquide articulaire ou du LCR chez l'homme. Chez les animaux vivants, l'isolement se fait partir d'hmocultures. A partir d'animaux morts, il faut utiliser des milieux d'enrichissement supplments avec des antibiotiques ou des inhibiteurs des autres bactries. B - Examen direct L'examen microscopique est rarement positif sur la biopsie cutane. En culture, E. rhusiopathiae est un bacille droit ou lgrement incurv, Gram positif, immobile, non capsul, non sporul. De grandes variations de taille sont observes :

Chapitre K - Erysipelothrix rhustopatluae

133

0,2-0,3 x 1 5 )J.m dans les cultures jeunes et filaments de plusieurs dizaines de [im dans les cultures ges. Sous forme de longs filaments, il prend l'aspect de touffes de cheveux (d'o une partie de son nom : thrix).

C - Culture
La culture est favorise par la prsence de glucose ou de srum et par un pH lgrement alcalin. E. rhusiopathiae est aro-anarobie facultatif, plus volontiers micro-arophile lors de l'isolement. Il existe une forme S et une forme R. La forme S correspond aux formes courtes et donne des colonies fines (1 mm en 24-48 heures), lisses, bombes, brillantes, transparentes, bords nets, devenant opaques aprs plusieurs jours. Les longs filaments correspondent la forme R qui donne des colonies plates, opaques, surface mate et rugueuse, bords irrguliers (colonies de Bacillus anthracis en miniature). La dissociation des colonies dans les deux sens peut tre observe. Sur glose au sang les colonies provoquent une hmolyse de type alpha parfois intense, mais l'hmolyse n'est jamais de type bta. La temprature optimale de culture est de 30-37C, mais la culture est possible entre 5 et 42C. Le germe pousse lentement et faiblement en milieu usuel, sa croissance est favorise par l'addition de sang, de srum, d'ascite ou de glucose. D - Identification - Pouvoir pathogne exprimental Dpourvu d'oxydase et de catalase, ce genre bactrien a une faible activit mtabolique. Le glucose et le lactose sont acidifis sans production de gaz ; le rhamnose, le saccharose, le mannitol et l'esculine ne sont pas modifis. Il n'y a pas de production d'indole en eau peptone et les nitrates ne sont pas transforms. La bactrie dpourvue d'urase, produit lentement de l'H^S sur milieu au sous-actate de plomb ou sur milieu de Kligler-Hajna. En glatine sur piqre profonde, la culture de E. rhusiopathiae donne une image en cure-pipe caractristique, sans liqufaction de la glatine ( 22-25C) Deux espces, la souris et le pigeon sont particulirement sensibles l'infection exprimentale. Chez la souris l'injection par voie intrapritonale ou sous-cutane de 0,1 ml d'une culture de 24 heures provoque la mort en 24-48 heures. La bactrie est retrouve au niveau de tous les organes (foie, rate... et est particulirement visible sur les dcalques de rein) et dans le sang du coeur.

E - Diagnostic diffrentiel
E. rhusiopathiae est une bactrie rarement rencontre en bactriologie mdicale courante. Le diagnostic diffrentiel n'en mrite que plus d'attention. Plusieurs espces de bacilles Gram positif non sporuls doivent tre envisags (Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria) et mme cocci Gram positif (Streptococcus). Un tableau prsentant les principaux caractres diffrentiels entre ces espces se trouve au chapitre Listeria . Les caractres prendre en compte, outre la morphologie et le type respiratoire sont : la catalase, l'oxydase, les tempratures de croissance, la culture sur milieux enrichis ou non, l'hydrolyse de l'esculine, la production d'H^S, la mobilit, la culture en milieu acide (MRS), le mtabolisme glucidolytique et protoly tique. Le pouvoir pathogne exprimental chez la souris ventuellement avec un test de protection par le srum spcifique peut complter l'identification et le diagnostic diffrentiel.

134

Section ffl - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

F - Classification - Srotypes Des antignes thermolabiles spcifiques d'espce et thermostables spcifiques de type ont t identifis. Les antignes spcifiques de type sont de nature polysaccharidique et permettent de dfinir 22 srotypes (srovars). Les srotypes 1 et 2 sont les plus frquents. Il existe au moins un antigne de groupe et, chez certaines souches, un antigne vaccinant et un antigne hmagglutinant ont t dcrits.

V - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE Le traitement repose sur l'antibiothrapie ; la pnicilline est l'antibiotique de choix. Les souches sont sensibles aux ttracyclines, aux macrolides, au chloramphnicol, la streptomycine. Dans les formes svres (septicmie, endocardites) une assocation est recommande : pnicilline G / streptomycine ou ampicilline / gentamicine. Le traitement doit tre prolong plus d'un mois ; les rechutes ne sont pas exceptionnelles. La prophylaxie se limite aux prcautions observer par ceux qui, par leur profession sont en contact avec des animaux malades ou porteurs de germes ou avec des produits d'origine animale susceptibles d'tre contamins par le bacille du rouget.

BIBLIOGRAPHIE
BRISOU J., DENIS F., Genre Erysipelothrix Rosenbach 1909 . in Bactriologie Mdicale, Dumas J., Flammarion, Paris, 1972, 557-566. FRELAND C., Les infections Erysipelothrix rhusiopathiae. Revue gnrale propos de 31 cas de septicmie avec endocardite relevs dans la littrature . Path. Biol., 1977, 25, 345-352. LEMARTE C., COTTIN J., MAHAZA C., CARBONNELLE B., Erysipelothrix rhusiopathiae : 4 nouvelles observations de septicmie, Med. Mal. Infect., 1991, 21, 660-664. PHILIPPON A., PAUL G., Erysipelothrix rhusiopathiae . in Bactriologie Mdicale, Le Minor L., Vron M., Flammarion, Paris, 1990, 859-866. REBOLI A.C., FARRAR W.E., Erysipelothrix rhusiopathiae : an occupational pathogen. Clin. Microbiol. Rev., 1989, 2, 354-359.

Chapitre X BACILLUS
GNRALITS
Le genre Bacillus comprend des bactries en forme de btonnets, gnralement mobiles, sporognes. Ces bacilles sont Gram positif, arobies stricts ou anarobies facultatifs. Le genre Bacillus comprend une vingtaine d'espces, mais on s'intresse essentiellement B. anthracis, en raison de son pouvoir pathogne (animaux, homme) et B. cereus (intoxication alimentaire). Nanmoins, depuis quelques annes, de nombreuses publications rendent d'autres espces de Bacillus responsables d'infections chez les immunodprims (bactrimies, mningites, mningo-encphalites, pneumonies, endocardites). 1 - CLASSIFICATION ET NOMENCLATURE Les espces du genre Bacillus sont classes sur leur morphologie et la position de leurs spores. Cette classification divise le genre Bacillus en 3 groupes : - Groupe 1 Bacilles spores ne dformant pas le corps microbien, - Groupe 2 Bacilles spores dformantes, ovales, - Groupe 3 Bacilles spores dformantes, rondes. A l'intrieur de ces groupes, les espces et les varits se distinguent par des caractres morphologiques et physiologiques.

136

Section III - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

II - PRINCIPAUX CARACTRES DU GENRE BACILLUS A - Morphologie Mobile par ciliature pritriche, contrler partir d'un bouillon (B. anthracis est toujours immobile). La coloration de Gram thoriquement positive peut tre ngative (le groupe 1 garde mieux la coloration). La coloration simple la fuchsine dilue permet de mieux apprcier les formes, les dimensions, la prsence de vacuoles cytosplasmiques dues des inclusions lipidiques. Les Bacillus sont rarement capsuls, sauf B. anthracis dans certaines conditions. Une glose sans peptone est le milieu le plus favorable la sporulation. La spore mre est ovale ou ronde. Son diamtre est infrieur ou suprieur celui du bacille. Sa localisation est centrale, paracentrale, subterminale ou terminale. Dans certaines espces il existe des inclusions parasporales. Parfois on note la prsence de cristaux de protines. La rsistance aux agents physico-chimiques est faible pour les formes bacillaires, facilement tues par le vieillissement et la chaleur (1 h 55C) et les antiseptiques. Elle est plus leve pour les spores (40 mn 120C). B. subtilis compte parmi les plus rsistants. B - Caractres culturaux La plupart des espces se dveloppent mieux 28-33C qu' 37C, mais beaucoup d'espces tolrent des diffrences thermiques marques. Les dterminations des tempratures seuil de croissance sont ralises sur glose inclines incubes au bain marie. Les milieux de culture usuels permettent la croissance de la plupart des espces du genre Bacillus. Les espces ont chacune leurs exigences propres et souvent relativement homognes : utilisation d'azote ammoniacal pour les uns, des acides amins pour les autres, etc... Les milieux favorables ou hostiles utiles pour l'identification sont : - glose nutritive pH 6, - pomme de terre : culture ou non, - bouillon hypersal. C - Caractres biochimiques gnraux Mtabolisme respiratoire catalase (+), oxydase () arobies stricts ou anarobiose facultative suivant les espces. Nitrate rductase Elle est prsente ou non suivant l'espce. Attaque des hydrates de carbone En milieu complexe, l'acidification est souvent masque. Il faut donc employer un milieu minral glose (milieu de Smith, Gordon, Clark), enrichi d'extrait de levure.

Oupiire X- Bacillus

137

L'acidification ou non du glucose, arabinose et xylose suffisent gnralement pour l'identification. Production d'actone (actyl-mthyl-carbinol) Sa production sur le milieu usuel de Clark et Lubs n'est pas toujours bonne. Il vaut mieux utiliser un milieu glucose, pepton sans phosphate. La temprature favorable la production varie suivant les espces (32C, 37C et 45C). Autres caractres tudier - Hydrolyse de l'amidon, de la casine, de la glatine, - Hydrolyse de la lcithine ; B. subtilis possde une phospholipase qui hydrolyse la lcithine en diglycride et phosphorylcholine (opacification). Souvent, la raction est R (= restreinte), c'est dire trs localise sous la culture. Il faut donc parfois enlever les colonies pour la mettre en vidence. - Indole : rarement positive. - Urase.

BACILLUS ANTHRACIS
HISTORIQUE
B. anthracis est responsable du charbon , connu depuis l'antiquit. 1823 : Barthlmy procde la premire transmission exprimentale des moutons. 1848 - 1850 : Rayer et Davaine dclent dans le sang charbonneux des petits corps filiformes . 1860 Delafond ralise la culture de la bactrie. 1880 Pasteur, Roux et Chamberland attnuent la bactrie par la chaleur. 1881 Exprience de Pouilly-Le-Fort : Pasteur prouve l'efficacit de son vaccin anti-charbonneux.

1 - HABITAT La spore confre une trs grande rsistance dans les milieux extrieurs. Ce sont des germes telluriques mais que l'on rencontre aussi dans l'eau et dans l'air. B. anthracis est largement distribu dans le monde. Les animaux malades dissminent le germe ; le sol constitue le rservoir (champs, tables, prs) ; les cadavres et les produits d'origine animale (peaux, poils, os,...) participent la pollution des terrains et peuvent contaminer l'homme. II - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A - Morphologie et structure Gros bacille (5-6 |iim x 1 |n.m). Immobile (diffrent des autres Bacillus). Dans les produits pathologiques, il se prsente sous forme de courtes chanettes. En culture : chanes longues en canne de bambou Gram positif. Extrmits carres.

138

Section m - BACILLES A GRAM POSITIF AROBIES

1. La capsule Les souches virulentes de B. anthracis sont capsules. La capsule n'est produite in vivo ou en culture que dans certaines conditions (sang, srum, bicarbonate de sodium, CO;). Les souches non-capsules sont avirulentes.
2. La spore.

Elle est ovode, non dformante. B. anthracis appartient au groupe 1. La sporognse se fait en prsence d'O^, entre 18C - 42C et en atmosphre humide, dans des milieux pauvres, sans peptone. B - Caractres culturaux B. anthracis se dveloppe bien sur milieux usuels. Anarobie, il prfre la prsence d'oxygne. Temprature optimum : 30C 35C (15C - 43C) ; pH 7 - 7,4 (6 - 8,5). Sur glose nutritive incline, les colonies sont R contours irrguliers. Sur glose au srum, les colonies sont S (en raison de la production d'une capsule). En bouillon ordinaire et en eau peptone : formation de flocons au fond du tube avec surnageant clair. C - Caractres biochimiques 1. Pouvoir protolytique II est peu marqu. La liqufaction de la glatine en culot, aprs piqre est lente. Elle donne un aspect en sapin renvers . Le lait est coagul lentement et digr lentement. Srum liquide : glification puis liqufaction. Srum coagul : digestion lente. L'hmolyse est lgre et apparat lentement.
2. Pouvoir glucidolytique

II fermente : glucose, maltose, saccharose, lvulose, trhalose et dextrine. Lactose (-), galactose (-), arabinose (-). Les autres sucres sont attaqus de manire inconstante. 3. B. anthracis ne possde nipnicillinase, ni urase. Il est HyS (-). Les nitrates sont rduits en nitrites. D - Produits labors B. anthracis labore la toxine charbonneuse. C'est une toxine de nature protique, qui est compose de 3 protines distinctes : le facteur 1 = facteur dmatogne (adnylate-cyclase), le facteur II = antigne protecteur, le facteur III = facteur ltal (PM = 82 000). Les facteurs II et III doivent tre associs pour entraner la mort de la souris, du rat ou du cobaye. L'injection intradermique des facteurs 1 et II entrane des lsions cutanes chez le cobaye et le lapin.

Chapitre X-Bacillus

139

L'action toxique des diverses souches peut varier suivant la production respective de ces 3 facteurs, et ainsi, certaines souches sont trs dmatognes et d'autres peu. La production de la toxine rpond un dterminisme plasmidique. E - Structure antignique 1. La capsule Elle est polypeptidique et intervient dans la virulence de la bactrie. Elle empche la phagocytose, inhibe le pouvoir bactricide du srum et rend le sang incoagulable. Les anticorps anticapsulaires ne sont pas protecteurs chez l'homme. 2. Les antignes somatiques Ifs peuvent tre tudis par raction de prcipitation (raction d'Ascoli). 3. La toxine Elle provoque la formation d'anticorps neutralisants. Il existe des communauts antigniques entre B. anthracis et certains autres Bacillus, mises en vidence par immunodiffusion (ex. avec B. subtilis, B. megaterium et B. cereus). F - Lysotypie B. anthracis est sensible diffrents bactriophages. La lysotypie peut tre utilise dans le diagnostic diffrentiel entre B. cereus et B. anthracis : - phages du groupe A actifs sur B. anthracis, inactifs sur B. cereus - phages du groupe AC actifs sur B. anthracis et B. cereus - phages du groupe C inactifs sur B. anthracis, actifs sur certains B. cereus. III - POUVOIR PATHOGNE NATUREL A - Chez les animaux On distingue des formes subaigus, aigus et suraigus. Le charbon peut tre interne ou plus rarement externe . Les formes cliniques varient suivant les espces animales : Mouton : forme suraigue (mort en quelques heures) Cheval et Boeuf : forme aigu (souvent fatale en 1 2 jours) Porc : charbon externe forme subaigu (oedme de la gorge). Dans le charbon interne animal, les lsions macroscopiques sont celles d'une septicmie. Le sang est noir, poisseux, incoagulable ; on observe une splnomgalie et une hmaturie. Dans le charbon externe, on note une tumeur centre sur un paquet ganglionnaire. Les lsions microscopiques sont reprsentes par une accumulation de bacilles dans les capillaires. B - Chez l'homme 7. Charbon externe Le charbon est rarement rencontr chez l'homme en France, mais on estime qu'il y a au niveau mondial chaque anne entre 20 000 et 100 000 cas de charbon (Afrique, Asie surtout).

140

Section m - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

La lsion typique est la "pustule maligne", qui sige au point de pntration du bacille (main, bras, face). Cette papule rythmateuse volue vers une vsicule, puis un escarre noirtre lui succde. L'volution est le plus souvent favorable. Trs rarement, il y a apparition d'un oedme malin envahissant. Le charbon cutan est une maladie professionelle (fermiers, vtrinaires, bouchers, mgissiers...). 2. Le charbon interne II est rare. Il peut prendre diffrentes formes : - la forme pulmonaire : par inhalation de poussires aprs contact avec de la laine, - la forme gastro-intestinale : aprs ingestion de viande contamine, - la mningite charbonneuse. Ces formes ont un pronostic beaucoup plus sombre et conduisent souvent la mort, parfois avant d'avoir instaur une thrapeutique efficace. IV - POUVOIR PATHOGNE EXPRIMENTAL
',

Le cobaye est trs sensible B. anthracis. Aprs inoculation, la mort survient en deux jours environ. V - PATHOGNIE ET IMMUNIT Aprs pntration dans les tissus, les spores germent et donnent naissance des bacilles qui s'encapsulent, se multiplient et pntrent dans les ganglions lymphatiques affrents. Cette rtention ganglionnaire est temporaire puis les bacilles passent alors dans le sang (bactrimie). La rate fixe les bacilles. Lorsque sa capacit de fixation est dpasse, les bacilles se dversent massivement dans le sang et s'y multiplient (septicmie tardive). La mort est due l'action de la toxine charbonneuse. L'injection de toxine charbonneuse au cobaye produit des troubles analogues. Aprs la gurison, le sujet possde des anticorps protecteurs induits par le facteur II. Les souches non-capsules, de virulence modre, produisent de la toxine et sont vaccinantes. VI - PIDMIOLOGIE Le charbon existe pratiquement dans toutes les parties du monde, mais surtout en Asie et en Afrique. Il existe des fluctuations saisonnires de l'incidence de la maladie avec un maximum en t, notamment durant les ts chauds et secs. A - Les matires virulentes Ce sont principalement les animaux malades et leurs produits de scrtion et d'excrtion. Les cadavres sont des sources de bacilles. La virulence des cadavres non autopsis disparait en quelques jours car la spore ne peut pas se former. Peaux, poils, crins, laine sont dangereux pour l'homme. Sang, muscles, os (farines, poudres) sont dangereux pour l'animal et l'homme.

Chapme X - Bacdtus

141

Le sol souill est un rservoir important et permanent (80 ans). Les spores enfouies peuvent tre ramenes en surface par les vers de terre ou les inondations. B - Rceptivit Les espces animales n'ont pas la mme rceptivit. Par ordre dcroissant de rceptivit, on trouve les herbivores, les omnivores, les carnivores, les oiseaux. Chez l'homme, la profession est dterminante. Le charbon est une zoonose professionnelle (tanneurs, bouchers, dockers). C - Modalit de la transmission 7. Infection des animaux Elle se fait essentiellement par voie digestive (ingestion d'herbes, de fourrages, de viandes pollues). Il y a donc des possibilits de contamination locale (prs, champs maudits) ou distance (transmission par oiseaux). Le commerce de poudre d'os importe de pays o le charbon est frquent (Inde) peut amener l'apparition du charbon animal dans des rgions indemnes. 2. Infection de l'homme Elle se ralise par voie cutane. Elle atteint : leveurs, vtrinaires, ouvriers d'abattoirs et d'quarrissage, bouchers, tanneurs, dockers. En dehors de cet aspect professionnel, il peut survenir une contamination accidentelle (ingestion de viande provenant d'animaux malades). VII - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE II est souvent orient par l'pidmiologie : rgion (animaux) ou profession (homme). A - Prlvements 1. Animal - Fragments d'organes, - Os long, - Os broys, aliments composs, peaux,...
2. Homme

- Prlvement de lsion ou de pustule, - Sang.LCR... B - Examens bactriologiques 1. Frottis de sang ou d'organe Prsence de bacilles volumineux, en petites chanes. A la coloration de Gram, B. anthracis apparat comme de grands bacilles, bouts

142____________________________________Section m - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

plats (3-5 u.m / 1-1,25 u.m). Il apparat comme de courtes chanettes dans les chantillons biologiques. Les spores sont rarement prsentes.
9

2. Culture al Prlvement monomicrobien Milieux usuels (bouillons d'hmoculture, glose au sang...) bl Prlvement polymicrobien Avec des prlvements polymicrobiens (ex. aliments composs...) on slectionne les spores de B. anthracis par chauffage 80C, 5 mn avant l'ensemencement. Milieux slectifs - Milieu de Pearce et Powell : glose nutritive 40 u.g/ml d'hmatine et 60 u.g/ml de lysozyme, incube 40C. - Milieu de Knisely : glose l'extrait de coeur 30 U/ml de polymyxine, ^40 u.g/ml de lysozyme, 300 u.g/ml d'EDTA et 40 u.g/ml d'actate de thallium. En culture, les chanes sont plus longues (cannes de bambous). Prsence d'une spore centrale subterminale non dformante. Sur glose au sang, on observe des colonies non hmolytiques. Les colonies sont du type R sur glose au sang, TSA ou glose nutritive, en forme de tte de mduse . Elles sont non-capsules. La sub-culture doit tre faite sur un milieu contenant 0,5 % de bicarbonate de sodium et incube dans 5 % de CO^. Les souches virulentes produisent alors une capsule, et les colonies deviennent muqueuses. Cette formation de capsule est favorise par addition au milieu de 0,7 % de srum-albumine bovine. Des anticorps fluorescents peuvent tre utiliss pour dtecter les bacilles encapsuls directement dans les tissus, sur les cultures, ou sur un frottis sanguin. (Les anticorps monoclonaux et polyclonaux anti-capsule sont disponibles au CDC). On peut identifier directement les colonies de B. anthracis sur la glose. Un anticorps anti-toxine (Facteur II) est dpos dans un puits 5 mm d'une colonie suspecte. Aprs une nuit 4C on observe une bande de prcipitation entre la colonie et l'immunsrum. B. anthracis peut galement tre identifi l'aide de galeries d'identification miniaturises prtes l'emploi. C - Diagnostic diffrentiel avec les autres Bacillus 1. L'un des lments de base est le caractre de mobilit. B. cereus et B. thuringiensis sont mobiles. B. anthracis est immobile. 2. B. anthracis est sensible la pnicilline, pas les autres Bacillus 3. La vitesse d'hydrolyse du para-nitro-phnyl-glucopyranoside ou maltoside par B. anthracis est augmente par la prsence dans le milieu de 1 % de Triton X-100, alors qu'elle est retarde pour B. cereus, B. mycoides ou B. thuringiensis. 4. La sensibilit au bactriophage gamma Seul B. anthracis y est sensible. Le diagnostic diffrentiel entre B. anthracis et B. cereus peut tre complt par les caractres suivants :

ChapilieX-fiacifli______________________________________________________143

TABLEAU 1

Mobilit
Capsule (in vivo) Colonies sur glose-srum Glatine Lait toumesol Lcithinase Hmolyse Salicine Pnicilline Sensibilit aux phages Dose ltale pour le cobaye

B. anthracis + S
digestion lente coagulation lente -ou - ou lentement + sensible AetAC faible dose suffisante

B. cereus
+
R digestion rapide coagulation rapide +++ +++ rapidement + rsistant ACetC forte dose ncessaire

E - Inoculation l'animal Le pouvoir pathogne exprimental est prcieux pour apporter un diagnostic de certitude. On utilise le cobaye (600 g), dont on rase les flancs et sur lesquels on fait des scarifications. Le prlvement (polymicrobien, c'est dire : aliments composs, morceau de cadavre,...) est alors dpos sur la peau. Lorsque le prlvement est monomicrobien (tude d'une souche), l'injection se fait par voie sous-cutane. L'animal meurt dans une attitude naturelle, on recherchera le bacille du charbon sur des frottis d'organes (rate). F - Diagnostic indirect 1. Raction d'Ascoli On rvle les antignes polysaccharidiques thermostables de B. anthracis dans un prlvement par une raction de prcipitation avec un srum anti-charbonneux. Technique : Le fragment d'organe est broy au mortier avec 5 10 fois son poids d'eau physiologique, chauff 100C pendant 5 minutes et filtr. Dans un capillaire on dpose du srum anti-charbonneux, puis le filtrat sans mlanger. Un prcipit se forme l'interface lorsque la raction est positive. 2. Recherche d'anticorps anti-Bacillus Chez les convalescents du charbon par prcipitation ou fixation du complment

3. Allergie
On peut mettre en vidence un tat d'allergie B. anthracis par injection intra-dermique de 0,1 ml d'anthraxine . On observe une raction locale au bout de 24 heures. VIII - TRAITEMENT Animal : pnicilline Homme : pnicilline + srothrapie dans les cas graves. Les rsistances la pnicilline sont exceptionnelles. Streptomycine et ttracyclines ont t proposes. En cas d'oedme malin ou de "charbon interne" la pnicilline G doit tre administre fortes doses (20 millions UI/j chez l'adulte).

144

Section H! - BACILLES GRAM POSITIF AROBIES

IX - PROPHYLAXIE A - Prophylaxie sanitaire Elle est difficile et illusoire en raison de la persistance des spores dans les terres pollues. On peut simplement essayer de ne pas crer de nouvelles zones dangereuses en surveillant les importations d'animaux et de produits d'origine animale en provenance de pays ou de rgions infects, ou en les traitant par diffrentes techniques (chaleur, rayons gamma, sulfure de sodium). En rgion infecte, on doit dtruire les cadavres d'animaux charbonneux par incinration ou enfouissement dans des fosses contenant de la chaux vive. La prophylaxie de la maladie humaine est lie celle de la maladie animale. ^ B - Prophylaxie mdicale Chez l'animal, la prophylaxie du charbon repose sur l'injection annuelle d'une suspension de spores d'une souche attnue non-capsule de B. anthracis en prsence d'adjuvant. Chez l'homme, les essais de vaccination n'ont pas dpass le stade exprimental. Le succs de la lutte contre le charbon animal repose sur une vaccination rgulirement applique aux espces sensibles en zone pollue, associe des mesures sanitaires de destruction des cadavres en cas d'apparition de la maladie. Cette maladie figure en France dans la liste des maladies animales rputes contagieuses et dans la liste des maladies professionnelles indemnisables pour les professions exposes.

BACILLUS CEREUS GENERALITES


Bacillus cereus appartient au Groupe 1 du genre Bacillus. Gram (+), aro-anarobie facultatif, mobile (), nitrate (+), catalase (+), mannitol (-) (cf. B. anthracis). Il cultive entre 10 et 45C avec un optimum 30-35C (voir caractres gnraux du genre Bacillus). Ce germe est largement rpandu dans la nature, dans l'air et le sol, il peut contaminer les aliments par ses spores. B. cereus est responsable d'intoxications alimentaires aprs prolifration massive du germe dans un aliment contamin. Deux types d'intoxication sont dcrits : - Le premier type, correspondant la production d'entrotoxine in vivo, ressemble une toxi-infection due Clostridium perfringens : aprs une incubation de 8 16 h, il apparat une diarrhe profuse, accompagne de douleurs abdominales, de nauses. Les symptmes rgressent en 24 h. - Le deuxime syndrome, correspondant l'ingestion d'entrotoxine prforme dans l'aliment, est caractris par des vomissements trs violents : l'incubation peut tre courte (30 mn 5 h). La rgression des signes cliniques est galement rapide.

Chapitre X - Bacillus

145

I - TOXINES ET ENZYMES SCRTES B. cereus produit des toxines et des enzymes varies, des hmolysines dont l'une d'elle est la crolysine, des protases, des phospholipases. Les enzymes expliquent le caractre fulminant de certaines infections occulaires dues B. cereus. B. cereus produit galement des toxines plus spcifiques quant leur action sur le tube digestif. A - Une entrotoxine protique de 50 kDa, encore appele toxine diarrhigne . Cette toxine agit directement sur le tractus digestif. Elle modifie la permabilit vasculaire et provoque une accumulation liquidienne dans la lumire intestinale. Elle possde une action ncrotique et une action cytotoxique. Elle est antignique et thermolabile. B - Une toxine, encore appele toxine mtisante de 5 kDa Elle n'est pas antignique et thermostable. Sa production serait caractristique de certaines souches, lie au stade de la sporulation et non produite au del de 40C. II - RISQUES D'ORIGINE ALIMENTAIRE A - Les sources de germes B. cereus est un saprophyte de l'homme et de l'animal. Il est frquent dans le sol, sur les vgtaux, les pies, les crales (particulirement le riz). B - Aliments incrimins De nombreux aliments peuvent tre l'origine des intoxications : viandes, lgumes crus ou cuits, prparations base de viande et de vgtaux, pasta, sauces (sauces tomates instantanes), soupes, laits, crme la vanille, pures de pomme de terre dshydrates (consommes aprs une conservation plus ou moins longue). Dans le cas de syndromes diarrhiques, les taux de contamination des aliments par B. cereus sont voisins de 107 109 germes/gramme. Cette multiplication des germes est due des conditions de conservation inadaptes. Le riz prpar l'avance, rchauff une temprature trop basse pour tuer les spores, aprs une priode de conservation temprature ambiante pouvant atteindre 2 3 jours est considr comme l'aliment caractristique l'origine de vomissements (saison chaude, cuisine orientale). A noter qu'en France, sur 611 pisodes d'intoxications alimentaires identifis en 1989, B. cereus n'a t identifi qu'une fois, mais sa place dans cette pathologie est srement sous estime. Elle reprsente nanmoins 5 % des cas d'intoxications alimentaires aux USA. III - DIAGNOSTIC L'isolement de B. cereus dans les selles n'est pas suffisant. Le diagnostic bactriologique est bas sur la numration des germes dans l'aliment et sur l'identification de l'espce B. cereus.

146

Section III - BACILLES A GRAM POSITIF AROBIES

Les milieux de dnombrement et d'isolement utilisent les proprits les plus caractristiques de la bactrie : proprits hmolytiques, prsence d'une glatinase, d'une lcithinase, rsistance la polymyxine, absence d'action sur le mannitol. Ces proprits sont utilises conjointement dans un milieu base de jaune d'uf, de mannitol et de polymyxine. Ces preuves suffisent pour un diagnostic prsomptif. La confirmation de B. cereus doit tre faite par d'autres caractres : mobilit du germe, l'hmolyse (alpha ou bta), et la rsistance la pnicilline (B. anthracis est sensible la pnicilline). B. cereus est diffrenci de B. mycoides par des tests d'agglutination de lectines : B. cereus n'est agglutinable que par les lectines de soja, alors que B. mycoides est galement agglutin par des lectines d'Hlix pomatia. Enfin une classification srologique, base sur la spcificit des antignes flagellaires permet de mettre en vidence la prdominance de certains srotypes dans les cas d'intoxication, le srovar 1 est le plus souvent isol, sans doute en raison de sa plus grande rsistance la chaleur. IV - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE Un traitement n'est pas justifi, tout au plus un anti-mtique peut tre ncessaire. La prophylaxie de cette intoxication est d'une part un problme d'hygine alimentaire collective o l'utilisation de produits dshydrats se dveloppe (cuisines, restaurants) et d'autre part d'hygine industrielle dans le domaine agro-alimentaire.

BACILLUS OPPORTUNISTES
D'autres espces de Bacillus peuvent parfois jouer le rle de germes opportunistes et on sait que durant ces dernires annes, une augmentation significative des infections nosocomiales a t constate. Traditionnellement, dans un laboratoire de bactriologie, ces Bacillus taient, peut-tre htivement, assimils des contaminants de la peau ou de l'air. Actuellement, on est parfois amen leur accorder de l'importance dans une large varit d'infections (Tableau III) o cependant il faut bien prciser le terrain (immunodprims, cancers) et faire la preuve de la responsabilit du Bacillus, en particulier lors d'isolements rpts dans un produit normalement strile. Ont t impliqus dans diverses manifestations : B. brevis, B. circulons, B. macerans, B. licheniformis, B. coagulons, B. pumilus, B. sphaericus, B. thuringiensis, B. subtilis. Rcemment des auteurs amricains ont tout particulirement insist sur la progression des endophtalmies Bacillus (B. cereus, B. subtilis...).

Chapitre X-Bacillus__________________________________________________________147

TABLEAU n DIAGNOSTIC DIFFRENTIEL DE QUELQUES BACILLUS________ B. cereus B. licheniformis B. megaterium B. subtilis Mobilit Anarobiose Gaz en glucose Hydrolyse de l'amidon VP N03-> Nui Croissance en 7 % NaCl Culture 50C Lcithinase
V = variable

V + + + + + +

+ + + + + + + + -

+ V
+

+ +

+ +
+

TABLEAU m TABLEAUX CLINIQUES IMPUTABLES AUX "BACILLUS OPPORTUNISTES" Espce


B. alvei
B. brevis

Manifestations cliniques septicmie, mningite ulcre de corne bactrimie, pneumonie, ostomylite, endocardite, endophtalmie mningite abcs du cerveau septicmie bactrimie mningite, septicmie mningite, bactrimie pritonite, pleursie, pricardite, mningite, bactrimie mningite, otite, mastodite, infection urinaire, bactrimie, pneumonie, endocardite, abcs de l'orbite, panophtalmie, kratire, iridocyclite ulcre de corne

B. cereus

B. circulons B. coagulons B. laterosporus B. licheniformis B. megaterium B. pumilus B. sphaericus B. subtilis B. thuringiensis

BIBLIOGRAPHIE
BERKELEY R.C.W., LOGAN N.A., SHUTE L.A. and CAPEY A.G., Identification ofBacillus species , in Methods in Microbiology, T. Bergan d., 1984, vol. 16, Acadmie Press, London, pp. 292-328. DONNIO P.Y., LE DEAUT P., SCHUTTLER C., AVRIL J.L., Caractrisation et signification clinique des souches de Bacillus isoles par hmocultures , Md. Mal. Infect., 1987,13, 110-112. DOYLE R.J., KELLER K.F., EZZELL J.W., Bacillus , m Manual ofClinical Microbiology, E. H. Lennette and coll. eds, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1985, pp. 211-215. TOMA B., Bacillus , in Bactriologie Mdicale, L. Le Minor et M. Vron eds., 1989, Flammarion Mdecine Sciences, Paris, pp. 879-886.

SECTION IV ENTEROBACTERIACEAE

GENERALITES SUR LES ENTEROBACTERIACEAE


1 - CLASSIFICATION ET DFINITION La famille des Enterobacteriaceae est constitue de genres bactriens qui sont rassembls en raison de leurs caractres bactriologiques communs. - Ce sont des bacilles Gram ngatif dont les dimensions varient de 1 6 [im de long et 0,3 1 u-m de large ; - Mobiles par une ciliature pritriche ou immobiles ; - Se dveloppant en aro-anarobiose et sur glose nutritive ordinaire ; - Acidifiant le glucose par voie fermentative ( la diffrence des Pseudomonas) avec souvent production de gaz ; - Ne possdant pas d'oxydase ( la diffrence des Vibno et Pasteurella) ; - Rduisant les nitrates en nitrites. Les Enterobacteriaceae ont un G + C % du DNA compris entre 38 et 60 mol %. Les travaux de taxonomie gntique bass sur l'hybridation de DNA ont entran la distinction rcente de nouveaux genres et de nouvelles espces dont beaucoup n'ont pas de pouvoir pathogne dfini. Voici les genres dcrits dans la famille des Enterobacteriaceae : Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Moellerella, Koserella, Leclercia, Morganella, Obesumbactenum, Proteus, Providencia, Rahnella, Salmonella, Serratia, Shigella, Tatumella, Xenorhabdus, Yersinia, Yokenella. Seuls les genres et les espces qui ont un intrt mdical reconnu seront envisags plus loin. Une centaine d'espces d'Enterobactenaceae sont individualises, mais 23 d'entre elles reprsentent 99 % des souches isoles en clinique.

150

Section IV-ENTEROBACTERIACEAE

II - HABITAT ET POUVOIR PATHOGNE Parmi les nombreuses espces d'Enterobacteriaceae certaines sont trouves dans l'environnement, d'autres chez les vgtaux ou les animaux. Il en est qui ont un pouvoir phyto-pathogne. Parmi les espces qui peuvent tre isoles chez l'homme, certaines (Shigelld) sont constamment pathognes. D'autres espces se comportent comme des bactries pathognes opportunistes responsables d'infections chez des malades fragiliss. Leur identification est une part importante du travail du laboratoire de bactriologie. III - CARACTRES CULTURAUX Les Enterobacteriaceae se dveloppent bien dans un bouillon ou sur une glose ordinaire incubs 18 heures 37C. - Les formes S (smooth) sont l'aspect habituel au sortir de l'organisme. Les colonies sont lisses, bombes, brillantes et humides, elles ont 2 4 mm de diamtre. Le bouillon est trouble de faon homogne. - Les formes R (rough) s'observent surtout avec des souches ayant subi plusieurs repiquages. Les colonies sont rugueuses, sches, contours irrguliers et de teinte mate. En bouillon, les formes R donnent un aspect grumeleux. - Les colonies muqueuses sont habituelles avec les Klebsiella. Leur diamtre peut dpasser 10 mm ; elles ont une tendance la confluence. On peut les rencontrer aussi avec d'autres espces, notamment Salmonella paratyphi B. - Les colonies naines s'observent avec des souches dficientes dans certaines de leurs chanes mtaboliques. Elles ne sont pas exceptionnelles chez les Escherichia coli isols d'infections urinaires. IV - CARACTRES ANTIGNIQUES L'identification des Enterobacteriaceae se fait par l'tude des caractres biochimiques. La dtermination du srotype ne peut tre entreprise que pour des souches dont l'identification est certaine. Toute autre faon de faire ne peut qu'entraner des agglutinations croises non spcifiques. - Les antignes 0 Ce sont des antignes de paroi constitus de lipo-polysaccharides (LPS) qui sont thermostables et rsistent l'alcool ou l'acide.

SCHMA situant les antignes 0, H et Vi chez les Entrobactries

Gnralits sur les Enterobacteriaceae

151

Les ractions d'agglutination o ils interviennent se produisent lentement, sont constitues d'agglutinats granulaires, difficilement dissociables par agitation. La spcificit 0 est perdue par les souches R qui sont auto-agglutinables en eau distille. - Les antignes H Ce sont des antignes flagellaires qui ne sont donc prsents que chez les souches mobiles. Constitus d'une protine, la flagelline, ils sont thermolabiles et inactivs par l'alcool. Les ractions d'agglutination o ils interviennent se produisent rapidement, sont constitues d'agglutinats floconneux, facilement dissociables par agitation. - Les antignes K Ces antignes capsulaires sont gnralement constitus d'une couche externe polysaccharidique. Parmi les antignes K, se trouvent les antignes L, A, B des E. coli et l'antigne Vi de certaines Salmonella ou Citrobacter. Ces antignes rendent la souche qui les possde inagglutinable par les antisrums 0. Ils sont dtruits par une bullition de deux heures. Les antignes d'adhrence ou adhsines, de nature protique, en relation avec la prsence de pili sont classs parmi les antignes K (K88, K99). - Antigne Kunin Cet antigne commun aux Enterobacteriaceae n'est pratiquement retrouv que dans cette famille et a un intrt taxonomique. Des antisrums dirigs spcifiquement contre chacun des antignes bactriens sont prpars en utilisant la mthode de l'absorption spcifique des anticorps de Castellani. Des anticorps qui se sont fixs sur l'antigne bactrien correspondant forment des agglutinais. Aprs centrifugation, il ne reste plus dans le surnageant que les anticorps qui n'ont pas t en contact avec l'antigne.

BIBLIOGRAPHIE
FARMER III, J.J., DAVIS B.R., HICKMAN-BRENNER F. W., et al., Biochemical identification of new and species biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical spcimens , J . Clin. Microbiol., 1985, 21, 46-76. IZARD D., HUSSON M.O., VINCENT P., LECLERC H., Mthodes rapides et automatiques d'identification des Entrobactries , Ann. Biol. Clin., 1983, 41, 419-426. RICHARD C., Techniques de recherche d'enzymes utiles au diagnostic des bactries Gram ngatif , Ann. Biol. Clin. 1978, 36, 407-424. RICHARD C., Nouvelles espces de Enterobacteriaceae ,Bull. Inst. Pasteur, 1984, 82,
205-277.

RICHARD C., Entrobactries rares et inhabituelles , Bulletin de l'Ass. Ane. El. Inst. Pasteur, 1990, 124, 17-25.

Chapitre XI ESCHERICHIA COLI

Isole pour la premire fois par Escherich en 1885, Escherichia coli est l'espce bactrienne qui a t la plus tudie par les fondamentalistes pour des travaux de physiologie et de gntique. Cette bactrie est connue depuis longtemps comme commensale du tube digestif et pathogne pour l'appareil urinaire. Au cours des dernires dcennies, le rle de certaines catgories de E. coli dans les syndromes diarrhiques a t prcis et les mcanismes de ce pouvoir pathogne ont t analyss. 1 - HABITAT E. coli est une espce commensale du tube digestif de l'homme et des animaux. Dans l'intestin, E. coli est l'espce arobie quantitativement la plus importante, prsente raison de 10^ 109 corps bactriens par gramme de selles. Cette population bactrienne ne reprsente qu'environ 1 %o de celle des anarobies (voir encadr sur la flore du tube digestif). La recherche de E. coli dans l'eau d'alimentation (colimtrie) est faite pour apprcier sa potabilit. La prsence de E. coli dans l'eau est le tmoin d'une contamination fcale rcente et la rend impropre la consommation. II - POUVOIR PATHOGNE A - Pouvoir pathogne pour l'homme 1. Infections intestinales L'existence de diarrhes E. coli est connue depuis 1940. Ces diarrhes sont dues des souches de srotypes particuliers qui provoquent soit des cas sporadiques, soit des petites pidmies. Les diffrents syndromes cliniques sont dus des E. coli diffrents dont nous prciserons plus loin le support de la virulence. On reconnat aujourd'hui 4 types de souches responsables de diarrhes :

Chapitre XI - Escherichia coli

_____

________ ________

153

al Les souches entropathognes ou "Entero-Pathogenic E. coli" (E.P.E.C.). Elles taient responsables, dans les annes 50, de diarrhes infantiles graves ou toxicoses survenant par pidmies dans des crches ou des maternits. Ces souches encore appeles E. coli G.E.I. (des gastro-entrites infantiles) sont plus rarement rencontres aujourd'hui, elles sont alors isoles de cas sporadiques. Elles appartiennent des srotypes particuliers : O U I , 026, 055, 086, 0125, 0119, 0127, 0126,0128 et, plus rarement en Europe, 0124,0114 et 0142. bl Les souches entrotoxinognes ou "Entero-Toxigenic E. coli" (E.T.E.C). Elles sont responsables de diarrhes trs liquides survenant dans les pays en dveloppement. Ces diarrhes s'observent principalement chez les voyageurs (Turista). Elles sont souvent pidmiques chez les enfants de ces pays.
cl Les souches entro-invasives ou "Entero-Invasive E. coli "(E.I.E.C.)

Elles sont isoles de syndromes dysentriques tant chez l'adulte que chez l'enfant. La prsence de leucocytes dans les selles est le tmoignage du processus invasif. dl Les souches entro-hmorragiques ou "Entero-Hemorrhagic-Colitis E. coli "(E.H.E.C.). Ces souches ont t dcrites en Amrique du Nord o elles ont t responsables d'pidmies de diarrhe aqueuse puis hmorragique. Elles appartiennent un srotype particulier 0157. Un produit alimentaire contamin peut tre l'origine de la diffusion de l'pidmie. Ces souches sont aussi responsables du syndrome hmolytique-urmique.
TABLEAU 1 PROPRITS DES E. COL/RESPONSABLES DE DIARRHES
E.COU
DIARRHE CIBLE SROTYPES ENTROPATHOGNES ENTROHMORRAGIQUES ENTROTOXIQUES EPEC EHEC ETEC aigu et chronique enfants moins de 1 an 026,055,086,0111, 0114*, 019, 0125, 0126,0127,0128, 0142* adhrence dysentrique ? OUI 55-72 Md sanglante intox, alimentaire 0157 liquide enfants et voyageurs 06, 08, 015, 020, 025, 027,063, 078, 080, 085,0115,0128, 0148,0159 attachement LT/ST OUI ENTROINVASIFS EC dysentrique adultes et intox, alun. 028,0112,0124,0136 0143,0144, 0147, 0152, 0164 envahissement dysentrique OUI 140Md

MCANISME TOXINES PLASM1DE TAILLE

dysentrique OUI 30-75 Md

pas invasif

2. Infections extra-intestinales a/ Infections urinaires La majorit des infections urinaires de la femme jeune observes en pratique mdicale de ville est due E. coli. Les souches provenant de la flore fcale contaminent les urines par voie ascendante. C'est la classique colibacillose . cl Mningites no-natales Un tiers d'entre elles sont dues E. coli. La plupart des souches en cause possdent un antigne polysaccharidique de type Kl dont la composition est proche de l'antigne capsulaire de N. meningitidis de type B.

154

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

dl Suppurations diverses Les E. coli de la flore fcale peuvent tre en cause dans des pritonites, des cholcystites, des salpingites et des suppurations post-opratoires. Toutes ces infections, si elles sont insuffisamment traites, peuvent tre l'origine de septicmies. B - Pouvoir pathogne pour l'animal Certaines souches de E. coli productrices de toxines ou possdant des proprits invasives sont particulirement pathognes pour les animaux et provoquent des diarrhes chez les veaux ou les porcelets. Ces diarrhes sont, par leur frquence et la mortalit qu'elles entranent, causes de pertes conomiques importantes. III - PHYSIOPATHOLOGIE Au cours des dernires dcennies, des progrs importants ont t faits dans la comprhension des mcanismes contribuant la virulence de certaines catgories de E. coli. A - E.T.E.C. Pour tre pathognes, ces souches doivent la fois possder des adhsines et produire des entrotoxines. 1. Les adhsines ou antignes d'adhsion Ce sont des structures filamenteuses (appelees pili oufimbriae) de nature protique, qui entourent les corps bactriens la manire d'une fourrure. Elles permettent aux bactries d'adhrer spcifiquement aux bordures en brosse des entrocytes de la partie haute de l'intestin grle. Les souches qui les possdent peuvent alors s'y maintenir malgr les mouvements pristaltiques. Ces adhsines confrent aux bactries la proprit d'hmagglutiner les globules rouges. Cette hmagglutination est mannose-rsistante ; elle persiste en prsence de mannose contrairement celle due aux pili communs. Les adhsines sont antigniques. Au moyen d'immun-srums on peut en distinguer plusieurs types : - CFA/I, CFA/II et CFA/III (Colonization Factor Antigen) ont t dcrits chez des souches responsables de diarrhes souvent cholriformes. - K 88 est prsent chez des souches responsables de diarrhes du porcelet. - K 99 est trouv chez des souches de diarrhes du veau ou de l'agneau. Ces diffrentes adhsines sont codes par des plasmides transfrables qui peuvent porter simultanment les gnes codant la production d'entrotoxines. 2. Les entrotoxines' Les souches d'E.T.E.C.peuvent produire deux types d'entrotoxines mises en vidence par leur pouvoir de dilater l'anse de lapin ligature , par l'accumulation de liquide qu'elles provoquent lorsqu'elles sont injectes dans l'intestin grle. - L'entrotoxine LT, thermolabile C'est une protine, inactive par un chauffage 60C. Elle est mise en vidence par son pouvoir cytopathogne sur les cellules Y 1 de surrnale de souris ou sur les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO).

Chapitre XI - EKherichia coli__________________________________________________155

Sa structure et son mcanisme d'action sont trs voisins de ceux de la toxine de Vibrio cholerae. La sous-unit A-[ stimule l'adnylate-cyclase en augmentant la concentration d'AMP cyclique des entrocytes. La sous-unit B est responsable de sa fixation qui lve la concentration d'AMP cyclique intra-entrocytaire un rcepteur membranaire, le ganglioside Gml. - L'entrotoxine ST, thermostable Elle est moins bien connue et plusieurs formes de l'entrotoxine ST existent. Elle est mise en vidence par l'accumulation de liquide aprs injection dans l'estomac du souriceau nouveau-n (test de Dean). Elle stimule l'activit guanylate-cyclase en augmentant le GMP cyclique des entrocytes. En fonction des plasmides qu'elles hbergent, les souches d'E.T.E.C.produisent, soit l'une, soit les deux entrotoxines. La diarrhe est plus intense avec les souches qui produisent la fois LT et ST qu'avec celles qui produisent uniquement ST.
TABLEAUn PROPRITS DE LA TOXINE CHOLRIQUE ET DES TOXINES LT ET ST DES ESCHERICHIA COU
Proprits Poids molculaire Sous-units Rcepteur cellulaire Mcanisme d'action Immunognicit Mise en vidence Dterminisme V. cholerae 01 83000 AetB ganglioside GM 1 active l'adnylate-cyclase proche de LT Modles animaux, cultures de cellules et proprits immunologiques Chromosomique ETEC LT ST 86000 1 500 5 000 AetB non identifis non identifi ganglioside GM 1 active l'adnylate-cyclase active la guanylate-cyclase proche de la toxine cholrique non antignique Modles animaux, cultures Modles animaux seuls de cellules et proprits immunologiques Plasmidique Plasmidique

E.I.K.C.

Ces souches pntrent dans les cellules de la muqueuse intestinale o elles provoquent des ulcrations et des micro-abcs. Le pouvoir invasif de ces souches peut tre mis en vidence soit par le test de Srny (krato-conjonctivite aprs instillation d'une suspension bactrienne dans l'il d'un cobaye), soit par leur aptitude pntrer dans des cellules HeLa en culture. C - E.P.E.C. Le mcanisme de leur pouvoir pathogne est mal connu. Ces souches ne produisent gnralement ni entrotoxines ST, ni LT. Elles sont capables d'adhrer aux entrocytes par des mcanismes qui restent prciser. Elles possdent une toxine dsigne comme Verotoxine (VT) parce qu'un surnageant d'une culture produit un effet cytotoxique irrversible sur des cellules Vero en culture. Les souches de E.H.E.C. produisent galement une toxine VT, dont le rle n'est pas clairement tabli. D - Souches d'infections urinaires Les souches responsables d'infections urinaires, en particulier celles isoles de pylonphrites, possdent des facteurs de virulence particuliers. La prsence de fimbriae (de type P, de type 1), de certains antignes 0, de polysaccharides capsulaires (antignes Kl), la production d'hmolysine, d'arobactine, et la rsistance au pouvoir bactricide du srum (par le complment) sont les facteurs principaux.

156

Section IV-ENTEROBACTERIACEAE

IV - CARACTRISATION D'UNE SOUCHE DE E. COLI E. coli possde tous les caractres dcrits plus haut comme tant communs aux Enterobacteriaceae. Cette espce est le plus souvent mobile.

A - Caractres culturaux et mtaboliques E. coli se dveloppe en 24 heures 37C sur les milieux gloses en donnant de colonies rondes, lisses, bords rguliers, de 2 3 mm de diamtre, non pigmentes. Sur les milieux lactoses, les colonies sont gnralement lactose positif. Sur glose au sang elles peuvent tre hmolytiques. Les principaux caractres positifs sont : - indole (+) (exceptions) - ONPG (+) (exceptions) - mannitol (+) Les caractres suivants sont positifs de faon moins constante : mobilit, LDC, ODC, sorbitol [les souches 0157:H7, E.H.E.C. sont le plus souvent sorbitol (-) et dcarboxylases (+)], production de gaz lors de l'attaque du glucose. Sont toujours ngatifs : inositol, ure, TDA, VP, glatinase, citrate de Simmons. Les souches de E. coli entro-invasives ont souvent une faible activit mtabolique. B - Diagnostic diffrentiel Trois autres espces de Escherichia sont rarement rencontres dans les prlvements. Ce sont : E. hermanii, E.fergusonii et E. vulneris. Les caractres ci-dessous permettent de distinguer les diffrents Escherichia. E. hermanii est sorbitol (-) comme E. coli 0157:H7 et possde une bta-lactamase comme les Klebsiella. E. coli
E. hermanii E. fergusonii E. vulneris
Indole + + + ODC
d + + -

Saccharose

d d -

Pigment jaune +

PGR d -

TTR + -

Des souches de E. coli la fois immobiles et agazognes, antrieurement dsignes comme Akalescens-Dispar, peuvent parfois poser des problmes d'identification avec les Shigella. La recherche de la lysine-dcarboxylase et le test au citrate de Christensen sont gnralement positifs avec les E. coli, alors qu'ils sont toujours ngatifs avec les Shigella.

ChapIleXI-E/ieric/iiacoil

__________________________________157

C - Caractres antigniques - Antignes 0, somatiques ou lipopolysaccharidique. Il existe environ 160 antignes 0 diffrents. Au moyen d'immun-srums spcifiques, il est possible de classer srologiquement les souches de E. coli dans les groupes 0. Cette srotypie est la seule tre utilise en routine pour reconnatre notamment les souches E.P.E.C.. - Antignes K, capsulaires, polysaccharidiques. Environ 70 antignes d'enveloppe diffrents ont t reconnus. Leur subdivision en antignes L, A et B semble devoir tre abandonne. La majorit des souches responsables de mningites possdent l'antigne K 1. De ces antignes capsulaires on rapproche les antignes protiques ou adhsines en rapport avec la prsence de pili permettant l'adhrence aux bordures en brosse (K 88, K 99). - Antignes H ou flagellaires, protiques. On en connat 52 types. Ils ne sont prsents que chez les souches mobiles. V - DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE D'UNE INFECTION A E. COU A - Infections intestinales Les selles doivent tre ensemences sur un milieu glose non inhibiteur pour E. coli : Drigalski, Mac Conkey, osine-bleu de mthylne. - E.P.E.C. Leur recherche ne se fait que chez les enfants de moins de 1 ou 2 ans. Leur prsence est sans signification chez les individus plus gs. Aprs 18 heures d'incubation 37C, cinq colonies suspectes d'tre un E. coli (lactose (+)) sont examines l'aide d'un srum nonavalent, contenant des anticorps dirigs contre les 9 srotypes les plus frquents en Europe. La recherche de l'agglutination peut tre faite en tube ou sur lame. Sur lame, pour tre positive une agglutination doit tre rapide et se faire en moins de 5 secondes. Une agglutination positive avec le srum nonavalent n'a qu'une valeur d'orientation et doit tre prcise en utilisant des srums monovalents. - E.T.E.C. Leur caractrisation, comme celle des E.I.E.C., n'est pas faite en routine. Elle est faite par des laboratoires spcialiss lorsque les donnes cliniques et pidmiologiques suggrent leur utilit. - La recherche des antignes d'adhsion CFA/I et CFA/II est faite l'aide d'antisrums spcifiques. - L'entrotoxine LT est recherche par inoculation d'un surnageant de culture sur des cellules Y 1 ou CHO. Diffrentes mthodes plus simples sont en cours d'valuation : agglutination de particules de latex sensibilises, immunoprcipitation en gel l'aide d'un antisrum de lapin (Biken-test). - L'entrotoxine ST est dtecte par inoculation intra-gastrique du surnageant au souriceau nouveau-n. - Le milieu de Mac Conkey au sorbitol permet la dtection des souches E. coli 0157:H7 qui en gnral n'attaquent pas le sorbitol. B - Infections urinaires La recherche de germes se fait sur des urines prleves au milieu du jet, ensemences immdiatement ou conserves dans des conditions appropries (+ 4C ou milieu de transport).

158

Section IV - NTEROBACTERIACEAE

La numration des bactries permet de distinguer une infection urinaire authentique (nombre de bactries suprieur 105 /ml) d'une contamination par des bactries urtrales lors de la miction (nombre de bactries infrieur K^/ml). Ici l'emploi d'une glose C.L.E.D (Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient) est recommand, car il vite l'envahissement de la culture par un ventuel Protons contaminant.

C - Autres infections
L'isolement d'un E. coli ne pose pas de problme technique particulier puisque cette bactrie se dveloppe bien sur les milieux usuels. VI - TRAITEMENT Infections intestinales Le traitement curatif d'une diarrhe aigu est avant tout un traitement symptomatique par la rhydratation. La diarrhe des voyageurs peut tre prvenue par des mesures d'hygine ou par la prise d'antibiotiques pour certains. Les fluoroquinolones ou le cotrimoxazole sont utiliss titre curatif. Autres infections Les souches de E. coli sont gnralement sensibles aux antibiotiques actifs sur les bacilles Gram ngatif : amino-pnicillines, cphalosporines, quinolones, aminosides, trimthoprime-sulfamthoxazole. Nanmoins cette sensibilit doit toujours tre vrifie par un antibiogramme.

BIBLIOGRAPHIE
EVANS D.J., EVANS D.G., Classification of pathogenic Escherichia coli according to serotype and th production of virulence factors, with spcial rfrence to colonization-factor antigens , Rev. Infect. Dis., 1983, 5, S692-S701. JALLAT C., AUBEL D., DARFEUILLE-MICHAUD A., JOLY B., Toxines et adhrence du colibacille dans les diarrhes, Med. Mal. Infect., 1991, 21, 556-561. JOHNSON J.R., Virulence factors in Escherichia coli urinary tract infection , Clin. Microbiol. Rev., 1991, 4, 80-128. GROSS R.J., ROWE B., Escherichia coli dian-hoeae , J . Hyg. Camb., 1985, 95, 531-550. 0RSKOV I., 0RSKOV F., Escherichia coli extra-intestinal infections , J . Hyg. Camb., 1985, 95, 551-575. SANSONETTI P.J., Escherichia coli entropathognes, donnes rcentes sur la virulence , Bull. Inst. Pasteur, 1985,83,5-18. A signaler : le numro spcial du mois de mars 1987 de la revue Mdecine et Maladies Infectieuses sur les colibacilles et leur pathologie.

Chapitre XI - Escherichia coli

159

ANNEXE
LA FLORE INTESTINALE NORMALE Dans la flore colique le nombre de bactries est d'environ 1010 bactries par gramme de contenu intestinal. La presque totalit de ces bactries sont des anarobies stricts : Eubacterium, Bacterodes, Peptococcus, Clostridium, ainsi qu'un grand nombre d'espces qui ne sont pas rpertories et sont dsignes comme E.O.S. (Extremely Oxygen Sensitive). Les bactries aro-anarobies ne reprsentent qu'environ 1 %o de la flore totale. Escherichia coli, l'espce prdominante parmi les Enterobacteriaceae, n'est prsente qu' raison de 107 corps bactriens par gramme. D'autres Enterobacteriaceae peuvent tre retrouves en quantit bien moindre : Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Serratia. Les autres espces bactriennes sont prsentes des taux de l'ordre de 103 bactries par gramme ou moins. Ce sont : les entrocoques, Staphylococcus aureus, P. aeruginosa. Quelques levures sont aussi prsentes. Deux vnements sont susceptibles de modifier cet quilibre complexe et d'entraner des troubles digestifs graves. Ce sont : 1. L'implantation dans l'intestin d'une espce bactrienne pathogne qui ne s'y trouve pas l'tat physiologique : Salmonella, S h i g e l l a , E. coli entrotoxinognes, Vibrio cholerae, etc... 2. La destruction par les antibiotiques de la majorit de la flore rsidente physiologique ; cela permet la prolifration de l'une des espces suivantes : S. aureus ou Clostridium difficile, P. aeruginosa...

Chapitre XII SHIGELLA

Les Shigella sont des Entrobactries responsables de la dysenterie bacillaire et de diarrhes qui constituent un problme majeur de sant publique dans les pays en voie de dveloppement. Elles sont caractrises par leur faible activit mtabolique et par leur parent gntique avec Escherichia coli (les GC % sont trs voisins). 1 CARACTRES BACTRIOLOGIQUES COMMUNS A TOUTES LES SHIGELLA

Outre les caractres gnraux des Enterobacteriaceae, les souches appartenant au genre Shigella ont toutes les caractres communs suivants : - Immobiles (bouillon en phase exponentielle). - Pas de culture sur milieu au citrate de Simmons. - Absence de LDC et de tryptophane-dsaminase. - Fermentation du glucose sans gaz (exceptions avec certains biotypes de S.flexneri 6 et S. boydii 13 et 14). - Jamais de production d'H^S. II - CARACTRES DE CHAQUE ESPCE Les quatre espces du genre Shigella se distinguent entre elles par des caractres biochimiques et des caractres antigniques, bass sur l'tude des antignes 0 polysaccharidiques. Les caractres essentiels sont indiqus dans le tableau I. - S. dysenteriae = sous-groupe A Cette espce est caractrise par l'absence de fermentation du mannitol. Il existe 10 srotypes. S. dysenteriae type 1 ou bacille de Shiga possde une bta-galactosidase trs active, est indole (-) et, fait rare chez les Enterobacteriaceae, ne possde pas de catalase. Le bacille de Shiga est l'agent des grandes pidmies historiques survenues dans les armes en campagne ou les camps de rfugis. - S.flexneri = sous-groupe B Cette espce comporte 6 srotypes et 2 variants.

Chapitre XII-augeflo______________________________________________________161

- S. boydii = sous-groupe C Cette espce comporte 15 srotypes. - S. sonnei = sous-groupe D II n'existe qu'un seul srotype. Cette espce se distingue des autres par la prsence d'une omithine-dcarboxylase et par le fait que les souches ne produisent jamais d'indole. On peut subdiviser cette espce en biotypes.
TABLEAU 1 CARACTRES DIFFRENTIELS DES DIFFRENTES ESPCES DE SHIGELLA

Test
Fermentation du Mannitol Indole ONPG ODC Srogroupe

5. dysenteriae'1 .b d A

S.flexneri + d B

S . boydii + d

d C

S . sonnei + + + D

a = le type 1 possde la particularit de ne pas avoir de catalase, ce qui est exceptionnel chez les Enterobacteriaceae b = caractre positif avec les types 2,7 et 8. d = caractre variable.

III - PHYSIOPATHOLOGIE

A - Shiga-toxine Connue depuis 1903 chez S. dysenteriae 1, elle est localise dans l'espace priplasmique de la bactrie et libre lors de la lyse de la bactrie. C'est une toxine protique de 70 kDa, code par des gnes chromosomiques, constitue d'une sous-unit A (32 kDa) et de 5 sous-units B (7,7 kDa). La sous-unit B est compose de 69 acides amins, identique la sous-unit B de la toxine Shiga-like, type 1 ou Vrotoxine de E. col). La structure multimrique de la Shiga-toxine est comparable celle de la toxine cholrique et de la toxine LT de E. coli, mais sans prsenter de communaut antignique. Les sous-units B sont responsables de la liaison aux rcepteurs cellulaires (glycolipidiques ou glycoprotiques). La sous-unit A, aprs coupure par une enzyme protolytique, est rduite en un fragment Al activit enzymatique qui est intemalis par endocytose. La cible est le ribosome, o par action sur EF1 (l'exotoxine A du B. pyocyanique et la toxine diphtrique agissent sur EF2) au niveau, de la sous-unit 60S, la toxine provoque une inhibition de l'longation de la chane peptidique et par consquent une inhibition des synthses protiques. La toxine exerce : - un effet paralytique et ltal aprs injection IV au lapin. L'action neurotoxique rsulte de troubles neurologiques secondaires des lsions des vaisseaux du cerveau et de la moelle pinire ; - une action entrotoxique, se traduisant par une accumulation liquidienne hmorragique ; - une action cytotoxique sur certaines cellules en culture (HeLa les plus sensibles, cellules KB, de rein de singe). Le rle de la toxine dans la virulence de la bactrie et dans la dysenterie n'est pas clairement tabli.

162

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

B - Vrotoxine

^Diffrentes espces bactriennes produisent une toxine caractrise par son pouvoir cytotoxique pour les cellules Vro. Cette toxine trs voisine de la Shiga-toxine a t trouve : - chez des souches de E. coli responsables du syndrome hmolytique et urmique (maladie de Moskowitz), de colite hmorragique et chez des souches entropathognes (ECEP). - chez d'autres espces bactriennes : 5. Typhimurium, V. cholerae, Vibrio non-01 et V. parahaemolyticus. C - Pouvoir entro-invasif Le pouvoir entro-invasif est en relation avec la prsence de plasmides communs aux diffrentes espces de Shigella et aux E. coli entro-invasifs (de 180 kb chez S. sonnei, de 220 kb chez S.flexneri). L'expression des gnes plasmidiques de virulence est sous le contrle de la temprature : le phnotype invasif est exprim 37C et est perdu de faon rversible 30C. Diffrentes protines sont responsables du pouvoir invasif. Le pouvoir entro-invasif est mis en vidence exprimentalement par : le test de Serny (krato-conjonctivite purulente dans les 48 h aprs instillation d'une suspension de bactries dans l'oeil du cobaye) - la pntration dans des cellules HeLa et la mort des cellules - coloration par le rouge Congo. Le lipopolysaccharide (LPS) participe la virulence des Shigella. La maladie humaine est la consquence de l'invasion de la muqueuse du clon. Les diffrentes tapes sont la pntration dans les cellules pithliales, la multiplication intra-cellulaire, et l'invasion des cellules voisines et du tissu conjonctif des villosits. Ceci entrane une forte raction inflammatoire provoquant abcs et ulcration du colon et l'apparition de sang et de mucus dans les selles. L'intestin grle n'est habituellement pas concern. L'infection est limite la muqueuse sans traverser la lamina propria. L'atteinte de la sous-muqueuse et la diffusion systmique sont exceptionnelles.

IV - PIDMIOLOGIE Le seul rservoir de Shigella est le tube digestif de l'homme. Ces bactries ne font pas partie de la flore normale du tube digestif. Elles sont prsentes dans les matires fcales des malades ou des porteurs sains (convalescents, entourage des malades). La shigellose est la plus transmissible des maladies bactriennes intestinales ; dix germes vivants peuvent provoquer la maladie chez un adulte sain. La dissmination de la maladie se fait par des aliments, de l'eau de boisson contamine par des matires fcales ou de personne personne. Les shigelloses surviennent l o les conditions d'hygine sont dfectueuses. Le lavage des mains et l'amlioration de l'approvisionnement en eau sont les mesures qui rduisent la transmission fcale-orale. En France, environ 1 000 souches sont reues annuellement par le Centre National des Shigella de l'Institut Pasteur. Le plus grand nombre de souches est reu en septembre-octobre. Cela s'explique par la temprature estivale et les retours de vacances en pays exotiques. S. sonnei est la plus souvent isole. S.flexneri vient ensuite. S. dysenteriae et S. boydii sont rarement isoles en France. On peut observer de petites pidmies chez des nourrissons ou des vieillards vivant en collectivit.

Chapitre XQ-Shigella

163

Dans les pays en voie de dveloppement, la shigellose endmique est due avant tout S.flexneri. Le taux de morbidit est lev. Les enfants de un cinq ans sont particulirement atteints. Dans certains pays, la mortalit est importante. Une pandmie de shigellose due 5. dysenteriae 1 a commenc en 1969 en Amrique Centrale. Elle englobe maintenant une large rgion d'Afrique centrale et les pays du sous-continent indien. La souche en cause est rsistante de nombreux antibiotiques. V - POUVOIR PATHOGNE Une shigellose commence habituellement par une diarrhe aqueuse suivie aprs 24 48 heures par l'apparition de sang et de mucus dans les selles. Il y a de la fivre, des douleurs abdominales et du tnesme. Une dshydratation est possible mais dans une faible proportion des cas. La mortalit, qui avec S. dysenteriae 1 peut dpasser 10 % des cas, malgr un traitement adapt, est due diffrentes complications : cachexie, tat pseudoleucmique, ilus paralytique, perforation intestinale, prolapsus rectal. La maladie est particulirement grave quand elle se dclare aprs la rougeole ou quand il existe une malnutrition pr-existante. Les localisations extra-digestives sont peu frquentes. Les moins rares sont les infections urinaires. On observe parfois des formes septicmiques, des arthrites, des mningites. VI - DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE A - Isolement de la bactrie C'est la seule faon de faire le diagnostic de certitude de shigellose. Coproculture : C'est la mthode de choix. Elle se fait en ensemenant des selles frachement mises et des glaires muqueuses si elles en contiennent. L'examen microscopique des selles met en vidence des polynuclaires qui sont tmoins d'un processus invasif. L'isolement de la bactrie se fait sur un milieu glose slectif non inhibiteur : Hektoen, Drigalski, Mac Conkey. Le milieu SS ne permet pas la croissance de certaines souches de Shigella. Il est donc dconseiller. Il n'existe pas de milieu d'enrichissement efficace pour les Shigella. Les colonies suspectes (lactose (-) et H^S (-)) sont l'objet d'une caractrisation plus complte. Il importe de faire le diagnostic diffrentiel entre les Shigella et les Akalescens-dispar qui sont des E. coli immobiles et ne produisant pas de gaz. Deux caractres, la LDC et la croissance sur milieu au citrate de Christensen, sont toujours ngatifs avec les Shigella alors qu'ils sont gnralement positifs avec les Akalescens-dispar . Autres examens : Hmocultures. Elles sont rarement pratiques, mais peuvent tre positives dans un faible pourcentage de cas. Urines. Elles permettent l'isolement de la bactrie dans les cystites ou pylites Shigella qui sont rares mais non exceptionnelles.

164

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

B - Srotypie ou typage srologique d'une souche Ce n'est qu'une fois le diagnostic de genre Shigella tabli avec certitude que le typage antignique peut tre entrepris par agglutination sur lame. Les srums agglutinants commercialiss sont :
1. Sous groupe A : 2 srums polyvalents Ce sous-groupe comporte 10 srotypes mannitol ngatifs, dont 2 sont exceptionnels (9 et 10). Srum Al : nnti-Shigella dysenteriae indole ngatives : 1, 3, 4, 5, 6. Srum A2 : smti-Shigella dysenteriae indole positives : 2, 7, 8. 2. Sous groupe B : 1 srum polyvalent, commercialis sous le nom de srum sm-flexneri. Il agglutine les 6 srotypes de ce sous-groupe 3. Sous-groupe C : 3 srums polyvalents - Cl : m-Shigella boydii indole ngatives : 1, 2, 3, 4. - C2 : smti-Shigella boydii indole ngatives : 8, 10, 14. - C3 : smti-Shigella boydii indole positives : 5, 7, 9, 11, 15. Le srotype 6, troitement apparent Shigella sonnet, phase II, est agglutin par le srum anti-Shigella sonnei. 4. Sous-groupe D '. 1 srum mixte : D, commercialis sous le nom de srum mixte anti-sonnei. Il agglutine les 2 phases de Shigella sonnei.

C - Srodiagnostic
J

II peut se faire par sro-agglutination, mais est dpourvu d'intrt dans les syndromes dysentriques car il est trop tardif et sa spcificit est ingale selon les sous-groupes. Il est parfois utile pour relier certains syndromes rhumatismaux une infection S.flexneri. Dans ces cas, il est souhaitable de prlever deux srums, deux semaines d'intervalle, pour observer une ascension du titre des agglutinines. VII - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES Les Shigella sont irrgulirement sensibles aux antibiotiques. L'ampicilline, les ttracyclines, la colistine, les sulfamides et le trimthoprime sont gnralement actifs. Cependant, rappelons que c'est au cours d'une pidmie de shigellose que les plasmides de rsistance multiple transfrable ont t dcouverts au Japon. Aussi, aujourd'hui, le traitement doit tre guid par les rsultats d'un antibiogramme. VIII - VACCINS CONTRE LES SHIGELLA Les vaccins injectables contenant des bactries tues ou les vaccins par voie orale base de bactries vivantes attnues sont sans efficacit. Par les techniques du gnie gntique, il a t possible d'analyser avec prcision les dterminants de la pathognicit et de l'immunognicit des Shigella. Des recherches sont en cours afin de produire un vaccin buccal vivant. Ces recherches se font dans les directions suivantes :

Chapitre Xa-Shyella

165

production d'hybrides mutants de Shigella attnus par incorporation de segments de gnes de E. coli ; production de E. coli contenant des gnes de Shigella ; utilisation de Salmonella Typhi attnues contenant des squences codantes de gnes pour la synthse d'antignes de Shigella.

BIBLIOGRAPHIE
CANTEY J.R., Shiga toxin, an expanding rle in th pathogenesis of infectious diseases , J . Infect. Dis., 1985,151, 766-771. FORMAL S.B., HALE T.L., SANSONETTI P.J., Invasive enteric pathogens , Rev. Infect. Dis., 1983, 5, S702-S707. MAURELLI A.T., SANSONETTI P.J., Genetic dterminants of Shigella pathogenicity , Ann. Rev. Microbiol., 1988, 42, 127-150. O'BRIEN A.D., HOLMES R.K., Shiga and Shiga-like toxins , Microbiol. Rev., 1987, 51,
206-220. J

RICHARD C., Les Shigelles hier et aujourd'hui , Bull. de l'Association des anciens lves de l'Institut Pasteur, 1990,125, 18-28.

Chapitre XIII SALMONELLA - CITROBACTER

HISTORIQUE
En 1820, Bretonneau montra la contagiosit de la fivre typhode qu'il appelait alors dothinentrite. _, En 1880, Eberth observa le premier le bacille dans les organes d'un malade mort de typhode. En 1884, Graffky russit la culture de ce bacille. En 1896, Widal montra que le srum de malades atteints de fivre typhode agglutinait des cultures du bacille d'Eberth. C'tait l le premier sro-diagnostic, technique dont on connat le succs ultrieur pour l'aide au diagnostic des maladies infectieuses. En 1930, Kauffmann et White dvelopprent une classification des bactries voisines du bacille d'Eberth base sur l'identification de leur antignes. En 1939, Reilly montra le rle du systme neuro-vgtatif dans la pathognie de la typhode.

1 - TAXONOMIE ET NOMENCLATURE Les travaux taxonomiques les plus rcents ont montr que le genre Salmonella ne comprend qu'une seule espce Salmonella enterica compose de 7 sous-espces qui correspondent aux anciens sous-genre I, II, III et IV de Kauffmann. La dnomination S. enterica a t prfre celle initialement propose de 5'. choleraesuis qui dsigne aussi un srovar. Les diffrentes sous-espces sont : sous-espce 1 sous-espce II sous-espce IIIa sous-espce IIIb sous-espce IV sous-espce V sous-espce VI Salmonella enterica subspecies enterica Salmonella enterica subspecies salamae Salmonella enterica subspecies arizonae Salmonella enterica subspecies diarizonae Salmonella enterica subspecies houtenae Salmonella enterica subspecies bongori Salmoenlla enterica subspecies indica

Ces sous-espces sont elles-mmes subdivises en srovars (ou srogroupes) sur la base des constituants antigniques (0, H et Vi). La sous-espce 1 reprsente plus de 99,5 % des souches isoles en pathologie. La dsignation des srovars qui antrieurement correspondaient des noms d'espce, en particulier ceux de la

Chapitre XIII - Salmonella Citrobacter

167

sous-espce I, avait t choisie selon le syndrome (5'. typhi), la spcificit d'hte (typhimurium, choleraesuis) puis sur l'origine gographique de la premire souche du nouveau srovar (dublin). Ces dnominations ont t conserves, mais l'criture en est modifie : la sous-espce n'est pas mentionne car tous les srovars sont de la sous-espce 1 et le nom dbute par une majuscule (Salmonella Typhimurium, S. Montevideo) et n'est plus crit en italique. Les srovars des autres sous-espces sont dsigns uniquement par leur formule antignique (S. salamae 1, 9, 12 : 1, w : e, n, x). En 1987, 2213 srovars : 1299 dans la sous-espce I, 445 dans la sous-espce II, 296 dans la IIIb, 91 dans la IIIa, 59 dans la IV, 14 dans la V et 9 dans la VI taient identifis. Les souches de la sous-espce 1 proviennent gnralement d'animaux sang chaud et cette sous-espce est pratiquement la seule avoir un intrt mdical. Les autres sous-espces sont gnralement isoles d'animaux sang froid ou de l'environnement. II - HABITAT ET PIDMIOLOGIE S. Typhi et S. Paratyphi A sont strictement adaptes l'homme. Il n'est pas possible de reproduire la fivre typhode chez l'animal par administration per os. La transmission de la fivre typhode d'homme homme se fait par l'intermdiaire d'eau ou d'aliments (coquillages) souills par des selles de malades ou de convalescents, porteurs sains. En France S. Typhi est plus souvent isole que S. Paratyphi. Il n'y a plus d'pidmies importantes mais des foyers localiss ; cependant on peut estimer plus d'un millier le nombre des cas observs dans une anne. L'augmentation du nombre de cas contracts dans les pays mditerranens est souligner. Il n'existe pas en France de cas autochtones de salmonelloses dus S. Paratyphi A. La contamination des malades se fait l'tranger. Les Salmonella autres sont avant tout des parasites du tube digestif de l'homme et des animaux. Les srotypes qui, contrairement aux prcdents n'ont pas de spcificit d'hte, sont dits ubiquitaires. Aprs la maladie, certains sujets restent porteurs sains et liminent pendant plusieurs mois des Salmonella dans leurs selles. Les Salmonella sont retrouves dans le milieu extrieur, dans les eaux d'gout en particulier. Des Salmonella sont aussi frquemment retrouves dans les farines de poisson ou poudres d'os utilises pour l'alimentation des animaux. La contamination de l'homme se fait par voie buccale. La frquence des infections Salmonella est en augmentation. Elle est favorise par le dveloppement des repas pris en collectivit o les aliments sont prpars bien avant d'tre consomms et dans lesquels les bactries peuvent se multiplier. S. Typhimurium est rencontre dans tous les pays. Elle est la plus souvent identifie au Centre National des Salmonella de l'Institut Pasteur. Elle est isole chez l'homme, chez les animaux et dans l'environnement. S. Typhimurium occupe la premire place dans l'tiologie des toxi-infections alimentaires. Pratiquement toutes les denres peuvent hberger quelques Salmonella ; mais les denrpes d'origine animale jouent le rle principal. Tout dfaut dans la conservation des aliments (ce qu'il est convenu d'appeler la chane du froid) permet la multiplication des quelques Salmonella ventuellement prsentes. L'ingestion de 106 bactries entrane une toxi-infection alimentaire. Certains srotypes, jusqu'alors exceptionnellement isols, peuvent avoir une diffusion pidmique importante. Ce fut le cas partir de 1972 pour S. Wien. En 1984, S. Goldcoast a prsent une "bouffe", conscutive la consommation de pt contamin. En 1985, S. Bovismorbificans a eu une diffusion importante en France. Depuis 1987, la frquence d'isolement de S. Enteritidis augmente fortement pour tre

168

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

en 1989 le deuxime srovar le plus frquemment isol chez l'homme. Cette flambe d'infection S. Enteritidis est proccupante et correspond dans la majorit des cas la consommation d'oeufs de poule. Les mesures de prvention doivent s'appliquer en aval, au niveau de l'utilisation des oeufs avec les prcautions habituelles concernant la chane du froid pour les prparations sans cuisson, mais surtout en amont, au niveau de la production des oeufs, complique par la transmission verticale (voie transovarienne) de l'infection S. Enteritidis (lysotype 33). Les 15 srovars les plus frquents, reprsentant 84 % des souches isoles chez l'homme sont indiqus dans le tableau II. III - POUVOIR PATHOGNE Les salmonelloses peuvent revtir trois aspects : A - Les formes septicmiques Ce sont les fivres typhodes et paratyphodes dues S. Typhi, S. Paratyphi A, B et rarement C. Ce sont des septicmies point de dpart lymphatique. Chez le nouveau-n ou le jeune enfant, d'autres srotypes comme S. Panama ou S. Wien peuvent tre responsables de septicmies qui mettent en jeu le pronostic vital. B - Les salmonelloses purement digestives Les toxi-infections alimentaires Salmonella se manifestent par des diarrhes, de la fivre, et des vomissements. Les premiers signes surviennent 8 10 heures aprs l'ingestion de l'aliment contamin. L'volution de ces gastro-entrites est en rgle gnrale spontanment favorable en quelques jours. Les entrites Salmonella s'observent principalement chez le jeune enfant. Des pidmies peuvent survenir dans des collectivits de nourrissons. La frquence des entrites Salmonella au cours du S.I.D.A. est noter. C - Les formes extra-digestives Elles sont plus rares ; infections urinaires, cholcystistes, mningites, ostomylites, spondylodiscites, infections pulmonaires. Ces formes surviennent plus volontiers chez des malades immuno-dprims. Les dficits enzymatiques des globules rouges et la drpanocytose sont des circonstances favorisantes. IV - PHYSIOPATHOLOGIE Au cours de la fivre typhode, les Salmonella ingres pntrent dans les cellules des plaques de Peyer et colonisent les ganglions lymphatiques intestinaux. Elles dissminent par voie sanguine, en ralisant une septicmie point de dpart lymphatique. Au cours de la maladie il est possible de trouver des Salmonella dans les urines. Les Salmonella peuvent se dvelopper dans la bile et survivre dans les canalicules et la vsicule biliaire o il est difficile de les radiquer. Leur persistance ce niveau entrane un tat de portage chronique. Une partie des corps bactriens en se lysant libre de l'endotoxine ou LPS qui atteint par voie sanguine les centres neuro-vgtatifs, ce qui entrane le tuphos et le collapsus cardio-vasculaire. En injectant exprimentalement des lapins de

Chapitre XIII - Salmonella - Citrobacter

169

l'endotoxine au voisinage du nerf splanchnique, Reilly a pu reproduire des lsions du tube digestif, montrant ainsi le rle du systme neuro-vgtatif. V - CARACTRES D'IDENTIFICATION

A - Caractres de la sous-espce 1
Les Salmonella ont les caractres morphologiques culturaux et mtaboliques dcrits plus haut comme tant communs toutes les Enterobacteriaceae. Les caractres qui permettent d'identifier les souches appartenant la sous-espce 1 ou S. enterica subsp enterica sont les suivants : - bacilles mobiles, - produisant du gaz en glucose (sauf S. Typhi), - lactose et ONPG ngatifs, - possdant une LDC et une ODC, - utilisant le citrate de Simmons comme seule source de carbone, - ne possdant ni urase, ni TDA, ni glatinase, - ne fermentant pas le saccharose, le raffinose et la salicine, - la raction de Voges-Proskauer (VP) est ngative. Le phage 01 de Flix et Callow lyse 98 % des souches de Salmonella et pas les autres Enterobacteriaceae. La mise en vidence de cette lyse est simple. On procde comme pour un antibiogramme. Au lieu de dposer des disques d'antibiotiques la surface de la glose on y laisse tomber une goutte d'une suspension du phage 01. Il est important de noter quelques exceptions ces caractres fondamentaux : - Un srovar aviaire, S. Gallinarum est immobile ; - S. Paratyphi A ne produit pas d'H^S et est LDC ngatif ; - S. Typhi ne produit pas de gaz en glucose et produit peu ou pas d'H^S ; - S. Typhi et S. Paratyphi A n'utilisent pas le citrate de Simmons ; - Le srovar S. Choleraesuis ne produit pas d'H^S. B - Caractres des autres sous-espces En raison de leur faible incidence en bactriologie mdicale nous renvoyons le lecteur intress l'article de Le Minor, Vron et Popoff cit en bibliographie de ce chapitre. Indiquons seulement que ces sous-espces se distinguent de la sous-espce 1 par les caractres suivants : ONPG, glatinase, utilisation du malonate et culture sur milieu au KCN. Ces quatre caractres sont ngatifs simultanment pour les seules souches appartenant la sous-espce 1. C - Diagnostic diffrentiel Trois Enterobacteriaceae, commensales du tube digestif de l'homme, peuvent lors d'une identification sommaire tre confondues avec les Salmonella. Ce sont Hafnia alvei, Citrobacter freundii et Proteus mirabilis. Les caractres diffrentiels avec les Salmonella sont indiqus dans le tableau II. - Citrobacter freundii n'a pas de LDC et est ONPG (+) ; - Hafnia alvei ne produit pas d'H^S, est VP (+) 22C et est gnralement ONPG (+) ; - Proteus mirabilis possde une urase et une tryptophane-dsaminase. N'tant pas des Salmonella, aucune de ces trois espces n'est lyse par le phage 01.

170

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

TABLEAU 1 DIAGNOSTIC BIOCHIMIQUE DES SALMONELLA Salmonella Milieu de Hajna-Kliger Glucose Gaz Lactose B-galactosidase HzS LDC Milieu Mannitol-mobilit Mannitol Mobilit Nitratase Milieu ure-indole + + sauf S. Typhi + sauf S. Paratyphi A et S. Choleraesuis + sauf S. Paratyphi A + + sauf S. Gallinarum + + -/(+) -' Hafnia + + Citrobacter P.mirabilis

+ +
d [+] [+] + + + [+] +

+ + + [+1 + + + d +/(+)

M () + +
(37)[-] (22)+ +

Urase
TDA Indole Citrate de Simmons EP + 1 % glycrol

HO -/(+) +

C.S.
Gly.

Tableau d C.Richard + : positif en 1 ou 2 jours. [+] : caractre positif de la majorit des souches. (+) : positif entre 3 et 7 jours. - : ngatif. [-] : caractre ngatif de la majorit des souches. d : diffrentes ractions suivant les souches. () : en cas de rponse ngative, rechercher la p-galactosidase partir d'une culture de Hafnia sur milieu de Kligler incub 22C. () : certaines souches de Hafnia possdent une urase. TDA : tryptophane dsaminase.

VI - CLASSIFICATION SROLOGIQUE Elle est base sur la dtermination, par agglutination sur lame, des antignes 0, H et Vi. Il existe plus de 2 000 srovars, mais avec un nombre limit de srums agglutinants, tout laboratoire peut typer la majorit des souches de Salmonella qu'il isole. Le typage des srovars rares ncessite l'intervention d'un laboratoire de rfrence. A - Antignes 0 La spcificit de chacun des 67 antignes 0 rpertoris est dtermine par sa composition, c'est--dire par la structure des polysaccharides de la paroi bactrienne. Les formes R. Ce sont des mutants, non pathognes, qui ont perdu par dltion une grande partie de la chane polysaccharidique responsable de la spcificit 0. Ces souches ne sont plus srotypables et sont auto-agglutinables dans de l'eau physiologique.

Chapitre XW - Salmonella Citrobacler

171

Les formes T (de transition). Ces souches sont rares. Elles donnent des colonies ayant l'aspect S, mais elles ont perdu leur spcificit 0, comme les formes R. Les bactriophages dits convertisseurs. Ils peuvent par lysognie produire des modifications de la structure antignique 0 des Salmonella. Les facteurs antigniques 0 qui sont lis une conversion phagique peuvent tre prsents ou absents. Ils sont souligns dans le tableau de Kauffmann-White. B - Antignes H Les flagelles sont constitus d'une molcule protique, la flagelline, dont la composition en acides amins dtermine le type antignique H. Cette composition est code par un gne de structure H) pour la phase 1 et un gne H^ pour la phase 2. Certains srotypes sont monophasiques. Ils ne peuvent synthtiser de la flagelline que d'une seule spcificit. La plupart des srotypes sont diphasiques. Ils peuvent synthtiser des antignes H soit de la phase 1, soit de la phase 2. Les antignes de la phase-1 sont dsigns par des lettres : a, b, c ... z. Comme l'alphabet n'y suffisait pas, les plus rcemment reconnus sont dsigns par un z suivi d'un nombre. Les antignes de la phase 2 sont dsigns par des chiffres. Inversion de phase. Lorsque dans une culture, la majorit des bactries est par exemple en phase 1, la quantit d'antignes de la phase 2 est trop faible pour tre dtecte. L'inversion de phase consiste ensemencer la souche dont la phase 1 est connue dans une glose molle en prsence de srum correspondant cette phase 1. Seules les bactries qui ne sont pas immobilises par ce srum, donc qui sont de l'autre phase, peuvent migrer dans la glose molle et tre recueillies distance du point d'ensemencement. Cette population entirement constitue de bactries en phase 2 est utilise pour la dtermination de la deuxime phase. Cette technique est connue sous le nom de mthode de Sven-Gard. C - Antigne Vi Ce polyoside capsulaire n'est trouv que de faon inconstante chez trois srotypes : S. Typhi, S. Paratyphi C, S. Dublin. Les souches Vi + qui produisent une quantit importante d'antigne Vi sont 0-inagglutinables. Elles deviennent habituellement 0-agglutinables aprs un chauffage 100C qui fait passer l'antigne Vi dans le surnageant. D - Le tableau de Kauffmann-White Ce tableau indique pour chaque srovar les antignes 0, Vi et H dont la dtermination est utile pour le typage srologique. A chaque srovar correspond une formule antignique. Par exemple, S. Virchow : 6,7 : r : 1,2. Dans ce tableau, les srovars qui ont des antignes 0 communs caractristiques sont rassembls pour former un groupe 0 dsign par une lettre A, B, C, D etc. Exemple : les srovars du groupe B ont tous l'antigne 04 et ceux du groupe D, l'antigne 09. A l'intrieur de chaque groupe 0, les srovars apparaissent d'aprs l'ordre alphabtique de la phase 1 de leur antigne H.

172

Section IV - ENTEROBACTERIACEAK

TABLEAU H
FORMULES ANTIGNIQUES DES SROVARS DE SALMONELLA ENTERICA LES PLUS FREQUEMMENT RENCONTRS EN FRANCE (Extrait du tableau de Kauffmann-White) N Srovar Antigne 0 Groupe A S. Paratyphi A 1, 2, 12 Groupe B 8 S. Paratyphi B S. Wien S. Schwarzengrund S. Duisburg S. Saint-paul S. Derby 'S. Agona S. Typhimurium S. Bredeney S. Brandenburg S. Heidelberg S. Coein 1, 4, (5), 12 1,4,12,27 1,4, 12,27 ,1,4, 12,27 1,4, 12 1, 4, (5), 12 1,4, 12 1, 4, (5), 12 1,4,12,22 1,4, 12 1,4, (5), 12 4, 5, 12 Groupe Cl S. Ohio S. Isangi S. Livingstone 14 5'. Braenderup S. Montevideo S. Thompson 5 S. Infantis 3 S. Virchow 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 Groupe C2 4 6 16 S. Manhattan S. Newport S. Litchfield S. Bovismorbificans S. Hadar 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 Groupe D 9 7 2 8 S. Panama S. Typhi S. Enteritidis S. Dublin 5'. Gallinarum 1,9, 12 9, 12, (Vi) 1,9, 12 l,9,12(Vi) 1, 9, 12 Groupe E S. Anatum S. Meleagridis S. Senftenberg S.London S . Give 3, 10 3, 10 1, 3, 19 3.10 3, 10 Groupe G2 S. Tel-el-kebir S. Kedougou S. Worthington 13,23 1, 13, 23 1, 13,23 d i z e, n, zl5
1.W 1.W

Antigne H Phase II Phase I a

10 13 1 15 12 11

b b d d e,h f,g f,g,s i l,v l,v r

1,2 l,w 1,7 e, n, zl5 1,2 1,2 1,7 e, n, zl5 1,2 1.2

b d d e,h g k r r

l,w 1,5 l,w 1.2 m, s 1,5 1.5 1,2

d e,h I,v r zlO

1,2 1,2 1,5 e,n, x

1,5

l,v d g, m g,P

1,5 -

e,h e,h g, s,t l,v l,v

1,6 l,w 1,6 1,7

Les facteurs entre parenthses peuvent tre absents. Les chiffres de la colonne N correspondent l'ordre de frquence d'isolement des srotypes les plus frquents qui reprsentent 84 % des souches isoles de l'homme en France en 1989 (B.E.H. 1990,16,69).

Chapitre XIII - Salmonella - Citrobacler

173

VII - MARQUEURS PIDMIOLOGIQUES Ils servent comparer des souches appartenant un mme srovar pour rechercher l'origine d'une contamination. Plusieurs types de marqueurs sont utilisables. - Antibiotypie. Par simple antibiogramme, une souche possdant de nombreux caractres de rsistance peut tre distingue d'une souche sensible. - Biotypie. Elle consiste comparer certains caractres mtaboliques variables au sein d'un mme srotype. Exemple : l'utilisation du d-tartrate par S. Paratyphi B, varit Java. - L y s o t y p i e . La souche tester est soumise l'action d'une srie de bactriophages virulents actifs sur le groupe auquel appartient la souche. La sensibilit aux phages ncessite la prsence de rcepteurs de surface spcifiques qui sont des caractres gntiques stables pour chaque souche. Le lysotype est la liste des phages lytiques pour la souche tudie. - Bactriocinotypie ou colicinotypie. Des substances initialement dcrites chez E. coli, sont produites par certaines souches et sont capables de lyser d'autres souches de la mme espce ou d'espces voisines. La dtection des bactriocines et la dtermination du lysotype ne sont effectues que par des laboratoires spcialiss. VIII - DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE D'UNE INFECTION A SALMONELLA II faut toujours chercher isoler le germe au cours d'une salmonellose. Cela permet sa caractrisation prcise pour une enqute pidmiologique et l'tude de sa sensibilit aux antibiotiques. Le srodiagnostic de Widal et Flix n'est utile que pour les fivres typhodes et paratyphodes. Le sro-diagnostic n'est qu'une mthode indirecte et des ractions croises sont possibles mme avec des bactries autres que les Salmonella.
MARQUEURS PIDMIOLOGIQUES UTILISS PAR LE CENTRE DE RFRENCE POUR LA LYSOTYPIE ET BIOTYPIE ENTRIQUE
S. Typhi

Lysotypie : - systme international : 103 lysotypes ; - lysotypie complmentaire : 10 sous-types. Action du bactriophage Vi yn Biotypie : - utilisation du xylose ; - recherche de la ttrathionate rductase. Colicinognie (souche sensible : E. coli K 12). Recherche de l'antigne H : z 55 S. Paratyphi A Lysotypie, systme international : 6 lysotypes.

S. Paratyphi B Lysotypie, systme international : 48 lysotypes. Biotypie, activit d-tartrate (biovarjava). S. Typhimurium Lysotypie : systme international : 265 lysotypes - lysotypie complmentaire : 21 sous-types. S. Montevideo Lysotypie (Vieu et coll.) : 88 lysotypes Biotypie (Vieu et coli) : 7 biovars. S. Dublin Lysotypie (Vieu et coll.) : 57 lysotypes.

Tableau extrait du Bulletin pidmiologique Hebdomadaire n 23/1986

174

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

A - Diagnostic direct ; Isolement des Salmonella 1. Hmocultures . Elles sont faites de prfrence lors des ascensions thermiques. Il est souhaitable que chaque prlvement recueille environ 10 ml de sang car le nombre de bactries par ml de sang est souvent faible au cours des fivres typhodes. La ralisation ne pose pas de problmes techniques : les Salmonella poussent sur milieux usuels. L'hmoculture est surtout utile lors des fivres typhodes et paratyphodes. Pendant le premier septnaire, elle est positive dans 90 % des cas. Le taux de positivit tombe 40 % pendant le troisime septnaire. L'hmoculture peut tre positive lors des entrites du jeune enfant. Sa positivit est exceptionnelle dans les entrites de l'adulte et les toxi-infections alimentaires. 2. Coprocultures al Indications - Une coproculture doit tre pratique ds que l'on suspecte une infection Salmonella. - Au cours de fivres typho-paratyphodiques, elle reste plus longtemps positive que l'hmoculture. - Au cours des entrites et des toxi-infections alimentaires, la coproculture est positive alors que les hmocultures restent ngatives. - Aprs traitement, la coproculture permet de vrifier que le malade ne reste pas porteur sain. L'limination des Salmonella pouvant tre intermittente, il y a donc lieu de faire deux coprocultures une semaine de distance. - Une coproculture systmatique annuelle est prconise pour les personnes employes dans des cuisines ou dans l'industrie alimentaire.
bl Technique

Au cours des salmonelloses, l'excrtion de germes dans les selles peut tre faible. De plus les Salmonella sont en nombre infrieur des espces commensales : Escherichia coli et Proteus. Il faut donc, pour les isoler, utiliser la fois des milieux d'enrichissement et des milieux slectifs. - A l'arrive du prlvement un milieu d'enrichissement et un milieu slectif sont ensemencs. Un trs grand nombre de milieux ont t proposs. Notamment pour la bactriologie alimentaire. Nous indiquons ici les milieux le plus usuellement adopts en bactriologie mdicale. Milieux d'enrichissement Ils permettent l'aide d'antiseptiques slectifs inhibant les autres bactries d'accrotre la proportion de Salmonella. Un bouillon de Miiller-Kauffmann au ttrathionate ou un bouillon au slnite de sodium sont ensemencs et repiqus aprs une incubation de 18 heures 37C.
Milieux slectifs

Ces milieux gloses contiennent des antiseptiques, des sels biliaires qui empchent la croissance de certaines espces bactriennes et inhibent l'envahissement par les Proteus. Ils permettent de reprer les colonies suspectes par la fermentation de certains sucres (lactose) et la production d'H^S. La glose Hektoen est gnralement prfre au milieu SS (Salmonella-Shigella). - Le deuxime jour, aprs incubation de ces milieux 37C : - Le milieu d'enrichissement est repiqu sur un milieu slectif qui sera examin le lendemain.

Chapitre XSS-Salmonella-Curobacler

175

Cinq colonies suspectes (lactose (-) et H^S (+)) repres sur le milieu slectif ensemenc la veille, sont l'objet d'une caractrisation biochimique succincte, puis, si les caractres sont ceux d'une Salmonella d'une identification prcise et enfin d'un srotypage.
SCHMA D'ISOLEMENT D'UNE SALMONELLA PAR COPROCULTURE

Selle ^
1 jour 2e jour
e

^
Bouillon d'enrichissement (Mller-Kauffmann) Isolement sur Hektoen f Si une Salmonella n'est pas dj isole, tude de 5 colonies suspectes etc.

Isolement sur glose slective (Hektoen) Identification prsomptive de 5 colonies suspectes (Urase-APIZ) Si + : galerie d'identification Si Salmonella agglutination sur lame

3 jour

3. Autres prlvements

Dans la bile la recherche de Salmonella se fait de faon analogue la coproculture. Dans les autres produits pathologiques, urines, pus divers, la prsence d'une Salmonella est gnralement une dcouverte fortuite du laboratoire. L'analyse des aliments contamins en utilisant des milieux slectifs et des milieux d'enrichissement est la meilleure faon d'isoler une Salmonella responsable d'une toxi-infection alimentaire. B - Diagnostic indirect : le sro-diagnostic de Widal et Flix II n'est utile que pour le diagnostic des fivres typhodes et paratyphodes A, B et C et est sans intrt pour les autres salmonelloses. Lorsque le malade est vu tardivement ou s'il a bnfici d'une antibiothrapie applique l'aveugle, l'isolement de la bactrie n'est souvent plus possible. C'est alors que le srodiagnostic de Widal et Flix a son intrt. Il permet de rechercher les anticorps anti-0 et anti-H dans le srum. Mais de nombreuses causes d'erreurs existent et l'interprtation est parfois dlicate. C'est pourquoi la prescription d'un srodiagnostic de Widal et Flix doit toujours tre accompagne de celle d'une coproculture voire d'une hmoculture visant isoler la Salmonella.
1. Principe et ralisation

II s'agit de rechercher dans le srum des malades les agglutinines correspondant aux antignes somatiques 0 et aux antignes flagellaires H de Salmonella Typhi et des Salmonella Paratyphi A, B et C. La recherche d'agglutinines Vi n'a aucun intrt pratique Pour cela on utilise des suspensions antigniques TO, TH, AO, AH, BO, BH, CO et CH. Ces suspensions antigniques sont consitues de bactries tues, traites soit par l'alcool qui dtruit les antignes H, soit par le formol qui dtruit les antignes 0. Dans une srie de tubes, chaque suspension antignique est mise en prsence de dilutions croissantes du srum du malade, pour dterminer le titre des agglutinines. La lecture est faite soit aprs une centrifugation de 10 minutes (mthode rapide), soit aprs 2 heures l'tuve 37C.

176

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

2. Rsultats normaux Les agglutinines 0 apparaissent vers le 8e jour de la maladie, et les agglutinines H vers le 10-12e jour. A la priode d'tat, il y a simultanment des agglutinines 0 et H. Le titre de ces dernires est plus lev (par exemple TO = 1/200 ; TH = 1/800). Les agglutinines 0 disparaissent normalement en 2 3 mois. Les agglutinines H persistent plusieurs annes aprs une infection ou une vaccination antityphoparatyphodique A et B. La prsence seule d'agglutinines 0 tmoigne d'une infection rcente.

VOLUTION DU TITRE DES AGGLUTININES AU COURS DES FIVRES TYPHODES ET PARATYPHODES

Une fivre typhode peut parfois s'observer chez un vaccin : dans ce cas, il y a prsence simultane d'agglutinines TH, AH, BH et d'agglutinines 0. Il n'y a pas de relation entre le titre des agglutinines et la gravit de la maladie. 3. Rsultats faussement posif s - La prsence d'agglutinines TO seules peut tre due une infection par une Salmonella ayant un antigne 0 commun avec S. Typhi, mais des antignes H diffrents. Il s'agit le plus souvent de 5'. Enteritidis. - De mme la prsence d'agglutinines BO seules peut tre due une infection S. Typhimurium, par exemple. - Certaines souches de Yersinia pseudotuberculosis, cause de communauts antigniques, peuvent donner une agglutination avec BO (srogroupe II) ou avec TO (srogroupe IV) - Des ractions faussement positives peuvent tre observes au cours de certaines maladies : paludisme, typhus exanthmatique, dysglobulinmies (mylomes, collagnoses, cirrhoses) et infections diverses par des Entrobactries. 4. Rsultats faussement ngatifs - Le srodiagnostic de Widal est ngatif pendant le premier septnaire. - Un traitement prcoce par des antibiotiques ou des corticodes peut empcher l'lvation du taux des anticorps. - n existe des cas rares de typhode authentique sans lvation du taux des anticorps. IX - TRAITEMENT Un antibiogramme est effectu sur toute souche de Salmonella isole autant pour caractriser cette souche que pour orienter le traitement antibiotique qui n'est pas systmatique pour toutes les salmonelloses digestives.

chapitre Xffl - Salmonella - Curobacter

_________

________

___

177

A - Fivres typhodes et paratyphodes Les souches isoles en France demeurent gnralement bien sensibles aux antibiotiques, contrairement ce qui a t observ lors d'pidmies au Mexique, au Viet-Nam et au Prou. Les antibiotiques de choix sont ceux qui ont une bonne concentration dans les ganglions lymphatiques : chloramphnicol ou trimthoprime-sulfamthoxazole. L'ampicilline a une concentration lymphatique moins bonne, par contre elle a une bonne limination biliaire. Les antibiotiques administrs par voie orale assurent une meilleure concentration lymphatique. C'est le cas des fluoriquinolones. Contrairement la rgle gnrale en antibiothrapie, les antibiotiques ont t classiquement donns posologie progressive pour viter une lyse microbienne massive et les inconvnients dus la libration brutale d'endotoxine. B - Entrites et toxi-infections alimentaires Seules les formes svres chez le nourrisson ou chez le vieillard sont traites par les antibiotiques. Dans les autres cas o le pronostic est favorable, un traitement symptomatique suffit. C - Porteurs sains Les personnes qui, au dcours de la maladie, continuent d'liminer des Salmonella dans leurs selles ne doivent pas tre traites par les antibiotiques. Ceux-ci slectionnent des souches rsistantes et sont sans action sur la dure du portage. Seules des mesures d'hygine sont prconiser. X - PRVENTION A-La vaccination

Le vaccin TAB, injectable, constitu de bactries entires inactives, mal tolr et confrant une protection de qualit mdiocre n'est plus le cauchemar des jeunes incorpors dans l'arme franaise et des rares catgories de personnes pour lesquelles cette protection est obligatoire. Deux vaccins ont t mis au point. L'un est un vaccin vivant attnu (souche mutante Ty 2 la), utilisable par voie orale. L'autre, disponible en France (TYPHIM Vi) est un vaccin injectable constitu par le polyoside capsulaire de S. Typhi ou Ag Vi obtenu purifi sous sa forme 0-actyle native. Innocuit et efficacit sont les qualits de ce vaccin qui a permis de confrer 72 % et 64 % de protection en milieu forte incidence (Npal, Afrique du Sud). B - L'hygine Hygine collective. C'est la prvention du pril fcal par le contrle bactriologique de l'efficacit du rseau de distribution d'eau potable et l'installation de rseaux d'assainissement. C'est aussi le contrle de la qualit bactriologique des denres alimentaires. Hygine individuelle. C'est la dtection des porteurs sains notamment parmi le personnel des cuisines ou des industries alimentaires.

178

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

BIBLIOGRAPHIE
HIMMICH H., MARHOUM EL FILAKI K., Antibiothrapie de la fivre typhode. La lettre de l'infectiologue, 1990, 5, 466-468. LE MINOR L., POPOFF M., Formules antigniques des srovars de Salmonella , Centre collaborateur OMS de rfrence et recherche sur Salmonella, 1987. LE MINOR L., VRON M., POPOFF M., Proposition pour une nomenclature des Salmonella , Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur), 1982 ,133 B, 245-254. RICHARD C., Les bactries qui peuvent tre confondues au laboratoire avec les Salmonella et les Shigella . Feuillets de Biologie, 1981, 22, 37-41. VU J.F., BINETTE H., LEFEVRE M., LEHERISSEY M., pidmiologie de la fivre typhode en France : rsistance de Salmonella typhi aux antibiotiques (1973-1983) , Md. Mal. Infect., 1984, 14, 347-351. Les Nouveaux Vaccins , Md. Mal. Infect., 1989,19, Numro spcial Novembre.

Chapitre XDI - Salmonella - Curobacter

179

ANNEXE 1
SROTYPAGE D'UNE SOUCHE DE SALMONELLA Ce typage consiste dterminer par agglutination sur lame les spcificits des antignes 0 et H et reconnaitre le srotype en se rfrant au Tableau de Kauffmann-White. Le typage est effectu avec des Salmonella recueillies sur glose ordinaire en pente (dont l'humidit permet un bon dveloppement des antignes H) et non sur milieu slectif. L'absence d'auto-agglutination de la souche est vrifier. Typage simplifi Environ 98 % des souches de Salmonella isoles chez l'homme appartiennent des srotypes reconnus par l'utilisation des srums agglutinants qui suivent : - srum anti Vi - srums 0 : 4,5 - 9 - 6,7,8 - 3,10,15. - srums H : b - d - i - G - Ll. Typage par la mthode classique - Antignes 0 Le premier temps est d'utiliser des srums polyvalents 0 appels OMA, OMB,OMC, etc. Aprs agglutination dans l'un de ces srums on teste les srums monovalents correspondants pour dterminer le groupe du Tableau de Kauffmann-White auquel appartient la souche. - Antignes H De la mme faon on utilise des srums polyvalents H appels HMA, HMB, HMC etc. puis des srums monovalents contenus dans le srum polyvalent o une agglutination a t observe. Pour l'inversion de phase par la mthode de Sven Gard, l'un des srums dnomms SG 1 6 contenant les agglutinines correspondant la phase dj dtermine est ajout la glose. IDENTIFICATION PRATIQUE DE SALMONELLA TRS FRQUENTES 1. Dtermination du groupe 0 Les srums mlanges sont souvent inutiles. L'utilisation de 3 srums (04,5 06,7,8 - 09) permet de grouper plus de 90 % des Salmonella isoles en France. 2. Identification du srotype Typhimurium 1,4, [5], 12 : i : 1,2 Dans le groupe B (04), le srotype de loin le plus frquent est Typhimurium. - Dtermination minimale (en priode pidmique comme en ce moment) : L'agglutination avec un srum anti-H i est suffisante. En effet, les autres srotypes ayant 04 et Hi (Lagos, Agama, Farsta, Tsevie, Gloucester) sont rarissimes. - Dtermination complte : Aprs avoir identifi Hi, rechercher une deuxime phase agglutinant avec le mlange HI et le srum monovalent H2. Il est souvent ncessaire d'immobiliser les bactries ayant Hi par la mthode de Sven Gard pour faire "courir" celles qui ont Hl,2. 3. Identification des srotypes Enteritidis 9,12 : gm : - et Dublin 9,12 : gp : Dans le groupe D (09), il est essentiel de distinguer Enteritidis de Dublin (les manifestations cliniques sont parfois trs diffrentes).

180

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

Il est important de savoir que le srum anti-H gm agglutine les deux srotypes (g en commun), de mme pour le srum anti-H gp. On ne peut donc pas arrter le diagnostic la vue d'une agglutination en gm ou gp. On peut faire l'conomie d'un srum mlange G (trop de coagglutinations, l'agglutination ne signifie pas qu'il y a un facteur g prsent) Utiliser systmatiquement les srums anti-H gm, anti H m, et anti-Hp p. On aura les rsultats suivants : Srotype Enteritidis Dublin Srum 09 agglutin agglutin Srum gm agglutin agglutin Srum m agglutin ngatif Srum p ngatif agglutin

Srums possder : 0 : 4,5 - 6.7,8 - 9 H : i - gm - m - p Vi (essentiellement pour ne pas passer ct d'un Typhi)

ANNEXE 2
EXEMPLES DE RSULTATS DE SRO-DIAGNOSTICS ET DE LEURS INTERPRTATIONS POSSIBLES MAIS NON EXCLUSIVES (Par le Pr. L. Le Minor, Compte-rendu du contrle national de qualit en bactriologie) 1 2 3 4 5 6 7

10 TH AO AH BO BH 00 CH

400 800 . 100 . .

200 . 400 800 . -

200 . -

100 200 -

400 100 200 -

400 1600 100 200 . -

200 -

1) Fivre typhode la priode d'tat. 2) Fivre paratyphode B la priode d'tat : coagglutination TO due aux facteurs 0 communs (12) 3) Trois hypothses au moins envisager : a) Fivre typhode au dbut, vers le 8e jour ; les agglutinines 0 sont apparues, les agglutinines H ne le sont pas encore : un nouveau sro-diagnostic pratiqu quelques jours plus tard pourra les mettre en vidence. b) Infection due un srotype de Salmonella ayant l'antigne 0 commun avec S. Typhi, mais un antigne H diffrent ; rechercher dans ce cas si la suspension H de S. Enteritidis (dans le groupe D, S. Enteritidis est un srotype frquent) n'est pas agglutine. c) Infection Yersinia pseudotuberculosis (bacille de Malassez et Vignal), type IV : faire intradermoraction. 4) Trois hypothses au moins : a) Paratyphode B au dbut avec coagglutination TO. Voir 3a. b) Mme raisonnement que 3b. Recherche d'agglutination de 5. Typhimurium H. c) Mme raisonnement que 3c avec Y. pseudotuberculosis type II

Chapitre XIII - Salmonella Citrobacter

181

5) Vaccin au TAB depuis plus de trois mois : les agglutinines 0 ont disparu, les agglutinines H persistent pendant de nombreuses annes. Les agglutinines AH peuvent tre absentes, le vaccin contenant moins de A que de T et B. 6) Vaccin au TAB faisant nanmoins une fivre typhode la suite d'une absorption massive de S. Typhi hautement virulentes. 7) Trois hypothses au moins : a) Ancien malade ayant fait une fivre typhode et en ayant gard la marque srologique, comme s'il avait reu un vaccin T seul. b) Infection due une Salmonella possdant l'antigne H : d commun avec S. Typhi, mais un antigne 0 diffrent de TABC : essayer d'isoler cette bactrie, en particulier par coproculture. c) Fivre typhode traite prcocement par chloramphnicol ou chloramphnicol + corticodes. Les agglutinines 0 peuvent ne pas apparatre. Si un nouveau sro-diagnostic montre une ascension nette des agglutinines TH, si les signes cliniques et hmatologiques sont en faveur d'une fivre typhode, cette ascension rend probable ce diagnostic. Mais on ne pourra l'affirmer, la mme ascension pouvant s'observer dans l'hypothse 7b.

ANNEXE 3
RECOMMANDATIONS DU CENTRE NATIONAL DE RFRENCE DES SALMONELLA ET DES SHIGELLA I. Chaque isolement de Salmonella et de Shigella doit tre signal au Centre de Rfrence. Son adresse : Centre National de Rfrence des Salmonella et des Shigella Unit des Entrobactries Institut Pasteur de Paris 28, rue du Docteur Roux 75724 PARIS Cedex 15 Tel : (1) 45 68 83 39 II. Plusieurs cas peuvent se prsenter. 1 ) II s'agit d'une Salmonella ubiquitaire. Elle ne prsente pas de caractres anormaux : galerie d'identification typique, antibiogramme sans anomalies, diagnostic srotypique sans problme. Il ne s'agit pas d'une Salmonella appartenant aux srotypes Typhi, Paratyphi A ou B. Remplissez les feuilles d'accompagnement fournies par le Centre de Rfrence, et envoyez-les au Centre de Rfrence. Il est inutile de joindre la souche. 2) II s'agit d'une Salmonella appartenant aux srotypes Typhi, Paratyphi A ou B. La feuille d'accompagnement sera soigneusement remplie. Elle sera adresse avec la souche au Centre de Rfrence pour tude lysotypique. 3) II s'agit d'une Salmonella dont on ne peut mener bien la srotypie. Remplir soigneusement la fiche d'accompagnement en signalant les agglutinations observes. Adresser la souche au Centre de Rfrence. Les identifications des srotypes de Salmonella (d'origine humaine) sont effectues gratuitement condition qu'une tude minimale ait t faite (agglutinations recherches avec les srums 0:4,5 - 0:9 - 0:6,7,8). 4) II s'agit d'une toxi-infection alimentaire collective ou d'une pidmie de crche. Remplir soigneusement la feuille de renseignements.

182

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

ventuellement, la complter sur une fiche manuscrite avec les notions d'intrt pidmiologique que vous avez obtenues. Ne pas omettre d'indiquer le nombre de cas observs. Adresser la souche au Centre de Rfrence. Si l'pidmie continue : aprs l'envoi initial, adresser rgulirement des feuilles de renseignements, en prcisant Continuation de l'pidmie - Pour information . Si les modifications apparaissent dans le comportement des souches, au moindre doute, adresser les souches qui semblent anormales, au Centre de Rfrence. 5) II s'agit d'une Shigella. Vrifier l'absence de mobilit, la ngativit de la LDC et du citrate de Christensen (diagnostic diffrentiel avec Akalescens-dispar). S'il s'agit d'un cas isol de Shigella sonnei, sans problme diagnostique, remplir une feuille et l'adresser SEULE, sans la souche, au Centre National : Pour information, souche non adresse . S'il s'agit d'une pidmie Sh. sonnei, adresser toutes les souches pour biotypie et lysotypie, avec une lettre d'accompagnement donnant toutes informations utiles. S'il s'agit de Sh. dysenteriae, Sh.flexneri, Sh. boydii, il faut adresser la souche pour identification srotypique prcise. III. Remarques 1. Comment acheminer vos cultures. Pas de botes de Ptri. Pas de bouillon. Seuls des milieux solides conviennent : glose ordinaire incline en tube bouch vis. Ou mieux un tube de milieu pour conservation des souches bactriennes. (Pasteur-Diagnostics, tube de 95 x 8). Envelopper le tube dont le bouchon est bloqu, dans du papier absorbant. Introduire l'ensemble dans un tui mtallique, lui-mme plac dans un second emballage en bois ou en plastique (Bulletin Officiel des P.T.T.) 2. Les donnes pidmiologiques sont stockes dans la banque de donnes, et utilises des fins d'information pidmiologique et de prophylaxie. Il est important de remplir le plus compltement possible la fiche d'accompagnement, en mentionnant chaque fois l'origine gographique de la contamination. Exemples : - Malade revenant de Calcutta, hospitalis Pont-1'Abb. - Malade habitant Le Touquet, hospitalis Arras. - Souche isole Paris, de cuisses de grenouilles importes du Pakistan. - Eau use prleve Saumur et analyse Angers. 3. Pour obtenir des nouvelles feuilles. Indiquer en rouge sur une feuille : Adressez X nouvelles feuilles SVP . 4. Si ncessaire, en cas de besoin urgent d'informations ou de renseignements, tlphoner : Centre National de Rfrence. Tel ; (1) 45 68 83 39

ChsptaeXQl-Salmwwlla-CiIrotmcter

183

ANNEXE 4
NOTE SUR CITROBACTER I - DFINITION Ce genre rassemble trois espces d'Enterohacteriaceae qui ont les caractres suivants : citrate (+), fermentation du glucose avec gaz, mobilit (+), test ONPG (+), raction de VP ngative et absence de LDC. Il existe de nombreuses souches atypiques de Citrobacter. Celles qui sont ONPG ngatif et produisent de l'H^S peuvent tre confondues avec les Salmonella. Certaines souches peuvent tre H^S ngatif, ou citrate de Simmons ngatif, ou agazognes. Se reporter au tableau qui donne les caractres permettant de distinguer les deux genres. II - HABITAT ET POUVOIR PATHOGNE Les Citrobacter sont des bactries commensales du tube digestif de l'homme et des animaux sang chaud. Ils sont trouvs dans l'environnement et dans les eaux. Ils peuvent tre isols occasionnellement d'urines ou de suppurations diverses. III - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES L'espce type, C.freundii, se dveloppe sur milieu usuel en donnant une odeur nausabonde. La production d'H^S et l'absence de production d'indole permetttent de faire la distinction avec C. diversus et C. amalonaticus. Le tableau ci-dessous donne les caractres diffrentiels entre les trois espces.
Production d'H^S Production d'indole Croissance en KCN Utilisation du malonate C.freundii + + + C. diversus + C. amalonaticus + +

Chapitre XIV KLEBSIELLA - ENTEROBACTER SERRATIA

Dans le groupe Klebsiella - Enterobacter - Serratia, dit K.E.S., sont rassembles des Enterobacteriaceae qui ont en commun les caractres suivants : l/ La raction de Voges-Proskauer (VP) est gnralement positive. Cette raction consiste mettre en vidence la production d'actylmthylcarbinol (ou actone) par la bactrie. Elle est trs spcifique. Un VP positif signifie que la souche possde une voie mtabolique particulire pour la fermentation des hexoses, la voie butylneglycolique. 21 Ce sont des Bactries Pathognes Opportunistes. Peu virulentes par elles-mme, elles se rencontrent peu en pratique extrahospitalire. Opportunistes, elles sont responsables d'infections hospitalires nosocomiales chez des malades dbilits : cirrhotiques, diabtiques, brls, cancreux, vieillards, malades de ranimation, nourrissons. 3/ Ces espces sont souvent multirsistantes aux antibiotiques. La frquence avec laquelle on les rencontre est d'autant plus grande que la pression de slection par des antibiotiques large spectre est forte. Les caractres bactriologiques qui permettent de distinguer les genres formant le groupe K.E.S. sont indiqus dans le tableau I. TABLEAU 1 PRINCIPAUX CARACTRES DISTINCTIFS ENTRE LES GENRES KLEBSIELLA. ENTEROBACTER, SERRATIA ET HAFNIA Mobilit ODC ADH DNase Glatinase Klebsiella Enterobacter + + d Serratia + (+) + + Hafnia + 22C +

()= exceptions ; d = caractre variable.

Chapitre XIV - Klebsiella - Enterobacter Serralia

185

GENRE KLEBSIELLA
1 - DFINITION ET CLASSIFICATION Les Klebsiella sont des Enterobacteriaceae toujours immobiles, possdant gnralement une capsule et fermentant de nombreux glucides. Elles ne possdent ni ODC, ni ADH, ni tryptophane-dsaminase (TDA), ni lipase et ne produisent pas d'H^S. La classification des diffrentes espces de Klebsiella est discute. Nanmoins 6 espces sont usuellement reconnues : - Quatre espces ont un pouvoir pathogne pour l'homme : K. pneumoniae (espce-type), K. oxytoca, K. ozaenae et K. rhinoscleromatis. Deux espces sont trouves dans l'environnement et sont rarement pathognes, ce sont K. terrigena et K. planticola qui ne seront pas dcrites ici.

II - HABITAT ET PIDMIOLOGIE

K. pneumoniae et K. oxytoca sont les espces les plus souvent rencontres. Elles sont frquement isoles des eaux, du sol et des vgtaux. Elles sont prsentes dans la flore fcale de l'homme et sont souvent commensales de la peau, des muqueuses et des voies respiratoires. Les malades s'infectent soit avec leurs propres souches, soit avec des souches responsables de petites pidmies hospitalires. Elles sont alors manuportes de malade malade. III - POUVOIR PATHOGNE K. pneumoniae, de loin la plus souvent rencontre, et K. oxytoca sont isoles principalement de broncho-pneumopathies aigus ou subaigus, mais aussi d'infections urinaires, hpato-biliaires ou de pus divers. En raison du terrain dbilit sur lequel elles se dveloppent, les septicmies Klebsiella ont un pronostic trs svre. K. ozaenae n'est pratiquement isole que d'infections respiratoires chroniques. Elle est rarement isole d'urines ou d'hmocultures. Il en est de mme de K. rhinoscleromatis qui est rarement rencontre en France. Elle est plus frquente en Afrique. Le rle de K. ozaenae comme agent tiologique de l'ozne et celui de K. rhinoscleromatis comme agent du rhinosclrome sont imparfaitement tablis.

186

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

IV - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A - Aspect des colonies Sur milieux usuels, les Klebsiella donnent aprs une incubation de 24 heures 37C des colonies gnralement lactose (+), rondes, de 3 4 mm de diamtre, bombes, muqueuses et ayant une tendance la confluence. Cet aspect muqueux, en relation avec la prsence habituelle d'une capsule plus ou moins volumineuse, est parfois observe avec d'autres Enterobacteriaceae notamment certaines souches de E. coll. B - Diagnostic d'espce Les caractres biochimiques utiles au diagnostic sont prsents dans le tableau II : - K. pneumoniae est VP (+), ONPG (+), LDC (+) et attaque le glucose en produisant beaucoup de gaz. - K. oxytoca se distingue par la production d'indole. - K. ozaenae est VP (-), ONPG (+) et malonate (-) - K. rhinoscleromatis est VP (-), ONPG (-) et LDC(-)
TABLEAU H PRINCIPAUX CARACTRES PERMETTANT LE DIAGNOSTIC DES ESPCES DU GENRE KLEBSIELLA K. pneumoniae Voges-Proskauer ONGP LDC Indole Malonate Urase + + + + (+) K. oxytoca
+ +

K. ozaenae
+

K. rhinoscleromatis

+ + +

d
d

( ) = exceptions ; d = caractre variable

C - Diagnostic diffrentiel La majorit des souches de K. pneumoniae est urase (+) en milieu ureindole . Les souches urase (-) de K. pneumoniae sont parfois confondues avec Enterobacter aerogenes qui s'en distingue par la mobilit et l'ODC, (tableau III).
TABLEAU m CARACTRES DIFFRENTIELS DE K. PNEUMONIAE ET DE E. AEROGENES K. pneumoniae Mobilit ODC Carbnicilline Urase R : rsistant ; S = sensible R (+) . aerogenes

+ +
S

D - Marqueurs pidmiologiques Leur recherche est faite par des laboratoires spcialiss pour carter ou affirmer l'existence d'infections nosocomiales pidmiques en milieu hospitalier. - Le typage capsulaire. C'est la mthode la plus discriminante. Il existe 77 antignes capsulaires K. La dtermination de ces antignes se fait essentiellement

CbtpitteW/-Ktebsiella-Enterobacter-Serratia

187

par la raction de gonflement de la capsule ou raction de Neufeld, en prsence del'immum-srum correspondant. La biotypie. Elle est moins performante. Huit biotypes peuvent tre distingus par l'tude de 3 caractres : sorbose, dulcitol et d-tartrate.

V - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES Les Klebsiella ont une rsistance naturelle l'ampicilline et la carbnicilline. Elles sont normalement sensibles aux cphalosporines. Des enzymes rcemment caractrises, CTX-1 (TEM 3, K. pneumoniae) et SHV-2, rendent les souches rsistantes aux uridopnicillines, toutes les cphalosporines (except les cphamycines) et aux monobactames. Ces nouvelles bta-lactamases plasmidiques sont fortement inhibes par l'acide clavulanique. Chez K. oxytoca, la bta-lactamase spectre largi a un support chromosomique, elle est inhibe par l'acide clavulanique. La majorit des souches hberge des plasmides R qui les rendent rsistantes de nombreux antibiotiques. Le traitement ne peut se passer d'un antibiogramme sur lequel il est ncessaire de tester les antibiotiques les plus rcents.

GENRE ENTEROBACTER
1 - DFINITION ET CLASSIFICATION Les Enterobacter sont des Enterobacteriaceae VP (+), voisines des Klebsiella dont elles se distinguent par leur mobilit, par la prsence d'une ODC, parfois d'une ADH et par l'absence d'urase. La TDA, la DNase, la production d'indole et d'H^S sont ngatives. La classification des Enterobacter a t l'objet de nombreux remaniements. Nous indiquons dans le tableau ci-dessous les dnominations des espces rencontres en bactriologie mdicale. Dnomination actuelle E. cloacae E. aerogenes E. agglomrons E. gergoviae E. sakazakii E. asburiae Hafnia alvei
Dnomination ancienne

Aerobacter cloacae, Cloaca A Aerobacter aerogenes, Cloaca B Erwinia herbicola


Enterobacter urase (+)

E. cloacae pigment en jaune Enterobacter hafniae

L'espce type est E. cloacae. C'est aussi la plus souvent rencontre. L'espce Hafnia alvei est aujourd'hui classe dans le genre Hafnia dont elle est le seul reprsentant. Les Erwinia sont des Enterobacteriaceae phytopathognes non rencontres en bactriologie mdicale.

188

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

II - HABITAT ET PIDMIOLOGIE Les Enterobacter sont des commensaux du tube digestif de l'homme et des animaux. On les trouve dans les eaux, sur le sol, sur la peau et les muqueuses. Ce sont des bactries de l'hospitalisme. III - POUVOIR PATHOGNE Ces bactries pathognes opportunistes peuvent tre responsables de septicmies, de mningites, d'infections urinaires, d'infections nonatales et de suppurations diverses. IV - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES Les caractres biochimiques qui permettent de distinguer les espces rencontres en clinique sont indiqus dans le tableau IV. Il est noter que les colonies de E. sakazakii sont pigmentes en jaune. Un pigment jaune peut aussi tre produit par des souches de E. agglomrons. Cette dernire espce est htrogne et constitue de plusieurs biotypes. E. gergoviae possde une urase. E. asburiae est immobile, RM (+), malonate (-), rhamnose (-).
TABLEAU IV CARACTRE DES DIFFRENTES ESPCES D'ENTEROBACTER
i

ADl LDC ODC Sorbitol

cloacae + + +

E.

E. E-aerogenes + + +

E.agglomerans E.gergoviae

E.

E.

E.sakazakii
+ +
+

E.

E. E. asburiae + +

+ +
d d

Urase Pigment jaune

V - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES Les Enterobacter sont souvent trs rsistants aux antibiotiques. E. cloacae a une rsistance naturelle l'ampicilline et la cphalotine. Un pourcentage important des souches est rsistant la carbnicilline, la gentamicine, aux ttracyclines, au chloramphnicol, aux sulfamides et au trimthoprime. La sensibilit aux ureido-pnicillines, aux cphalosporines de 3e gnration, aux aminosides et aux quinolones doit tre dtermine par antibiogramme. Certaines souches de E. cloacae initialement sensibles au cfotaxime peuvent devenir rsistantes aux cphalosporines de troisime gnration au cours d'un traitement par une de ces cphalosporines. Il s'agit soit de l'induction d'une cphalosporinase chromosomique, soit de la slection d'un mutant drprim produisant haut niveau cette cphalosporinase. L'enzyme en cause est une bta-lactamase de la classe 1 de Richmond et Sykes. Elle inactive les molcules rcentes l'exception de l'imipnme. Elle n'est pas inhibe par l'acide clavulanique. L'induction peut tre dtecte sur antibiogramme en plaant un disque de cfoxitine, trs inductrice, ct d'un disque de cfotaxime.

Chapitre XIV - Klebsiella - Enterobacter - Serratia

189

Ce mcanisme de rsistance, frquent chez E. cloacae, peut aussi tre rencontr chez les principales espces de Enterobacteriaceae sauf E. coli et Shigella et chez Pseudomonas aeruginosa.

GENRE SERRATIA
I - DFINITION ET CLASSIFICATION Les Serratia sont des Enterobacteriaceae gnralement mobiles. Elles donnent parfois des colonies pigmentes en rouge. Elles sont VP (+), ONPG (+) et produisent de nombreux enzymes extracellulaires. Elles ne possdent pas d'ADH, ni de TDA, ni d'urase et ne produisent pas d'H^S. Huit espces sont actuellement reconnues : S. marcescens, S. liquefaciens (antrieurement classe comme Enterobacter), S. plymuthica, S. rubidaea, S. odorifera et S.fcaria, S.fonticola et S. entomophila. II - HABITAT ET PIDMIOLOGIE Les Serratia sont des bactries de l'environnement trouves sur le sol et sur les plantes. S. marcescens est une espce ubiquitaire qui est la seule jouer un rle important comme pathogne opportuniste. Les souches pigmentes sont rpandues dans la nature, mais rarement isoles en milieu hospitalier ; les souches non pigmentes sont frquemment isoles en milieu hospitalier. Elles sont beaucoup plus rsistantes aux antibiotiques. Les Serratia sont les Entrobactries les plus rsistantes aux agents physiques et chimiques. Elles peuvent survivre des mois dans l'eau distille et se multiplier dans des solutions antiseptiques : ammoniums quaternaires, chlorhexidine. Elles se multiplient bien +4C. Elles sont tues par la chaleur ou l'eau de Javel. Les infections hospitalires peuvent tre en relation avec des antiseptiques ou des flacons contamins, mais la transmission manuporte semble la plus frquente. III - POUVOIR PATHOGNE Les Serratia sont peu pathognes pour les sujets sains. Aujourd'hui, elles sont responsables d'infections hospitalires parfois pidmiques, particulirement S. marcescens. La localisation de l'infection dpend de la nature de l'activit du service hospitalier : infections urinaires aprs manoeuvres instrumentales ; infections respiratoires dues l'emploi d'appareils de ventilation artificielle ou par arosols ; surinfections des plaies par des antiseptiques contamins ; septicmies compliquant les infections prcdentes ou conscutives l'usage de cathters. En dehors des infections acquises l'hpital, des infections graves Serratia (endocardites, ostomylites) ont t observes chez les hronomanes. S. plymuthica et S.fcaria n'ont pas de pouvoir pathogne connu pour l'homme.

190

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

IV - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES Certaines souches de S. marcescens, isoles plus souvent de l'environnement que chez l'homme, produisent un pigment rouge, la prodigiosine. La majorit des souches de S. marinorubra et de S. plymuthica produit un pigment ros ou rouge. La plupart des souches de Serratia donne sur antibiogramme une zone d'inhibition autour de la colistine avec une repousse en cocarde autour du disque. Cet aspect peut parfois s'observer avec d'autres espces bactriennes. Les caractres distinctifs des diffrentes espces de Serratia sont indiqus dans le tableau V. A noter que : S. marcescens est raffinose (-) et arabinose (-), S. liquefaciens est adonitol (-), arabinose (+), 5. rubidaea est ODC (-) et sorbitol (-), S. odorifera produit de l'indole.
TABLEAU V CARACTRES DISTINCTIFS DES DIFFRENTES ESPCES DE SERRATIA Pigment ODC Adonitol Raffinose Arabinose Sorbitol Indole S. marcescens d + + + S. liguefaciens + + + + + + d S. plymuthica " d S. rubidaea + + + + S. odorifera

d +

d + + +

Pour des tudes pidmiologiques, il est possible de caractriser les souches de S. marcescens par biotypie ou par srotypie. V - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES Les Serratia sont parmi les espces bactriennes les plus rsistantes aux antibiotiques. Elles ont une rsistance naturelle la cphalotine, la colistine et aux ttracyclines. Certaines souches sont rsistantes aux cphalosporines de 3e gnration soit par production d'une cphalosporinase, soit par diminution de la permabilit. Parmi les Serratia, des souches pratiquement rsistantes tout peuvent se rencontrer. Elles posent des problmes thrapeutiques difficiles.

GENRE HAFNIA
Ce genre est form d'une seule espce, Hafnia alvei, antrieurement dsigne comme Enterobacter alvei. Hte normal du tube digestif de l'homme et des animaux, H. alvei peut tre isole lors d'infections opportunistes. Les caractres biochimiques de H. alvei, notamment le VP, sont plus rgulirement positifs aprs une incubation 22C qu' 37C. H. alvei est mobile

Chapitre XIV - Klebsiella - Enterobacter - Serratia

191

22C et souvent immobile 37C. Les ractions suivantes sont positives : LDC, ODC, ONPG (exceptions), arabinose, mannitol. H. alvei est parfois confondue avec des Salmonella Hy3 ngatives.

BIBLIOGRAPHIE
GRIMONT, P.A.D., Th genus Serratia , Ann. Rev. Microbiol., 1978, 32, 221-248. PECHRE J.-C., La rsistance 'Enterobacter cloacae acquise au cours des traitements par les nouvelles bta-lactamines, Med. Mal. Infect., 1986,16, 661-665. RICHARD C., ALONSO J.M., Une Entrobactne mconnue : Enterobacter hafniae ,Bull. Inst. Pasteur, 1976,74, 339 352. RICHARD C., Bactriologie et pidmiologie des espces du genre Klebsiella ,Bull. Inst. Pasteur, 1982, 80, 127-145. RICHARD C., GRIMONT P.A.D., Klebsiella, Enterobacter, Serratia in Bactriologie mdicale, Le Minor et Vron, Flammarion, Paris, 1990.

Chapitre XV PROTEUS - PROVIDENCIA MORGANELLA

I - DFINITION Ce groupe d'Enterobacteriaceae rassemble des espces qui ont en commun de possder des enzymes permettant la dsamination oxydative des acides amins en corps ctoniques. Ceux-ci forment des complexes colors avec les ions Fe"1"1"1". Deux de ces enzymes sont recherches en pratique courante. Ce sont : - la tryptophane-dsaminase ou TDA, - la phnylalanine-dsaminase ou PDA. Dans la suite de ce chapitre, ce groupe de bactries sera dsign comme Entrobactries TDA+ . C'est un groupe trs htrogne . Ces bactries sont en gnral mobiles, donnent des colonies lactose ngatif et sont ONPG ngatif. II - CLASSIFICATION Les travaux de taxonomie bass sur les ractions d'hybridation du DNA ont montr que : - Les souches antrieurement dsignes comme Proteus morganii n'appartiennent pas au genre Proteus. Elles forment le genre Morganella. - Les souches dsignes comme Proteus rettgeri doivent tre classes dans le genre Providencia. La classification actuelle du groupe des Entrobactries TDA+ est la suivante : - genre Proteus, 4 espces : P . mirabilis, P . v u l g a r i s , P. penneri et P. myxofaciens. Cette dernire n'a pas d'intrt mdical. - genre Providencia, 4 espces : P. alcalifaciens, P. stuartii, P. rettgeri et P. rustigianii (proche de P. alcalifaciens) - genre Morganella, une seule espce : M. morganii III - HABITAT Les Entrobactries TDA+ sont extrmement rpandues dans l'environnement. On les trouve partout, sur le sol, dans les eaux de surface, dans les eaux d'gout etc. Ce sont des htes habituels du tube digestif de l'homme et des animaux.

Chapitre XV - Proteus - Pravidencia - Morganella

193

IV - POUVOIR PATHOGNE Ces bactries sont avant tout responsables d'infections urinaires. P. mirabilis est de loin l'espce la plus frquente. Les espces rencontres ensuite sont M. morganii et les Providencia. Une anomalie de l'appareil urinaire ou un diabte sont des circonstances favorisant la survenue de ces infections qui peuvent tre l'origine de septicmies. Ces bactries sont aussi isoles de produits pathologiques varis : scrtions tracho-bronchiques, brlures, pus divers. Des mningites Proteus ont t dcrites chez le nourrisson. Le pouvoir entropathogne des Proteus et des Providencia est trs discutable. Ces espces sont souvent prsentes en grande quantit dans les selles lors des diarrhes par dysmicrobisme intestinal. En raison de la grande frquence des Entrobactries TDA+ dans l'environnement, il y a toujours lieu de s'interroger sur la qualit des prlvements avant d'attribuer un rle pathogne aux souches isoles. V - PHYSIOPATHOLOGIE Plusieurs facteurs contribuent ce que les Entrobactries TDA+ du groupe Proteus -Providencia soient uropathognes. - L'urase que possdent la plupart des souches transforme l'ure en hydroxyde d'ammonium. Il s'en suit une lvation du pH de l'urine, ce qui altre les cellules rnales et favorise la formation de calculs. - P. mirabilis possde des pili qui en augmentant leur adhrence aux cellules pithliales favorisent la survenue d'une pylonphrite ascendante. - La grande mobilit des Proteus favorise leur diffusion dans l'appareil urinaire. Des travaux exprimentaux ont montr que des souches mises en contact avec des anticorps antiflagelles perdaient leur aptitude provoquer une infection ascendante. VI - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A Morphologie P. mirabilis et P. vulgaris sont des bacilles trs polymorphes (d'o la rfrence Prote). Dans une culture jeune, il peut exister des formes courtes et des formes longues. Les souches trs mobiles sont pourvues de longs flagelles.

194

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

B - Caractres culturaux - En bouillon, les cultures se dveloppent en donnant souvent un voile en surface. - En milieu glose, P. mirabilis et P. vulgaris peuvent envahir la surface du milieu en formant des ondes concentriques. Cet essaimage, ou swarming, est d la grande mobilit de la bactrie. L'envahissement des cultures par les Proteus peut tre rduit par la prsence dans le milieu de sels biliaires ou de dtergents, par accroissement de la teneur en glose ou par une diminution de la teneur en NaCl (milieu CLED = Cysteine Lactose Electrolyte Dficient). - Phnomne de Dienes Les cultures en nappe par essaimage de deux souches diffrentes de Proteus ne s'interpntrent pas et sont spares par une zone troite sans culture. Ce phnomne peut tre utilis pour comparer des souches isoles d'un mme secteur hospitalier. C - Caractres biochimiques 1. Genre Proteus Les Proteus sont caractriss par leur urase trs active (exceptions), la production d'H^S, d'une glatinase et leur pouvoir glucidolytique faible. - P. mirabilis est indole (-) et ODC (+) - P. vulgaris est indole (+) et ODC (-) - P. penneri est indole (-) et ODC (-), H^S (d) toujours rsistant au chloramphnicol
TABLEAU

DIAGNOSTIC D'ESPCES DES PROTEUS, PROVIDENCIA ET MORGANELLA


P. mirabilis Essaimage Production d-HaS Urase + + + . + P. vulgaris + + + + P. penneri + d + P. alcaUfaciens + + + P. rettgeri + + + + P. stuartii d + + P. rustigianii + + M.morganii + + + + -

Indole

ODC Mannosc Adonitol

2. Genre Providencia Ces souches produisent de l'indole, mais pas d'H^S, de LDC, d'ODC, ni d'ADH. P. alcalifaciens est urase (-), adonitol (+), et trhalose (-) ; P. rettgeri est urase (+), adonitol (+) et trhalose (-) ; P. stuartii est urase variable, adonitol (-) et trhalose (+) ; P. rustigianii est urase (-), adonitol (-) et trhalose (-). 3. Genre Morganella M. morganii est indole (+), ODC (+), urase (+) et H^S (-). Cette espce a une trs faible activit glucidolytique.

Chapitre XV - Proleus - Providencia - Morgonella

\ 95

VII - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES Les Entrobactries TDA+ ont une rsistance naturelle la colistine et la ttracycline. Il est classique d'opposer les Proteus indole (-) (gnralement plus sensibles aux antibiotiques, notamment les bta-lactamines) aux Proteus indole (+) souvent multirsistants. P. stuartii et M. morganii peuvent poser des problmes difficiles d'antibiothrapie. Ils restent nanmoins gnralement sensibles l'amikacine et aux cphalosporines de 3e gnration. A l'exception des souches de Providencia, les Entrobactries TDA+ sont habituellement sensibles aux nouvelles fluoroquinolones.

BIBLIOGRAPHIE
WARREN J.W., Providencia stuartii : a common cause of antibiotic-resistant bacteriuria in patients with long-term indewelling cathters , Rev. Infect. Dis., 1986, 8, 61-67.

Chapitre XVI YERSINIA

HISTORIQUE
Le genre Yersinia, du nom du bactriologiste Alexandre Yersin qui le premier a isol en 1894 le bacille de la peste, a t propos en 1944 et officialis en 1974 aprs le dmembrement du genre Pastewella. En 1883, Malassez et Vignal ont isol Pasteurella pseudotuberculosis chez des cobayes prsentant des lsions pseudo-tuberculeuses du foie, de la rate, et des ganglions ; cette bactrie tait responsable d'pizooties en particulier chez les rongeurs et le rle de Y. pseudotuberculosis en pathologie humaine a t montr partir de 1954. Dans les annes 1960, Y. enterocolitica a t responsable d'pizooties atteignant des levages de chinchillas en Europe Occidentale et est depuis cette date isole dans un nombre croissant de cas humains. Actuellement, le bacille de la peste n'occupe plus la place qui fut la sienne pendant des sicles et le devant de la scne est occup de faon nettement moins spectaculaire par V. enterocolitica.

1 - CARACTRES GNRAUX DU GENRE Le genre Yersinia regroupe des bacilles droits, parfois cocco-bacillaires, Gram ngatif, avec une tendance la coloration bipolaire, de 0,5-0,8 (-un x 1-3 u.m, non capsuls, non sporuls, immobiles 37C, mobiles au-dessous de 30C par une ciliature pritriche. Cependant Y. pestis est toujours immobile. Les Yersinia prsentent les caractres gnraux des Enterobacteriaceae auquel le genre appartient avec cependant des particularits comme l'expression de caractres phnotypiques dpendant de la temprature. II - TAXONOMIE ET NOMENCLATURE Le genre Yersinia est constitu de plusieurs espces qui peuvent tre spares en deux groupes : d'une part les espces virulentes Y. pestis (bacille de Yersin), Y. pseudotuberculosis (bacille de Malassez et Vignal) et Y. enterocolitica (srogroupes 0:3, 0:8, 0:9 et 0:5,7) ; et d'autre part les espces non virulentes pour l'homme : Y. enterocolitica des autre srogroupes, Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. kristensenii, Y. aldovae. Y. ruckeri, pathogne pour les poissons, n'appartiendrait pas au genre Yersinia. Deux nouvelles espces , Y. mollaretii et Y. bercovieri ont t rcemment dcrites. Y. pestis et Y. pseudotuberculosis sont deux espces trs proches sur le plan gntique (homologie d'hybridation ADN-ADN trs leve) et pourraient tre deux variants pathognes d'une mme espce.

Chapitre XVI -Ygrsaua_________________________________________________________197

III - HABITAT ET PIDMIOLOGIE Les bactries du genre Yersinia ont une vaste distribution et peuvent tre isoles dans le sol et chez de nombreuses espces animales. Les espces pathognes atteignent diverses espces animales et occasionnellement l'homme. A - Le bacille de la peste Y. pestis, est prsent essentiellement chez les rongeurs. Des dizaines d'espces prsentes sur tous les continents peuvent tre infectes. La dispersion de la maladie est assure par le couple rongeur-puce et l'pidmiologie de la peste est troitement lie l'cologie des rongeurs et de leurs puces. La bactrie survit plusieurs mois dans le sol, et les terriers contamins par les cadavres de rongeurs et de puces constituent le rservoir de bactries. Lorsque la maladie animale atteint les rongeurs des villes, en particulier les rats, la contamination de l'homme devient possible par l'intermdiaire de la piqre de puce. La peste a disparu d'Europe au dbut du sicle mais elle est encore observe en Afrique (Centrale, de l'Est, du Sud), en Asie (du Sud-Est, en U.R.S.S., en Iran), et en Amrique du Nord et du Sud, sous forme enzootique. Les souches de Y. pestis prsentent des caractristiques biochimiques particulires en fonction de leur distribution gographique : le biovar antiqua est observ en Asie Centrale et en Afrique Centrale ; le biovar medievalis est rencontr en Iran et en U.R.S.S. ; le biovar orientalis (ou oceanic) a une distribution mondiale. B - Y. pseudotuberculosis Cette espce a comme rservoir le sol et les animaux contamins partir du sol comme les rongeurs et les oiseaux. D'autres espces animales peuvent tre concernes. La maladie chez l'homme est observe au cours de la saison froide aprs contact direct avec les animaux porteurs qui liminent Y. pseudotuberculosis dans les fces. Des animaux proches de l'homme comme le chat (chasseur de rongeurs et d'oiseaux) et des petits rongeurs de loisirs entretenus la maison jouent un rle non ngligeable. La maladie est aussi observe au printemps aprs contamination partir du sol ou d'aliments ou de vgtaux contamins par les excrments de micromammifres ou d'oiseaux. Ceci fait de l'infection par Y. pseudotuberculosis une saprozoonose pseudotellurique, maladie commune l'animal et l'homme avec un rservoir commun constitu par le milieu extrieur.
C - y. enterocolitica

Cette espce possde une distribution et un rservoir beaucoup plus vastes. De plus l'htrognit qui sera dcrite sur le plan biochimique existe galement au point de vue pidmiologique. Y. enterocolitica a t isol chez des rongeurs, des micromammifres, chez le porc, dans les eaux, le sol, les aliments. Il existe des souches adaptes un environnement ou un hte (homme ou animal) et des souches non adaptes rencontres dans le sol, l'eau, le tube digestif des micromammifres. Y. enterocolitica est pathogne pour les chinchillas, les livres, les singes et l'homme. Les souches de biovar 5 sont rencontres chez le livre en Europe, celle de biovar 3 chez le chinchilla. Les souches de biovar 4, srogroupe 0:3, de biovar 3, srogroupe 0:5 et de biovar 2 srogroupe 0:9 sont les plus frquentes chez l'homme en Europe ; celles de srogroupe 0:8 sont plus frquemment isoles au U.S.A. La maladie humaine est surtout observe depuis 1960 et l'augmentation de la prvalence des infections Y. enterocolitica chez l'homme peut tre attribue d'une part la particularit de l'espce de se multiplier basse temprature et d'autre part

198

Sctton IV - ENTEROBACTERIACEAE

la prsence frquente de Y. enter ocolitica dans certains aliments (vgtaux, viandes et charcuteries, lait et drivs). Ceci est en relation avec l'importance prise par la chane du froid pour la conservation des denres alimentaires en milieu familial, avec des changements d'attitudes alimentaires et la consommation de nombreux vgtaux crus, avec la gnralisation de la restauration collective qui amplifie les deux lments prcdents. La contamination se fait donc essentiellement par voie digestive ; exceptionnellement les voies sous-cutane, oculaire, et aprs griffure de chat ont t observes. Les espces Y. intermedia, Y. kristensenii, et Y. frederiksenii prsentes dans le milieu extrieur (dans l'eau, le sol) et occasionnellement isoles chez l'homme sont considres comme non pathognes. IV - POUVOIR PATHOGNE NATUREL A - Y. p e s t i s C'est l'agent de la peste, maladie avant tout des rongeurs sauvages transmise d'animal animal par la puce. Chez cette dernire la bactrie se multiplie et engorge l'oesophage et le pharynx ; la contamination se fait lors du repas au cours duquel la puce rgurgite les bactries. L'homme est un hte accidentel choisi par Xenopsylla cheopis (la puce du rat) lorsqu'elle n'a pas d'autre hte disponible (lorsque les populations de rats sont dcimes). D'autres arthropodes peuvent plus rarement servir de vecteurs. L'infection aprs piqre de puce se traduit par la forme bubonique typique. La bactrie se multiplie localement et est dissmine par voie lymphatique. Les ganglions du territoire de la piqre, enflamms et hypertrophis, constituent le bubon. La maladie volue sous forme septicmique avec parfois localisation pulmonaire secondaire. La contamination interhumaine peut s'effectuer par dispersion partir des scrtions bronchopulmonaires d'un sujet prsentant une localisation pulmonaire secondaire. Elle entrane alors chez le sujet neuf ainsi contamin une forme pulmonaire primitive. Ce mode d'infection par arosol a pu exceptionnellement tre observ lors du travail en laboratoire.
B - Y. enterocolitica et Y. pseudotuberculosis.

Elles sont responsables des yersinioses, regroupant des manifestations pathologiques varies. Les infections Y. enterocolitica sont les plus frquentes.
1. Manifestations digestives

Ce sont les plus anciennement connues et de loin les plus frquentes (grands enfants, adolescents et adultes). L'adnolymphite msentrique est la forme la plus classique observe avec les deux espces, se traduisant par un syndrome abdominal aigu douloureux de la fosse iliaque droite, pouvant tre confondu avec une appendicite aigu. L'infection sous forme d'ilite aigu est moins frquente. Chez le jeune enfant (jusqu' 6 ans environ), Y. enterocolitica est responsable de gastro-entrites dont le tableau clinique est comparable celui observ avec les autres bactries intestinales : fivre, douleurs abdominales, diarrhe.

ChapitteXVI-ro-wufl

199

2. Septicmies Les formes septicmiques sont plus rares et sont observes sur un terrain particulier (cirrhose, diabte, hmochromatose, hmopathies,...). Les infections systmiques sont plus frquentes chez des sujets prsentant une surcharge en fer. Le tableau clinique habituel des septicmies peut s'accompagner de localisations secondaires (hpatiques, abdominales, ganglionnaires). En raison de son aptitude se multiplier dans les poches de concentrs globulaires conservs + 4C Y. enter-ocolitica peut tre responsable de chocs septiques transfusionnels conscutifs une bactrimie chez le donneur.
3. Manifestations extra-digestives

Elles sont provoques le plus souvent par un processus auto-immun : - rythme noueux survenant aprs une infection Y. pseudotuberculosis chez l'enfant entre 8 et 15 ans ou aprs une infection Y. enterocolitica chez la femme aprs 50 ans, - polyarthrites ou arthrites ractionnelles succdant un pisode d'entrite aigu mais concernant dans la plupart des cas les sujets porteurs de l'antigne HLA-B27. D'autres manifestations ont t occasionnellement dcrites reposant sur des arguments srologiques, syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter, cardite, glomrulonphrite, thyrodite. La fivre scarlatiniforme d'Extrme-Orient due Y. pseudotuberculosis et dcrite depuis une trentaine d'annes dans la partie la plus orientale de l'Union Sovitique n'a pas encore t observe en Europe. V - PHYSIOPATHOLOGIE - FACTEURS DE VIRULENCE Les Yersinia pathognes possdent en commun plusieurs facteurs de virulence. Y. enterocolitica fut la premire espce pour laquelle les capacits invasives ont t rattaches la prsence d'un plasmide, mcanisme maintenant commun aux Shigella, Salmonella et aux souches entro-invasives d'E. coll. Un plasmide de virulence (pYV) de 70 kb est prsent dans les souches pathognes. Plusieurs gnes plasmidiques codent des protines de la membrane externe (Yop) dont l'antigne V ou W ; la synthse de ces protines est ralise 37C en absence d'ions calcium, mais pas ou peu 28C. Ces protines permettraient de rsister la phagocytose. La protine PI, produite indpendamment des ions calcium est constitue de sous-units recouvrant, sous forme de fibrilles, la surface des bactries. Code par pYV, cette protine serait le support de l'adhsion et protgerait la bactrie de l'action bactricide du srum. Deux gnes chromosomiques responsables de l'invasion ont t identifis. L'un, inv, prsent chez Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica code une protine de 103 kDa ou "invasine", produite 28C, prsente la surface de la bactrie et dans la membrane externe. L'autre gne chromosomique d'invasion est le gne ail (locus d'attachement et d'invasion) qui code une protine de 17 kDa produite 37C. Seules les souches pathognes possdent ail alors que le gne inv est prsent mais non fonctionnel chez les souches non pathognes (de l'environnement) de Y . enterocolitica. Les souches trs virulentes, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica 0:8, possdent des protines de haut poids molculaire (190 kDa) synthtises dans un milieu carence en fer. Le gne est absent chez les autres espces et chez Y. enterocolitica 0:3 et 0:9.

200

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

Y. enter ocolitica produit 28C une entrotoxine aux proprits identiques celles de l'entrotoxine thermostable (ST) de E. coli. Le rle de l'entrotoxine dans la pathognie de l'infection n'est pas clairement tabli car elle n'est pas produite une temprature suprieure 30C. L'urase, par les altrations de la muqueuse produites par l'ammoniaque libr partir du contenu intestinal, participerait la colonisation bactrienne. De nombreux facteurs vont donc participer la virulence de Y. enterocolitica et Y. pseudotuberculosis. L'atteinte de la lamina propria s'effectuerait par l'intermdiaire de cellules pithliales spcialises dpourvues de bordure en brosse recouvrant les plaques de Peyer (cellules M) ou par l'intermdiaire des entrocytes. Chez l'animal de laboratoire les espces virulentes sont Y. p e s t i s , Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica (srotypes 0:8, 0:9 et 0:3). Chez l'homme, en particulier chez l'enfant, l'infection Y. enterocolitica ralise un tableau de gastro-entrite et des signes d'infection systmique. La bactrie provoque une diarrhe selon un mcanisme entro-invasif. La porte d'entre se situe sur l'ilon terminal et le caecum au niveau desquels sont observes les principales lsions sous forme de zones inflammatoires et d'ulcrations dans la zone des plaques de Peyer. Les bactries ont une multiplication intra-cellulaire dans les cellules de la muqueuse formant des granulomes inflammatoires et des micro-abcs qui voluent vers la ncrose entranant ulcrations et hmorragies. Les ganglions msentriques sont aussi le sige d'une multiplication bactrienne dans les cellules mononucles avec formation de granulomes inflammatoires ; l'adnite msentrique peut parfois prsenter un aspect pseudotumoral. VI - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE A - Les produits pathologiques Le cas particulier de la peste ne sera pas envisag ici. Les principaux prlvements sont les selles, les ganglions msentriques (plus particulirement pour Y. pseudotuberculosis), l'appendice, le sang pour hmoculture et tout autre prlvement selon les localisations. Les prlvements peuvent tre conservs au froid, qui, pour les produits plurimicrobiens, est utilisable comme moyen d'enrichissement. B - Examen direct - Morphologie Les Yersinia sont de petits bacilles Gram ngatif, parfois coccodes dont la morphologie est proche de celle des Pasteurella. Une coloration bipolaire est dcelable, elle est plus prononce pour Y. pestis et Y. pseudotuberculosis. Les bactries sont mobiles 22 - 29C, mais immobiles 37C. Y. pestis est toujours immobile. C - Culture - Caractres culturaux La culture est possible sur milieux ordinaires (glose nutritive). En 24 heures 37C, les colonies sont le plus souvent la limite de la visibilit ; elles augmentent de taille en prolongeant l'incubation et peuvent ainsi tre repres beaucoup plus facilement. Toutes les espces, aprs 48 heures d'incubation, prsentent un certain polymorphisme des colonies. Y. enterocolitica et Y. pseudotuberculosis sont des espces psychrophiles et peuvent se multiplier des tempratures comprises entre + 4 et + 10C. Les chantillons non contamins sont mis en culture sur les milieux usuels. Pour la recherche de Yersinia dans les produits plurimicrobiens (selles, aliments,

Chapitre XVI -Yersinia

201

environnement...) des mthodes d'enrichissement peuvent tre utilises, en particulier l'incubation basse temprature (+ 4C) pendant plusieurs jours ou semaines en milieu liquide (eau peptone, tampon PBS). La recherche de Y. enterocolitica par coproculture est facilite par l'utilisation de milieux de slection. Les milieux slectifs contenant des sels biliaires (glose Mac Conkey, Hektoen, Wauters, SS, DCL) sont utilisables et incubs 30C. Il existe aussi des milieux rendus slectifs par l'adjonction d'antibiotiques (milieu CIN : cefsulodine, irgasan, novobiocine) permettant de dtecter de faibles quantits de Y. enterocolitica dans les selles. Y. enterocolitica est prsente dans les selles au cours de la diarrhe et peut y persister plusieurs semaines ou plusieurs mois aprs la gurison clinique. Elle pourra tre recherche distance des manifestations aigus, en particulier lors d'atteintes auto-immunes. Par contre, Y. pseudotuberculosis ne persiste pas dans le tube digestif aprs la cessation de l'pisode diarrhique et n'est plus retrouve dans les selles lorsque se manifeste l'adnite msentrique. D - Identification Les Yersinia prsentent les caractres gnraux des Enterobacteriaceae : il s'agit de bacilles Gram ngatif, aro-anarobies facultatifs, fermentant le glucose, oxydase ngative et rduisant les nitrates en nitrites (sauf Y. pestis var. medievalis et le biovar 5 de Y. enterocolitica). Les lments importants de l'identification sont : l'absence de mobilit 37C et la mobilit en-dessous de 29C. Selon les souches, la mobilit peut ne pas tre observe lors de l'isolement et peut n'apparatre qu'aprs plusieurs subcultures. La raction de l'urase est toujours fortement et rapidement positive (sauf Y. pestis). Le test l'ONPG est positif mais les souches ne possdent pas de bta-galactosidase. L'absence de lysine-dcarboxylase, d'arginine-dihydrolase, de phnylalaninedsaminase est constante. La production de H^S et la culture sur citrate de Simmons sont ngatives. Il convient de souligner l'aspect thermo-dpendant des caractres phnotypiques en particulier pour Y. enterocolitica. Certains caractres comme la production d'actone ou d'acide seront plus nettement et plus rapidement positifs aprs incubation une temprature infrieure 30C. Les principaux caractres des espces du genre Yersinia sont prsents dans le tableau I. L'htrognit biochimique de Y. enterocolitica permet de dfinir 5 chimiotypes (ou biovars) sur la base de caractres variables (production d'indole, fermentation du xylose, prsence d'une lipase, rduction de l'esculine) (Tableau II). Il n'existe pas d'espce animale assez sensible pouvant aider l'identification des souches de Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica. Les principaux lments du diagnostic diffrentiel devant une colonie lactose ngative, et positive pour l'urase reposent sur la recherche de caractres propres aux Proteus (PDA ou TDA, production d'H^S). D'autres espces comme les Enterobacter seront diffrencier de Y. enterocolitica. Enfin les autres espces de Yersinia, considres il y a peu comme des souches atypiques de Y. enterocolitica, sont parfois d'identification moins aise (voir Tableau I).

202

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

TABLEAU 1 CARACTRES DIFFRENTIELS DES ESPCES DU GENRE YERSINIA Y. Y. Y. pestis pseudotuberculosis enterocolitica Mobilit (25C) Lysinedcarboxylase Ornithinedcarboxylase Urase Citrate Simmons (25C) VosgesProskauer(25 0 Production indole GT Acidification .rhamnose .saccharose . a mthyl D glucoside . sorbitol . raffinose . mlibiose Test ONPG + . + . d + + d + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + d + + + + + + + d + + + + + + Y. Y. intermedia frederiksenii + + Y "Y. kristensemi ruckeri" + d + + + d + +

d +

d + +

TABLEAUn DIFFRENTS CHIMIOTYPES (BIOVAR) DE YERSINIA ENTEROCOLITICA Caractres 1 Production indole Dsoxyribonuclase Lipase (Tween 80) Rduction nitrate en nitrite Acidification : . D xylose . Saccharose . D-trhalose + + + + + + + + + + + 2 + Biovar 3 4 + 5 +

+ +

+ +

+ +

E - Classification - srotypes - lysotypes La structure antignique des Yersinia est complexe ; elles possdent l'antigne commun des Entrobactries. Certains antignes sont des dterminants de virulence (fraction 1 d'antigne d'enveloppe, antignes V et W) et ont t voqus dans le chapitre correspondant. Les souches des deux espces, Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica sont classes en srotypes en fonction de la spcificit de leurs antignes somatiques. Y. pseudotuberculosis a t divise en six types (I VI) selon les antignes 0. Le chimiotype 1 est le plus frquent. Il existe des ractions croises entre le type II et le groupe B des Salmonella, le type IV et le groupe D des Salmonella, le type VI et E. coli 055. Il existe 5 antignes flagellaires (a e). Chez Y. enterocolitica, 34 antignes 0 et 20 antignes H ont t dcrits. Ils dfinissent des srogroupes utiles pour les tudes pidmiologiques. Un petit nombre de srogroupes est associ une pathologie humaine ou animale. Une modification de la distribution des types des souches isoles dans les selles chez l'homme est observe depuis 1985. En effet, si 0:3 est toujours le plus frquent, 0:9 semble en rgression et

Chapitre XVI -Yersuua

203

il y a une notable augmentation des souches de chimiotype 1 (0:6 ; 0:5...), rputes non pathognes, dans d'authentiques syndromes diarrhiques. Il existe une distribution gographique particulire ; les souches 0:3 et 0:9 sont rencontres en Europe, alors que les souches 0:8 sont les plus frquentes aux USA. Il existe des ractions croises entre les Brucella et Y. enterocolitica 0:9. Les tudes pidmiologiques peuvent tre compltes par la lysotypie et il existe deux schmas de classification dont l'un, franais, reconnat 10 lysotypes (I X). F - Diagnostic indirect Les recherches srologiques sont utiles au diagnostic lors de manifestations extra-digestives. Elles explorent la prsence d'anticorps agglutinants ou d'anticorps fixant le complment. Les antignes utiliss sont les antignes de type 1 V pour Y. pseudotuberculosis et les antignes 0:3 , 0:9 et 0:5 pour Y. enterocolitica dans une raction d'agglutination en tube ou de microagglutination. La technique ELISA est utilisable. Les titres suprieurs ou gaux 200 par la technique d'agglutination classique et 40 par microagglutination sont considrs comme significatifs. Les ractions croises entre le type 0:9 et les Brucella sont observes avec les deux mthodes. D'autres ractions antigniques croises notamment avec les Salmonella du groupe B ou du groupe D, et la prsence d'anticorps chez des sujets apparemment sains font toute la difficult de l'interprtation de la srologie de routine. Il convient dans tous les cas de suivre l'volution des anticorps spcifiques. Les anticorps augmentent une semaine aprs le dbut des symptmes et atteignent leur sommet la deuxime semaine de la maladie.

VII - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE Y. pseudotuberculosis est habituellement sensible aux antibiotiques actifs sur les bacilles Gram ngatif : bta-lactamines, aminoglycosides, ttracyclines, Y. enterocolitica est naturellement rsistant l'ampicilline et aux cphalosporines de premire gnration par production la fois d'une bta-lactamase constitutive et d'une bta-lactamase (cphalosporinase) inductible. De rares souches prsentent une rsistance acquise d'autres antibiotiques. Comme pour les caractres biochimiques, l'expression de la rsistance est dpendante de la temprature. Lors d'infections graves, les antibiotiques utiliss seront choisis parmi ceux cits ci-dessus ou parmi les cphalosporines de troisime gnration associes ou non un aminoglycoside. Il n'existe pas de prvention spcifique des yersinioses.

BIBLIOGRAPHIE
CANTON Ph., ROCHE G., DUREUX J.B., Les Yersinioses , Rev. Praticien, 1983, 33, 2393-2411. COVER T.L, ABER R.C., Yersinia enterocolitica , New Engl. J . Med, 1989, 321, 16-24. MAZIGH D., Les dterminants de virulence des bactries pathognes du genre Yersinia Bull Inst. Pasteur, 1985,83,33-39.

204

Section IV - ENTEROBACTERIACEAE

MOLLARET H.H., ALONSO J.M., BERCOVIER H., Aspects biologiques, diagnostiques et cologiques des Yersinioses , Md. Mal. Infect., 1982,12, 664-667. MOLLARET H.H., WALLET P., GILTON A., CARNIEL E., DUEDARI N., Le choc septique transfusionnel Yersinia enterocolitica Med. Mal. Infect., 1989,19,186-192. MOLLARET H.H., CARNIEL E., GUILVOUT I., La fivre scarlatiniforme d'Extrme-Orient , Md. Mal. Infect., 1990, 20, 519-529. PIEMONT Y., RASOAMANANJARA D., MINCK R-, Interprtation de la srologie des Yersinioses, Problmes de ractions croises avec d'autres germes , Md. Mal. Infect., 1982,12, 668-671. A signaler : Les infections Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia enterocolitica , Numro spcial de la revue Mdecine et Maladies Infectieuse, 1982, 12 bis.

SECTION V AUTRES BACILLES A GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

Chapitre XVII LES VIBRIONS


DEFINITIONS ET CLASSIFICATION La famille des VIBRIONACEAE
Elle regroupe des bacilles Gram ngatif, mobiles par ciliature polaire ou mixte, aro-anarobies facultatifs, croissant sur milieux ordinaires, rduisant les nitrates en nitrites, fermentant les glucides et donnant une raction d'oxydase positive. Elle regroupe quatre genres : Vibrio, Plesiomonas, Aeromonas, Photobacterium. Les Vibrionaceae sont des bactries aquatiques. Les espces des genres Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas sont rencontres en pathologie humaine. Les bactries du genre Photobacterium sont des bactries de l'environnement. Le tableau ci-dessous indique les principaux caractres diffrentiels de ces quatre genres.
TABLEAU 1 CARACTRES DIFFRENTIELS DES DIFFRENTES VIBRIONACEAE Caractres Ciliature Oxydase Luminescence ADH Gladnase Halophihe Sensibilit 0/129 G+C pour 100 Vibrio Pm + Plesiomonas PI + + d 51 Aeromonas Pm + + + 57-63 Photobacterium

d + d +

Pm d + + + +
40-44 d : caractre variable

38-51

Pm : polaire monotriche

PI : polaire lophotnche

206

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

Le genre VIBRIO
Le genre Vibrio est maintenant bien individualis, d'une part des genres numrs prcdemment, d'autre part des Campylobacter et des Spirillum, grce des critres morphologiques, mtaboliques et au GC %., Campylobacter (28-35 %), Spirillum (36-65 %) Les Vibrio sont des bacilles Gram ngatif gnralement isols, droits ou incurvs, assez courts (1,5 3,0 |im), parfois franchement coccobacillaires. Quand ils sont cultivs en milieux liquides, ils sont mobiles par flagelles polaires entours d'une gaine, monotriches ou plus rarement multitriches. En milieux solides, co-existence possible d'un double systme de ciliature ; avec prsence, en plus des flagelles insertion polaire, de flagelles latraux nus, de longueur d'onde plus courte que les prcdents. Cette ciliature mixte s'accompagne souvent de phnomne d'envahissement (swarming). Chimio-organotrophes, anarobies facultatifs capables de mtabolisme respiratoire et fermentatif ne dnitrifient pas, ni ne fixent l'azote. Les Vibrio n'ont pas d'exigence nutritive particulire : ils sont isols sur milieux ordinaires. La croissance est abondante en milieux peptons simples. Mais les espces halophiles ont besoin de sodium pour une croissance optimale, la diffrence des espces halotolrantes ne ncessitant que de faibles concentrations en NaCl. Temprature de culture : 18-38C, dans une zone de pH comprise entre 6 et 9. On distingue des espces halotolrantes - V. cholerae - V. cholerae non 0:1 ou NC (non cholrique) ou NAG (non agglutinable par le srum polyvalent 0:1). - V. mimicus On distingue des espces halophiles
V. fluvialis V. metschnikovii V. anguillarum, V. vulnificus V. parahaemolyticus V.fischeri, alginolyticus, costicolus... - V. damsela - V. hollisae - V. furnissii

Une autre distinction peut tre faite selon que les espces sont retrouves ou non en pathologie humaine : - soit comme pathognes pour l'homme : V. cholerae, V. parahaemolyticus - soit comme saprophytes ou opportunistes : V. alginolyticus V. fluvialis V. metschnikovii V. furnisii V. mimicus V. vulnificus V. damsela V. hollisae

Chapitre XVH - Les Vibrions

207

VIBRIO CHOLERAE
C'est l'espce type du genre Vibrio. HISTORIQUE
Le cholra tait jusqu'en 1817 une maladie endmo-pidmique limite au delta du Gange avec quelques incursions en Chine et dans le Sud-Est asiatique. A partir de 1817 se dveloppe la premire des 6 pandmies dues au vibrion classique. C'est au cours de la 5e pandmie que Koch a dcouvert Calcutta (1884) l'agent du cholra: Komma Bacillus . Entre 1910 et 1960, part quelques pidmies (Egypte en 1957), le cholra semblait de nouveau limit aux Indes. A partir de 1961, s'est dveloppe la septime pandmie dont l'origine se situait dans l'archipel des Clbes (Indonsie). Elle est due un V. cholerae d'un biotype particulier, El Tor. Ce biotype isol pour la 1e fois en 1905 au Lazaret d'El Tor dans le Sina, avait t jusque l considr comme pathogne et non pidmique. Depuis cette date, cette souche s'est tendue dans le Sud-Est Asiatique, au Moyen Orient et au Continent africain (Afrique du Nord, Afrique Noire...) o il se maintient. Le continent Sud amricain est touch actuellement par cette pandmie (pidmie de cholra au Prou en 1991).

Le vibrion cholrique classique est rapparu en 1979 au Bangladesh. L'isolement partir de 1974 Guam de souches agglutinables par l'antisrum 0:1, mais non toxinognes, a fait reconnatre ct des V. cholerae toxinognes toutes 0:1 (2 biotypes : classique et El Tor), l'existence de : - V. cholerae 0:1 atypiques (du milieu extrieur) non toxinognes. - V. cholerae non-0:l (non agglutinable par 0:1) dj connus produisant des toxines responsables de diarrhes. 1 - HABITAT ET PIDMIOLOGIE L'agent du cholra est limin en grande quantit par les malades dans les selles, ainsi peut-on retrouver de 106 108 vibrions par ml de selles. Il est prsent galement dans les vomissements. On peut retrouver V. cholerae dans le milieu extrieur. Relativement fragile, ce germe persiste de faon phmre dans les eaux d'tangs ou de rivires. Sa survie est prolonge dans les eaux sales (lagune, ...) ; il peut y survivre plus de 15 jours. Il peut galement persister dans certains aliments frais (lait, poisson...) durant plus de deux semaines. L'homme est le principal rservoir de vibrions cholriques, qu'il soit malade ou porteur sain . Le vibrion est en gnral retrouv durant 6 10 jours chez le porteur, parfois plus longtemps (porteur chronique). La contamination peut se faire surtout par contact manuel direct avec un porteur et surtout avec un malade ou un cadavre. Des travaux rcents ont prouv l'existence d'une niche cologique naturelle ( ct du rservoir humain). Les eaux d'estuaire et le zooplancton (USA, Europe, Inde...) qui s'y trouvent, constituent un rservoir naturel de V. cholerae surtout non 0:1, mais parfois mme 0:1. Le zooplancton infect peut tre consomm par des fruits de mer (coquillages, crevettes, crabes et poissons) et les contaminer ; ceux-ci pourraient alors tre l'origine de cas sporadiques. De plus, dans un environnement dfavorable, les cellules de V. cholerae sont capables de se transformer en microvibrions filtrables potentiellement pathognes. Dans les rgions sches, la transmission est uniquement interhumaine. En zone humide (ctire, lagunaire ou fluviale) la transmission est mixte, interhumaine et hydrique.

208

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

En zone sche, les pousses sont plus explosives, pouvant toucher 30 voire 70 % de la population. Les circonstances favorisant la diffusion de la maladie sont lies au bas niveau socio-conomique et surtout aux mauvaises conditions de peuplement. Quelques cas de cholra sont observs annuellement en France chez des voyageurs provenant de pays contamins. Nombre de cas

Source : Bulletin pidmwtogique hebdomadaire n44 11 986 CHOLRA EN FRANCE (aot octobre 1986)

Mercredi 3 septembre 1986.. ALGRIE Le cholra a fait des dizaines de morts. Alger - De nombreux foyers de cholra se sont dclars dans diffrentes rgions d'Algrie, faisant plusieurs dizaines de victimes parmi plus d'un millier de cas recenss sur l'ensemble du territoire, depuis le dbut de l't. Aucune information officielle n'a t donne sur l'apparition de la maladie, ce qui engendre les rumeurs les plus alarmistes parmi la population. Le cholra a touch la plupart des rgions du pays, y compris la capitale, indiquent des sources mdicales qui se refusent toutefois parler d'pidmie. Des foyers de mningite et de typhode ont t galement recenss, en moins grand nombre cependant. Ces maladies, qui apparaissent chaque anne, ont pris des proportions plus importantes la faveur d'un t particulirement prouvant, marqu par une vague de chaleur sans prcdent, qui a aggrav les conditions d'hygine dj prcaires dans les campagnes et les quartiers populaires des grandes villes. Dans certaines villes de l'intrieur du pays, qui souffrent cruellement du manque d'eau, la temprature a dpass quarante degrs pendant plus d'un mois, alors qu' Alger mme, o des travaux sont engags pour rnover un rseau de canalisations vtusts, les coupures d'eau quotidiennes dans certains quartiers sont frquentes et souvent longues. La presse algrienne appelle les habitants respecter certaines rgles d'hygine pour se prmunir contre des maladies dont elle ne dit pas qu'elles aient fait des victimes. Elle a aussi violemment critiqu les responsables au niveau des communes, qui n'ont pas pris les mesures de prvention ncessaires en ne mettant pas d'eau de javel dans les rserves d'eau de boisson. Ces conseils semblent depuis avoir t suivis, notamment par les particuliers, puisque ce produit se fait rare aujourd'hui chez les droguistes - (AFP.)

II -

PHYSIOPATHOLOGIE

Aprs avoir franchi massivement la barrire gastrique, les vibrions se multiplient rapidement dans l'intestin ; ils traversent la couche de mucus et

Chapitre XVn - Les Vibrions

209

adhrent aux entrocytes par leurs antignes d'attachement. L'entrotoxine libre provoque le tableau du cholra. Les symptmes du cholra sont lis une fantastique perte de liquides et d'lectrolytes par l'intestin. Le volume quotidien des selles peut parfois dpasser 20 litres et la composition des selles est pratiquement isotonique. Cette fuite liquidienne n'est pas due une invasion des entrocytes de la muqueuse intestinale (pas de lsion de la muqueuse, pas de copro-leucocytes, pas de fivre, hmocultures ngatives), mais la production d'une entrotoxine CT (CT : choiera toxin) qui provoque l'accroissement du taux d'AMP cyclique dans les entrocytes entranant une fuite d'eau et d'lectrolytes dans la lumire intestinale. Ce mcanisme d'action est galement celui observ pour la toxine LT (proche antigniquement de la toxine CT) des E. coli E.T.E.C. Les IgG et IgA spcifiques prsentes dans l'intestin peuvent avoir une action neutralisante sur le germe et sa toxine. Les diarrhes dues aux Vibrio non-0:l sont provoques, soit par leur toxine cholrique, soit par des entrotoxines analogues celles d'E. coli. III - POUVOIR PATHOGNE

A - Exprimental 1. Chez les animaux II est impossible de reproduire le cholra chez des animaux adultes aprs administration de V. cholerae per os. Par contre, administr par cette voie des animaux nouveau-ns (lapin, chien) il est possible de reproduire la maladie. En injectant de la toxine CT (environ 1 p.g) dans des anses ligatures de lapin, on observe une fuite liquidienne vers la lumire intestinale. Ceci est obtenu tant avec la culture que le filtrat de culture de V. cholerae. Tout comme la toxine LT d'E. coli, l'exotoxine de V. cholerae produit un effet cytotonique sur cellules Yl surrnaliennes ou CHO (cellules ovariennes de hamster chinois).
2. Chez l'homme

Des essais aux USA ont t pratiqus sur des volontaires ingrant des souches de V. cholerae 0:1, - il faut 108 1011 germes pour provoquer une diarrhe svre chez 50 % des volontaires ; - par contre, si l'administration per os est accompagne de bicarbonate, 104 bactries suffisent pour provoquer une diarrhe svre chez 70 % des receveurs. En effet, l'acidit gastrique normale dtruit les vibrions. L'hypochlormie dans les tats de dnutrition peut expliquer galement la colonisation intestinale. Seules certaines souches non 0:1 peuvent produire des diarrhes exprimentales chez des volontaires mais des doses de 109. B - Naturel : 1. le cholra d V. cholerae 0:1 Le cholra est une maladie strictement humaine. La dure d'incubation varie de quelques heures 5 jours selon la dose infectante.

210

Section V - AUTRES BACILLES A GRAM NEGATIF AERO-ANAEROBIES

LE CHOLERA EN 1989 DANS LE MONDE

Tableau 1. - Situation mondiale du cholra, 1983-1989


1383 1384 1985 1386 1987 1988 1989

Nombre de pays nonfiani le chlorera Nofflore de nouveaux pays infenes Nomor as cas

36 34 30 35 1 2 6 4 0 6 1 28 893 40 510 46 473 48 507 44083 48 403 33 -

35 -

36 -

source : Bulletin Epidmiologique Hebdomadaire n 21/1990

1.1. Les formes graves Elles ralisent un tableau typique avec un dbut brutal domin par des douleurs pigastriques et abdominales, une sensation de malaise et une diarrhe entranant rapidement des pertes liquidiennes importantes avec risque de dshydratation aigu. A la phase d'tat, la diarrhe est caractrise par des selles afcales faites de liquide clair, avec des flocons blanchtres, aspect eau de riz . Elles sont sans odeur. Le nombre de selles est variable : 10 50 selles par jour (3 15 litres peuvent tre limins en 24 heures). Les selles sont mises de manire incoercible ; le patient a des crampes musculaires lies aux pertes lectrolytiques. Ce tableau ne s'accompagne pas de fivre, mais les vomissements sont frquents. En l'absence de rhydratation rapide et massive, l'volution se fait vers un collapsus cardio-vasculaire avec anurie et acidose.

1. 2. Les formes bnignes Elles ne sont pas exceptionnelles avec simple diarrhe (1 20 selles par jour), selles fcales, douleurs abdominales, sans vomissements et une dshydratation modre ou nulle. 1.3. Les formes atypiques Elles se voient surtout chez l'enfant, pouvant donner des formes pseudomninges. Chez l'adulte g ou dbilit on peut rencontrer des cas de cholra sec . La mort survient avant l'apparition de la diarrhe. Des formes typhodiques peuvent se rencontrer. Si le cholra est trait rapidement, la mortalit est de 1 5 % ; par contre, en l'absence de traitement, elle dpasse 50 % des cas. 2. Infections Vibrio cholerae non-0'.l Les srotypes de V. cholerae non-0:l sont responsables de pathologies digestives : gastro-entrites, diarrhes simples ou cholriformes. Les manifestations extra-intestinales sont observes surtout chez les immunodprims. Les infections de plaies ou d'oreille font suite des contacts avec l'eau de mer. IV - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES

A - Morphologie et caractres culturaux - Classiquement : bacilles Gram ngatif, incurv en virgule 2 p.m/0,5 |J.m, isol, parfois group par 2 ou plus, mobile par cil polaire unique, non sporul, non capsul. - Des morphologies atypiques peuvent tre observes : sphres, aspects en poires, formes longues, incurvation manquante, voire formes immobiles. - V. cholerae a un mtabolisme arobie prfrentiel, anarobie facultatif. H est peu exigeant temprature optimale 30-40C, rsiste 4C. . pH tolr 7,6-9,6, supporte les pH alcalins (milieux d'isolement) . halotolrant (0,5-7 % de NaCl), . rsiste la bile, aux sels biliaires et aux tensioactifs (milieux au Teepol) - Culture . milieux liquides : culture rapide avec voile en surface . milieux solides : en 24 heures, colonies plates et transparentes, gristres, aspect non iris en transillumination oblique. B - Caractres biochimiques - Mtabolisme respiratoire : oxydase (+), catalase (+), nitrate-rductase (+) - Mtabolisme glucidique : . glucose (+) ferment sans gaz, saccharose (+) . lactose (-) (ou lent), ONPG (+), arabinose (-) . VP(-) pour biotype classique, (+) pour El Tor

212

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

- Mtabolisme protique : . glatine (+), indole (+). En eau peptone nitrate, la prsence simultane de nitrite et d'indole produit en prsence d'^SO^ l'apparition d'une teinte ros ou choiera Roth . Cette raction historique n'est pas spcifique. . LDC (+), ODC (+), ADH(-) - Mtabolisme lipidique : . Estrase (+), lcithinase (+). - L'hmolyse des globules rouges varie avec l'espce animale et avec le biotype. V. cholerae est sensible au compos vibriostatique 0/129 (2,4 diamino-6,7 diisopropylptridine) et la novobiocine. Des souches rsistantes au 0/129 ont t isoles au Zare et en Cte d'Ivoire. On sait que in vitro la rsistance au 0/129 est transfrable d'E. coli V. cholerae. L'apparition de telles rsistances ne sauraient donc surprendre ; elle complique le diagnostic. C Diffrenciation en biovars

On distingue au sein de l'espce V. cholerae deux biovars, classique et El Tor. Les principales diffrences sont regroupes dans le tableau ci-dessous.
TABLEAU III DIAGNOSTIC DIFFRENTIEL ENTRE LES BIOVARS CLASSIQUE ET EL TOR Biovar Hmolyse (sang de mouton) Polymyxine B (50 UI) Cholraphages (Mukerjee) IV II V. cholerae classique sensible + V. cholerae El Tor + (- depuis 1970) rsistant

Rcemment une sonde oligonuclotidique correspondant au gne hly A codant llimolysine a permis de distinguer les deux biovars plus efficacement que les tests classiques. D - Constitution antignique

- Ag flagellaire H thermolabile, protique II n'est pas spcifique et des communauts antigniques avec d'autres vibrions existent. La srotypie n'est pas utilise en pratique. - Ag somatique 0 thermostable, polysaccharidique. Il existe plus de 100 srogroupes 0. Les souches pathognes de V. cholerae (biovar classique et El Tor) appartiennent au srogroupe 0:1 Ce srogroupe 0:1 comporte 3 spcificits antigniques a, b, c aussi bien pour classique que pour El Tor ; la combinaison des antignes aboutit l'individualisation de 3 srotypes, l'antigne a est toujours commun.
ANTIGENES COMBINAISON SEROTYPES Ogawa Hikojima Inaba

Chapitre XVH - Les Vibrions______________________________________________________213

Les srotypes Ogawa et Inaba sont le plus frquemment isols. Il existe des communauts antigniques entre 0:1 et d'autres espces bactries (certains srovars de Yersinia enterocohtica, Salmonella, Brucella), d'o des ractions croises possibles. E - Substances labores

Le vibrion cholrique labore de nombreuses enzymes extracellulaires (lcithinase, protase, neuraminidase et mucinase) qui jouent un rle important en favorisant la traverse de la couche de mucus (mucinase) et l'entre en contact du vibrion sur la bordure en brosse des cellules intestinales. Certaines substances jouent un rle primordial dans l'adhsion aux cellules intestinales et dans la colonisation de celles-ci. Ce sont les pili ou fimbriae qui sont de deux types, l'un d'entre eux est appel TCP (toxin coregulated pilus) car il est exprim en mme temps que la production de toxine CT. L'hmagglutinine soluble (non inhibe par D-mannose et L-fucose) protase qui clive la sous-unit A polypeptidique de la toxine CT l'intrieur du pont disulfure en Al et A2, de mme qu'un facteur dit facteur accessoire de colonisation (ACF) jouent un rle en tant que facteurs d'adhsion complmentaires. L'antigne 0:1 et le glycocalyx, interviendraient dans la fixation et l'adhsion de la bactrie l'entrocyte. Comme le srotype 0:1, les souches de V. cholerae non-0:l produisent diverses enzymes extracellulaires : protase, neuraminidase, mucinase... Une entrotoxine similaire la toxine cholrique a pu tre mise en vidence ainsi que des entrotoxines LT, ST, une cytolysine et une cytotoxine Shiga-like F - Toxine cholrique

C'est le prototype des entrotoxines provoquant une diarrhe par activation de l'adnylate cyclase (AC) des cellules pithliales de l'intestin grle. La toxine cholrique est une protine oligomrique thermolabile classe dans le groupe des exotoxines vraies. La toxine native (84 kDa) est constitue : - d'une sous-unit A centrale (28 kDa) et - de 5 sous-units B priphriques (11,5 kDa). La sous-unit A et les sous-units B sont lies de manire non covalente. La sous-unit A comporte deux chaines peptidiques Al (22,5 kDa) et A2 (5,5 kDa) lies par un pont disulfure. La sous-unit A2 servirait de squence-signal de la translocation de la sous-unit A 1 dans le cytoplasme. Les sous-units B se fixent aux gangliosides GM1 de la surface membranaire, ce qui entrane un changement conformationnel de la toxine se traduisant par la cration d'un canal hydrophile par lequel la sous-unit A est internalise. La neuraminidase du germe transforme les di et trisialogangliosides membranaires en GM1. La sous-unit Al stimule l'adnylate cyclase. Le mcanisme d'action est le suivant : l'adnylate cyclase membranaire est stimule par le complexe protine Gs-GTP ; cette activation cesse suite l'hydrolyse du GTP en GDP par l'activit GTPasique de la sous-unit a de la protine Gs. La sous-unit Al ADP-ribosyle la sous-unit a en inhibant son activit GTPasique. L'AC stimule ainsi de manire permanente augmente considrablement le taux d'AMPc intracellulaire provoquant une fuite hydrique trs importante par inhibition de l'absorption de sodium et en stimulant la scrtion de chlore.

214

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

Entrocytes

Rcepteur 0^1

AMP cyclique SCHMA 1 CIBLES MOLCULAIRES DE LA TOXINE CHOLRIQUE DANS L'ENTROCYTE


CT : choiera loxin, G^ = monosialoganglioside, Gd = disialoganglioside, Gi = trisialoganglioside, AC = adnylate cyclase, Gs = unit rgulatrice stimulante de l'AC (GTP binding protein), cm = calmoduline, PK = protine kinase. a = rserves de calcium 1 : activit glycohydrolase 2 : activit ADP ribosyltransfrase 3 : activit GTPase

ATP

SCHMA 2 INTERNALISATION ET ACTION DE LA TOXINE CHOLRIQUE SUR L'ENTROCYTE


Schma propos par D. M. Gill pour expliquer le mcanisme d'entre du fragment A de la toxine cholrique. a ; les sous-units B reconnaissent leur rcepteurs spcifiques b ; les sous-units B induisent une modification de la conformation de la paroi et s'insrent dans la membrane de l'entrocyte. c ; un canal hydrophile se trouve ainsi cr qui permet le passage intracellulaire de la sous-unit A d ; le pont disulfure est dtruit et le fragment Al peut activer l'adenylcyclase dans le cytoplasme de l'cmrocyte.

Chapitre XVII-Les Vibrions__________________________________________________215

Les sous-units A et B de l'entrotoxine CT sont codes par 2 gnes contigus ctx A et ctx B formant un opron sur le chromosome. L'analyse des squences montre 75 % d'homologie entre les gnes ctx A fi et les gnes elt A B codant la toxine LT des E. coli ETEC. Les souches de V. cholerae portent des copies multiples de l'opron ctx A B. Le gne tox R responsable de l'activation de l'opron ctx A B contrle d'autres gnes impliqus dans la virulence, tcp A (pili), omp V (protine membranaire) et ACF. G - Lysotypie On peut isoler dans les zones d'endmie, des vibriophages partir des selles de malades, de porteurs sains, d'eaux d'gouts ou de rivires. Ces phages permettent une lysotypie, 14 phages sont utiliss en pratique. Les types III, IV, V et VI sont spcifiques du biovar classique, les types 1 et II du biovar El Tor. La lysotypie fournit des renseignements intressants en pidmiologie. H - Sensibilit aux antibiotiques Les transferts gntiques raliss in vitro permettent d'obtenir des souches multirsistantes ; de telles souches pourraient survenir spontanment et dclencher des pidmies. Des souches porteuses de rsistances plasmidiques ont t isoles Calcutta, mais aussi en Afrique du Nord, en Afrique noire, en U.R.S.S.... Les rsistances signales portent notamment sur les ttracyclines, les sulfamides, ce qui pose des problmes de chimioprophylaxie et de traitement curatif. Sans toujours atteindre des niveaux de rsistance levs, ces souches se caractrisent assez souvent par une simple lvation de la CMI et par une certaine instabilit. Il a t possible de transfrer ces rsistances plasmidiques des E. coli. Enfin les rsistances la colistine et la polymyxine sont classiques pour El Tor. V - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE

Un examen bactriologique complet est ralis en Europe et dans les pays industrialiss devant une suspicion de cholra mais il est vident qu'en zone d'endmie on se limite des tests prsomptifs. 1. Les prlvements et leur transport -Prlvements d'origine humaine : on recherche le vibrion cholrique dans les selles, les couvillonnages rectaux, les vomissements, dans des prlvements de contenu intestinal lors d'autopsies. Les hmocultures n'ont pas d'intrt. -Prlvements du milieu extrieur : - eaux . si lgrement trouble, concentration par fitration ; . si trouble, mlanger l'eau de l'eau peptone alcaline concentre 10 fois, ventuellement par le procd des gazes flottantes. - gouts : milieux slectifs - aliments : ils doivent tre homogniss et enrichis en eau peptone alcaline. L'idal est de pouvoir ensemencer les milieux d'enrichissement et de culture sur place. Ceci n'est pas toujours possible et on peut dposer l'chantillon de selles sur du papier buvard ou filtre et l'expdier au laboratoire sous enveloppe scelle. Si possible faire sur place un ensemencement en eau peptone alcaline ou sale (2 % de NaCl) pH 9, et envoyer le tube vis au laboratoire.

216

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

2. L'examen bactriologique a/ L'examen direct. Il peut tre vocateur si on observe entre lame et lamelle une mobilit en banc de poissons et au Gram une flore monomorphe Gram ngatif plus ou moins incurve. bl La mise en culture II est conseill (schma 3) d'ensemencer en parallle des milieux d'enrichissement et d'isolement. - milieux d'enrichissement, on peut utiliser : - soit une eau peptone alcaline 1 ou 3 % NaCl - soit un milieu taurocholate-tellurite-peptone. Pour l'un ou l'autre milieu, on procde un repiquage sur milieu solide aprs 6 8 heures d'incubation 37C (parfois on a recours une 2e tape d'enrichissement). - milieux d'isolement, on utilisera en parallle des milieux non ou peu slectifs et des milieux slectifs solides -peu slectifs : glose nutritive avec 0,1 % de Teepol. Sur ce milieu, les colonies d'eltor sont non irises, la production d'oxydase est conserve - slectifs : glose TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose). Les colonies sont grandes, jaunes, convexes, frquemment vertes si l'incubation est prolonge (El Tor). La raction de l'oxydase est alatoire. D'autres milieux slectifs existent. Citons : - Lauryl-sulfate-tellurite - Dsoxycholate-Citrate-Lactose - Glatine-Taurocholate-Trypticase-Tellurite (GTTT. Monsur) En routine le milieu TCBS peut tre conseill. Il est assez slectif et en rgle gnrale, Pseudomonas etAeromonas ne poussent pas. Par contre, des Proteus, des bacilles sporuls, voire des cocci, peuvent pousser en donnant des colonies jaunes. Certaines souches de V. cholerae peuvent pousser sur glose SS et sur Me Conkey.
cl L'identification

On repre les colonies suspectes, on tudiera au moins 5 colonies diffrentes. - Les tests prsomptifs - oxydase (+), mobilit (+), Gram ngatif -agglutination sur lame avec srum polyvalent anti 0:1 ; si ngatif reprendre l'agglutination aprs chauffage 100C durant 2 heures. Puis utiliser des srums spcifiques. Ces tests peuvent ventuellement suffire en priode pidmique, mais devant un cas isol, en dbut ou en queue d'pidmie que l'on obtienne ou non une agglutination, il faut procder une identification complte. - Diagnostic de certitude On procde une galerie complte d'identification - On carte facilement les Pseudomonas qui sont arobies, oxydase (+), et rsistent au 0/129. - Les Aeromonas et Plesiomonas sont plus difficiles liminer, mais ils sont ADH(+) et 0/129 rsistant (Aeromonas), ou variable (Plesiomonas) (Tableau I). Plus difficile est la diffrenciation avec les autres espces de vibrions.

Chapitre XVH - Les Vibrions__________________________________________________217

Les principaux caractres permettant cette distinction sont regroups dans le tableau III. Parmi les Vibrio rencontrs assez frquemment en pathologie humaine, le diagnostic diffrentiel se pose surtout avec V. parahaemolyticus (saccharose (-), ONPG (-), plus tolrant au NaCl) (Schma 3).

SCHMAS TAPES DU DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE DU CHOLERA : DIAGNOSTIC CLASSIQUE ET PROSPECTIF

Diagnostic de biovar La diffrenciation entre biovar classique et El Tor repose sur les caractres mentionns dans le tableau II, en outre El Tor est classiquement VP (+), et agglutine les globules rouges de poulet contrairement au srovar classique. Mise en vidence de la toxine CT Seules 67 % des souches isoles de cholra ou de sujets contacts sont CT positives. La recherche de la toxine peut se faire partir des cultures en utilisant notamment des kits commercialiss utilisant la coagglutination ou l'agglutination de particules de latex (VET-RPLA). On peut aussi utiliser soit des techniques ELISA classiques, soit la raction dite ELISA-GM1, soit enfin une technique dite GERYDO d'inhibition de l'hmadsorption sur le ganglioside GM1 ; ces techniques sont utilises sur des cultures, mais des dveloppements sont envisageables en recherchant directement la toxine sur les selles par ces procds.

218

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

- V. cholerae 0:1 atypiques Ce sont des souches agglutinables par les srums polyvalents 0:1, mais non productrices d'entrotoxine. Elles peuvent prsenter des anomalies par rapport aux souches pidmiques (fermentation lente du saccharose, comportement particulier vis--vis des phages). Ces souches se trouvent dans les eaux, les coquillages et parfois dans les selles de sujets sans diarrhe. En plus de ces techniques classiques de diagnostic de cholra par isolement et identification de la souche, des recherches sont en cours permettant de rechercher la toxine cholrique non seulement sur les souches, mais aussi directement dans la selle cholrique, ou le gne codant la toxine par sonde ou amplification gnique (PCR).
TABLEAU IV CARACTRES DIFFRENTIELS DE QUELQUES ESPCES HALOPfflLES ET NON HALOPHILES DE LA FAMILLE DES VIBRIONACEAE

Oxydase Nitrate-rductase Indole Gaz (en glucose) Test ONPG TTR LDC ODC ADH Mannitol Inositol Saccharose VP Gladnase Sensibilit 0/129 Tolrance NaCl (g%)

+ + + + + + + + + + + + + + [+]* d + d S S 0-5 0-5

+ + d + ND . + + + + S 0-1.7

+ + d d d + + d d + + + d d d + + d [+] + + + + + + d + d .* + + + + + + + d d [+] + + + + + d R S S S S S S S 0-5.6 0-5.8 0,5-10 1-12 0,5-2,5 0,2-6 0-4 0-4 + + + [-] + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + [+]

. -

(+) ou (-) = caractre ngatif ou positif de la majorit des souches (d) = diffrents rsultats observs (ND) = non dtermin (R) = rsistant (S) = sensible - quelques souches avec caractre contraire

B - Diagnostic

indirect

Vu le caractre d'urgence du cholra, la recherche des anticorps n'a pas d'intrt pour le diagnostic. Elle n'est utile que pour surveiller l'immunit. - Les agglutinines sont dcelables partir des 10-15 jours. Il faut exiger une monte des anticorps ou un titre atteignant plus d'1/100 pour porter un diagnostic prsomptif tardif. - La recherche d'anticorps vibriocides : la combinaison vibrions + srum contenant des anticorps + complment entrane une lyse des vibrions. Une augmentation de ces anticorps est observe chez plus de 90 % des cholriques.

Chapitre XVH - Les Vibrions______________________________________________________219

Le dosage des anticorps antitoxine connat un regain d'intrt car il permettrait de dtecter non seulement les anticorps anticholriques, mais aussi ceux dirigs contre la toxine LT des E. coll. Plusieurs techniques sont proposes : immunohmolyse radiale, ELISA... VI A TRAITEMENT Prventif

1. Mesures d'hygine C'est une maladie quarantenaire dclaration obligatoire. Il faut prendre des mesures d'hygine individuelles et collectives. Il faut faire bouillir l'eau, faire cuire les aliments. Se laver trs soigneusement les mains, vacuer les excrments, mme pour les sujets sains. Pour les malades et les porteurs sains , faire un dpistage, procder un isolement (5 jours), dsinfecter linges, excrments, vtements, lits, moyens de transport, prendre des mesures vis--vis des cadavres. Une chimiothrapie diminue la dure du portage.
2. Vaccins anticholriques

Aprs un cholra, la protection confre est de l'ordre de 90 % ; ceci fait que trs tt, en 1885, Ferran a imagin de protger contre le cholra par un vaccin. Actuellement plusieurs types de vaccins sont proposs. al Vaccin base de vibrions tus : (cellules entires) par voie parentrale : c'est le vaccin classique, disponible. Il contient dans chaque dose 4 000 millions de vibrions tus, Inaba et Ogawa. Ce vaccin donne - des ractions locales et gnrales modres ; - une protection de l'ordre de 55 60 % durant 3 6 mois ; mais il n'est pas protecteur chez les jeunes enfants. une rponse immune avec production d'anticorps vibriocides circulants, d'anticorps agglutinants, mais pas antitoxiniques. par voie orale : des essais ont eu lieu en faisant prendre 1010 vibrions/jour durant 5 jours. La protection serait de l'ordre de 60 %. bl Vaccins base de constituants purifis
Anatoxine (toxoid) On peut utiliser de la toxine dtoxifie par : le formol - le glutaraldhyde

- la chaleur : le toxoid est chauff 65C durant 5 minutes, ou mieux durant 25 minutes pour
diminuer la toxine rsiduelle (< 1 %). Fraction purifie Dodin a propos un vaccin administr per os fait de facteurs d'attachement de la bactrie aux cellules intestinales (petits peptides) et de LPS dont le polyoside serait responsable du pouvoir vibriocide induit par le vaccin. Sous-unit B purifie Ce type de vaccin provoque l'apparition d'IgA intestinales qui persistent plus longtemps si l'administration se fait per os. Cette approche est intressante, mais insuffisante. Aussi Holmgren a-t-il propos d'associer sous-units B purifies et vibrions tus, administrs par voie orale. Un vaccin cholrique oral germes entiers + sous unit B arrive au terme de son dveloppement, administr deux reprises 4 semaines d'intervalle ; il confre une protection de 85 % durant les six premiers mois et de 63 % sur la premire anne. Au bout de trois ans, la protection est encore de

220

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

50 %. A noter que ce vaccin confre une protection nette, mais de courte dure contre les diarrhes E. coli entrotoxinognes (ETEC).

cl Souches attnues de V. cholerae


Souches naturellement attnues. Les souches non toxinognes de V. cholerae 0:1 ne confrent pas de protection. Souches attnues par mutagnse : - mutant hypotoxinogne obtenu par la nitrosoguanidine souche 569 B (M 13) utilise per os. Elle donne une protection de 60 %, mais a tendance une reversion toxinogne. - autres mutants, telle la souche Texas-Star (3083) qui produit des sous-units B, mais pas de sous-unit A. Utilise per os elle entrane l'apparition d'anticorps vibriocides (85 % des sujets) et antitoxiniques (25 %), la protection est infrieure 75 % durant 1 2 ans. Parmi les inconvnients on peut noter une petite diarrhe lors de la vaccination, et on peut imaginer un ventuel retour la virulence. dl Souches recombinantes obtenues par gnie gntique Diffrents recombinants de V. cholerae ont t utiliss. Il a t possible de les obtenir car les gnes codant les sous-units A et B de la toxine ont t squences ; on a obtenu des souches synthtisant uniquement la sous-unit B, d'autres ne synthtisant aucune des deux sous-units... Ces vaccins sont en cours d'valuation. Ils confreraient une importante protection... mais nous manquons encore de recul pour juger les rsultats. Une autre approche a t tente : on a introduit les gnes codant le LPS de V. cholerae dans une souche de Salmonella typhi avirulente (S. typhi Ty 2 la), cette souche EX 845 est parfaitement avirulente, mais s'est rvle peu immunogne et non protectrice chez les volontaires. 3. Chimioprophylaxie

Elle n'est utilisable qu'en prophylaxie de courte dure (sjour court en zone d'endmie). Elle prvient la maladie et supprime le portage. On utilise les sulfamides-retards (Fanasil), ou les ttracyclines (doxycycline). Une surveillance des sensibilits du V. cholrique ces antibiotiques est indispensable, vu l'existence de rsistances. B - Traitement curatif

Correctement trait le cholra n'entrane qu'environ 1 % de dcs, mais quand il survient dans des zones dfavorises, les structures sanitaires sont vite dbordes devant plusieurs dizaines de cas quotidiens. La mortalit peut alors atteindre 50 %. Le traitement curatif comporte : - une rhydratation massive par voie parentrale par srum physiologique et bicarbonat en fonction de la dshydratation (souvent 5-6 litres perfuss en 3-5 heures), ou par voie orale (solut de rhydratation orale : SRO de l'O.M.S.) ; - une antibiothrapie dont l'intrt est souvent mis en doute. Elle rduit l'importance et la dure de la diarrhe et raccourcit la dure du portage. On utilise les sulfamides, le trimthoprime-sulfamthoxazole, le chloramphnicol ou les ttracyclines (sous rserve que la sensibilit de la souche pidmique ait t vrifie).

Chapitre XVH - Le Vibrions___________________________________________

221

AUTRES VIBRIONS
En dehors de V. cholerae, d'autres espces de vibrions ont t retrouves chez l'homme. Les principales d'entre elles sont dcrites ci-dessous.

VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
Aprs V. cholerae, c'est l'espce la plus importante. I HABITAT ET POUVOIR PATHOGNE

Bactrie prsente dans l'eau de mer, dans les eaux littorales, dans les poissons, les coquillages, les mollusques. Vibrio parahaemolyticus est responsable de diarrhes aigus chez l'homme, conscutives une ingestion d'aliments contamins. La diarrhe dbute 2 6 heures aprs le repas. Les selles sont souvent hydriques, parfois sanglantes, la temprature est peu leve ; la diarrhe persiste 4 7 jours. Ce Vibrio produirait une entrotoxine thermolabile, mais le mcanisme de la diarrhe est assez complexe et une action entro-invasive combine l'entrotoxine n'est pas exclue. II - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE

A - Prlvements La bactrie peut tre recherche partir de selles, de fruits de mer frais ou congels, ou d'eaux. La recherche devra tre systmatique, mme en France, partir des selles, si on a la notion d'intoxication alimentaire conscutive l'ingestion de produits d'origine marine. B Culture

II est conseill comme pour V. cholerae de procder un ensemencement double : - de milieux d'enrichissement (eau peptone sale 3 % NaCl) - et de milieux d'isolement (TCBS) (Les milieux d'enrichissement tant repiqus au bout de 6 18 heures sur milieux d'isolement). Les incubations des milieux de culture se font 30C. On observe des colonies bleues-vertes sur TCBS. A noter que ces colonies peuvent se dvelopper (lentement en 48 heures) sur divers milieux pour Entrobactries (Drigalski, Mac Conkey, Hektoen, SS). C - Morphologie Bacilles droits, assez courts, trs mobiles par ciliature polaire monotriche.

222

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBffiS

D - Caractres

biochimiques

En dehors des caractres gnraux communs avec les autres vibrions, ce vibrion doit tre diffrenci particulirement, d'une part, de V. cholerae et V. mimicus et, d'autre part, de V. alginolyticus. V. parahaemolyticus est VP(-), ONPG(-), saccharose (-), arabinose (+) alors que V. cholerae est VP variable, ONPG(+), saccharose (+), arabinose(-), et V. alginolyticus est VP(+), ONPG(-), saccharose (+), arabinose (-). La diffrence avec V. mimicus se fait sur le caractre ONPG(+) et l'halophilie modre de cette espce. En outre, V. parahaemolyticus tolre 7 - 8 % de NaCl, alors que V. alginolyticus supporte jusqu' 10 % de NaCl. Un caractre est intressant rechercher pour les V. haemolyticus ; il s'agit de l'hmolyse p sur milieu de Wagatsuma, additionn de 5 % de sang dfibrin humain ou de lapin. Si l'hmolyse est prsente, les souches sont dites Kanagawa + , c'est le cas des souches pathognes pour l'homme. Celles provenant du milieu extrieur sont en gnral Kanagawa - , sans que l'on sache la nature du lien hmolyse-virulence. A noter que le gne tdh codant l'hmolysine thermostable de V . parahaemolyticus prsente une forte homologie avec les gnes codant les hmolysines de V. cholerae non 0:1, V. mimicus et V. hollisae ce qui suggre un anctre commun. E - Constituants antigniques On reconnat 12 spcificits antigniques 0 et 59 antignes K. Selon conditions de culture, deux types de flagelles sont observs, monotriche M lophotriche L. Il existe des communauts antigniques entre les flagelles V. parahaemolyticus et V. alginolyticus (flagelles M et L) et non avec V. cholerae (flagelles M). La srotypie n'est pas ralise en routine. F - Sensibilit aux antibiotiques Les souches sont rsistantes l'ampicilline, sensibles la gentamicine et la tobramycine, aux ttracyclines, au chloramphnicol et au trimthoprimesulfamthoxazole. les ou de de

VIBRIO ALGINOLYTICUS
1 - HABITAT ET POUVOIR PATHOGNE II s'agit d'un vibrion halophile dnu de pouvoir entropathogne, qui peut tre isol partir d'infections cutanes (ulcres, cellulite), souvent la suite d'un contact avec de l'eau de mer.

Chapitre XVn - Les Vibrions__________________________________________________223

II - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE V. alginolyticus prsente beaucoup de caractres communs avec V. cholerae hormis son caractre halophile trs marqu. Il prsente comme certains Proteus un caractre diffusible des colonies sur glose au sang.

VIBRIO VULNIFICUS
1 - HABITAT ET POUVOIR PATHOGNE V. vulnificus est une espce du milieu marin. Elle est responsable, chez l'homme, de deux types d'infections : une forme septicmique grave, survenant 24 heures aprs l'ingestion de fruits de mer, chez des patients dfenses compromises (cirrhose par exemple) et des formes cutanes conscutives un traumatisme et un contact avec de l'eau de mer ou des aliments d'origine halieutique.

II - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE Le caractre ONPG rapide, lactose positif et sa rsistance constante la colistine sont les lments majeurs d'orientation vers ce diagnostic.

BIBLIOGRAPHIE
CADOZ M., Dveloppement de vaccins contre les maladies diarrhiques : situation actuelle et perspectives. , Md. Mal. Inf., 1989,11 (n spcial), 571-577. CLEMENS J.D., et al., Fieids trial of oral choiera vaccines in Bangladesh , Lancet, 1986, ii, 124-127. DAVID-PRINCE M., M'BOUP S., DENIS F., RICHARD C., BARIN F., DIOP B., DIOP MAR I., Gastro-entrites Vibrio parahaemotyticus au Sngal , Md. Mal. I n f . , 1980, 10, 348-341. GERMANffiR R., Bacterial vaccine , Acadmie Press, Orlando, 1984. HOLMGREN J., SVENNERHOLM A.M., Mechanisms of disease and immunity in choiera : a review , J . I n f . Dis., 1977, 136, S105-S112. JANDA J.L., POWERS C., BRYANT RG, ABBOTT S.L., Current Perspectives on th epidemiology and pathogenesis ofclinically significant Vibrio spp. Clin. Microbiol., Rev., 1988, 1, 245-267. MORRIS J.G., TAKEDA T., TALL B.D. et al., Exprimental non 0:1 Vibrio cholerae gastroenteritis in humans , J . Clin. Invest., 1990, 85, 697-705. OMS (Groupe de travail). Cholra et autres diarrhes asssocies des vibrions , Bull. de l'OMS, 1981, 59, 27-52. RICHARD C., GIAMMANCO G., POPOFF M., Vibrio parahaemolyticus. Isolement et diagnostic biologique , Ann. Biol. Clin., 1974, 32, 33-46. TAYLOR R.K. Genetic studies of enterotoxin and other potential virulence factors of Vibrio cholerae in "Genetics of bacterial diversity , Hopwwood D.A., Chater K.F., Acadmie Press, London, 1989, 309-329.

Chapitre XVIII AEROMONAS - PLESIOMONAS

Ces deux genres appartiennent la famille des Vibrionaceae dont les caractres gnraux ont t dcrits dans le chapitre prcdent.

LE GENRE AEROMONAS
Le pouvoir pathogne de ces bactries de la famille des Vibrionaceae a t longtemps sous-estime. Les infections sont le plus souvent d'origine hydrique. Les Aeromonas sont des bacilles Gram ngatif, aro-anarobies dots d'une oxydase, fermentant le glucose avec ou sans gaz, rduisant les nitrates en nitrites, mobiles par ciliature polaire ou immobiles, rsistants au compos 0/129. HISTORIQUE
Des souches d'Aeromonas ont t dcrites ds 1890, mais le nom 'Aeromonas propos par Kluyver et Van Niel en 1936, n'a t admis dans le Bergey's manual qu'en 1959.

CLASSIFICATION

Certaines espces d'Aeromonas ont t longtemps confondues avec des Proteus, des Pseudomonas ou des vibrions. Les Aeromonas (GC % compris entre 57 et 63) sont actuellement classs dans la famille des Vibrionaceae, ct des genres Vibrio et Plesiomonas. Certains auteurs proposent de les faire rentrer dans une nouvelle famille : les Aeromonadaceae. Le genre Aeromonas est constitu par plusieurs espces mobiles et immobiles, les principales sont les suivantes : - les espces mobiles : A. hydrophila (espce type) A. caviae A. veronii (biogroupes veronii et sobria) A. jandaei A. schubertii A. eucrenophila

Chapitre XVffl - Aeromonas - Pleswmonas___________________________________________225

- les espces immobiles : A. salmonicida (ssp., salmonicida, achromogenes,


masoucida, smithid) A. mdia

II - PHYSIOPATHOLOGIE Les infections Aeromonas sont souvent lies une contamination d'origine hydrique. Les germes pntrent gnralement dans l'organisme la suite d'une effraction, la faveur d'un traumatisme ou par voie digestive grce une lsion de ta muqueuse. Les infections concernent souvent les sujets immunodprims. Le tableau peut tre celui d'un choc endotoxinique, ou bien les manifestations sont lies aux toxines labores par la bactrie.

III

HABITAT

Les Aeromonas sont isols frquemment dans les eaux doues (bactries dulaquicoles), dans les eaux stagnantes, les eaux courantes, les eaux de boisson, les eaux de mer ou de lagunes recevant de l'eau doue et les eaux d'gout (concentration > 10 ml). Ce sont des bactries caractristiques des eaux de surface. Ils peuvent se multiplier dans les eaux doues en fonction des conditions de temprature, de pH et de la teneur en lments nutritifs, ils seraient de bons indicateurs de l'tat trophique de ces eaux. Leur prsence est signale dans divers aliments (hutres, moules, coquillages notamment) et dans les sols. Grce des recherches utilisant des milieux slectifs, on a pu montrer l'existence d'un portage intestinal chez les animaux ou chez l'homme. Chez ce dernier le portage concerne 1 3 % des sujets en Europe ou aux Etats-Unis, et jusqu' 8 16 % des enfants et 27 % des adultes dans des pays exotiques comme la Thalande.

IV - POUVOIR PATHOGNE
1. Chez, les animaux sang froid (poissons, reptiles et batraciens)

Les Aeromonas provoquent des syndromes hmorragiques ; ils sont parfois responsables d'pidmies prjudiciables la pisciculture (truites). A. salmonicida est responsable de la furonculose des salmonids.
2. Chez l'homme

Les infections sont le plus souvent d'origine hydrique, plaie profonde aprs baignade dans une rivire, immersion, noyade... ou conscutives l'ingestion d'aliments contamins. On reconnat :

226_______________________Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

al Des infections cutanes Elles sont type de cellulites ou de surinfections de plaies, de brlures et conscutives un contact avec l'eau ou le sol. Des cas (rares) de gangrne gazeuse ont t dcrits et constituent un pige thrapeutique. bl Des diarrhes plus ou moins aigus Elles peuvent voquer des syndromes cholriformes, avec des selles aqueuses, non glaireuses et non sanglantes. Ces diarrhes sont retrouves dans tous les points du globe notamment en zone tropicale (les voyageurs et les jeunes enfants sont souvent touchs) mais aussi en zone tempre (1 % des selles Strasbourg lors d'tudes systmatiques), surtout en saison chaude. Le pouvoir entropathogne a t longtemps controvers car seuls 5 % des volontaires ingrant 5.1010 Aeromonas prsentaient des signes digestifs dans certaines tudes. On considre maintenant que Aeromonas hydrophila, A. sobria, et A. caviae peuvent se comporter comme de vritables pathognes intestinaux.
cl Des septicmies

Elles sont souvent en rapport avec des maladies hpatiques (cirrhose), biliaires, pancratiques ou des infections malignes notamment des hmopathies. Mais ces septicmies peuvent aussi survenir chez des sujets aux dfenses immunitaires normales. L'origine est le plus souvent digestive, notamment au cours des chimiothrapies anti-cancreuses. Dans certains cas, la septicmie s'accompagne de lsions cutanes de type ecthyma gangrenosum. La mortalit dans les septicmies est de l'ordre de 50 %.
al D'autres infections peuvent tre observes

Ce sont des infections pulmonaires aprs noyade, rarement des infections urinaires, pritonites, infections mninges, otites, endocardites, des infections oculaires. Les infections sont soit monomicrobiennes, soit mixtes, en particulier dans les diarrhes. Les patients prsentant des affections hpato-biliaires sont plus prdisposs que les autres aux infections Aeromonas. La pose de sangsues a t l'origine de certaines infections Aeromonas. V - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A - Morphologie Les Aeromonas sont des bacilles Gram ngatif de 1-4 p.m/0,6 prn, mobiles par ciliature polaire, habituellement monotriches ou immobiles (A. salmonicida). Ils peuvent prendre un aspect coccobacillaire ou en courtes chanettes. B - Caractres culturaux

Ce sont des germes aro-anarobies. Le pH optimal est de 7 (culture entre 5,2 et 9,8) et la temprature optimale est en gnral de 30C. Elle est en fait variable selon les espces, ainsi A. salmonicida ne se dveloppe pas 37C.

Chapitre XVIII - Aeromonas - Plesiomonas______________________________________________227

En 24 heures, sur milieu solide, on obtient des colonies de 1 3 mm translucides, ressemblant aux entrobactries. La culture est possible sur milieux du type trypticase-soja ou glose au sang, mais aussi sur milieux slectifs Mac Conkey, EMB ou Drigalski (les colonies fermentent trs ingalement le lactose). Le milieu SS est trs inhibiteur pour les Aeromonas, les colonies sont grles et n'apparaissent qu'en 48 heures. C - Caractres biochimiques Ces bactries sont oxydase (+) et rduisent les nitrates en nitrites. Certains caractres sont communs aux diffrentes espces : - fermentation du glucose, saccharose (sauf A. jandaei et schubertii), maltose, trhalose, mannitol (sauf A. schubertii). Caractre ONPG (+). - Possession de DNase, glatinase, production d'indole. Caractre ODC (-) (sauf A. veronii veronii) - rsistance au compos vibriostatique 0/129 Le diagnostic des espces les plus courantes repose sur les caractres diffrentiels indiqus dans le tableau I. La recherche des dcarboxylases chez ces espces peut poser certaines difficults en raison de la diffrence de sensibilit des milieux ractionnels. Le milieu de Fay et Barry (Appl. Microbiol., 1972, 23, 710-713) serait plus adapt cette recherche (30C, 24 H) que le milieu de Moeller.
TABLEAU 1 CARACTRES DIFFRENTIELS DES AEROMONAS ET PLESIOMONAS A. hydrophila A. caviae biotype sobria . + + + + + + + + + A. veronii biotype veronii + d + + + + + + A. veronii A. P. salmonicida shigelloides

Gaz en glucose V.P. Esculine L-arabinose Mannitol Saccharose Salicine ONPG ODC ADH Indole Gladnase Sensibilit au compos vibriostatique 0/129

+ + + + + + + + + + + -

+ + + + + + + + + + -

d -

d d d d d d + d +

+ + + +
d

D -

Substances labores, facteurs de virulence et hypothses physiopathologiques

Pigment : A. salmonicida et A. hydrophila donnent des colonies bruntres ou vert fonc au bout de 2 5 jours d'incubation. Ces espces synthtisent un pigment mlanique partir de la tyrosine et de la phnylalanine. Les facteurs de virulence identifis chez Aeromonas sont nombreux, en dehors des enzymes favorisant l'infection : protases, lastase, DNase, phospholipases, lipase, ils prsentent des capacits d'adhsion et produisent diverses toxines.

228

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

- La capacit d'adhsion qui constitue la premire tape avant la colonisation de la muqueuse intestinale, a t montre l'aide des cellules HEp-2 (modle d'tude pour la pathognie des infections E. coli, Salmonella, Campylobacter). Il existe deux types de pili : pili-L (pili longs, fins, flexibles, polypeptide de 4 kDa) et pili-S (courts, pais, polypeptide de 17 kDa). Le pouvoir d'adhsion est li la prsence de pili-L qui sont impliqus dans le pouvoir pathogne, les souches de l'environnement sont peu adhrentes et prsentent des pili-S. - Les souches entrotoxinognes produisent des lectines spcifiques de l'acide sialique permettant la colonisation des surfaces intestinales. Il existe des souches entroinvasives d'A. sobria et A. hydrophila (except les souches environnementales). - Les toxines appartiennent plusieurs types. On distingue d'une part les hmolysines ou cytotoxines et les entrotoxines ou cytotonines. Il existe deux hmolysines : - une alpha-hmolysine (65 kDa) non produite au del de 30C - une bta-hmolysine (50 kDa) produite en plus grande quantit 37C encore appele arolysine ou ASAO-hemolysin. Thermolabile, elle est cytotoxique pour de nombreuses lignes cellulaires et produit une accumulation hydrique dans l'anse ilale isole ; elle serait le principal facteur de virulence impliqu dans les diarrhes. La nature des entrotoxines d'Aeromonas a fait l'objet de nombreuses controverses. On a dcrit :
- une entrotoxine cholriforme (63 kDa) neutralise par un srum anti-toxine cholrique produite par 5 10 % des souches d'A. hydrophila. Cette toxine cytotonique (sur cellules Yl) a des communauts immunologiques avec la toxine cholrique et stimule la production d'AMPc. - une entrotoxine cytolytique (52 kDa) qui ragit avec l'antitoxine cholrique mais n'est pas neutralise ; ses activits cytolytique et hmolytique sont corrles et sa squence N-terminale est identique celle de l'arolysine. - une entrotoxine cytotonique (15 kDa) assez stable la chaleur produite par la majorit des souches d'A. hydrophila et A. sobria et 10 % environ d'A. caviae, active sur l'intestin de souriceau nouveau-n. - une entrotoxine cytotonique et c y t o t o x i q u e (50 kDa) thermostable non neutralise par un srum anti-toxine cholrique et vrotoxique produite par la moiti des souches d'A. hydrophila et A. sobria.

L'tude de. ces toxines s'est rvle difficile, il semble actuellement (bien que ceci ne soit pas encore fermement tabli) que les entrotoxines cytotoniques et les entrotoxines cholera-like soient trs voisines gntiquement et, de mme, que l'entrotoxine cytolytique et la bta-hmolysine soient galement proches. Seules des diffrences d'expression in vivo ou in vitro modifieraient la toxinognse se traduisant par une variation de l'activit entrotoxique ou cytotoxique selon le type de cible tissulaire. Certaines souches d'Aeromonas mobiles (A. hydrophila, A. sobria, A. caviae) cultives en bouillon contenant 0,5% de glucose montre une inhibition de la croissance conscutive l'accumulation d'acides gras et d'actate entranant la rpression du cycle de Krebs. Ce "phnomne suicide" est corrl avec la temprature de croissance et il a t dmontr que seules les souches non-suicide

Chaptre XVIII - Aeromonas - Plesiomonas

229

taient virulentes et entropathognes. Ce phnomne suicide a t rapproch de la prsence d'antignes protiques de surface thermostables rendant les souches autoagglutinables, rsistantes l'acide actique, et considres comme les plus virulentes. L'tude de la physiopathologie des infections Aeromonas est complexe : l'entropathognicit des souches d'Aeromonas est due l'intervention simultane de plusieurs facteurs physiologiques, mtaboliques, antigniques et toxiques. La prsence d'Aeromonas dans une coproculture ne signifie pas forcment qu'elle soit entropathogne, selon que la souche sera suicide ou non, elle s'implantera, selon qu'elle sera entroadhrente ou entroinvasive ou qu'elle produira une toxine cholera-like ou cytolytique on observera soit une infection intestinale peu importante, soit plus grave voire chronique. E - Structures antigniques

Les Aeromonas possdent tous des antignes 0. Les espces mobiles ont en outre des antignes H. Les techniques d'agglutination ou d'hmagglutination indirecte ont t utilises pour tenter une srotypie des Aeromonas. Si l'espce A. salmonicida semble homogne sur le plan antignique, une grande htrognit a t observe au sein des autres espces. De plus un nombre non ngligeable de souches prsente une agglutination spontane. Les souches du groupe 0:11 d'A. hydrophila sont autoagglutinables et sont impliques dans plus de 50 % des septicmies et des infections de plaies. Il existe des ractions croises entre les diffrentes espces d'Aeromonas, entre P. shigelloides et A. hydrophila ou A. sobria. F Lysotypie

Un schma provisoire de lysotypie a t propos par Popoff. A noter qu'il existe un phage actif sur toutes les souches de A. salmonicida, ce qui peut avoir un intrt pour le diagnostic. VI - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE A - Produits pathologiques

Les isolements, en dehors de recherches systmatiques, sont souvent le fait du hasard. Les principaux produits pathologiques sont : les hmocultures, les pus, les urines, LCR, liquides de ponction, les selles... Les recherches peuvent tre effectues sur les eaux ou les aliments.

B - Isolement
L'isolement peut facilement tre obtenu sur milieux non slectifs (trypticase-soja, glose au sang) si le produit pathologique est monomicrobien. Pour les prlvements polymicrobiens, par contre, on doit utiliser des milieux slectifs, en particulier pour les selles. Divers milieux d'isolement solides ont t prconiss : glose dextrine-fuschine ; xylose-dsoxycholate de sodium- citrate ; Mac Conkey au trhalose la place du lactose ; glose inositol - vert brillant - sels biliaires (IBB) ; glose amidon - glutamate - ampicilline - pnicilline (SGAP - 10 C) pour

230

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

les chantillons d'eaux pollues. A noter que le milieu TCBS n'est pas assez slectif. En fait, pour une coproculture, on peut simplement utiliser une glose trypticase soja au sang de mouton (5 %) contenant de l'ampicilline (20 mg/1) ou encore la glose CIN : cefsulodine (4 mg/1) irgasan - novobiocine. Les milieux liquides slectifs d'enrichissement (eau peptone alcaline pH 8,6 et ampicilline, par exemple) ne prsentent pas d'intrt car il n'y a pas de corrlation avec la clinique. Les principaux diagnostics diffrentiels se posent avec les Vibrions, les Plesiomonas et les Pseudomonas. La fermentation des sucres, le caractre oxydase (+) et la rsistance au 0/129 orientent le diagnostic. Les principaux caractres diffrentiels sont la production de gaz en milieu contenant du glucose, l'hydrolyse de l'esculine, la fermentation de l'arabinose, le VP et l'ONPG. VII - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES

Les Aeromonas sont sensibles aux cyclines, au chloramphnicol, aux aminosides et l'association trimthoprime-sulfamthoxazole. Le comportement vis--vis de la colistine est variable selon les souches (CMI entre 1 et plus de 64 mg/1). Parmi les bta-lactamines, une rsistance est rgulirement observe pour l'ampicilline, mais aussi pour la carbnicilline, la ticarcilline ou la pipracilline. A. hydrophila et A. caviae sont galement rsistants la cfalotine, mais A. sobria est relativement sensible. Par contre, le latamoxef et les cphalosporines de 3e gnration (cfotaxime, ceftriaxone) sont constamment actives. Mais certaines souches d'Aeromonas sp. peuvent possder plus de 2 bta-lactamases inductibles leur confrant une rsistance largie aux cphalosporines de 3e gnration, l'aztronam et l'imipnme. Ces germes sont galement sensibles l'acide nalidixique et trs sensibles aux fluoroquinolones. Les formes septicmiques requirent souvent un traitement associant cphalosporine de troisime gnration ou une fluoroquinolone avec un aminoside. Le traitement des diarrhes peut ncessiter une rhydratation, mais l'antibiothrapie est en gnral inutile.

LE GENRE PLESIOMONAS
II n'existe qu'une seule espce : P. shigelloides. 1 - HABITAT ET POUVOIR PATHOGNE P. shigelloides est prsent dans les eaux (toute l'anne en zone tropicale ou subtropicale, en t ou automne en zone tempre) et chez divers animaux. Il est isol dans des selles de sujets diarrhiques surtout en zone tropicale, occasionnellement en Europe. Des hypothses physiopathologiques sur ces formes de diarrhes ont t avances. Leur caractre invasif ou entrotoxique n'est pas prcis. Il n'y a pas d'homologies de squence de l'ADN avec les gnes codant les

Chapitre XVffl - Aeromonas - Plesiomonas______________________________________________231

entrotoxines connues. Toutefois, on commence tudier certains facteurs de virulence potentiels (cytotoxine ou cytolysine). P. shigelloides est impliqu dans des infections chez l'homme, les poissons et probablement d'autres animaux. Chez l'homme on retrouve parfois des facteurs prdisposants : maladies sousjacentes (cancer, cirrhose), traitements anti-acide ; et des sources de contamination tels que contacts avec des eaux doues ou de mer, ingestion de fruits de mer crus ou mal cuits, ou de conserves de poisson avaries. Le fait que l'ingestion de P. shigelloides par des volontaires ne provoque pas de maladie laisse penser que cette espce n'aurait de pouvoir pathogne qu'en association avec un autre agent. P. shigelloides a t isol dans divers tableaux : - des gastroentrites (forme la plus frquente) chez l'enfant ou l'adulte de prfrence ( l'oppos d'Aeromonas), prenant soit un aspect cholriforme, soit plus rarement un aspect dysentrique ; les cas peuvent tre isols mais on peut assister de petites pidmies, des formes subaigus ou chroniques peuvent s'observer, voluant de 14 jours 2 ou 3 mois. - des formes extra-intestinales, rares. Des cas de mningites, septicmies, cellulites, arthrites ou ophtalmies ont t signales.

II - DIAGNOSTIC A - Caractre

BACTRIOLOGIQUE morphologique

Bacilles mobiles par une ciliature polaire, gnralement lophotriche. B - Caractres culturaux

Ils poussent bien 37C, mais ils ne se dveloppent pas en bouillon CINa 6,5 %. La culture sur les milieux usuels classiques pour les bactries entriques peut tre inhibe. Le milieu slectif inositol - vert brillant - sels biliaires (IBB) peut tre employ pour les coprocultures. Dans une diarrhe authentique le germe sera en culture pure. C - Caractres d'identification Fermentent le glucose sans production de gaz. Oxydase (+), sensibilit frquente au 0/129. Les Plesiomonas sont ODC (+), LDC (+), ADH (+) et les principales caractristiques biochimiques sont indiques dans le tableau I. Une classification antignique a t propose par Sakasaki comportant 107 srovars. Certains groupes 0 donnent des ractions croises avec les antignes de Shigella ou 'Aeromonas. IV - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES P. shigelloides est frquemment rsistant aux amino-, carboxy- et urido-pnicillines, mais il est sensible d'autres antibiotiques (imipnme, aztronam...). De nombreuses souches produisent une pnicillinase code par un plasmide, les inhibiteurs de bta-lactamases (sulbactam, acide clavulanique,

232

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

tazobactam) restaurent l'activit des bta-lactamines. P. shigelloides est en gnral rsistant aux aminosides, la ntilmicine restant active. Dans les gastroentrites les traitements les plus couramment employs sont base de ttracyclines, de trimthoprime-sulfamthoxazole, ou de fluoroquinolones (ciprofloxacine).

BIBLIOGRAPHIE
ALTWEGG M., GEISS H.K., Aeromonas as a human pathogen , CRC CriticaIRev. Microbiol., 1989, 16, 253-286. BAKKEN J.S., SANDERS C.C., CLARK R.B., HORI M., p-lactam rsistance in Aeromonas spp. caused by inducible p-lactamases active against penicillin, cephalosporins and carbapenems , Ant. Agents Chemother., 1988, 32, 1314-1319. BLOCH S., MONTEIL H., Purification and characterization of Aeromonas hydrophila beta-hemolysin , Toxicon, 1989, 27, 1279-1287. BRAUER C., SCHEFTEL J.M., RIHN B., MONTEIL H., Isolement d'Aeromonas hydrophila dans les diarrhes ; caractrisation des souches entrotoxinognes et relation cliniques , Ann. Biol. Clin., 1985, 43, 725-731. FASS R. J., BARNISHAM J., In vitro susceptibilities of Aeromonas hydrophila to 32 antimicrobial agents , Antimicrob. Agents Chemother, 1981, 19, 357-358. HOLMBERG S.D., FARMER III J.J., Aeromonas hydrophila and Plesiomonas shigelloides as causes of intestinal infections , Rev. Infect., Dis., 1984, 6, 633-639. JANDA J.M., Rcent advances in th study of th taxonomy, pathogenicity, and infectious syndromes associated with th genus Aeromonas , Clin. Microbiol. Rev., 1991, 4, 397-410. KHARDORI N., FAINSTEIN V., Aeromonas and Plesiomonas as etiological agents , Ann. Rev. Microbiol., 1988, 42, 395-419. MANDJEE A., DARBAS H., ROUSSENQ - JEAN A., BOYER G., JEAN-PIERRE H., Aeromonas hydrophila : circonstances d'isolement et discussion du rle pathogne partir de 8 observations , Md. Mal. Infect., 1987, 10, 574-576. PICARD B., ARLET G., GOULET Ph., Septicmies Aeromonas hydrophila. Aspects pidmiologiques. Quinze observations Presse Md., 1984,13, 1203-1205. POPOFF M-., Aeromonas in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9th Ed. Vol 1Williams and Wilkins Co, Baltimore, 1984. REINHARDT J.F., GEORGE L., Comparative in vitro activities of selected antimicrobial agents against Aeromonas species and Plesiomonas shigelloides , Antimicrob. Agents Chemother. 1985, 27, 643-645. RICHARD C., LHUILLIER M.M., LAURENT B., Plesiomonas shigelloides, une vibrionace entropathogne exotique , Bull. Inst. Pasteur, 1978, 76, 187-200.

Chapitre XIX PASTEURELLA


Le genre Pasteurella est ainsi dsign en hommage Louis Pasteur dont les travaux sur le cholra des poules , septicmie hmorragique dcimant les levages, aboutirent en 1880 la premire vaccination anti-bactrienne.

1 - CLASSIFICATION La famille des Pasteurellaceae regroupe les genres Pasteurella, Haemophilus et Actinobacillus. Des travaux taxonomiques rcents, bass sur des expriences d'hybridation ADN/ADN, aboutissent d'une part classer comme Pasteurella des souches exigeantes en facteur V et d'autre part tendent carter du genre Pasteurella des espces qui y taient jusqu' prsent incluses : P. haemolytica, P. pneumotropica, P. aerogenes et P. ureae. Le texte ci-dessous est consacr l'espce-type P. multocida. Les caractres de quelques espces voisines qui sont des Pasteurella stricto sensu et peuvent tre isoles chez l'homme (P. dagmatis, P. canis) seront signals. II - HABITAT ET PIDMIOLOGIE Les Pasteurella sont des parasites obligatoires des muqueuses des cavits naturelles des vertbrs. Elles sont trouves avec une grande frquence dans la cavit buccale et dans la salive d'un grand nombre d'espces animales : chiens, chats, chevaux, porcs, sangliers, etc. Incapables de survivre longtemps dans le milieu extrieur, les Pasteurella sont gnralement transmises l'homme par un animal. III - POUVOIR PATHOGNE

A - Pour l'homme
7. La pasteurellose d'inoculation La plus frquente, elle est gnralement conscutive une morsure ou une griffade d'un chien ou d'un chat. Toutes les morsures ne sont pas le point de dpart d'une

234

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

pasteurellose d'inoculation, mais les inoculations au niveau de la main semblent plus


graves.

Stade aigu. Aprs une incubation brve, de 3 6 heures, des douleurs trs violentes apparaissent aux points d'inoculation qui deviennent trs inflammatoires. L'inflammation s'tend aux articulations de voisinage. La fivre est inconstante. Une adnopathie satellite est rarement observe. En l'absence de traitement adapt, la douleur et l'inflammation diminuent spontanment, mais l'impotence fonctionnelle persiste. Stade chronique. Quatre six semaines aprs l'inoculation, les lsions cutanes sont guries/mais un syndrome algo-dystrophique rebelle toute thrapeutique persiste et constitue une vritable infirmit. Il n'y a pas d'adnopathie satellite contrairement la lymphorticulose d'inoculation.
2. Autres formes de pasteurellose.

Elles surviennent surtout chez des individus qui ont une maladie sous-jacente. On peut observer des septicmies, endocardites et mningites. P. multocida peut tre isole de pus divers : otite, sinusite, pritonite, adnite. Des infections pleuropulmonaires ont t signales, notamment chez des leveurs de porcs. B - Pour l'animal P. multocida est responsable de septicmies chez les volailles, de pneumopathies chez les lapins et les ruminants. La rhinite atrophique du porc o P. multocida est souvent associe Bordetella bronchiseptica est la cause de pertes conomiques importantes. . IV - PHYSIOPATHOLOGIE A partir de souches responsables de rhinite atrophique, il a t possible de mettre en vidence une toxine ayant un pouvoir dermoncrotique et ostolytique. Cette toxine peptidique localise dans le cytoplasme est code par le gne tox A qui a t clone. Injecte des porcs, elle reproduit les signes de la rhinite atrophique. Cette toxine a t retrouve chez des souches responsables d'infections pleuro-pulmonaires chez l'homme. V - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES DE P. MULTOCIDA A - Morphologie Ce sont des coccobacilles Gram ngatif avec habituellement une coloration bipolaire. Parmi les corps bactriens de petite taille (L = 1 2 jim ; 1 = 0,3 0,4 (im) des formes longues (L = 3 5 prn) sont souvent observes. Les chanettes sont trs rares. A l'tat frais, les bactries sont immobiles. L'encre de Chine permet de voir une capsule dont l'paisseur varie avec le srotype.

Chapitre XK - Pasteurella_______________________________________________________235

B - Caractres culturaux La temprature de croissance est comprise entre 22 et 44C avec un optimum 37C. Ce sont des bactries aro-anarobies avec en glose profonde une petite inhibition la surface et un renforcement de la croissance en microarophilie. Sur milieux riches (glose au srum, glose au sang) aprs 24 heures d'incubation 37C, les colonies sont petites (1 2 mm de diamtre) rondes, gristres, en gouttes de rose. Parfois, l'importance de la capsule leur donne un aspect muqueux. En bouillon, un trouble homogne est obtenu en 24 heures. Il n'y a pas de croissance sur les milieux suivants : Mac Conkey, milieu de Drigalski, milieu au citrate de Simmons et eau de levure. C - Caractres biochimiques. - L'oxydase est toujours positive si sa recherche est faite l'aide de ttramthyl-pphnylnediamine. - La catalase, la nitrate-rductase, l'ODC et l'indole sont constamment positives. - Les caractres suivants sont ngatifs : glatinase, LDC, ADH, urase et HyS. - Toutes les souches sont sensibles au compos vibriostatique 0/129. - La fermentation du glucose se fait toujours sans production de gaz. Les glucides suivants sont rgulirement attaqus : mannitol, galactose, fructose, mannose, saccharose. Par contre, sont rgulirement ngatifs : sorbose, rhamnose, inositol, adonitol. L'tude de la fermentation du sorbitol et du dulcitol permet chez P. multocida de reconnatre les trois sous-espces indiques ci-dessous :
Sous-espces multocida septica gallicida Fermentation Dulcitol Sorbitol + + +

D - Caractres antigniques Les polyosides constituant la capsule permettent, en fonction de leur composition, de distinguer classiquement 4 types capsulaires : A, B, D, et E. Un cinquime type capsulaire F, a t dcrit pour des souches isoles chez la dinde. Les lipopolyosides de paroi, possdant les caractres des endotoxines des bacilles Gram ngatif, permettent de classer les souches en 12 srotypes. Une srotypie capsulaire et somatique existe donc, mais elle n'est pas utilise en pratique courante en raison de la complexit de cette dtermination. E - Pouvoir pathogne exprimental La souris inocule par voie pritonale meurt rapidement d'une septicmie. Cette aptitude tuer la souris peut tre perdue par des souches qui sont dpourvues de capsule.

236

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

VI - AUTRES ESPCES DU GENRE PASTEURELLA Les caractres diffrentiels de P. multocida avec P. canis et P. dagmatis sont montrs dans le tableau I. Ces deux espces ont un pouvoir pathogne pour l'homme voisin de celui de P. multocida.
CARACTRES D'IDENTIFICATION DES PASTEURELLA Taxon Omithine + + .c

Indole Urase + d + + ~ + + + +

P. multocida P. canis P. dagmatis P. haemolytica1' P. pneumotropica P. aerogenes* P. ureae

+
+

Acidification en 24 48 h de Trhalose Maltose Xylose Arabinose Mannitol + d d d d + + + d d d + + + + + d + + ~ ~ ~

a+ : > 90% des souches sont positives ; - : S 90% des souches sont ngatives ; d : diffrents rsultats obtenus. b : production d'une hmolyse p, variable selon les souches. c : espces se dveloppant sur glose de Mac Conkey. * : production de gaz abondante en milieu glucose.

Les quatre autres espces dsignes dans ce tableau par P ne sont pas des Pasteurella stricto sensu et sont dans l'attente d'une position taxonomique plus prcise. P. haemolytica est souvent pathogne pour les animaux d'levage : bovins, porcs, volailles. Comme P. pneumotropica, elle se dveloppe sur glose de Mac Conkey. VII - DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE D'UNE INFECTION A P. MULTOCIDA A - Isolement de P. multocida II se fait le plus souvent partir de srosits recueillies profondment dans les lsions de morsures. Classiquement il y a une auto-strilisation rapide des lsions ; il est cependant souvent possible de retrouver P. multocida dans les morsures aprs plusieurs jours. Dans les autres produits pathologiques l'isolement de P. multocida est souvent fortuit (scrtions bronchiques). Un milieu slectif contenant 2 mg/1 d'amikacine et 4 mg/1 de vancomycine peut tre utile pour les prlvements pluri-microbiens. B - Diagnostic indirect La recherche d'anticorps sriques n'a pas d'intrt pratique. Le diagnostic indirect, utile dans les formes chroniques o il n'y a plus de bactries dans les lsions, se fait par l'intradermoraction la pasteurelline de Reilly. Une raction allergique d'hypersensibilit retarde apparat 10 20 jours aprs l'inoculation de Pasteurella multocida. L'antigne utilis ou pasteurelline est un filtrat d'une culture en bouillon de P. multocida. L'injection intradermique est effectue avec 0,5 ml de pasteurelline. La lecture doit tre relativement prcoce, car la raction commence la 6e heure, est maximale la 12e heure et dcrot la 24e heure. La raction locale (placard rythmateux) doit mesurer au moins 3 cm pour tre significative. Elle s'accompagne

Chapitre XK - Pasteurella

____________________________________237

souvent d'une raction focale : sensibilit de la zone d'inoculation, douleur articulaire, pousse thermique. L'hypersensibilit retarde la pasteurelline persiste des annes. Elle est toujours nette dans les formes algodystrophiques chroniques. Elle peut tre ngative si le malade reoit des corticodes ou d'autres anti-inflammatoires. VIII - TRAITEMENT D'UNE PASTEURELLOSE A - Les antibiotiques Les souches de P. multocida isoles chez l'homme sont gnralement sensibles aux ttracyclines, la pnicilline G et l'ampicilline qui sont les antibiotiques de choix pour les pasteurelloses d'inoculation. Les souches d'origine bovine sont moins sensibles et peuvent rsister la pnicilline en produisant une bta-lactamase de type ROB-1. Les souches isoles chez l'homme qui produisent une bta-lactamase sont encore rares. Les aminosides sont peu actifs et ne doivent pas tre utiliss seuls pour traiter une infection P. multocida. B - Antignothrapie Dans les formes chroniques algodystrophiques, les antibiotiques sont inefficaces. Une amlioration peut tre obtenue par 4 ou 5 injections intradermiques de pasteurelline spares d'une semaine chacune.

BIBLIOGRAPHIE
AVRIL J.L., DONNIO P.Y-, POUEDRAS P., Slective mdium for Pasteurella multocida and its use to detect oropharyngeal carnage in pig breeders J. Clin. MicrobioL, 1990, 28, 1438-1440. BURDIN J. C., LION C., Diagnostic biologique des infections Pasteurella in Les Pastourelles et leur pathologie. Numro spcial de la revue Mdecine et Maladies Infectieuses, mars 1986. DONNIO P. Y., AVRIL J.-L, ANDRE P.-M., VAUCEL J.-H., Dermonecrotic toxin production by strains ofPasteurella multocida isolated from man, J Med. MicrobioL, 1991, 34, 333-337 KILIAN M., FREDERIKSEN W., BIBERSTEIN EL, Haemophilus, Pasteurella and Actinobacillus, Acadmie Press., London, 1981. MUTTERS R-, PIECHULLA K., MANNHEIM W., Phenotypic differentiation of Pasteurella stricto sensu and th Actinobacillus group , Eur. J Clin. Microbiol., 1984, 3, 225-229. SCHEFTEL J.M. et al., Infection d'une plaie par Pasteurella aerogenes chez un chasseur aprs blessure due une charge de sanglier , Md Mal I n f e c t , 1987, 5, 267-268. WEBER D.J., WOLFSON J.S., SWAETZ M.N et al., Pasteurella multocida infections, report of 34 cases and review of th literature , Medicine, 1984,63, 133-154.

238

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

ANNEXE 1
AUTRES BACTRIES DES MORSURES Les bactries cites ici sont prsentes dans la flore buccale des animaux et peuvent tre trouves dans des plaies ou lors de septicmies conscutives des morsures. Ce sont des petits bacilles Gram ngatif, immobiles, donnant des colonies petites qui se dveloppent lentement sur glose au sang ou glose chocolat incubes dans une atmosphre enrichie en CO^. N'tant pas encore classs de faon prcise, ces bacilles sont dsigns par le CDC d'Atlanta comme : Groupe EF 4 (eugonic fermenter) ; Groupe M 5 ; Groupe II ; (apparent aux Flavobacterium) et Groupe DF 2 (dysgonic fermenter, aujourd'hui classe comme Capnocytophaga canimorsus). Les caractres permettant de les distinguer de P. multocida sont prsents dans le tableau ci-dessous.

ANNEXE II
STREPTOBACILLUS MONILIFORMIS Cette bactrie n'a aucune parent taxonomique avec les Pasteurella. C'est parce que l'infection est gnralement conscutive une morsure que nous la situons ici. 1 - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES Bacille Gram ngatif, formant des filaments longs et flexueux, mais donnant aussi des formes coccobacillaires. Dans les cultures ges de quelques jours la coloration de Gram peut tre positive. La culture se fait en aro-anarobiose, elle est favorise par une atmosphre enrichie en CO^. Ce germe ncessite du sang, du srum ou de l'ascite. Les colonies se dveloppent en 2 5 jours. Le sodium polythanol sulfate (S.P.S), anticoagulant utilis dans les flacons d'hmoculture, a un effet inhibiteur. Il faut en cas de suspicion d'infection S. moniliformis utiliser des flacons d'hmoculture contenant du citrate comme anticoagulant. II - HABITAT Commensal de la cavit buccale des rongeurs.

Chapitre XW - Posleurella___________________________________________________239

III - POUVOIR PATHOGNE - Septicmie survenant 3 5 jours aprs une morsure de rat. Les panchements articulaires sont frquents et permettent l'isolement du germe. Ces septicmies peuvent se compliquer d'endocardites, de pricardites, d'abcs crbraux. - Les djections de rongeurs peuvent tre contaminantes et des infections non prcdes de morsure ont t dcrites. IV - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES S. moniliformis est sensible la plupart des antibiotiques y compris la pnicilline G laquelle ce germe est trs sensible.

BIBLIOGRAPHIE
DELLAMONICA P., DELBEKE E., GIRAUD D., ILLY G., Septicmies Streptobacillus moniliformis : propos d'un cas, revue de la littrature , Md. Mal. fnfect.,1979, 9, 224-229. KUNNERT J.E., CHRISTMANN D-, PIEMONT Y., MONTEIL H., STORCK D., Fivres aprs morsure de rat : propos d'un cas de streptobacillose , Sem. Hop. Paris, 1985, 61, 2379-2381.

CARACTRES PHNOTYPIQUES DES BACILLES GRAM NGATIF ISOLES DE MORSURES Caractres communs Bacilles Gram ngatif, immobiles, oxydase positive, catalase positive, se dveloppant sur glose au sang en donnant des petites colonies, ne se dveloppant pas ou mal sur glose de Mac Conkey. La LDC est ngative. Caractres diffrentiels P. multocida Croissance sur Mac Conkey Attaque du glucose par voie fennentadve Rduction des nitrates Production d'indole Urase Gladnasc ODC ADH Production possible d'un pigment + + + + EF-4 d + + DF-2* M5 +

Ilj

d + + +

d + + d +

* DF-2 est aujourd'hui rattach au genre Capnocytophaga sous le nom de C. canimorsus.

240

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

ANNEXE III
MALADIE DES GRIFFES DU CHAT Le bacille de la maladie des griffes du chat a t dcrit en 1988 et class dans le genre Afipia (du sigle AFIP pour Armed Forces Institute of Pathology de Washington DC, USA o la premire souche a t isole). Il s'agit de bacilles Gram ngatif, oxydase positive, mobiles, cultivant sur glose BCYE (voir Legionella) et en bouillon nutritif 25 et 30C, mais pas sur Mac Conkey. Les colonies sont gristres, brillantes, convexes, bords nets. Le caractre urase est positif, mais l'hmolyse, la production d'indole, de SH2, l'hydrolyse de la glatine et de l'esculine sont ngatifs; il n'y a pas d'oxydation du glucose, lactose, maltose et saccharose. L'espce Afipia felis est responsable de la maladie des griffes du chat et a t isole d'un ganglion de sujet atteint. A. felis est rsistant de nombreux antibiotiques et est sensible aux aminoglycosides, l'imipnme et au ceftriaxone. Les autres espces du genre, A. clevelandensis, A. broomae et A. genospecies 1,2 et 3 ne sont pas associes avec la maladie des griffes du chat et ont t isols de plaies, crachat, liquide synovial, liquide pleural, liquide de lavage bronchique et de l'eau.

BIBLIOGRAPHIE
BRENNER D.-J., et al.. Proposai of Afipia gen. nov., with Afipia felis sp. nov. (formerly th cat scratch disease bacillus), Afipia cleveladensis sp. nov. (formerly th Cleveland Clinic Foundation strain), Afipia broomae sp. nov. and three unnamed genospecies, J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 2450-2460.

Chapitre XX HAEMOPfflLUS

HISTORIQUE
Au cours de la pandmie de grippe de 1889-1892, Pfeiffer a observ et cultiv partir de crachats de gripps un petit bacille, Bacillus influenzae et en a fait l'agent tiologique de la grippe ou influenza ; il a montr la prsence indispensable de sang pour la culture de cette bactrie et invente la glose au sang. Quelques annes plus tt, en 1883 en Egypte par Koch, en 1886 aux U.S.A. par Weeks, avait t observe, puis cultive dans l'exsudat de conjonctivites purulentes une bactrie, bacille de Koch-Weeks, signale dans un trait de 1889 sous le nom de Bacillus aegyptius. Le nom du genre Haemophilus a t propos en 1917. En 1939, A.Lwoff propose le dmembrement des Hemophilae et la cration du genre Moraxella, suivi en 1952 par Moreno-Lopez qui propose le genre Bordetella. Jusqu'en 1933, date de la dcouverte de l'agent tiologique de la grippe, H. influenzae tait rest, parfois avec des doutes, la bactrie suspecte d'tre responsable de l'influenza. En 1930 Miss M. Pittman met en vidence l'existence de souches capsules, propose des types srologiques et montre la prdominance du type b dans les mningites et autres infections aigus suppurees.

HAEMOPHILUS INFLUENZAE
1 - CARACTRES GNRAUX DU GENRE Les caractres gnraux des bactries du genre Haemophilus sont les suivants : petits bacilles ou coccobacilles Gram ngatif avec un polymorphisme trs accentu (formes allonges) ; immobiles, non sporuls, parfois capsuls, arobies et anarobies facultatifs, exigeant des facteurs prsents dans le sang, le facteur X ou protoporphyrine IX ou protohme et/ou le facteur V (NAD ou NADP), dont la croissance est aussi favorise par les milieux complexes, la temprature optimale de 35-37C ; possdant une nitrate-rductase, prsentant une raction de la catalase et de l'oxydase variables ; utilisant les hydrates de carbone par un processus fermentatif ; tant des parasites obligatoires des muqueuses de l'homme et des animaux ; le G + C % de l'ADN est compris entre 37 et 44 moles.

II - TAXONOMIE ET NOMENCLATURE Le genre Haemophilus est plac (Kilian, Bergey's Manual 1984) dans la famille des Pasteurellaceae avec les genres Pasteurella et Actinobacillus.

242

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

Haemophilus influenzae est l'espce-type du genre qui contient seize espces d'origine animale et humaine. Parmi les seize espces dcrites, 3 exigent les facteurs X et V (H. influenzae, H . aegyptius et H . haemolyticus), 2 n'exigent que le facteur X (H. haemoglobinophilus et H . ducreyi) et 10 n'exigent que le facteur V ( H . parainfluenzae, H. parahaemolyticus, H . paraphrohaemolyticus, H. pleuropneumoniae, H. paracuniculus, H. paraphrophilus, H. segnis, H. parasuis, H. paragallinarum, H. aviwn). H. aphrophilus prsente une exigence en facteur X variable. III - HABITAT ET PIDMIOLOGIE Les Haemophilus font partie de la flore normale des muqueuses des voies respiratoires suprieures et de la cavit buccale de l'homme ; ils peuvent aussi tre isols dans le tube digestif et au niveau de la muqueuse vaginale. Deux espces, H. aegyptius et H. ducreyi ne sont pas rencontres chez le sujet sain. Par contre H. influenzae, H . haemolyticus, H. parainfluenzae, H. parahaemolyticus, H. paraphrohaemolyticus, H. aphrophilus, H. paraphrophilus et H. segnis occupent une place variable dans les diffrentes niches cologiques. Les Haemophilus reprsentent 11 % de la flore pharynge d'un sujet normal; l'espce dominante est H. parainfluenzae, H. influenzae est prsent en moins grande quantit et est plus frquent chez l'enfant. Le portage d'H. influenzae concerne 75 % des jeunes enfants et 35 % des adultes et des enfants gs, mais il existe de grandes variations dans la colonisation pharynge par les souches capsules de type b. Dans une population normale les souches capsules sont rencontres chez moins de 5 % des enfants (la moiti des souches tant de type b) ; chez les adultes, le portage est habituellement infrieur 0,50 %. H. influenzae est plus rarement rencontr au niveau de la muqueuse buccale, de la salive et la surface de la muqueuse vaginale. H. haemolyticus est localis au niveau du pharynx. H. parainfluenzae est plus ubiquitaire et colonise les muqueuses buccales et pharynges ; il est aussi prsent dans les selles et la cavit vaginale. Dans la salive, H. parainfluenzae peut tre en quantit importante (1.107 bactries par ml). Les autres espces, le plus souvent V dpendantes, H. parahaemolyticus, H. paraphrohaemolyticus, H. segnis, H. paraphrophilus ont les mmes prfrences cologiques (muqueuses buccales et pharynges), mais sont moins frquentes. Dans la bouche, la surface des dents (plaque dentaire, espace dentaire, poche gingivale) est le site prfrentiel pour H . parainfluenzae, H . segnis, H. paraphrophilus et H. aphrophilus. H. influenzae de type b est l'une des trois principales espces bactriennes responsables des mningites primitives. Il occupe dans notre pays la deuxime place derrire le mningocoque. Aux Etats-Unis d'Amrique, il occupe la premire place et le risque pour un enfant de prsenter une mningite H. influenzae pendant les cinq premires annes de sa vie est estim 1/500. Ce risque est de 1/1 500 en Grande Bretagne. La maladie atteint des enfants gs de 2 mois 3 ans avec une incidence maximale entre 6 mois et 1 an. Les souches sont le plus souvent de biotype I. La mningite H. influenzae est une infection sporadique et il n'y a pas de vraies pidmies comme celles observes avec le mningocoque. Cependant des tudes rcentes ont montr que la mningite Haemophilus doit tre considre comme contagieuse, avec un risque quivalent celui de la mningite crbrospinale. Lors de manifestation invasive dans une collectivit ou une famille, il y a toujours une augmentation importante du nombre de porteurs de souches capsules. Les autres

Chapitre XX - Haemophilus______________________________________________________243

manifestations invasives ont une distribution, selon l'ge, identique celle des mningites l'exception des piglottites moins frquentes qui touchent les enfants plus gs, de 2 7 ans. La dissmination des souches capsules se fait par les gouttelettes disperses lors de la respiration ou par contact direct, intime, avec les scrtions d'un malade ou d'un porteur ; la bactrie ne survit pas la dessication dans le milieu extrieur. IV - POUVOIR PATHOGNE NATUREL H. influenzae est une bactrie pyogne responsable d'infections varies parfois svres observes tous les ges de la vie mais plus frquemment chez l'enfant. Il s'agit soit d'infections aigus systmiques provoques par des souches invasives capsules de type b soit d'infections aigus sans bactrienne ou chroniques provoques par des souches non capsules dans lesquelles H. influenzae ne joue parfois qu'un rle secondaire. A - Chez l'enfant Les infections H. influenzae sont rares dans la priode nonatale ; il en est de mme des infections puerprales reconnues cependant depuis le dbut du sicle. Les souches responsables sont le plus souvent non capsules. La localisation mninge est exceptionnelle cet ge. Aprs l'ge de deux mois les manifestations invasives sont les plus frquentes et les plus graves. Les mningites H. influenzae sont frquentes chez l'enfant g de 3 mois 3 ans. La forme classique est habituellement prcde de signes d'infection des voies respiratoires suprieures (pharyngite, sinusite ou otite moyenne) contemporaine ou non d'une infection virale. Il existe plus rarement des formes foudroyantes. La mortalit est infrieure 10 % mais les squelles neurologiques ne sont pas rares, observes dans 20 30 % des cas. Le risque de complications et de squelles est d'autant plus lev que la concentration bactrienne (ou en antignes solubles) dans le LCR est importante et durable. La bactrie responsable est H. influenzae de type b. L'piglottite qui survient chez des enfants plus gs (de 2 7 ans) est moins frquente que la mningite. D'autres localisations sont observes avec une frquence variable lors d'infection systmique : arthrite (et plus rarement ostite ou ostomylite), otite moyenne, cellulite, pricardite, pneumonie avec ou sans empyme, orchi-pididymite. Chez l'enfant plus g les infections H. influenzae peuvent survenir lors de dficience du terrain, dficit immunitaire, leucmie, cancer. L'otite moyenne H. influenzae est le plus souvent une infection localise, sans bactrimie et les souches sont non capsules dans 80 % des cas. Il en est de mme des autres infections de la sphre ORL et des infections bronchopulmonaires. La conjonctivite H. influenzae se manifeste sous deux formes : cas sporadiques provoqus par des souches capsules ou non et pidmies localises dans des pays climat chaud (Afrique du Nord, sud des U.S.A.) habituellement provoques par le bacille de Koch-Weeks, H. aegyptius, non capsul proche de H. influenzae de biotype III. B - Chez l'adulte Toutes les manifestations prcdemment dcrites chez l'enfant peuvent tre observes chez l'adulte. Le terrain va jouer un rle prdominant dans la survenue des

244

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

infections H. influenzae. Les mningites H. influenzae reprsentent de 1 10 % des mningites purulentes de l'adulte. Elles sont observes plus volontiers chez le sujet g ou lors de causes favorisantes : traumatisme crnien, agammaglobulinmie, diabte, alcoolisme, splnectomie, autre maladie intercurrente. H. influenzae est rarement responsable de mningite rcidivante (essentiellement pneumocoque). Les souches sont le plus souvent non capsules. Les localisations pulmonaires et bronchopulmonaires sont les plus frquentes. Il s'agit soit de pneumonie avec bactrimie, soit d'infection bronchopulmonaire lors de bronchite chronique. Dans ce cas, la perte des capacits de dfense de la muqueuse bronchique permet la colonisation des bronches par les bactries de's voies respiratoires suprieures. L'exacerbation aigu de la maladie chronique est accompagne de la prolifration seul ou avec d'autres bactries de H. influenzae le plus souvent non capsul. H. influenzae joue avec le pneumocoque un rle important dans les sinusites aigus. Par contre les infections avec bactrimie sont peu frquentes chez l'adulte (piglottite, pricardite, endocardite, arthrite, cellulite). Des infections biliaires, appendiculaires, urinaires, prostatiques, gnitales et gyncologiques ont t dcrites. V - PHYSIOPATHOLOGIE ET FACTEUR DE VIRULENCE Haemophilus influenzae labore diffrents produits qui des degrs divers participent au pouvoir pathogne de cette espce. Toutes les souches d'H. influenzae (comme S. pneumoniae, N. meningitidis et le gonocoque) produisent une enzyme, immunoglobuline A protase, extracellulaire, spcifique des IgA humaines de la sous-classe des IgA,.Le rle des IgA^ protases n'est pas encore lucid. De dcouverte rcente, les pili de H . influenzae jouent un rle encore imparfaitement connu. Ils sont responsables de l'adhsion aux cellules pithliales mais ne semblent pas jouer un rle dterminant dans la colonisation des muqueuses et l'invasion. Parmi les composants bactriens, le lipopolysaccharide et les protines de membrane externe sont des constituants antigniques importants pour les tudes pidmiologiques. Les antignes polysaccharidiques de capsule sont le support essentiel de la virulence lors de manifestations invasives. Les souches capsules ont t classes par Miss Pittman en 6 srotypes a, b, c, d, e, et f. Le srotype b est le plus frquent ; il est d un polyribosylribitol phosphate ou PRP, antignique qui, purifi, est utilis comme vaccin. Les anticorps dirigs contre le PRP sont des anticorps protecteurs qui apparaissent progressivement chez l'enfant. Fothergill et Wright ont montr ds 1932 la relation existant entre l'absence d'activit bactricide du srum et l'incidence des mningites H. influenzae de type b. Ultrieurement la mme corrlation a t tablie entre les anticorps anti PRP et la survenue des mningites, plus frquentes entre 3 mois et 3 ans. La priode situe entre la fin de la protection passive confre par les anticorps d'origine maternelle et l'acquisition d'anticorps un titre suffisant est favorable au dveloppement des mningites.

Chapitre XX - Haemophilus______________________________________________________245

VI - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE A - Les produits pathologiques Ce sont soit des produits monomicrobiens obtenus par ponction (LCR, liquide articulaire, liquide pleural), soit des produits polymicrobiens comme les scrtions bronchiques et les prlvements dans la sphre ORL. Ces derniers doivent tre raliss en vitant ou limitant la contamination par la flore oropharynge. La mise en culture des scrtions bronchiques se fait aprs homognisation du prlvement et est accompagne d'une approche quantitative des bactries prsentes. L'hmoculture est utile dans tous les cas d'volution fbrile. Il faudra penser H. influenzae dans certaines circonstances inhabituelles et rares (urines, pus profond, ...) B - Examen direct Dans un produit pathologique ou dans une culture, H . influenzae se prsente comme un petit bacille Gram ngatif (0,3-0,4 x 1-1,5 u,m) court, le plus souvent coccobacillaire. Mais il faut souligner la frquence du polymorphisme qui lors de l'observation d'une prparation microscopique peut rendre perplexe un observateur non averti. Ce sont des bacilles immobiles, non sporuls et dans certains cas possdant une capsule. L'examen direct est utile pour les produits monomicrobiens et lors de mningite l'aspect coccobacillaire et le polymorphisme de bactries Gram ngatif sont de bons lments d'orientation. La lecture est plus difficile dans les produits souvent polymicrobiens comme les expectorations, les lments rechercher sont l'abondance de coccobacilles ou de bacilles fins (plus fins qu'une entrobactrie) accompagnant les polynuclaires et le polymorphisme. C - Culture - Caractres d'identification L'appartenance au genre Haemophilus repose sur l'exigence en facteur de croissance X et V prsents dans les globules rouges. Le facteur V, NADP, est une co-enzyme de dshydrognase. NAD est thermolabile et inactiv par chauffage 30 mn 120C. Le facteur V est intraglobulaire, est prsent dans les tissus et est synthtis par la plupart des espces bactriennes. Le facteur X est l'hmine qui entre dans la composition des enzymes respiratoires contenant du fer (cytochromes, cytochrome oxydase, catalase, peroxydase). Ce compos est indispensable aux bactries ne possdant pas les enzymes de la chane de transformation de l'acide delta amino-levulinique en protoporphyrine. En anarobiose les besoins en facteurs X de H. influenzae sont trs rduits ou mme nuls. Le facteur X diffuse partir des globules rouges intacts et est libr aprs chauffage. Les milieux de culture doivent contenir les facteurs X et V. La glose au sang avec une strie de S. aureus qui ralise un apport de facteur V permet la culture par le phnomne de satellitisme. La glose au sang cuit est obtenue par chauffage modr entranant la libration de X et V partir des globules rouges. La glose chocolat est un milieu nutritif complexe contenant de l'hmine auquel doit tre ajout le NAD. Les milieux nutritifs habituels peuvent tre supplments en facteur X et V (Fildes, NAD, hmine, extrait de levure). La recherche d'Haemophilus dans les produits polymicrobiens provenant du tractus respiratoire utilise des milieux slectifs prpars par addition d'antibiotique, bacitracine par exemple (ce fut la premire utilisation de la pnicilline par Fleming en 1929).

246

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

La temprature optimale de culture est de 35-37C. L'incubation en atmosphre humide favorise la croissance et certaines espces exigent une atmosphre enrichie en CO^ (H. aphrophilus, H. paraphrophilus}. Diffrents types de colonies ont t dcrits chez H. influenzae. Les souches capsules donnent des colonies muqueuses, volumineuses, ayant tendance s'taler ou des colonies lisses, rondes bords rguliers, bombes, facilement dissociables, iridescentes sur milieu transparent en lumire oblique. Les souches non capsules sont soit des colonies lisses, voisines des prcdentes, plus petites, sans iridescence soit plus rarement de type rugueux, difficile prlever, qui est l'aspect habituel des colonies d'H. parainfluenzae. En milieu liquide les souches S donnent un trouble homogne, les souches R forment un dpt granuleux sans modifier la limpidit du milieu. Certaines souches d'H. influenzae mettent une odeur d'indole caractristique. D - Identification La premire tape de l'identification des Haemophilus est la mise en vidence de l'exigence en facteur X et/ou V. Diffrentes mthodes permettent d'explorer cette exigence : phnomne de satellitisme sur glose au sang avec une strie de Staphylocoque, milieu complment avec l'un et/ou l'autre facteur, disques contenant l'un et/ou l'autre facteur dposs la surface d'un milieu glose. Tout apport parasite de facteur de croissance (en particulier X partir de milieu au sang, flacon d'hmoculture,...) doit tre soigneusement vit, de mme qu'il est important pour raliser ces tests d'utiliser des milieux nutritifs ne contenant aucune trace de ces facteurs. Le test explorant la synthse de porphyrine partir de l'acide delta-aminolvulinique permet d'apporter une certitude quant la dpendance en facteur X (test de la porphyrine). L'identification est complte par l'tude de caractres biochimiques prsents dans les tableaux 1 et II. La fermentation du glucose, avec ou sans production de gaz est constante ; l'utilisation du xylose et du ribose par H. influenzae et celle du saccharose et du fructose par H. parainfluenzae sont de bons caractres diffrentiels. Seules les espces exigeantes en facteur V seul et H. aphrophilus ont un test l'ONPG positif. En fonction de trois caractres biochimiques, omithine-dcarboxylase, urase et production d'indole, Kilian a propos des biotypes actuellement au nombre de 8 pour H. influenzae et de 3 pour H. parainfluenzae. Ces caractres peuvent tre recherchs avec les milieux habituels supplments ou non ou l'aide de micromthode (galerie API 10 E avec un inoculum lourd). La dtermination du srotype des souches capsules est ralise par agglutination sur lame, gonflement de la capsule, co-agglutination ou lectrophorse. L'tude des besoins en facteurs X et/ou V est la premire tape du diagnostic diffrentiel. L'exigence stricte en CO^ est un autre lment du diagnostic diffrentiel. Les caractres biochimiques utiles pour diffrencier les espces du genre Haemophilus et des bactries voisines ou isoles dans des situations identiques sont prsents dans les tableaux 1 et II.

Chapitre XX - Haemophilus

___________________________________________________247

TABLEAU 1 CARACTRES BIOCHIMIQUES DES HAEMOPHILUS RENCONTRS CHEZ L'HOMME Synthse Exigence Hmolyse Acidification D fructose Saccharose Lactose D-xylose D glucose porphyrines facteur V H.influenzae H aegyptius H.haemolyticus H.parainfluenzae H parahaemolyticus H.paraphrohaemolyticus H aphrophilus H.paraphrophilus H.segnis + + + + + + + + D-mannose + + + + (+) +(g) +(g) +(g) + +(g) +(g) f D-galactose Maltose + (+) + + d d + f + (+) + + + + + + f f + + + + + f + + + + + f + + d +

+ + + f + + D-ribose

Mlibiose Trhalose Raffinose SH^ + + + + + + + + + Phosphatase alcaline + + + + + + + + +

H.influenzae H.aegyptius H.haemolyticus H.parainfluenzae H.parahaemolyticus Hparaphrohaemolyticus H .aphrophilus H.paraphrophilus H.segnis

+ (+) + + + + -

+ +

Hmagglutinadon H.influenzae H.aegyptius H.haemolyticus H.parainfluenzae H.parahaemolyticus H.paraphrohaemolyticus H .aphrophilus H.paraphrophilus H.segnis

Besoin CO;

d -

+ + + -

f = raction positive faible ; g = avec production de gaz ; (+) = raction positive tardive pour plus de 90% des souches ; d = raction positive pour 10 90% des souches.

248

______ ___

Section V - AUTRES BACILLES AGRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

TABLEAUn BIOTYPES DE H. INFLUENZAE ET PARAINFLUENZAE ET CARACTRES DIFFRENTIELS AVEC DES ESPCES VOISINES
Omithine dcarboxylase H.influenza Biotype 1 + + + + + + d + Ure Indole ONPG Oxydase Catalase Rduction des nitrites

n m IV v

+ + + + + + + + + + -

+ + + +

VI VII

vin
H' .parainfluenzae Biotype 1 II

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + d d + + + d + d + -

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

d
d d

H.aegyptius H .haemolyticus H.parahaemotyticus H.paraphrohaemotyticus H.aphrophilus H.paraphrophilus

H.segnis

d d + + d -

A. actimmycetemcomitans Eikenella corrodens Cardiobacterium hminis

E - Classification : biotypes, srotypes Diffrents marqueurs peuvent tre utiliss pour caractriser les souches d'H. influenzae. La rpartition des biotypes est diffrente selon l'origine des souches : les souches invasives capsules appartiennent le plus souvent au biotype I, les souches prsentes au niveau des muqueuses des voies respiratoires suprieures sont de biotype II. Parmi les six srotypes dfinis par M. Pittman,le srotype b est pratiquement toujours celui isol lors de manifestations invasives. D'autres marqueurs comme les sous-types dfinis par le profil lectrophortique des protines de membrane externe ou du LPS permettent de complter les tudes pidmiologiques. F - Diagnostic rapide Le diagnostic rapide repose sur la recherche d'antignes polysaccharidiques (antignes solubles) dans les liquides biologiques, LCR, srum, urines. Cette recherche peut se faire par diffrentes techniques, lectrophorse, agglutination de particules de latex revtues d'anticorps, co-agglutination, ELISA. Elle concerne uniquement le type b d'H. influenzae et les indications sont les infections systmiques de l'enfant. VIII - AUTRES ESPCES D'HAEMOPHILUS Les caractristiques biochimiques des autres espces d'Haemophilus sont prsents dans les tableau 1 et II. - H. aegyptius (bacille de Koch-Weeks) - Cette espce doit tre considre comme une varit hmagglutinante de H. influenzae biotype III, mais tous les biotypes III ne sont pas H. aegyptius. Cette bactrie est responsable de conjonctivites en

Chapitre XX - Haemophtius___________________________________________________249

pays chauds. En 1984 est survenue au Brsil, chez des enfants, une pidmie de purpuras fulminants pouvant tre mortels et conscutifs une conjonctivite purulente. La conjonctivite et la maladie grave connue sous le nom de "Fivre Purpurique Brsilienne" sont dues H. aegyptius. H. parainfluenzae. Rarement responsable d'infections, essentiellement chez l'adulte, cette espce a t isole lors d'endocardite. Les cas de mningites et d'infections systmiques sont rares. H. haemolyticus, H. parahaemolyticus, H. paraphrohaemolyticus. Ces espces ont t isoles dans de trs rares cas d'endocardite et d'abcs du foie. H. aphrophilus et H. paraphrophilus. Ces deux espces sont responsables d'endocardites (plus frquemment que H. parainfluenzae) et d'abcs du cerveau. IX - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE A - Sensibilit aux antibiotiques et traitement Les diffrentes espces sont habituellement rsistantes aux lincosamines (caractre pouvant tre utilis comme aide au diagnostic) et peu sensibles in vitro aux macrolides. H. influenzae est sensible aux principales familles d'antibiotiques : pnicillines (ampicilline), cphalosporines (Ie, IIe et surtout IIIe gnration), aminoglycosides, chloramphnicol, ttracyclines, trimthoprime, sulfamides, rifampicine et quinolones. Dans les annes 1970 a t observe l'mergence des souches rsistantes en particulier l'ampicilline par production d'une bta-lactamase plasmidique de type TEM (identique celle observe chez E. coli et de nombreuses espces d'entrobactries, inhibe par l'acide clavulanique). Cette rsistance n'est pas toujours dcele par l'antibiogramme standard (diffusion en glose) et il est indispensable de rechercher, spcifiquement par une technique approprie, la production de bta-lactamase pour toutes les souches isoles en situation pathogne (par utilisation d'une cphalosporine chromogne, ou par mthode acidimtrique ou microbiologique). Plus rarement, la rsistance est due une enzyme de type ROB-1. Elle est parfois due une modification de la permabilit de la paroi bactrienne. La rsistance l'ampicilline concerne 12 20 % des souches isoles dans notre pays. La rsistance au chloramphnicol est plus rare (3 %) par production d'une chloramphnicol-actyl-transfrase d'origine plasmidique. La rsistance concerne aussi les ttracyclines, la kanamycine et le trimthoprime. Il existe des souches invasives multirsistantes ampicilline et chloramphnicol. H. parainfluenzae a la mme sensibilit que H. influenzae mais les souches rsistantes, en particulier l'ampicilline sont plus frquentes. Le traitement fait appel diffrents antibiotiques actifs. L'ampicilline est l'antibiotique de choix dans le traitement des mningites administre forte dose par voie parentrale. L'mergence des souches rsistantes l'ampicilline a fait modifier les schmas thrapeutiques et abandonner l'ampicilline pour le chloramphnicol ou plus frquemment une cphalosporine de troisime gnration bonne diffusion mninge.

B - Prophylaxie
Elle est concevable contre les infections H. influenzae de type b avec pour objectifs l'limination du portage chez l'individu isol ou dans une collectivit et l'augmentation des dfenses de l'organisme par la vaccination des sujets rceptifs. Ces deux objectifs ont fait l'objet de travaux nombreux, mais des incertitudes demeurent quant leur opportunit et leur efficacit.

250

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

La chimioprophylaxie, non utilise dans notre pays, peut faire appel la rifampicine par voie orale. La vaccination repose sur l'utilisation du polysaccharide de type b ou polyribosylribitol (PRP) obtenu purifi. La rponse aprs vaccination est troitement dpendante de l'ge et la synthse d'anticorps antipolysaccharidiques est faible avant 18 mois. Les amliorations visent mettre au point un vaccin, utilisable et efficace avant 18 mois, par couplage du PRP avec des protines par exemple des anatoxines diphtriques ou ttamiques ou des protines membranaires de Neisseria meningitidis.

BIBLIOGRAPHIE
BRENNER, D.J., MAYER L.W., CARLONE G.M. et al., Biochemical, genetic and epidemiologic characterization of Haemophilus influenzae biogroup Aegyptius (Haemophilus aegyptius) strains associated with Brazilian Purpuric Fever. J . Clin. Microbiol., 1988, 26, 1524-1534. DABERNAT H., Mthodes rapides de dtection de la rsistance enzymatique l'ampicilline et au chloramphnicol chez Haemophilus influenzae , Path. Biol. 1983, 31, 103-106. ESKOLA J., PELTOLA H., TAKALA A.K. et al., Efficacy of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-diphteria toxoid conjugale vaccine in infancy. N. Engl. J . Med., 1987, 317, 717-722. GRENIER B., MARCHAND S., Mningites Haemophilus influenzae chez l'enfant , Med. Mal. Infect., 1982, 13, 164-173. GUTMANN L., WILLIAMSON R., COLLATZ E., ACAR J.F., Mechanisms of beta-lactam rsistance in Haemophilus influenzae , Eur. J . Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1988, 7, 610-615. Rapport du colloque international organis par le Groupe d'tudes pidmiologiques et prophylactiques sur l'infection Haemophilus , Path. Biol., 1983, 31, n2 numro spcial.

HAEMOPHILUS DUCREYI
1 - POSITION TAXONOMIQUE En 1889, Ducrey a dcrit la bactrie responsable du chancre mou, connue actuellement sous le nom de Haemophilus ducreyi. Cette infection avait t individualise de la syphilis en 1852, mais les difficults de culture du bacille de Ducrey ont pendant longtemps fait reposer le diagnostic sur les seules donnes cliniques. H. ducreyi constitue une espce homogne et fait partie du genre Haemophilus. Cependant des tudes rcentes d'hybridation ADN-ADN ont montr que cette espce tait loigne des autres espces du genre Haemophilus. II - HABITAT ET PIDMIOLOGIE H. ducreyi est une bactrie strictement adapte l'homme et n'a jamais t retrouve dans le milieu extrieur. Elle est responsable du chancre mou, maladie sexuellement transmissible, endmique dans les rgions tropicales et subtropicales d'Asie et d'Afrique. En Europe et en France.la maladie a disparu pendant plusieurs dcennies ; elle tait occassionnellement observe dans les ports. L'infection est observe nouveau depuis les annes 1970. A ct de cas isols, le chancre mou volue sous forme d'pidmies dans des populations de travailleurs immigrs originaires d'Afrique le plus souvent. Dans la majorit des cas, l'infection

Chapitre XX - Haemophttus

se produit au contact de prostitues. La transmission se fait par contact direct et ncessite une effraction cutane. Il n'a pas t mis en vidence de porteurs sains (homme ou femme). La maladie est beaucoup plus frquente chez l'homme. Les infections H. ducreyi sont dans de nombreux pays en voie de dveloppement la principale cause d'ulcration gnitale, plus frquente que la syphilis. Dans les pays industrialiss la cause la plus frquente en est l'infection Virus Herps suivie par l'infection Treponema pallidum. III - POUVOIR PATHOGNE A - Pouvoir pathogne naturel Aprs une incubation de dure variable, courte, de moins d'une semaine, ou prolonge de 15 30 jours ou plus, la lsion dbute par une pustule qui volue sous forme d'ulcration douloureuse, non indure, bords surlevs et irrguliers, purulente. Le chancre mou est beaucoup plus frquemment observ chez l'homme et sige le plus souvent sur la peau des organes gnitaux (sillon balano-prputial, fourreau) plus rarement sur le gland. Il peut y avoir des ulcrations multiples rsultant d'une auto-inoculation. Le chancre peut tre accompagn d'une adnopathie satellite (bubon inguinal) voluant vers la fistulisation aprs ramollissement. L'infection est beaucoup plus rarement observe chez la femme et les lsions sont localises la partie cutane des organes gnitaux. B - Pouvoir pathogne exprimental L'auto-inoculation dans la peau du malade partir de sa propre lsion a t compltement abandonne comme moyen de diagnostic. Chez l'animal le pouvoir pathogne exprimental a pu tre recherch par voie intradermique chez le lapin. La virulence des souches est trs variable et s'attnue au cours de la conservation. IV - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE A - Produit pathologique Le prlvement est ralis au niveau du chancre aprs dtersion, la base de l'ulcre avec un vaccinostyle ou un couvillon ou par ponction au niveau du bubon inguinal. La conservation et le transport sont viter et le produit doit tre mis en culture immdiatement. B - Examen direct L'examen microscopique du frottis se fait aprs coloration au bleu de mthylne ou au Giemsa. La coloration de Gram ne permet pas de visualiser correctement le bacille de Ducrey. La lecture peut tre rendue difficile par la prsence d'une flore associe. H. ducreyi se prsente comme un bacille court (0,5 u-m x 1,5-2 (im), bouts arrondis, coloration bipolaire intra et extra-cellulaire, voquant une pingle de sret. Les bactries peuvent tre isoles ou groupes en chane (aspect en chane de bicyclette) ou en banc de poisson. L'examen direct est positif dans 50 80 % des cas.

252

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

C - Culture H. ducreyi fait partie des bactries de culture difficile ou bactries exigeantes . De plus la prsence frquente d'autres bactries dans le prlvement ncessite l'utilisation de milieux slectifs. Diffrents milieux solides ont t proposs, glose au sang (humain, lapin, de foetus de bovid), glose chocolat et Isovitalex. L'enrichissement en hmine et en srum (10 - 20 %) amliore le rendement des cultures. L'addition de vancomycine (3 mg/1) et de polymyxine (7,5 mg/1) ralise un milieu slectif (VCN). Il est ncessaire d'utiliser deux milieux (slectif et non slectif) lors de l'isolement. Les meilleurs milieux de base sont la glose Columbia, la glose PPLO et le milieu GC pour gonocoque. L'incubation est ralise 33-35C en atmosphre de 5 10 % de CO^ et sature d'humidit. Les colonies, visibles aprs 2 5 jours d'incubation, sont petites, semi-opaques, gris-jaunes, non muqueuses, qui, lors de la tentative de prlvement, glissent intactes sur la glose. Le produit pathologique lors de la rcolte peut tre inocul dans 1 ml de srum (humain, lapin ou foetal de bovid) et incub 35C pendant 2-3 jours. Ceci ralise un enrichissement du bacille de Ducrey qui, aprs coloration, se prsente sous forme de longues chanes de bacilles coloration bipolaire ayant l'aspect de chane de bicyclette. D - Identification L'espce est pauvre en critres d'identification. H. ducreyi est une espce exigeante en facteur X et ses besoins sont levs (200 mg/1), suprieurs ceux des autres Haemophilus. Le besoin en facteur X est difficile explorer par le satellitisme autour d'un disque sur milieu dficient comme pour les autres Haemophilus, mais il peut l'tre par le test la porphyrine (recherche de synthse de prophyrine partir de l'acide delta aminolevulinique). Les caractres habituels d'identification sont en majorit ngatifs ; les principaux caractres positifs sont la rduction des nitrates en nitrites ; la prsence d'une phosphatase-alcaline et le test l'oxydase ralis avec le ttra-mthyl-pphnylnediamine. H . ducreyi possde des amino-peptidases mais pas de glycosidases. ' Le profil lectrophortique des protines de membrane externe permet de dfinir des sous-types utilisables pour les tudes pidmiologiques. Le diagnostic repose donc sur l'aspect particulier du bacille, les exigences de culture et les caractres biochimiques ngatifs. Le diagnostic diffrentiel est envisager pour des colonies croissance lente comme certaines corynbactries ( Grain positif). V - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE Le traitement fait appel des soins locaux et une antibiothrapie par voie gnrale : les antibiotiques utiliss avec succs sont le trimthoprime sulfamthoxazole, la streptomycine, les ttracyclines, l'trythromycine. Il existe des souches rsistantes l'ampicilline (par production d'une bta-lactamase), la ttracycline, au chloramphnicol, aux sulfamides, aux aminosides. Ces rsistances sont d'origine plasmidique. La prophylaxie est celle des maladies sexuellement transmissibles. Il n'existe pas d'immunit de surinfection.

Chapitre XX - Haemophilus___________________________________________________253

BIBLIOGRAPHIE
ALBRITON W.L., Biology of Haemophilus ducreyi , Microbiol. Rev., 1989, 53, 377-389. KRAUS S.J., KAUFMAN H.W., ALBRITTON W.L., THORNSBERRY C., BIDDLE J.W., Chancrod therapy : a review of cases confirmed by culture , Rev. Infect. Dis., 1982, 54,
S848-S856.

MOREL P., CASIN I., GANDIOL C., VALLET C., CIVATTE J., pidmie de chancre mou : traitement de 587 malades , Nouv. Presse M e d , 1982, 11, 655-656. MORSE S.A., Chancroid and Haemophilus ducreyi , Clin. Microbiol. Rev., 1989, 2, 137-157. OBERHOFER T.R., BACK A.E., Isolation and cultivation of Haemophilus ducreyi , J. Clin. Microbiol., 1982,15, 625-629.

Chapitre XXI BACILLES GRAM NGATIF CROISSANCE DIFFICILE

CARDIOBACTERIUM HOMINIS

HISTORIQUE
Slotnick et Dougherthy ont propos en 1964 le nom de C. hominis pour dsigner des bacilles Gram ngatif, polymorphes, de culture lente, placs initialement dans le groupe II-D (bactries apparentes aux Pasteurella), responsables exclusivement d'endocardites. Il n'existe aucune parent andgnique avec Brucella, Streptobacillus, Pasteurella et Haenwphilus.

1 - HABITAT ET PIDMIOLOGIE C. hominis fait partie de la flore normale des voies respiratoires suprieures et est prsent dans le nez et le pharynx. Il est plus rarement prsent au niveau du vagin. ' II - POUVOIR PATHOGNE NATUREL Cette espce bactrienne est responsable exclusivement d'endocardites. C. hominis est une espce peu virulente. L'endocardite survient lors de bactrimie point de dpart oro-pharyng et greffe sur des lsions prexistantes. III - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE Le prlvement est uniquement reprsent par l'hmoculture qui est le seul moyen de diagnostic de l'endocardite C. hominis. La culture positive est habituellement dcelable aprs 1 7 jours d'incubation 37C (moyenne 4 jours) ; l'incubation doit tre prolonge 2 3 semaines. La culture se manifeste par un dpt floconneux discret sans modification de la limpidit du milieu liquide.

Chapitre XXI - Bacilles Gram ngatif croissance difficile

255

IV - EXAMEN DIRECT - MORPHOLOGIE C. hominis est un bacille droit, extrmits arrondies, parfois renfles, de 0,5-0,7 x 1-3 [im, polymorphe, avec des formes longues de 10-20 pm ; les bactries sont isoles, par paires, en courtes chanes ou groupes en rosette, en paquets d'pingles. C'est un bacille Gram ngatif (avec la particularit de retenir le colorant dans sa partie mdiane ou l'extrmit renfle), immobile, non capsul, non sporul. V - CULTURE - CARACTRES D'IDENTIFICATION C. hominis fait partie du groupe aro-anarobie facultatif ; certaines souches ont besoin de CO^ (3 5 % de CO^) l'isolement. En arobiose, les souches ont besoin d'humidit. La croissance est obtenue 30-37C. Les milieux doivent contenir de l'hmine, glose au sang (lapin, mouton, cheval), glose chocolat ; il n'y a pas de culture sur milieu ordinaire. En 48 heures, les colonies sont petites, 1-2 mm, lisses, circulaires, convexes, bords nets, opaques, non hmolytiques. Les bactries possdent un mtabolisme fermentatif acidifiant divers sucres (glucose, fructose, saccharose...) sans production de gaz. Les principales ractions biochimiques sont : oxydase (+), catalase (-), absence de rduction des nitrates en nitrites, ODC (-), ure (-), production d'indole en faible quantit recherche aprs extraction par le xylne. Les lments du diagnostic diffrentiel sont prsents dans le tableau.
CARACTRES D'IDENTIFICATION DES BACILLES CROISSANCE DIFFICILE Test Besoin en >2 Oxydase Catalase Nitrate-rductase Indole Acidification - glucose - lactose - maltose - mannitol - saccharose Capiwcytophaga + V + V + Cardiobacterium + + + + V V + Actinobacillus + + + + + V Eikenella corrodens + + + Haemophilus aphrophilus + -/+ -/+ + + + + +

VI - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE C. hominis est sensible aux antibiotiques habituellement utiliss en association pour le traitement des endocardites. La prophylaxie est celle de l'endocardite bactrienne, en particulier une bonne hygine bucco-dentaire.

256

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

CAPNOCYTOPHAGA
Le genre Capnocytophaga a t cr en 1979 et regroupe des bactries initialement dsignes comme Bacterodes ochraceus et groupe DF1. Trois espces, C. ochracea, C. gingivalis et C. sputigena appartiennent classiquement ce genre : ce sont des bacilles fsiformes Gram ngatif, cultivant en anarobiose ou en arobiose en prsence de 5-10 % de CO^ (d'o le nom : cellule qui mange du gaz carbonique), fermentant le glucose, donnant des colonies pigmentes en jaune-orange qui ont la particularit de s'taler et de glisser la surface de la glose. La position taxonomique de ce genre n'est pas dfinitivement tablie. Il est prsent ici en raison de ses similitudes d'habitat et de ses circonstances d'isolement. C. canimorsus, antrieurement dsigne comme DF-2, a t rattache au genre Capnocytophaga. C. cynodegmi dsigne des souches qui en sont proches. 1 - HABITAT ET PIDMIOLOGIE Ces bactries font partie de la flore buccale et ont t isoles au niveau de la surface gingivale, de la poche pridentaire, du pharynx, de la salive. C. canimorsus est un commensal de la cavit buccale du chien et du chat. L'infection humaine est gnralement conscutive une morsure. II - POUVOIR PATHOGNE La reconnaissance de Capnocytophaga en tant que bactrie pathogne pour l'homme est rcente. Elle a t isole dans des circonstances particulires. A - Pathologie dentaire Bien que normalement prsente au niveau de la bouche et de la poche pridentaire de sujets sains, Capnocytophaga semble responsable de certaines formes de priodontites. B - Infections systmiques Elles sont observes chez des patients atteints de maladie hmatologique avec granulopnie. Elles ont aussi t observes chez des sujets ne prsentant pas de modification des dfenses. C - Infections diverses Isole ou accompagnant des bactries de la flore bucco-pharynge, Capnocytophaga est responsable d'infections varies : empyme, sinusite, conjonctivite, ostomylite... III - PHYSIOPATHOLOGIE . FACTEUR DE VIRULENCE Chez le sujet immunodprim, les lsions buccales ou gengivales (gengivites, ulcrations), toujours prsentes lors de septicmie, sont le point de dpart de

Chapitre XXI - Bacilles Qram ngatif croissance difficile__________________________________

257

l'infection. Dans les autres cas, la prsence simultane de bactries de la flore bucco-pharynge atteste de l'origine de l'infection par Capnocytophaga. Des diffrences de virulence entre les espces ont t observes dans les tudes exprimentales de la priodontite chez l'animal. Le phnomne de glissement observ in vitro la surface de la glose pourrait jouer un rle in vivo dans l'infection de la poche pridentaire. De plus une substance soluble d'origine bactrienne modifie l'activit des leucocytes.

IV - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE A - Produits pathologiques Les produits pathologiques sont varis et les prlvements raliss selon les localisations de l'infection ; l'hmoculture reste le prlvement le plus important. B - Examen direct Les bactries du genre Capnocytophaga sont des bacilles fins, allongs (0,4-0,6 x 2,5-6 u.m), fusiformes, avec parfois une extrmit effile et l'autre arrondie. Ces bacilles Gram ngatif sont non flagells, non sporuls, non capsuls. C - Caractres culturaux et d'identification Capnocytophaga est un genre anarobie facultatif qui pousse en anarobiose, en arobiose en prsence de 5-10 % de CO^, mais pas en atmosphre ordinaire. La temprature doit tre comprise entre 30 et 37C. Les milieux de culture sont des milieux enrichis, glose au sang (qui n'est pas indispensable), glose chocolat, ou des milieux contenant des sucres. Certaines souches ont t isoles sur Milieu de Thayer et Martin. Les colonies ont un aspect particulier d un talement par glissement la surface du milieu glose. Ce phnomne de mobilit par glissement, qui conduit Capnocytophaga entourer et entraner des colonies dj prsentes sur le milieu est net sur glose au sang de mouton en anarobiose ; il est optimum avec un milieu 3 % d'agar. Les colonies sont plates, de 2-3 mm en 48 heures, les bords sont irrguliers et s'talent dans plusieurs directions. Sur glose au sang, les colonies ont une teinte ros ou jaune ; la masse bactrienne est de couleur jaune aprs prlvement par raclage. Certaines souches ont des colonies qui creusent la glose, d'autres qui adhrent au milieu glose. En milieu liquide, bouillon nutritif contenant des sucres, la culture se traduit par un trouble homogne du milieu et une culture fine en grains ou en pellicule adhrente la surface du verre. Les caractres biochimiques sont : oxydase (-), catalase (-), fermentation du glucose et du saccharose, test l'ONPG (+), indole (-), LDC (-), ODC (-). Les espces se diffrencient par les fermentations sucres et la rduction des nitrates. V - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE Les espces du genre Capnocytophaga sont habituellement sensibles aux btalactamines (pnicillines en particulier), ttracyclines, chloramphnicol, macrolides,

258

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

lincosamines, rifampicine et quinolones ; les aminoglycosides, la vancomycine, la colistine et le mtronidazole sont inactifs.

EIKENELLA CORRODENS
E. corrodens, seule espce du genre Eikenella, correspond des petits bacilles Gram ngatif, de culture lente et difficile, favorise par l'hmine et le CO;, ne fermentant pas le glucose. Cette espce, groupe HB-1 de King et Tatum, aro-anarobie facultative est spare de Bacterodes corrodens, devenue B. ureolyticus anarobie strict. I - HABITAT ET PIDMIOLOGIE E. corrodens est prsent au niveau des surfaces muqueuses, bouche, voies respiratoires suprieures, au niveau de la plaque dentaire et dans l'intestin. II - POUVOIR PATHOGNE Une meilleure connaissance de cette espce a permis son isolement dans de nombreuses situations pathognes seule ou associe d'autres espces bactriennes. A - Infections localises E. corrodens est responsable de la formation d'abcs en relation avec une contamination partir des muqueuses. Parmi les principales localisations, il faut mentionner : - les abcs du cerveau et l'empyme sous-dural lors de sinusite et d'abcs dentaire en association avec un streptocoque ; - les infections pleuro-pulmonaires en association avec diffrentes bactries ; - les infections dentaires de type priodontite ; - les infections cutanes aprs morsure, ou au niveau de la main lors de coup de poing dans la bouche, blessure par les dents et contamination par les bactries de la cavit buccale, l'infection est localise la peau et au tissu sous-cutan, l'articulation ou l'os. B - Bactrimies et endocardites E. corrodens est responsable d'endocardite. Aprs avulsion dentaire, les bactrimies sont frquentes mais habituellement sans manifestations ni consquences cliniques. III - PHYSIOPATHOLOGIE FACTEURS DE VIRULENCE E. corrodens est le plus souvent responsable d'infections d'volution lente, indolentes. Les diffrentes localisations sont en rapport avec une contamination partir des muqueuses aprs une lsion ou un traumatisme. Sa virulence est faible, aucune production de toxine n'a t mise en vidence et si dans certains cas

Chapitre XXI Bacilles Gram ngatif croissance difficile____________________________________2^J~f

(endocardite, mningite, ostomylite) la bactrie est isole seule, dans la majorit des cas d'abcs et de suppurations E. corrodons est associe avec une autre espce bactrienne (streptocoque) et les deux espces agissent en synergie. IV - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE A - Produits pathologiques E. corrodens peut tre isole de nombreux produits pathologiques : abcs, plaie, liquide articulaire, hmoculture, mais aussi expectoration, prlvement pharyng, buccal, gingival. La mise en culture est ralise sur glose au sang, ou chocolat qui peut tre rendue slective par addition de clindamycine. B - Examen microscopique La bactrie est un petit bacille (0,2-0,5 x 1 -4 (J.m) Gram ngatif, coccobacillaire, bords rguliers et extrmits arrondies, non capsul, non sporul, immobile, formant parfois des filaments. C - Culture Caractres d'identification Aro-anarobie facultatif, E. corrodens a besoin d'hmine (25 mg/1) en arobiose et une teneur de 5-10 % de CO^ favorise la croissance. La culture est ralise sur glose au sang ou glose chocolat 37C ; les colonies provoquent un verdissement de ces milieux. L'humidit est favorable la culture. Aprs 18 heures d'incubation les colonies sont trs petites (0,5 mm) et seront mieux visibles (1 mm) en prolongeant l'incubation. Il convient d'examiner soigneusement la surface des milieux lorsque une espce croissance rapide est prsente. L'utilisation d'un milieu slectif (clindamycine : 5 mg/1) facilite l'isolement partir des prlvements d'origine broncho-pulmonaire. Un aspect caractristique (partag avec d'autres espces comme A. actinomycetemcomitans, Capnocytophaga, C. hominis) est l'rosion, le creusement de la surface de la glose. Ce phnomne, dcel par observation en lumire oblique n'est pas constant et une mme souche peut avoir des variants sans rosion (colonies translucides, lisses, bombes) ; l'rosion est parfois mieux visible en enlevant les colonies.
Aprs 48 heures, la colonie typique de E. corrodens sur glose au sang comprend trois zones : une zone centrale claire brillante, une zone circulaire perle, mouchete, trs rfringente comme de multiples gouttelettes de mercure, une zone priphrique non rfringente de croissance active. Selon les conditions d'observation, les colonies peuvent aussi ressembler un oeil de boeuf ou une punaise incruste dans la glose, ou ne pas tre vues car confondues avec des zones de dessication de liquide de condensation (parfois aspect en plus grand de colonies de Campylobacter). Ces caractres sont moins nets sur glose chocolat et varient selon les conditions d'incubation. Les colonies, bien qu'apparaissant grises ou translucides, possdent un pigment jaune plus visible aprs incubation prolonge ou en runissant plusieurs colonies.

En milieu liquide, bouillon glucose, thioglycolate, la culture de E. corrodens se manifeste par des formations granuleuses ou floconneuses adhrentes aux parois du tube, plus ou moins renforce en zone microarophile. Cette particularit est aussi frquente avec A. actinomycetemcomitans et H. aphrophilus. Les principaux caractres d'identification sont : oxydase (+), catalase (-), indole (-), rduction des nitrates en nitrites, LDC (+), ODC (+), urase (-).

260

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

V - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE

E. corrodons est sensible de nombreux antibiotiques : pnicillines et cphalosporines (troisime gnration), chloramphnicol, ttracyclines, rifampicine, mais il est rsistant ou peu sensible aux cphalosporines de 1e gnration, la mthicilline, aux aminoglycosides, la lincomycine (et clindamycine) et au mtronidazole.

ACTINOBACILLUS ACTINOMYCETEMCOMITANS
Cette espce a t dcrite par Klinger en 1912 sous le nom de Bacterium actinomycetemcomitans aprs son isolement dans des lsions d'actinomycose (d'o son nom : qui accompagne un actinomycte). Elle fait partie du genre Actinobacillus aux cts d'espces pathognes pour l'animal. 1 - HABITAT ET PIDMIOLOGIE A. actinomycetemcomitans fait partie de la flore buccale normale et est prsent au niveau de la plaque dentaire ; les infections par cette bactrie sont des infections endognes, en gnral point de dpart bucco-dentaire. II - POUVOIR PATHOGNE NATUREL A. actinomycetemcomitans a t isol de lsion d'actinomycose associ avec Actinomyces israelii ; il semble capable de maintenir la persistance de lsions de type actinomycose en absence d'Actinomyces, mais ce rle n'est pas parfaitement clairci. A. actinomycetemcomitans est responsable d'infections des tissus mous voquant parfois une actinomycose, d'endocardites, d'abcs. Cette bactrie est aussi implique dans la pathologie bucco-dentaire, en particulier dans la priodontite de l'adulte et de l'enfant. M - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE A - Produits pathologiques L'hmoculture est l'examen essentiel lors d'endocardite. La culture est dcelable partir du 3e jour d'incubation et se manifeste sous forme de granules se dposant au fond du flacon, la surface du sang sdiment et adhrant la paroi du flacon. Les autres prlvements sont fonction de la localisation (abcs du cerveau, abcs des tissus mous, joue, face avec A. israelii, otite, sinusite, broncho-pneumonie, abcs dentaire) mais l'isolement peut tre difficile en raison de la flore associe. B - Examen direct - morphologie A. actinomycetemcomitans est une petite bactrie Gram ngatif, immobile, non sporule, non capsule, de forme coccode ou coccobacillaire. La forme bacillaire

Chapitre XXI - Bacilles Qram ngatif croissance difficile____________________________________261

peut tre observe aprs plusieurs subcultures. Les bactries sont isoles, par paires ou accoles, rarement en chanes. La coloration peut tre irrgulire. C - Culture - Caractres d'identification La culture est ralise 35-37C en atmosphre enrichie en CO^. Il n'y a pas d'exigence en X et V ; les milieux de culture sont la glose au sang et la glose chocolat. Sur glose, aprs 24 heures d'incubation, les colonies sont petites d'un diamtre de 0,5 mm mais atteignant 2-3 mm en 5-7 jours. Les colonies sont lisses, lgrement en dme, translucides, avec une surface ride. Aprs quelques jours d'incubation les colonies prsentent un centre opaque et prennent l'aspect d'une toile 4 ou 6 branches laissant leur empreinte sur la glose lorsque la colonie est enleve. Les colonies sont adhrentes la surface du milieu et sont difficiles prlever et dissocier. En milieu liquide, bouillon glucose, thioglycolate, la bactrie forme des granules qui adhrent la surface du tube, le liquide restant clair. Ces colonies sont difficiles prlever et dissocier. Les principaux caractres biochimiques sont : oxydase (-) (sauf quelques souches), catalase (+), rduction des nitrates en nitrites, ODC (-), ure (-) (les autres espces d'Actinobacillus possdent une urase), indole (-), fermentation du glucose mais pas du lactose et du saccharose. D - Classification Pulverer et Ko ont dcrit huit biotypes bass sur la fermentation du xylose, du mannitol et du galactose. E - Autres espces d'Actinobacillus A. lignieresii, A. equuli, A. suis, A. capsulatus sont des espces rencontres chez l'animal, normalement prsentes dans l'appareil respiratoire, le tube digestif ou l'appareil gnital et responsables d'affections varies chez diverses espces animales.

F - Traitement A. actinomycetemcomitans est sensible l'ampicilline, la ttracycline, au chloramphnicol...

CALYMMATOBACTERIUM GRANULOMATIS
Cette bactrie de culture trs difficile est la seule espce du genre Calymmatobacterium. Elle a t mise en vidence par Donovan en 1905 sous forme d'inclusion dans des cellules mononucles prsentes au niveau d'ulcres gnitaux ou granulome inguinal (dcrit en Inde en 1882).

262

Section V - AUTRES BACILLES GRAM NGATIF ARO-ANAROBIES

1 - PIDMIOLOGIE ET POUVOIR PATHOGNE C. granulomatis est une bactrie pathogne uniquement pour l'homme. Son habitat est mal connu et l'pidmiologie de la maladie est mal comprise. Elle est responsable du granulome inguinal , Donovanose ou granulome ulcreux des organes gnitaux . C'est une affection observe dans les pays climat chaud et humide sur des sujets peau colore. Les localisations sont similaires celles du chancre mou. Les lsions dbutent par une papule ou un nodule qui voluent en ulcrations chroniques, indures, formes de tissus granulomateux hypertrophiques d'aspect velout au niveau des muqueuses gnitales, sans adnopathie. Les ulcrations persistent pendant des mois et les lsions s'tendent par voie lymphatique la rgion inguinale. Il existe des localisations extra-gnitales de cette affection qui, pour certains, ne serait pas uniquement une maladie sexuellement transmissible. II - PHYSIOPATHOLOGIE Les connaissances sur la physiopathologie et les facteurs de virulence de cette bactrie sont trs limites. Il existe une parent morphologique et antignique avec Klebsiella. III - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE A - Les produits pathologiques Le prlvement est ralis au niveau de l'ulcration en tissu granulomateux par biopsie et empreintes. B - Examen direct La bactrie est un bacille immobile, polymorphe, capsul, Gram ngatif, coloration bipolaire. L'examen microscopique est le seul lment du diagnostic. Les empreintes et frottis tissulaires sont colors par la coloration de Giemsa ou de Wright ; le bacille prend mal les autres colorants et n'est pas acido-rsistant. Les bactries sont isoles ou en amas dans le cytoplasme de grandes cellules mononucles, constituant les corps de Donovan . Le plus souvent polymorphes, certaines bactries ont un aspect caractristique en pingle de sret ferme (d la coloration bipolaire). C - Culture Les milieux ordinaires et les milieux enrichis habituels ne permettent pas la culture qui a t obtenue sur milieu contenant du jaune d'oeuf. Il n'existe pas d'autres lments bactriologiques que ceux runis lors de l'examen microscopique et le diagnostic de la maladie repose sur l'aspect clinique des lsions. IV - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE La bactrie est sensible la ttracycline, au thiophnicol, l'rythromycine, au co-trimoxazole, antibiotiques qui sont utiliss pour le traitement.

Chapitre XXI - Bacilles Qram ngatif croissance difficile____________________________________263

BIBLIOGRAPHIE
BRENNER D.J., HOLLIS D.G., FANNING G.R., WEAVER R.E., Capnocytophaga carnimorsus sp. nov. (Formerly CDC group DF-2) a cause of septicemia following dog bite, and C. cynodegmi sp. nov., a cause of localized wound infection following dog bite . J . Clin. Microbiol., 1989, 27, 231-235. GRIGNON B., Capnocytophaga ochracea : un germe des plaies et des abcs souvent mconnu , Md. Mal. Infect., 1986,16, 176-178. RAVISSE P., Rhinosclrome et donovanoses : affections apparentes , Md. Mal. Infect., 1985,15, 11 bis, 689-692. SEDAILLAN A., Eikenella corrodens : frquence d'isolement et rle pathogne , Md. Mal. Infect., 1986, 16, 57-60. SLOTS J., Salient biochemical characters of Actinobacillus actinomycetemcomitans , Arch. Microbiol., 1982, 131, 60-67. WORMSER G.P., BOTTONE E.J., Cardiobacterium hominis : Review of microbiologie and clinical features , Rev. Infect. Dis., 1983, 5, 680-691.

SECTION VI BACILLES A GRAM NGATIF AROBIES STRICTS

Chapitre XXH LES PSEUDOMONAS


LE GENRE PSEUDOMONAS
1 - CARACTRES GNRAUX A - Dfinition Bacilles Gram ngatif, mobiles par une ciliature polaire, rarement immobiles, non sporuls. Bactries chimio-organotrophes avec un mtabolisme strictement respiratoire avec comme accepteur terminal d'lectrons l'oxygne en arobiose et pour certaines espces le nitrate en anarobiose avec synthse d'une nitrate-rductase ( respiration des nitrates ). Oxydatifs ou inactifs dans l'preuve de Hugh et Leifson. Presque toujours oxydase (+) c'est--dire possdant pour la plupart une chane cytochromique complte comprenant le cytochrome C et une cytochrome C oxydase. Caractriss par la pluralit des substrats hydrocarbons utiliss comme source de carbone et d'nergie. Bactries trs rpandues dans la nature, caractrises par leur rsistance aux antibiotiques et aux antiseptiques. G + C % compris entre 58 et 70 (assez homogne).

B - Morphologie et structure
Btonnets droits et fins 0,5 1,3 \im. Structure des bacilles Gram ngatif, pas de diffrence significative dans la structure du peptidoglycane de la paroi. Mobilit trs vive en arobiose. Ciliature polaire : monotriche - multitriche. Pour les espces multitriches le type de ciliature ne peut tre tabli que statistiquement en dterminant l'index flagellaire. Elle peut varier selon les conditions de culture. Quelques souches et P. mallei sont immobiles et acilies. C - Croissance et nutrition De nombreuses espces ou souches de Pseudomonas ne cultivent pas 37C alors que la temprature de 30C convient tous, pathognes et saprophytes.

266

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

La culture est facile sur milieu complexe avec ou sans production de pigment. Ils sont capables de cultiver sur des milieux minraux synthtiques avec une source simple de carbone : actate, pyruvate. Ces proprits sont utilises pour mettre en vidence les auxotrophies ncessaires pour l'identification. L'auxotrophie, ou besoins en facteurs de croissance, est caractristique pour : X. ( P . ) maltophilia : mthionine ou cystine. P. diminuta - P. vesicularis : pantothnate, biotine, cyanocobalamine. Depuis l'article de base de Stanier, Palleroni, Doudoroff (/. Gen. Microbiol., 1966, 43, 159-271), l'tude taxonomique des diffrentes espces est possible d'aprs l'tude des substrats carbons utilisables comme source d'nergie pour la croissance. C'est l'auxanogramme. . D - Pigments labors par les Pseudomonas Les deux pigments les plus frquents et caractristiques sont la pyocyanine et la pyoverdine. Ds sont solubles dans les milieux de culture, et peuvent les colorer. Les espces pigmentes sont par exemple : - P. aeruginosa : pyocyanine + pyoverdine, il possde l'un ou l'autre ou les deux, mais pouvant tre perdus par mutation. Il existe des varits mlanognes ou rythrognes produisant un pigment noir ou un pigment rouge. - P. fluorescens, P.putida, P.syringae, et P. cichorii produisent de la pyoverdine mais certaines souches sont parfois apigmentes. - P. aureofaciens : pigment jaune orange ou pourpre. E - Caractres physiologiques Ces bactries ont une longvit faible en culture mme 4C. - Tous les modes de conservation possibles sont proposs : lyophilisation, eau distille strile avec une anse de culture temprature ordinaire de 18C (Pseudomonas phytopathognes), glose incline avec huile de paraffine, surface d'une glose molle, tube vis comme pour les Entrobactries, conglation. - Proprits lytiques : P. aeruginosa - autolyse tardive (4 5 jours) ou prcoce (taches irises reflets mtalliques sur glose). - Sensibilit aux agents lyriques : plusieurs espces de Pseudomonas sont lysognes et bactriocinognes - P . aeruginosa : probablement 100 % de souches lysognes + nombreuses pyocines. - P. fluorescens : lysognie frquente ; fluocines. - P. stutzeri : lysognie encore peu tudie. Ces caractres prsentent un intrt pidmiologique. F - Mtabolisme Les Pseudomonas constituent le modle des bactries oxydantes ou dites oxybiontiques. Le rendement de la croissance est strictement dpendant de la concentration en oxygne dissout donc de l'agitation. - Les enzymes de la glycolyse (voie fermentative d'Embden-Meyerhof) sont absentes. - L'oxydation complte du glucose en arobiose est ralise dans le shunt de 1'hexose monophosphate ou voie de Warburg-Dickens-Horecker par l'intermdiaire du

Chapitre XXQ - Pseudomonas

267

6 P-gluconate, la voie du 2-cto-3 dsoxygluconate (voie d'Entner-Doudoroff aboutissant au pyruvate qui alimente le cycle de Krebs). D'o l'intrt du milieu de Hugh et Leifson (acidification dans le tube sans vaseline en arobiose). Paradoxalement pour des organismes arobies stricts certains Pseudomonas peuvent tirer leur nergie d'une reaction catabolique en anarobiose, par hydrolyse de l'arginine = systme de l'arginine dihydrolase (ADH) qui est constitutif : arginine - citrulline + NH, - carbamylphosphate + omithine

'ATP Ce systme a permis de renforcer l'hypothse selon laquelle la mobilit due au mouvement de flagelles est lie l'ATP. Il est mis en vidence chez Pseudomonas fluorescens, immobile en anarobiose mais qui devient mobile en prsence d'arginine. Cette raction a une importance taxonomique. On note une alcalinisation du milieu donnant une coloration violette caractristique (Milieu de Moeller). L'attaque des hydrates de carbone par oxydation peut tre la base de l'identification des Pseudomonas, mais toutes les espces ne donnent pas de produits acides partir de sucres comme le glucose ; certaines donnent une alcalinisation ou sont inactives. II - CLASSIFICATION Le genre Pseudomonas est un genre plthorique avec 160 espces rpertories en 1957. En ralit, beaucoup de ces souches ne sont que des nomenspecies mal connues et dont l'espce-type ne peut tre dfinie. Deux cent soixante cinq espces taient rpertories, mais l'dition 1974 du Bergey's Manual retenait 29 espces dont 13 d'intrt mdical. La nouvelle dition 1984 du Bergey's Manual retient 30 espces principales. La famille des Pseudomonadaceae regroupe actuellement 5 genres : Pseudomonas, Comamonas, Frateuria, Xanthomonas et Zoogloea. Un certain nombre d'tudes gntiques ont t ralises et ont permis de diviser le genre Pseudomonas en 5 groupes d'affinit gntique diffrents : Groupes d'homologies d'aprs les hybridations ADN-rARN et ADN-ADN. - Groupe gnomique 1 groupe fluorescens + groupe stutzeri + groupe alcaligenes - Groupe gnomique II groupe pseudomallei + cepacia - Groupe gnomique III groupe acidovorans - Groupe gnomique IV groupe diminuta-vesicularis - Groupe gnomique V groupe maltophilia (Xanthomonas) II faut avoir conscience, et ceci est vrai pour toute bactrie largement rpandue dans la nature, que le diagnostic d'une souche de Pseudomonas sera souvent effectu par la combinaison de plusieurs caractres. Ces germes ubiquitaires prsentent de trs nombreux biotypes qui tendent s'carter de l'espce-type.

268

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Le bacille pyocyanique Le bacille pyocyanique, du grec puon = pus et du grec kuanos = bleu fonc, est dsign sous le nom d'espce Pseudomonas aeruginosa du latin aeruginosus = couvert de rouille. Isol en 1882 par Gessard. C'est l'espce la plus connue et la plus rpandue du genre Pseudomonas. La plus pathogne, elle constitue l'espce-type du genre. 1 - HABITAT C'est une bactrie qui vit normalement l'tat de saprophyte dans l'eau et le sol humide ou sur les vgtaux. Elle rsiste mal la dessication. Cette bactrie peut vivre en commensale dans le tube digestif de l'homme et de divers animaux. Le B. pyocyanique peut survivre et se multiplier dans une infinie varit de liquides et de milieux, sur des supports et des matriels surtout s'ils sont humides. Considr comme une bactrie pathogne opportuniste c'est le germe-type des infections hospitalires ou nosocomiales. II - MORPHOLOGIE ET CARACTRES CULTURAUX Bacille Gram ngatif 1 3 p.m de long ; 0,5 1 u.m de large. Parfois entour d'une pseudo-capsule appele slime qui peut jouer un rle important dans la pathognicit de cette bactrie. Il peut tre cultiv facilement sur tous les milieux en arobiose (temprature de 37C ou 30C). Il dgage une odeur aromatique caractristique de seringa due la production d'ortho-amino-actophnone, intermdiaire du mtabolisme du tryptophane et non lie la production de pigment. Un milieu slectif comme le milieu de Drigalski convient pour la culture. Des milieux slectifs base de Ctrimide que l'on peut additionner d'antibiotique (ac. nalidixique) sont proposs pour la recherche dans des produits trs contamins ou les eaux (hydrologie). A - Aspects des colonies Ils sont particuliers cette espce. Une dissociation spontane en 3 types principaux peut tre observe : - colonies la ( large ) : isoles, grandes avec une partie centrale bombe et un contour irrgulier Fried Eggs (ufs sur le plat). Elles sont caractrises par une autolyse qui donne un aspect mtallique, iris lors de la culture en nappe de la bactrie. Ce phnomne est li l'action des enzymes protolytiques bactriennes. - colonies Sm ( small ) : petites, mates lgrement bombes avec un bord circulaire rgulier. - colonies M (muqueuse), bombes, opaques, visqueuses parfois coulantes comme pour Klebsiella. Ces colonies se rencontrent presque spcifiquement dans des infections chroniques, urinaires ou pulmonaires. La bactrie produit alors un polysaccharide extra-cellulaire (l'acide alginique) qui est diffrent du slime .

Chapitre XXII - Pseudomonas

269

B - Production de pigments C'est l'une des caractristiques de cette espce ; ils servent son identification. Cette proprit n'est corrle ni avec la virulence, ni avec la protection. Ces pigments sont fluorescents ou non fluorescents.
1. Pyoverdine

Pigment jaune-vert fluorescent, soluble dans l'eau, insoluble dans le chloroforme de poids molculaire 1500, chromophore quinolinique associ deux petits peptides. C'est un sidrophore qui en se complexant avec les ions Fe"1"1"1" permet de capter le fer extraceiulaire. Oxyd en pyorubine dans les vieilles cultures. Mis en vidence dans le milieu de King B (phosphate, sulfate, glycrol, peptone), sa production est inhibe par les ions sodium et favorise dans les milieux carences en fer.
2. Pyocyanine

Pigment bleu soluble dans l'eau et le chloroforme, caractristique de P. aeruginosa qui est la seule espce le produire (compos fortement polaire, de nature phnazinique). La synthse de ce pigment est diminue en prsence d'un excs d'ions phosphate et sodium. C'est un indicateur de pH, en solution pH 3 = rouge, en milieu neutre ou alcalin = bleu. Il peut jouer le rle d'accepteur terminal d'lectrons si la chane respiratoire est inhibe par exemple par l'azide de Na. La pyocyanine a de plus une action bactriostatique sur certaines bactries en particulier Gram positif. Elle est mise en vidence dans le milieu A de King (faible teneur en sels minraux, glycrol, peptone pepsique). Il existe des souches apigmentes ; moins de 5 % des souches sauvages ne produisent pas l'un ou l'autre de ces pigments. Elles sont frquemment isoles chez des malades traits aux antibiotiques. Il existe des souches mlanognes = pigment brun noir diffusant (ne produisant pas de pyocyanine ni de pyoverdine) isoles de lsions purulentes. Il existe encore des varits rythrognes = pigment rouge-brun aruginosine A, parfois appele pyorubrine. Il faut noter que d'autres Pseudomonas produisent des pigments notamment des espces phytopathognes et il convient d'en faire le diagnostic diffrentiel :
P.fluorescens, P.putida, P. aureofaciens, P. chlororaphis, P.lemonieri, P. cepacia, P. stutzeri, P. mendocina, P. vesicularis, X. ( P . ) maltophilia, P. paucimobilis.

III - IDENTIFICATION BACTRIOLOGIQUE Le diagnostic est facile : oxydase (+), culture 37C : culture 41C mais pas 4C. Il est prfrable d'tudier les caractres biochimiques 30C. Milieux A et B de King (production de pyocyanine et pyoverdine), oxydation de certains sucres avec production d'acides, utilisation comme seule source de carbone et d'nergie de nombreux substrats hydrocarbons (ralisation de l'auxanogramme dans un milieu minral simple). Hydrolyse : glatine, lcithine, DNA. En anaobiose respire les nitrates d'o une confusion si la glose profonde contient des nitrates, mais son mtabolisme est uniquement respiratoire. Arginine dihydrolase positive.

270

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

TABLEAU 1 CARACTRES DIFFRENTIELS DES PRINCIPALES ESPCES DU GENRE PSEUDOMONAS (d'aprs C. Richard) Test LDC ODC ADH Dnitnfication Culture 41 Glatinase Esculine Citrate Simmons KingA KingB Caractres particuliers P. aeruginosa . + + + + + d d TTR-1P.fluorescens . + d + + d TTR4 P.putida + (-) + d TTR'1 X. maltophilia + + + . Oxydase - ou + lent Besoin en facteur de croissance
iiiumJiuiit.

P. cepacia d d (+) d + Oxydase +lent. Pas de besoin en facteur de croissance TTR-

P. stutzeri + d + . Colonies sches plisses

TTR = Ttrathionate-rduetase

TTR+

Amylase

IV - SUBSTANCES TOXIQUES ET PRODUITS LABORS En dehors des pigments, dont nous venons de voir l'intrt pour l'identification, le B. pyocyanique labore des protines et des substances toxiques pour l'homme, l'animal de laboratoire ou les plantes. On distingue principalement : une hmolysine thermostable, des exo-enzymes (protases, phospholipase) et des toxines protiques (exotoxine, entrotoxine). Hmolysines Deux hmolysines sont produites : un glycolipide thermostable et une phospholipase C. - Le glycolipide hmolytique est une substance de bas poids molculaire non enzymatique et non antignique thermostable et relativement peu toxique. - Phospholipase C. L'hydrolyse de la lcithine est due une lcithinase, thermolabile, comparable la toxine alpha de Clostridium perfringens. Elle produit une raction inflammatoire limite, dmateuse, rythmateuse ou hmorragique chez l'animal ressemblant ce qui s'observe chez l'homme dans certaines formes cutanes d'infection P. aeruginosa. Protases P. aeruginosa produit des enzymes protolytiques (lastase, protase alcaline, collagnase, casinase) qui sont des facteurs de virulence car leurs actions se combinent, expliquant les destructions tissulaires observes lors d'une infection. Exotoxine A Cette toxine ltale a t dcouverte par LIU dans le sang de lapins moribonds aprs injection d'une culture vivante. Elle n'a pas d'activit protolytique ou lcithinasique (purifie, 66,6 kDa, 2 sous-units A et B, DL 50 de 0,05 0,10 u.g pour la souris). Cette toxine a le mme mcanisme d'action que la toxine diphtrique (toxine ADP-ribosylante) agissant en inhibant la synthse protique par altration du facteur d'longation EF^. La toxinognse n'est pas lie la prsence d'un phage lysogne. Cette toxine est produite par plus de 90 % des souches.

Chapitre XXII - Pseudomonas

271

Exoenzyme S Certaines souches de P . aeruginosa produisent une autre substance toxique diffrente de l'exotoxine A, ayant une activit ADP-ribosyltransfrase, excrte par 40 % des souches. Cytotoxine La cytotoxine ("leucocidine") est une protine de 25,1 kDa ayant une action lyrique faible dose sur diffrents types cellulaires en particulier les leucocytes (PMN, lymphocytes), produite par plus de 95 % des souches. Entrotoxine Elle est mal connue. Elle provoque une accumulation hydrique dans l'anse ligature de lapin et pourrait tre l'origine d'entrocolite B. pyocyanique. Facteur de permabilit vasculaire V - POUVOIR PATHOGNE NATUREL Peu virulent pour l'individu normal, le B. pyocyanique est par contre un agent infectieux redoutable lorsque les dfenses immunitaires du sujet sont altres. P. aeruginosa est l'exemple type de la bactrie pathogne opportuniste. Les malades particulirement sensibles sont les nourrissons, les personnes ges, les sujets atteints d'affections graves, chroniques, mtaboliques (diabte) mais surtout hmatologiques ou cancreuses. Les traitements immunosuppresseurs, les corticodes, les antimtabolites favorisent l'infection B. pyocyanique d'origine endogne. Chez les brls, cette infection est l'une des causes majeures de mortalit. La crote humide et l'amoindrissement des moyens locaux de dfense favorisent la prolifration rapide du germe. Enfin le traitement curatif ou prventif des malades hauts risques par des antibiotiques large spectre contribue largement l'augmentation de la frquence des infections bactries multirsistantes, parmi lesquelles P. aeruginosa joue un rle prpondrant. A - Infections pulmonaires Elles peuvent tre primitives ou secondaires une septicmie. Les pneumopathies primitives s'observent exceptionnellement chez le sujet sain mais sont le lot courant des malades trachotomiss, des insuffisants respiratoires sous antibiothrapie prolonge, des malades atteints d'hmopathies ou de cancers et recevant une chimiothrapie. L'volution est svre (mortalit 30 50 %), le germe est isol des expectorations alors que les hmocultures sont habituellement ngatives. La mucoviscidose (enfants atteints de fibrose kystique au pancras) se complique de surinfections bronchiques bactriennes notamment S. aureus dans les premires annes, puis sous l'influence de l'antibiothrapie, B. pyocyanique dans 70 90 % des cas. L'isolement de souches muqueuses M produisant de l'exopolysaccharide muqueux (alginate : polymre d'acide mannuronique et d'acide guluronique) est caractristique. Enfin une atteinte pulmonaire peut s'observer au cours des septicmies B. pyocyanique.

272

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

B - Infections uro-gnitales Trs frquentes, elles ne sont jamais primitives, mais toujours secondaires une exploration des voies urinaires : simple cystoscopie ou sondage vsical, sonde urtrale demeure, intervention rnale ou prostatique... C - Infections osto-articulaircs Le B. pyocyanique est l'origine de 10 % environ des ostites et de 20 % des arthrites septiques. Les ostites secondaires, les plus frquentes, succdent une fracture ouverte ou une intervention avec mise en place d'un matriel tranger, ou surinfections d'ulcrations cutanes chez un diabtique. Les ostites primitives d'origine hmatogne se voient essentiellement chez les hronomanes et touchent lectivement les vertbres. D - Infections oculaires Le B. pyocyanique peut tre prsent l'tat de saprophyte dans les culs de sac conjonctivaux. Dans certaines conditions, il peut entraner des infections superficielles de l'oeil, par exemple des blpharo-conjonctivites ont t observes au cours de chimiothrapies anticancreuses chez des malades porteurs de lentilles comennes aprs l'utilisation de mascara contamin. En fait, ces infections sont rares mais elles sont gravissimes. Le B. pyocyanique est responsable de 15 20 % des surinfections bactriennes d'ulcrations comennes. Elles gagnent trs vite l'ensemble du globe oculaire. Cette panophtalmie appele, avec raison, fonte purulente de l'oeil, est une complication redoutable de la chirurgie ou des investigations ophtalmologiques. E - Infections O.R.L. Le B. pyocyanique n'est pas un saprophyte courant du conduit auditif externe ; seuls 1 % des individus sains en sont porteurs. Il est par contre isol chez 45 65 % des sujets ayant une otite externe banale. L'otite maligne B. pyocyanique a pu tre observe chez les diabtiques gs. Le terme malin a t employ en raison des possibilits d'extension. Rcemment une nouvelle forme d'otite externe B. pyocyanique a t dcrite sous le terme d'oreille des plongeurs , atteignant les plongeurs des stations de recherches ptrolires en Mer du Nord. F - Infections mninges Elles sont rares : 2 % des mningites dans leur ensemble, toutefois 10 % des mningites aprs intervention neuro-chirurgicale sont dues P. aeruginosa. G - Infections cutanes Chez le sujet sain on peut observer un onyxis avec perionyxis ralisant l'ongle vert, des infections interdigitales, des surinfections d'ulcres de jambe. Des lsions cutanes polymorphes connues sous le nom Secthyma gangrenosum se rencontrent au cours de septicmies en particulier chez les leucmiques. Chez les brls la colonisation des lsions par le B. pyocyanique est rapide ; la trentime heure, 20 % des lsions sont infectes, 48 % la quarante-huitime heure et plus de 60 % au cinquime jour. Le risque majeur est bien la septicmie, brutale, dont le taux de mortalit est lev : environ 50 %.

Chapitre 'XXO. - Pseudomonas

_____

273

Des infections cutanes B. pyocyanique peuvent s'observer en climat chaud et humide, mais galement chez tout sujet en contact avec une eau contamine. En particulier sous nos climats, la vogue actuelle des bains en eau tide ou chaude (bains bouillonnants, balnothrapie, applications de boues rchauffes ou thermales, bains mdicinaux, thalassothrapie, bains romains) peuvent tre l'origine de folliculites pyocyanique. Le traitement par le chlore de ces eaux usage rcratif est parfois absent, souvent insuffisant et inefficace (conditions de pH, filtration, aration....) Un risque existe galement pour les baignades dans des eaux stagnantes ou mal renouveles ou non pures (gravires, anses du bord de mer sans courants ou faible mare surpeuples en t, proximit d'gouts) o sont associes, bien sr d'autres bactries hydriques.

H - Septicmies Elles sont en augmentation rgulire, comme d'ailleurs les autres septicmies bacilles Gram ngatif. Ces septicmies s'observent d'une part chez les nouveaux-ns et d'autre part chez les adultes traits par des corticodes ou des antimtabolites. Elles succdent aux surinfections cutanes des brls, aux prolifrations bactriennes des malades trachotomiss. Enfin les cathters et les sondes constituent galement des portes d'entre. Le pronostic des septicmies B. pyocyanique est svre ; la mortalit est suprieure 50 % mais celle-ci dpend bien entendu de l'affection sous-jacente puis de la prcocit et du choix du traitement. J - Entrites B. pyocyanique Leur mcanisme physiopathologique est proche de celui d'autres entrites. Elles sont trs rares. On a dcrit des pidmies de diarrhes dans des pouponnires. Les trois formes cliniques sont : - l'entrite aigu : conscutive une antibiothrapie large spectre ou l'ingestion d'aliments trs contamins , - la typhlite : colite ncrosante localise au caecum survenant chez des sujets leucmiques et neutropniques - l'entrite hydrique (Fivre de Shanga) avec un tableau de fivre typhode, lie l'absorption d'eaux pollues. Toutefois l'isolement dans les selles de P. aeruginosa ne doit pas conduire une antibiothrapie systmatique. K - Endocardites Environ 1 % des endocardites peuvent tre dues au B. pyocyanique. La frquence des endocardites tricuspidiennes augmente chez les drogus. VI - MODLE PHYSIOPATHOLOGIQUE P. aeruginosa colonise les muqueuses ou les plaies et adhre grce aux facteurs d'adhsion ou aux composs polysaccharidiques externes. Chez un patient non immunis contre une souche du mme srogroupe 0 une multiplication rapide des bactries se produit et sous l'influence des diffrents facteurs de virulence dj cits et en particulier du LPS-endotoxine, il se forme un foyer inflammatoire local. Dans ce foyer se concentrent de nombreux phagocytes, polynuclaires qui vont dans les cas favorables assurer la destruction rapide des bactries. Des anticorps sriques spcifiques d'espce pour les enzymes ou de groupe pour le LPS sont produits en quelques jours, mais trop tard pour jouer un rle dans les phnomnes immdiats. En cas de dficience immunitaire portant sur le nombre et/ou la qualit des polynuclaires, la phagocytose est insuffisante et le stade d'invasion succde la colonisation. Les bactries dbordent alors les barrires cellulaires de dfense dans le

274

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

foyer inflammatoire et se multiplient ; une bactrimie est habituellement constate avec localisations secondaires. La production d'exotoxine est intense et sa diffusion large. En raison des facteurs de virulence diversifis de ce germe, un modle physiopathologique simple ne peut rendre compte de la complexit pathognique de l'infection. VII - PIDMIOLOGIE La nature nosocomiale de la plupart des infections P. aeruginosa rend ncessaire la connaissance parfaite des mcanismes de transmission. L'utilisation de marqueurs pidmiologiques (srotypie, lysotypie, pyocinotypie) fiables permet de suivre les pidmies hospitalires et d'envisager la lutte contre les sources de contamination. A - Sources de contamination Le milieu extrieur et l'eau sous toutes ses formes ou le malade lui-mme par ses exsudais (urines, crachats, selles,...) L'environnement hospitalier : fleurs coupes (eau des vases), plantes en pots, fruits, lgumes crus ou en salade (tomates, carottes, radis, laitues), siphons d'viers ou de sol, humidificateurs, respirateurs, eau distille, (possibilit de multiplication jusqu' 107 germes/ml, sans trouble visible). Antiseptiques : par exemple les ammoniums quaternaires sont souvent inactifs et permettent la multiplication de la bactrie. B - Vecteurs de contamination La transmission partir d'une source de contamination initiale un malade ou de patient patient, rsulte de la contamination ou la souillure des supports inertes, des mains des visiteurs et surtout du personnel qui vhiculent la bactrie selon un schma pidmiologique dsormais classique. Dans les services de ranimation, les malades trachotomiss hbergent rapidement du B. pyocyanique qui colonise la partie suprieure du tractus respiratoire. Le germe pourra ainsi dissminer dans le service. C - Marqueurs pidmiologiques Les marqueurs pidmiologiques disposition sont : la srotypie, la lysotypie et la pyocinotypie. L'antibiotype ne constitue qu'une indication en gnral insuffisante. La srotypie est le marqueur le plus couramment utilis alors que la lysotypie et la pyocinotypie sont ralises par des laboratoires spcialiss.
1. Srotypie

La classification antignique de Habs comprend actuellement 17 srogroupes 0 (correspondant aux AgO lipopolysaccharidiques, thermostables) qui permettent d'identifier 90 95 % des souches par une technique d'agglutination sur lame (mimunsrums Diagnostics Pasteur). Les srogroupes 0 les plus frquents sont 01, 05, 06 et 011 (ce dernier ayant la particularit de prsenter une activit ONPG hydrolase). Lors des bactriennes, on isole plus frquemment les srogroupes 01, 2, 5, 6, 7,

10 et 11.
La distribution gographique mondiale des srogroupes est trs variable entre, d'une part des souches cosmopolites plus ou moins frquentes, et d'autre part des souches rares (014, 15,17) absentes dans certains pays.

Chapitre 'KXO.-Pseudomonas

__________________________________275

La dtermination des srotypes H (correspondant aux antignes protiques flagellaires, thermolabiles) permet d'abaisser le pourcentage des souches non typables, mais cette technique n'est pas utilise couramment.
2. Lysotypie

Le bacille pyocyanique peut tre lys par de nombreux phages lytiques. La majorit des souches sont lysognes, voire poly-lysognes. Une mme souche peut ainsi hberger, intgrs sur le chromosome ou sur un plasmide, une dizaine de phages temprs. Cette haute frquence de lysognie est d'ailleurs caractristique de P. aeruginosa et est rarement rencontre dans d'autres espces de Pseudomonas. La lysotypie employant 17 bactriophages selon la mthode de LINDBERG permet ainsi de marquer 98 % des souches, et le nombre des lysotypes est actuellement voisin de 300. C'est une excellente mthode complmentaire de la srotypie dans l'tude pidmiologique locale.
3. Pyocinotypie

La pyocinotypie consiste en la mise en vidence de la production de bactriocines : pyocines = aeruginocines. Cette technique est relativement simple condition de disposer de quelques souches sensibles ncessaires pour les rvler. Les pyocines sont classes en 2 types principaux : - type S : sensible aux enzymes protolytiques, ne montrant pas de forme particulire en microscopie lectronique - type R : rsistant aux enzymes protolytiques ayant une structure de cylindre creux et double ressemblant une queue de bactriophage en microscopie lectronique. Celles-ci pourraient tre des phages dfectifs. La pyocinotypie permet, l'aide de la mthode dcrite par Fyfe, Harris et Govan en 1984 utilisant 13 souches indicatrices, de distinguer 105 types principaux et 25 sous-types. L'une des trois mthodes permet de marquer 90 95 % des souches. Dans les cas difficiles, la combinaison de 2 mthodes amliore ce pourcentage. Les marqueurs pidmiologiques permettent de connatre la flore contaminant un service et ainsi de dterminer avec une forte probabilit l'existence d'une contamination au sein du service (souche connue) ou d'une contamination endogne (souche nouvelle).
VIII - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE

A - Sensibilit aux antibiotiques P. aeruginosa n'est sensible qu' quelques antibiotiques et le choix d'un traitement est donc important. Malgr l'efficacit de certains, le succs n'est souvent que relatif et l'effort de lutte contre les infections B. pyocyanique doit passer avant tout par la prvention : mesures d'hygine voire la vaccination. P. aeruginosa est rsistant de nombreux antibiotiques, (benzylpnicillines, aminopnicillines, cphalosporines de 1e et de 2e gnrations, phnicols, ttracyclines, trimthoprime). Cette rsistance rpond trois mcanismes :

- l'impermabilit de la paroi certains antibiotiques (rsistance naturelle pour les pnicillines M = mthicilline, cloxacilline ; rsistance acquise faisant intervenir des porines = ticarcilline, cefsulodine, imipnme) - l'inactivation enzymatique (17 bta-lactamases plasmidiques, plusieurs types : PSE = Pseudomonas Spcifie Enzyme, PSE-1 et PSE-4 : CARBcillinases ; OXA = oxacillinases ; TEM 1 et 2), rsistance naturelle aux premires bta-lactamines par synthse d'une bta-lactamase chromosomique habituellement rprime (Case = cphalosporinase inductible de Sabath) - modification de l'affinit de l'antibiotique pour la cible (PBP).

276

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

Il existe au moins une trentaine de plasmides de rsistance connus chez P. aeruginosa pouvant coder pour une multirsistance touchant bta-lactamines et aminosides. Formant une dizaine de groupes d'incompatibilit, ils se distribuent schmatiquement en trois catgories : des plasmides spcifiques du genre Pseudomonas, des plasmides pouvant circuler entre Pseudomonas et Entrobactries, des plasmides habituels des Entrobactries retrouvs parfois chez Pseudomonas.

Ces quelques donnes gnrales expliquent les phnotypes de rsistance trs divers qui sont observs et combien il est difficile sur la base de la valeur des CMI publies d'tablir une hirarchie parmi les molcules antipyocyaniques proposes. La conjoncture pidmiologique variable d'un hpital et d'un service l'autre, rend alatoire toute prvision de sensibilit.

Le choix d'une bta-lactamine pourra se faire en fonction de l'antibiogramme parmi les carboxypnicillines (ticarcilline, association ticarcilline + ac. clavulanique) ayant une bonne vitesse de bactricidie comme l'imipnme, les acyluridopnicillines (aziociiine, pipracilline), acylpnicillines (apalcilline), certaines cphalosporines (cefsulodine et ceftazidime), monobactame (aztronam), carbapnme (imipnme). En outre, l'association la plus efficace d'une bta-lactamine un aminoside sera souvent recherche afin d'tre rapidement bactricide dans les infections gnralises. Parmi les aminosides plusieurs phnotypes de rsistance sont observs, l'amikacine restant la plus active. La diminution de la permabilit aux bta-lactamines affectant galement les aminosides rend certaines souches particulirement rsistantes. P. aeruginosa est rsistant l'acide nalidixique mais les quinolones de 2e gnration, ont une activit intressante : la pfloxacine, la norfloxacine, l'ofloxacine et la ciprofloxacine donnant les CMI les plus basses. Les aminosides associes aux bta-lactamines antipyocyaniques constituent le traitement de premire intention. La sensibilit de P. aeruginosa la colistine est constante, mais son efficacit in vivo est dcevante. Certaines souches sont sensibles la fosfomycine, mais cet antibiotique doit tre associ pour viter l'mergence rapide de mutants rsistants. Dans la ralisation de l'antibiogramme, un inoculum trop lourd est un cueil viter. Cela est du la tendance des corps bactriens former des agglutinais. B - Protection par la vaccination La prvention de l'infection, notamment en milieu hospitalier, passe avant tout par des mesures d'hygine gnrale et dans le choix des antiseptiques. De nombreux travaux ont t consacrs l'immunoprvention des infections B. pyocyanique. Les tudes exprimentales ont dbut en 1960 et se sont constitues dans plusieurs directions. Aux U.S.A. : vaccin Pseudogne (7 srotypes - Heptavalent Lipopolysaccharide Prparation), au Royaume Uni : vaccin polyvalent soluble (antignes de surface - 16 srotypes - vaccin PEV-01), en Roumanie : suspension bactrienne chauffe (11 srotypes), en France : vaccin mixte polyvalent (10 srotypes, suspension bactrienne chauffe + staphyloccoque + anatoxine staphylococcique). Leurs applications cliniques peuvent se rsumer actuellement l'utilisation de deux types de vaccins : - vaccins bactriens (suspension de bactries chauffes) - vaccins acellulaires (extraits purifis divers, mais contenant habituellement du LPS). En France, le vaccin cellulaire polyvalent est utilis en prophylaxie chez les grands brls. L'immunothrapie est parfois prconise avec immunoglobulines naturelles ou hyperimmunes.

Chapitre XXII - Pseudomonas

277

LES AUTRES PSEUDOMONAS


Parmi les Pseudomonas, P. aeruginosa reprsente entre 60 et 80 % des souches isoles en clinique, mais d'autres espces peuvent se rencontrer : P. putida, P. fluorescens, P. cepacia, P. pseudoalcaligenes, P. paucimobilis, P. acidovorans... Les phnomnes conduisant l'isolement de P. aeruginosa en milieu hospitalier favorisent galement l'essaimage des autres Pseudomonas. Cependant ces derniers ont des potentialits mtaboliques diffrentes et un pouvoir pathogne moindre que le B. pyocyanique. Aussi ces Pseudomonas ont-ils une moindre importance en pathologie humaine. Leur isolement est souvent fonction de l'cologie locale et le plus souvent limite aux services hauts risques infectieux. Il faut aussi retenir que ces germes sont souvent multirsistants aux agents antibactriens. Ils peuvent se dvelopper partir de multiples substrats hydrocarbons simples ou complexes. En raison de leur pouvoir pathogne spcifique, deux espces se placent tout fait part : P. mallei, agent de la morve et P. pseudomallei, ou B. de Whitmore, agent de la mliodose. 1 - PSEUDOMONAS MALLEI : LA MORVE La morve est une maladie qui touche essentiellement les quids et qui est connue depuis l'antiquit. P. mallei est un parasite obligatoire des muqueuses des animaux ou de l'homme. Du point de vue bactriologique ce germe est toujours immobile et accumule du poly-bta-hydroxybutyrate. La morve est une maladie grave transmissible l'homme. Maladie disparue des pays dvelopps grce aux progrs de la mdecine vtrinaire, elle subsiste encore en Asie et en Afrique. Le dpistage des animaux atteints se fait grce une injection intradermique de malline dont la positivit entrane l'abattage du cheptel infect. II - PSEUDOMONAS PSEUDOMALLEI : LA MLIODOSE Whitmore et Karischnaswami ont dcrit en 1912 Rangoon en Birmanie une maladie proche de la morve qu'ils appelrent mliodose. P. pseudomallei ou B. de Whitmore se trouve dans l'eau et les sols humides. Ce germe a longtemps t considr comme caractristique des zones humides de Sud-Est Asiatique, o l'humidit lie une temprature leve (40-43C) des eaux de rizire ralise des conditions optimales de croissance. Cependant il s'avre que ce germe est ubiquitaire. Son isolement a t ralis en France ainsi que dans plusieurs pays des zones inter-tropicales : il est donc prsent dans une zone comprise entre les vingtimes parallles Nord et Sud. Une meilleure connaissance de cette affection a t acquise la suite des guerres d'Indochine puis du Vietnam. La transmission du B. de Whitmore peut se faire par ingestion d'eau contamine, pntration travers la peau excorie (plaies, griffures, blessures), contamination par voie arienne par des poussires mobilises par le vent ou arosols crs par le souffle des pales d'hlicoptres. Cette maladie a t observe galement en France (pidmies chez des animaux du Jardin des Plantes et dans un levage en Mayenne). Du point de vue clinique, la mliodose est une infection suppurative chappant une description gnrale simple en raison de la diversit des formes et des localisations. On rencontre des formes aigus septicopyohmiques avec localisations secondaires, mais galement des formes subaigus plus frquentes et des formes chroniques. Contracte essentiellement dans les rgions du Sud-est asiatique, tout au

278

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

moins dans les cas rcemment rapports, la mliodose peut survenir longtemps aprs la contamination, en particulier chez les sujets immunodprims, elle doit tre voque lors de fivres chez des sujets migrants en provenance de ces rgions. Des abcs splniques ont t dcrits, la ceftazidime paratrait la plus active. Le diagnostic bactriologique est effectu partir de divers prlvements (sang, pus, crachats). Le germe peut tre cultiv sur divers milieux. Le diagnostic diffrentiel se fera avec P. cepacia, P. stutzeri, P. mallei. Le pouvoir pathogne exprimental est ralis chez le hamster ou le cobaye : aprs inoculation par voie intra-pritonale on observe une pritonite purulente, une priorchite (signe de Straus), des suppurations polyviscrales et en premier lieu pulmonaires. III - LES AUTRES ESPCES DE PSEUDOMONAS D'INTRT MDICAL Le genre Pseudomonas comprend beaucoup d'autres espces qui peuvent tre isoles chez l'homme ou chez l'animal mais galement chez les plantes. La limite entre les Pseudomonas phytopathognes et ceux d'intrt mdical est assez imprcise dans certains cas. A - Habitat et pouvoir pathogne naturel
En raison de leurs exigences nutritives trs modestes, les Pseudomonas peuvent survivre et se multiplier durant des mois dans un environnement humide : eau du robinet, eau distille, coulements d'viers, surfaces humides, barboteurs, nbulisateurs. L'habitat habituel de ces germes est l'eau ainsi que le sol et les vgtaux. Certaines souches psychrophiles provoquent la dtrioration de denres alimentaires ou de produits biologiques conservs au froid (P'. fluorescens st P. putida par exemple). Inversement P. cepacia ou P. pseudoalcaligenes sont relativement rsistants la chaleur et peuvent se retrouver dans des eaux tides ou chaudes. En milieu hospitalier la contamination des eaux, dans la diversit de leurs usages, est trs souvent occulte et il faut souligner que des densits bactriennes de l'ordre de 107 germes/ml ne s'accompagnent pas de trouble visible l'il nu d'une solution aqueuse. Dans l'environnement hospitalier les Pseudomonas contaminent le plus souvent les solutions d'antiseptiques, plus actifs sur les germes Gram positif que sur les bacilles Gram ngatif, ainsi que les solutions aqueuses. L'utilisation de ces solutions contamines est responsable de la survenue d'infection chez des malades aux dfenses immunitaires effondres dans des services hauts risques infectieux (ranimation, onco-hmatologie, service de brls et de chirurgie cardio-vasculaire). L'expression clinique d'une infection cause par ces germes opportunistes trs peu pathognes par eux-mmes, dpendra essentiellement du terrain. Chez ces malades les surinfections locales peuvent entraner des bactriennes simples, mais aussi des septicmies vritables avec localisations secondaires, par exemple des endocardites dans lesquelles les possibilits de diagnostic et de traitement antibiotique s'avrent en gnral limites.

B - cologie et signification des diffrentes espces de Pseudomonas


P. fluorescens et P. putida isols pour la premire fois en 1886 de pourritures diverses, ont comme principal habitat le sol, l'eau, les plantes et les denres alimentaires avaries. Les eaux en milieu hospitalier sont souvent contamines par P. fluorescens, espce qui se trouve galement trs frquemment dans les eaux doues naturelles mme potables. P. fluorescens et P. putida peuvent se trouver dans la flore de l'oro-pharynx. P. putida s'isole en petite quantit, avec une frquence gale au tiers de celle de P. aeruginosa et P. maltophilia, d'objets et de matriels hospitaliers. Ces deux espces psychrophiles peuvent galement contaminer le sang utilis en transfusion qui peut tre souill lors du prlvement ou par l'intermdiaire du matriel de perfusion mal strilis ou des flacons. Du point de vue de la bactriologie clinique P. fluorescens et P. putida sont avant tout des bactries pathognes opportunistes pour l'homme. Leur virulence est bien sr quasiment nulle chez un individu sain. L'interprtation lors d'isolement de ces bactries, unique ou rpt, ne se fera qu'en fonction du contexte clinique. Les symptmes d'une septicmie survenant au dcours d'une transfusion ou d'une perfusion de liquides contamins s'expliquent par la prsence d'une endotoxine semblable celles des autres bacilles Gram ngatif. P. stutzeri dcrit pour la premire fois en 1895 est isol partir du sol, d'engrais, de paille, d'humus, d'eaux stagnantes, de cosmtiques pour les yeux. Cette espce peut se rencontrer dans

Chapitre 'XXSl-Pseudomonas

279

divers produits pathologiques d'origine humaine sans que l'on puisse y rattacher de circonstances pidmiologiques particulires. P. mendocina a t isol du sol, de l'eau et d'urines. Il n'a pas t impliqu comme agent causal dans des infections humaines. P. cepacia (Syn., Pseudomonas multivorans, Stanier) isol pour la premire fois en 1950 d'un bulbe d'oignon est remarquable par la varit et le nombre de substrats qu'il peut utiliser comme source d'nergie et de carbone. P. cepacia a t dcrit l'origine en 1950 comme un germe phytopathogne mais depuis ces dernires annes son isolement lors de contamination ou d'infection hospitalires est plus frquent. Neuf srotypes 0 et 7 srotypes H sont dcrits. Largement distribu dans la nature, il a t isol du sol, des eaux de rivire, du lait cru ou pasteuris, d'ufs de canard sals imports de Taiwan aux U.S.A., de produits cosmtiques contamins par l'eau du robinet. L'environnement hospitalier permet d'isoler frquemment P. cepacia : instruments, nbulisateurs, humidificateurs, appareils d'hmodialyse, bronchoscopes, sondes urinaires, cathters, solutions anesthsiques, solutions antiseptiques base d'ammoniums quaternaires, de ctrimide, de polyvidone iode, de chlorhexidine qui contaminent la peau et les instruments, de soluts isotoniques injectables de chlorure de sodium, de solutions pharmaceutiques base d'antibiotiques, d'albumine, de corticodes, d'eaux de diverses origines (eau du robinet, eau distille d'origine commerciale ou prpare dans les pharmacies des hpitaux, eau de bain-mari utilise pour rchauffer le sang avant transfusion). Chez des malades hospitaliss, P. cepacia peut tre isol : d'abcs, de plaies infectes, de lsions hyperkratosiques macres d'orteils chez des soldats, d'arthrites aigus (aprs injection de mthyl-prdnisolone contamine), d'infections pulmonaires ou d'infections urinaires (aprs manuvre instrumentale ou acte chirurgical), de pritonites. Etes infections plus svres, bactrimies transitoires ou septicmies, sont rencontres chez les malades aux dfenses immunitaires altres. Des endocardites sont apparues chez des malades porteurs de prothses cardiaques ou ayant des antcdents cardiaques, et occasionnellement des hronomanes. P. cepacia peut tre responsable de complications infectieuses en chirurgie cardiaque. La grande diversit de substrats utiliss par P. cepacia est responsable de la varit des sources potentielles de contamination et d'infection. Cependant, il parat avoir une faible virulence et un pouvoir invasif limit chez l'homme sain. Il se rencontre dans les surinfections de la mucoviscidose. P. putrefaciens possde les caractres des Pseudomonas ; cependant des auteurs proposent de lui attribuer le nom d'Alteromonas putrefaciens car certaines souches possdent un flagelle latral en plus du flagelle polaire habituel. La majorit des souches peut crotre 30C, certaines ne poussent pas 35C et certaines sont psychrophiles. La particularit essentielle de ce germe est de produire de l'H^S sur les milieux usuels pour Entrobactries et ceci amne souvent des confusions avec Salmonella ou Proteus. P. putrefaciens se trouve dans le sol, les eaux doues et sales, les saumures et se distribue largement dans la nature. Il est isol dans les produits alimentaires (morue, volaille, lait, ufs). P. putrefaciens est responsable d'altrations putrides du beurre, de la production d'H^S dans les filets de harengs, de la dcoloration verdtre de la viande. En bactriologie mdicale, cette espce est isole dans de nombreux produits pathologiques mais se comporte rarement comme un germe opportuniste bien qu'il ait pu tre associ des septicmies, des otites et des suppurations d'ulcre de jambe chez des diabtiques. P. alcaligenes et P. pseudoalcaligenes ont t dcrits en 1928 et en 1966. Ces deux espces, trs proches, ont t isoles d'eaux, de piscines, de lait contamin et de divers produits pathologiques humains. Leur incidence en pathologie humaine est extrmement faible, et seuls quelques cas isols de contamination ou de surinfection ont t dcrits. P. diminuta et P. vesicularis sont deux espces assez rares dcrites l'une en 1954 l'autre en 1971. Ces Pseudomonas sont caractriss par leurs exigences en biotine, acide pantothnique, cyanocobalamine et en outre, en cystine pour P. diminuta. Isols galement de l'eau et de quelques produits pathologiques, leur rle comme agents opportunistes ou pathognes est incertain et leur isolement rare. P. acidovorans et P. testosteroni sont deux espces proches par le haut degr d'homologie existant entre leurs acides nucliques. Leurs caractres biochimiques sont trs voisins et en majorit ngatifs. P. acidovorans a t isol partir d'urines, de sang, de pus, du tractus respiratoire chez l'homme et les animaux. Son rle en pathologie humaine est discutable. P. testosteroni est responsable de rares cas de bactrimie. D'autres espces de Pseudomonas sont rarement rencontres en bactriologie mdicale. Ce sont essentiellement des souches issues de l'environnement. Elles posent souvent des problmes de diagnostic diffrentiel. P. pickettii dcrit en 1973, a t isol dans divers produits pathologiques. P. paucimobilis s'apparente aux Xanthomonas. Il a t isol dans des hmocultures, des LCR, des urines, des crachats, des frottis vaginaux et peut se mettre en vidence frquemment dans les eaux de l'environnement naturel ou hospitalier.

280

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

C - Diagnostic bactriologique Pour identifier ces Pseudomonas d'intrt mdical, le bactriologiste peut emprunter plusieurs voies en s'adressant soit des mthodes traditionnelles, soit des galeries miniaturises prtes l'emploi. Cependant il est bon de se rappeler qu'une orientation correcte du diagnostic doit se faire ds le dpart en prtant une attention particulire la morphologie du bacille et notamment la dtermination du type de ciliature qui est polaire dans le genre Pseudomonas, monotriche ou multitriche. La coloration des flagelles, grce aux mthodes de Rhodes ou de Leifson, est d'une utilit vidente. La morphologie des colonies est importante. Par exemple, les colonies plisses rough sont caractristiques, pour un il averti, de P. stutzeri. La production de pigment sur les milieux A et B de King, la pigmentation jaune ou ros des colonies de certaines espces sur glose nutritive sont des lments d'orientation. Enfin, la raction de l'oxydase est importante ainsi que la dtermination du type respiratoire en glose profonde ne contenant pas de nitrates. Les mthodes conventionnelles font appel aux caractres d'identification classiques des germes arobies stricts (les mthodes usuelles pour les entrobactries tant inadaptes) : ADH, LDC ; hydrolyse de glycosides : esculine, ONPG ; cultures 4C et 41C ; bouillon nitrate ; glose profonde nitrate ; recherche d'activits enzymatiques (glatinase, amylase, tween 80 estrase, lcithinase, DNase) ; accumulation de l'acide poly-bta-hydroxybutyrique ; recherche de la production d'H^S, recherche d'une ttrathionate rductase. Les caractres complmentaires sont
bass :

- soit sur l'tude des substrats carbons utilisables comme seule source d'nergie et de carbone (auxanogramme en milieu liquide M 63 : lactate, actamide, arginine, glucose, maltose, trhalose, mannitol, inositol, additionns de facteur de croissance : mthionine), - soit sur l'tude de l'oxydation de sucres conduisant la production d'acide dans les milieux (glucose, fructose, mannose, lactose, maltose, mannitol...). D'autres tests biochimiques adapts aux Pseudomonas, comme l'tude du clivage des diphnols, sont dcrits dans les ouvrages spcialiss. Le tableau ci-aprs indique une cl d'orientation schmatique et rapide pour l'identification de quelques Pseudomonas frquents. Des galeries d'identification miniaturises commodes l'emploi sont actuellement disponibles (Galerie Pseudomonas-Diagnostics-Pasteur, Oxi-Ferm Tube-Roche, Flow NF Tek, Galerie API 20 NE). Elles permettent une identification en 24 48 heures alors que les mthodes traditionnelles ncessitent 2 4 jours. D - Sensibilit aux antibiotiques La recherche de la sensibilit de ces Pseudomonas aux antibiotiques, outre son intrt en bactriologie mdicale permet d'apporter une aide au diagnostic bactriologique en vitant des confusions entre certaines espces de Pseudomonas. Par exemple il est ais d'orienter le diagnostic diffrentiel entre X . maltophilia et P. cepacia en rappelant que le premier est rsistant la novobiocine et sensible la colistine et que pour P. cepacia c'est l'inverse. La sensibilit de ces espces de Pseudomonas est parfois paradoxale bien que prsentant des caractres voisins de ceux de P. aeruginosa ; les donnes concernant ce dernier ne sont pas toujours applicables aux autres Pseudomonas. La sensibilit aux aminosides est variables selon les espces, la quasi totalit des souches de P. cepacia, X. maltophilia, P. acidovorans sont rsistantes. La colistine est active sur ces Pseudomonas sauf sur P. cepacia, P. pickettii, P. pseudomallei. Malgr la multirsistance habituelle de ces bactries, avec les nouvelles pnicillines (carboxypnicillines) et les cphalosporines de troisime

Chapitre XXII - Pseudomonas

281

TABLEAU DES REACTIONS

P cepacia et AcineloHacler calcoacelicus (ADH - ) alcalinisent le milieu par assimilation de 1 arginine Acinelobacter caicoacelicus var giucidoiyica glucose oxydatif + Acinelobacter caicoaceticus var Iwofti/ glucose oxydalif " Alteromonas putretaciens produit de 1 H;S facilement dcelable sur le milieu de Migler ou sur le milieu Cellobose Inositol HaS de la galerie Uroculture "" Aprs 48 heures d incubation rechercher 1 indole avec le ractif de Kovacs

gnration (except la cefsulodine), sont apparues de nouvelles possibilits thrapeutiques. Il est utile de souligner que certaines espces de Pseudomonas possdent une sensibilit des antibiotiques inactifs sur P. aeruginosa comme le trimthoprime-sulfamthoxazole.

BIBLIOGRAPHIE
BODEY O.P., BOLIVAR R., FAINSTEIN V., JADEJA L., Infodons caused by Pseudomonas aeruginosa ,Rev. Inf Dis., 1983, 5, 279-313. GILARDI G.L., Glucose non-fermenting Gram ngative bacteria in clinical microbiology, C.R.C. Press, 1978, West Palm Beach, Flonda. GILARDI G.L., Non fermentative Gram ngative rods : Laboratory identification and clinical aspects. 1985. Marcel Decker Inc. d. New York - Basel.

282____________________________Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

GUIBERT J., Infection Bacille pyocyanique , Encycl. Md. Chir., Paris, Maladies Infectieuses, 8025 B 50, 11-1982. MONTEIL H., RASOAMANANJARA D., Autres bacilles Gram ngatif et Antibiotiques , in l'Antibiogramme (P. Courvalin, F. Goldstein, A. Philippon, J. Sirot ds.), 1985, MPC - Videom, pp. 127-132. MORRISON A.J., WENZEL R.P., Epidemiology of infections due to Pseudomonas aeruginosa , Rev. Infect. Dis., 1984, 6, S 627- S 642. PELADAN F., MONTEIL H., Identification of Pseudomonas, Flavobacterium and Alcaligenes with th API 20 NE System , Pathol. Biol., 1988, 36, 187-192. PHILIPPON A., THABAUT A., NEVOT P., Pseudomonas aeruginosa et bta-lactamines , in l'Antibiogramme (P. Courvalin, F. Goldstein, A. Philippon, J. Sirot ds.), 1985, MPC - Videom, pp. 103-110. VERON M., Pseudomonadaceae in Bactriologie Mdicale 2e d., L. Le Minor et M. Vron, 1990, Flammarion Mdecine Sciences, Paris. A signaler : Pseudomonas aeruginosa, Biology, immunology and therapy : a cefsulodin Symposium , numro spcial de Reviews of Infections Diseases, vol. 6, suppl. 3, sept-oct. 1984.

' ^

.!

Chapitre XXm AUTRES BACILLES NON FERMENTANTS


FLAVOBACTERIUM
1 - CARACTRES GNRAUX Pendant longtemps, le genre Flavobacterium a prsent une trs grande htrognit : il rassemblait en effet des bacilles Gram ngatif ou positif, immobiles ou mobiles, ciliature pritriche, bacilles dont la seule proprit commune tait la pigmentation jaune de leurs cultures. Dans la dernire dition du Bergey's Manual of Systematic Bacteriology , 1984, le genre Flavobacterium a t redfini comme regroupant des bacilles Gram ngatif, de 0,5 1-3 (im (en milieu liquide, prsence de bacilles de longueur suprieure 5 |J.m), ne formant pas de spores, arobies stricts, (mtabolisme de type strictement respiratoire), oxydase (+), catalase (+), immobiles et dpourvus de mobilit par glissement, et n'essaimant pas comme les Cytophaga . Les souches de l'environnement croissent entre 5 et 30C, la plupart des souches d'origine humaine se dveloppent galement 37C. Les colonies sont translucides, parfois opaques, rondes, de 1 2 mm de diamtre, lgrement ou peu bombes, lisses, brillantes. Les colonies sont pigmentes en jaune, jaune orang voire orang (pigment non diffusible, dont la production est favorise par une temprature de 15 20C, par la lumire du jour et par l'emploi de milieux base de casine, de lait ou d'amidon) ou ne sont pas pigmentes. Chimio-organotrophes, la majorit des souches sont protolytiques, hydrolysent la glatine et la casine, produisent une DNase. Les nitrates ne sont gnralement pas rduits. Diffrentes espces produisent de l'indole. Les Flavobacterium ont pour habitat le sol et l'eau : on les rencontre galement dans les viandes crues, le lait et divers aliments, dans l'environnement hospitalier et dans divers prlvements d'origine humaine. La teneur en bases (G + C %) des ADN est comprise entre 31 et 42 moles %. F. brve a t propos par HOLMES et OWEN comme espce-type du genre Flavobacterium en remplacement de F. aquatile. Selon ces auteurs, F. aquatile n'est pas reprsentatif de l'ensemble des espces du genre Flavobacterium et s'apparente davantage aux Cytophaga qu'aux Flavobacterium. Les autres espces de Flavobacterium et les souches types correspondantes sont respectivement :

284

Section VI - BACILLES A GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

F. balustinum (syn. Flavobacterium du groupe IIb), F. meningosepticum espce la plus importante sur le plan mdical, F. odoratum, F. multivorum (syn. groupe IIk, biovar 2), F. spiritovorum. II - F. MENINGOSEPTICUM A - Morphologie et caractres culturaux Bacilles Gram ngatif, courts, parfois mme trs courts (0,4-0,5 x 0,7-2 u.m), fins ou assez fins, avec tendance au polymorphisme : prsence de formes longues et souvent flexueuses, les longs bacilles sont d'autant plus nombreux que les cultures en bouillon sont plus ges. Prs de 20 % des souches de F. meningosepticum ne croissent pas sur le milieu de Drigalski ; les autres s'y dveloppent en donnant des colonies lactose (-), rondes, d'environ 1,5 2 mm aprs 48 h 30C. La grande majorit des cultures sont apigmentes ou apparaissent de couleur ros trs ple, lorsqu'on les prlve l'anse de platine ; les autres sont jaune-orang ple. Sur les milieux T.S.A. et Hajna-Kliger, certaines cultures de F. meningosepticum prsentent un aspect muqueux. B - Signification clinique et sensibilit aux antibiotiques Chez le nouveau-n, le plus souvent prmatur, F. meningosepticum est l'agent de septicmie et de mningite gravissimes, avec issue fatale frquente ou laissant d'importantes squelles (hydrocphalie). Chez l'adulte, les infections sont essentiellement iatrognes. F . meningosepticum est rsistant de nombreux antibiotiques habituellement actifs sur les bacilles Gram ngatif (bta-lactamines, aminosides, ttracycline, colistine, trimthoprime, furanes...) et le plus souvent prsente une sensibilit paradoxale des antibiotiques en principe seulement actifs sur des bactries Gram positif (novobiocine, vancomycine, rythromycine, spiramycine, lincomycine, clindamycine...). Le genre Flavobacterium reprsente une grande htrognit du point de vue de l'antibiotype : certaines souches sont sensibles aux uridopnicillines, la ciprofloxacine, au co-trimoxazole, on rencontre des souches rsistantes l'imipnme. III - LES AUTRES ESPCES DE FLAVOBACTERIUM F. odoratum, F. brve et F. I I f sont quelquefois isoles des urines, F. I I f des organes gnitaux, F. odoratum de pus divers, et F. I I b des cathters, des seringues, du matriel usage mdical ou chirurgical en milieu hospitalier. La sensibilit de ces espces est voisine de celle de F. meningosepticum l'exception de F. odoratum qui est trs rsistant.

ACHROMOBACTER - ALCALIGENES
La position taxonomique des espces appartenant ces genres est encore incertaine et la description actuelle du Bergey's Manual ne permet pas donner une prsentation pratique de ces espces que l'on rencontre dans certains produits pathologiques ou matriels hospitaliers.

Chapitre XXIII - Autres bacilles non fermentants

____

_______________________285

Leur diagnostic diffrentiel se pose avec diverses espces : Bordetella bronchiseptica, P. acidovorans, P. testosteroni, P. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes, Agrobacterium. Nous nous limiterons une description simplifie de ces espces sans tenir compte des incessants remaniements taxonomiques en raison de leur intrt limit au diagnostic diffrentiel en bactriologie clinique de routine.
A - Alcaligenes

L'espce-type serait A. faecalis (Castellani et Chalmers, 1919). Le genre Alcaligenes regroupe des bacilles Gram ngatif, oxydase (+), mobiles par une ciliature pritriche. Mais il faut souligner que cette ciliature peut tre dgnre ne laissant subsister qu'un ou deux flagelles latraux ou polaires. La coloration des flagelles (Mthode de Rhodes) est indispensable pour orienter le diagnostic et viter la confusion avec les Pseudomonas. Les espces dulaquicoles htrotrophes sont seules considres : - A. faecalis, (A. odorans assimil A. faecalis) - A. denitrificans (A. xylosoxidans subsp. denitrificans et subsp. xylosoxidans assimil Achromobacter xylosoxidans) - A. piechaudii. Les espces marines et autotrophes facultatives ne prsentent pas d'intrt en Bactriologie Mdicale. Alcaligenes, isol de l'eau et du sol, est frquent dans l'environnement hospitalier. Leur pouvoir pathogne naturel est nul, mais en raison de leur rsistance aux antibiotiques et antiseptiques usuels, ces germes peuvent tre l'origine de contaminations de solutions mdicamenteuses et de surinfections localises en milieu hospitalier. Un diagnostic bactriologique simplifi peut tre tabli sur le schma suivant (complt par un auxanogramme) :
Test Respiration N0^ Respiration N03
TDA

A. faecalis -

A odorans
+ +

A. denitrificans + +

Absence de pigment, de glatinase, de dcarboxylases. La sensibilit aux antibiotiques est peu diffrente de celle des Pseudomonas et l'action des aminosides est variable. B - Achromobacter Le genre Achromobacter groupe des bacilles Gram ngatif, oxydase (+), ciliature pritriche, oxydant divers hydrates de carbone et ne produisant pas de 3-ctolactose partir du lactose. La classification de ce genre est controverse. Deux espces sont reconnues par le Center for Disease Control (CDC) : A. xylosoxidans et Achromobacter sp, groupe Vd. L'habitat naturel de ces germes est mal connu. Ils feraient partie de la flore endogne du gros intestin et sont isols de diffrentes sources de l'environnement et hospitalires. Ils peuvent tre isols dans divers produits pathologiques et parfois ont une relle signification clinique lors d'infections nosocomiales (mningites, bactriennes,...) chez des malades immunodprims. Le diagnostic bactriologique retient l'oxydation du xylose par 99 % des souches d'A. xylosoxidans et l'hydrolyse de l'ure par Achromobacter sp groupe Vd.

286

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

Achromobacter est sensible aux carboxypnicillines, aux acyluridopnicillines (aziocilline, pipracilline), certaines cphalosporines de troisime gnration (cfoprazone, ceftazidime,...) et au cotrimoxazole.

AGROBACTERIUM
Ce genre a longtemps t considr comme pathogne des plantes (par exemple Agrobacterium tumefaciens) : agent de tumeur du collet (crown gall), prolifration des racines (hairy root). L'habitat de ces bactries est le sol. Une espce pourrait avoir un intrt mdical : A. radiobacte (non pathogne pour les plantes). Les souches hospitalires isoles prsentent diffrents biotypes, avec trois caractres principaux : esculine (+), urase (+), ONPG (+). Ce sont des bacilles mobiles ciliature pritriche souvent dgnre avec des flagelles peu nombreux. Ils peuvent contaminer et tre isols dans divers produits pathologiques, leur signification clinique est difficile tablir mme lors d'hmoculture positive.

XANTHOMONAS
Le genre Xanthomonas fut cr pour regrouper des bactries phytopathognes pigmentes en jaune voisines des Pseudomonas. Ce genre contenait une soixantaine d'espces dont la distinction se faisait sur la base de leur pouvoir pathogne vis--vis d'une plante donne. La dernire dition du Bergey's Manual reconnait cinq espces principales : X . campestris, X . f r a g a r i a e , X . albilineans, X . axonopodis, X . ampelina. Pseudomonas maltophilia t transfr dans le genre Xanthomonas. A - Morphologie Bacilles Gram ngatif, mobiles par un cil polaire monotriche. B - Caractres culturaux Bactries chimio-organotrophes, apparemment peu exigeantes mais pas absolument prototrophes. Temprature optimum 25 30C. Les Xanthomonas produisent un pigment jaune, mais il y a des exceptions. A l'origine, dfini comme tant de nature carotnode, il s'agirait en fait de xanthomonadine = aryl-polyne brome, soluble dans les solvants organiques. Sur glose nutritive contenant du glucose, certaines souches produisent un slime abondant. C - Caractres biochimiques Oxydase (-) parfois faiblement positive Catalase (+) Frquemment lipolytiques, protolytiques, pectolytiques et/ou amylolytiques. Les caractres biochimiques simples de X . maltophilia sont donns dans le tableau du chapitre 22 Pseudomonas.

Chapitre XXni - Aulres bacilles non fermentants___________________________________________287

D - Intrt mdical La signification en bactriologie clinique de l'isolement de Xanthomonas phytopathognes est encore obscure. Il s'agit surtout d'un problme de diagnostic diffrentiel pouvant ventuellement se poser au laboratoire. L'implication de ces Xanthomonas comme bactries opportunistes reste dmontrer. X. maltophilia a t dcrit en 1961 par Hugh et Ryschenkow. Malgr ses exigences nutritives particulires et notamment son auxotrophie vis--vis de la mthionine, cette bactrie ubiquitaire est isole partir de lgumes, de bananes, de graines de coton, de gousses de haricots, de plants de tabac, des eaux mme potables, des eaux stagnantes, des eaux d'gouts, des eaux de ruisseaux ou de rivires, d'eaux provenant de nappes phratiques, de lait contamin, du sol dans les zones ptrolifres. Dans l'environnement hospitalier on le rencontre dans l'eau distille, l'eau des incubateurs, des nbulisateurs, des humidificateurs. X . maltophilia est le deuxime bacille non fermentant apparent aux Pseudomonas isol par ordre de frquence dans un laboratoire de bactriologie mdicale aprs P. aeruginosa. Les sources habituelles d'isolement chez l'homme sont les voies ariennes, les plaies, le sang, les urines mais X. maltophilia peut se trouver en de multiples autres sites : les liquides, d'ascite, pricardiques, pleuraux, LCR, la lymphe, les ulcres de jambe, les soluts de dialyse... C'est habituellement un germe commensal qui fait partie de la flore transitoire des malades hospitaliss, il devient plus frquent dans la mucoviscidose. X . maltophilia est l'agent d'infections opportunistes : endocardites, septicmies, pneumonies lobaires, bronchopneumonies, pneumonies d'aspiration, infections urinaires, conjonctivites, mningites, surinfections de plaie, suppurations diverses. Vingt-six srotypes 0 ont rcemment t dcrits et pourraient servir aux tudes pidmiologiques. X. maltophilia est souvent caractris par une rsistance naturelle leve vis--vis de bta-lactamines li une faible permabilit membranaire. Il possde des bta-lactamases chromosomiques et plasmidiques. L'existence d'au moins 2 bta-lactamases chromosomiques inductibles (Ll Zn - pnicillinase et L2 cphalosporinase contenant une serine dans son site actif) assure dj l'hydrolyse de plusieurs bta-lactamines rendant difficile le choix d'une antibiothrapie. Il faut retenir qu'il est toujours rsistant l'imipnme. Les quinolones de 2e gnration peuvent tre actives mais de faon variable.

BIBLIOGRAPHIE
ARAFAT W., JEHL F., THABAUT A., MONTEIL H., Bta-lactamase de Pseudomonas maltophilia : distribution et purification , Md. Mal. Infect, 1988,1, 829-834. GILARDI G.L., Glucose non-fermenting Gram ngative bacteria in Clinical microbiology , CRC Press, 1978, West Palm Beach, Florida. IGRA-SIEGMAN Y., CHMEL H., COBBS C., Clinical and laboratory characteristics of Achromobacter xylosoxidans infection , J . Clin. Microbiol, 1980,11, 141-145. MARSHALL W.F., KEATING M.R., ANHALT J.P., STECKELBERG J.M., Xanthomonas maltophilia : an emerging nosocomial pathogen. Mayo Clin Proc., 1990,64, 1097-1104. MONTEIL H., RASOAMANANJARA D., JEHL F. Sensibilit aux antibiotiques actuels de Flavobacteriwn sp et Pseudomonas sa, bactries opportunistes d'avenir. Md. et Mal. Infect., 1986, 1, 18-23.

288

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

MONTEIL H., JEHL F. Activit compare de ticarcilline - acide clavulanique et de diverses bta-lactamines sur Pseudomonas maltophilia , Pathol. Biol., 1987, 35, 805-808. RASOAMANANJARA D., KOROSEC B., MONTEIL H., Classification and identification of Flavobacterium species by carbon-sources utilization , J . Clin. Microbiol., 1987, 25, 1285-1290. REVERDY M.E., FRENEY J., FLEURETTE J., et al., Nosocomial colonization and infection by Achromobacter xylosoxidans ,J. Clin. Microbiol., 1984, 19, 140-143. RICHARD C., MONTEIL H., Isolement, identification, signification clinique des espces du genre Flavobacterium , Ann. Biol. Clin., 1983, 41, 187-198.

1
2 3
1. Colorants ncessaires pour effectuer une coloration de Gram. 2. Mise en vidence du type de mtabolisme respiratoire d'une souche. Les quatre souches prsentes sont de gauche droite: arobie, micro-arophile, aroanarobie avec production de gaz, anarobie. 3. Milieu MEVAG pour tude du mtabolisme respiratoire des Staphylocoques. Tubes de gauche: Staphylocoque, aroanarobie; tubes de droite: Microcoque, arobie stricte. 4. Diffrents types de pigments produits par des colonies de Staphylocoques: blanc, citrin, dor. 5. Colonies de Staphylococcus aureus acidifiant le milieu de Chapman.

6 7

<6. Milieu de Chapman en tube. A gauche, souche Chapman ngatif; droite, souche Chapman positif. 7. Mise en vidence de la catalase; production des bulles d'oxygne par une colonie mise en contact avec de l'eau oxygne. 8. A gauche, souche de S. aureus coagulase positive; droite souche de S. epidermidis coagulase ngative. 9. Mise en vidence de la thermonuclase par un halo autour des puits des souches productrices. 10. Mise en vidence de la DNase. claircissement de la glose l'ADN autour de la souche positive ensemence en strie sur une glose l'ADN. 11. Galerie API-STAPH. Souche de Staphylococcus cohnii.

11

1C

14

12 13 15

12. Souches de S. aureus. Zone d'inhibition autour du disque de pnicilline. La souche de gauche est sensible. La souche de droite produit une pmcillmase. Observer la diffrence de bordure des zones d'inhibition. 13. Colonies de Streptocoque. Hmolyse B. 14. Colonies de Streptocoque. Hmolyse a viridans. 15. Streptocoque dficient. Coloration de Gram. Noter l'irrgularit de la taille et de la forme des corps bactriens. 16. Glose bile-esculine. A gauche, souche ngative. A droite, souche positive, noircissement du milieu. 17. Noircissement des colonies de Enterococcus faecalis sur glose au tellurite de potassium.

16

17

18
19
20
18. Antibiogramme d'une souche de Streptocoque 6-hmolytique. 19. Coloration de Gram. Streptococcus pneumoniae dans un liquide cphalo-rachidien. 20. Colonies de S. pneumoniae sur glose au sang, aprs 18 heures d'incubation. 21. Hmolyse bta des colonies de pneumocoque en prsence de vancomycine (VA) en anarobiose et inhibition de la croissance en prsence d'optochine. 22. Lyse d'une culture de S. pneumoniae par la bile. claircissement du bouillon de culture.

21
22

23
23. Agglutination d'une culture de S. pneumoniae. 24. Coloration de Gram. Neisseria gonorrhoeae dans un pus urtral. 25. Colonies de N. gonorrhoeae sur glose chocolat. 26. Mise en vidence de l'oxydase. 27. Disque de cphalosporine chromogne pour mise en vidence d'une bta-lactamase. 28. Galerie miniaturise Diagnostics-Pasteur pour identification des Neisseria et Branhamella.

24 25

26 27

28

29

30
29. Colonies d'Acinetobacter sur glose de Drigalski. 30. Coloration de Gram. Souche de Listena dans un liquide cphalo-rachidien. 31. Colonies de Listena sur glose au sang. 32. Colonies de Bacillus sur glose nutritive. 33. Coloration de Gram. Bacillus anthracis dans un liquide cphalo-rachidien. 34. Vibrio parahaemolyticus . phnomne de Kanagawa.

31

33

32

35 36 37
35. Colonies de Salmonella enteritidis sur glose SS. 36. Milieu de Kligler-Hajna. De gauche droite: Eschenchia coli, Salmonella typhimunum, S. enteriditis. 37. Colonies muqueuses de Klebsiella pneumoniae sur glose de Drigalski. 38. Colonie de Serratia pigmentes en rouge sur glose de Drigalski. 39. Diffrents types de colonies sur glose Hektoen.

38

39

41
40
40. Serratia marcescens. Galerie API -20E. 41. Antibiogramme de Serratia. Aspect caractristique avec prsence de colonies dans la zone d'inhibition autour du disque de colistine. 42.Proteus. Essaimage en nappe sur la glose partir du point d'inoculation au centre de la bote. 43. Colonies de Yersinia sur glose CIN. 44. Selles de cholrique. Coloration de Grain.

43

42

44

45
45 Inhibition d'une culture de Pasteurella multocida autour d'un disque de compos vibnostatique 46. Souche de Pasteurella multocida. Galerie API - 20E. 47. Souche de Streptobacillus moniliformis dans un bouillon d'hmoculture 48 Mise en vidence des besoins en facteurs de croissance d'une souche de Haemophilus influenzae 49 Dtection d'une btalactamase d'une souche de Haemophilus mfluenzae ensemence en stne.

46
47

48

49

51
50
50. Souche de Pseudomonas aeruginosa Pigments sur milieux de King A et B. 51. Souche rythrogne de P. aeruginosa. 52. Colonies de P. aeruginosa sur glose nutritive. 53. Galerie Pseudomonas (Diagnostics-Pasteur). 54. Antibiogramme de P. aeruginosa. Noter l'effet inducteur de la cfoxitine (disque du centre) qui entrane une diminution du rayon des zones d'inhibition.

52 54

53

55 56 57
55. Colonies de Campylobacter sur milieu slectif. 5 6. Coloration de Gram. Culture de Campylobacter. 57. Hmoculture sur flacon de Castaneda pour recherche de Brucella. 58. Srodiagnostic de Wright. 59. preuve l'antigne tamponn. 60. Colonies de Legionella aprs 48 heures d'incubation sur glose BCYE.

58
60 59

61
61

63

65

61. Colonies de Legionella. 62. Coloration de Gram. Legionella aprs subcultures. 63. Jarre pour incubation en anarobiose. 64. Enceinte pour manipulation en anarobiose. 65. Milieux de transport pour produits pathologiques destins la recherche de bactries anarobies.

64

67 68 66
66. Microplaque pour identification et tude de la sensibilit des anarobies aux antibiotiques. 67. Coloration de Gram. Clostridium perfringens. Noter la dcoloration de certains corps bactriens. 68. Colonies de C. perfringens sur glose au sang. 69. Colonies de C. perfringens sur glose Columbia. 70. Colonies de Clostridium difficile. 71. Coloration de Gram: Fusobacterium mortiferum.

69

,70

71

72

73
74
72. Coloration de Gram : Fusobacterium nucleatum. 73.Anarodiscs : Fusobacterium mortiferum. 74. Colonies de Bacteroides melanmogenicus. 75. Anarodiscs : Bacteroides fragihs. 76. Angine de Vincent. Coloration de Gram. Association fuso-spirochtienne. 77. Colonie de Gardnerella vaginahs.

75 77

76

79 78

78.Clue-cell. 79. Coloration de ZiehI-Neelsen. Bacilles acido-alcoolo-rsistants: M tuberculosis. 80. Milieu de Lowenstein-Jensen. Colonies de M tuberculosis. 81. Coloration de ZiehI-Neelsen. M avium. 82. Milieu de Lowenstein-Jensen. Colonies de M. gordonae.

80

81

82

83 85
84

83.1mmunofluorescence. Treponema pallidum. 54.Chamydia. Immunofluorescence. 55.ChIamydia. Culture de cellules. Inclusions. 86. Coloration de Gram. Nocardia dans un pus. 87. Coloration de Gram. Actinomyces dans un pus.

86
87

Chapitre XXIV CAMPYLOBACTER-HELICOBACTER

CAMPYLOBACTER
HISTORIQUE
En 1913 un bacille mobile, vibrio-like, a t rendu responsable d'avortements pizootiques ches les bovids. Ce bacille a t dsign comme Vibrio ftus par Smith et Taylor (U.S.A.) en 1919. Un bactriologiste franais, Vinzent, a rapport en 1949 le premier cas d'infection humaine Vibrio ftus. En 1963, par l'tude du G + C % du DNA, Sbald et Vron ont montr que ces bactries sont diffrentes des Vibrio (G + C % = 40 52) et forment un nouveau genre, Campylobacter (G + C % = 30 38). Au cours des dernires dcennies les conditions d'isolement des Campylobacter ont t amliores et le rle de ces bactries comme agents d'entrites a t dmontr.

1 - DFINITION Les Campylobacter sont des bacilles Gram ngatif caractriss par : - leur morphologie. Bacilles fins, de 0,5 5 |J,m de long, incurvs en forme de virgule, en forme de S, de vol de mouette ou de forme hlicodale pour les formes longues. - leur mobilit. Elle est trs vive due une ciliature polaire monotriche. Elle est classiquement dcrite comme un vol de moucheron . Les formes longues peuvent tre flagelles aux deux extrmits. leur mtabolisme respiratoire micro-arophile. une raction oxydase (+). un G + C % du DNA compris entre 30 et 38 %.

290

Section VI - BACILLES GRAM NEGATIF AROBIES STRICTES

II - CLASSIFICATION La catalase permet de diviser le genre Campylobacter en deux groupes. A - Groupe catalase ngatif Les espces qui forment ce groupe ne sont pas pathognes pour l'homme. C. sputorum est subdivis en 3 sous-espces : - subsp. sputorum, trouve dans la flore buccale normale. - subsp. bubulus, trouve dans les scrtions prputiales du taureau. - subsp. mucosalis, isol d'adnomes intestinaux du porc. B - Groupe catalase positif Dans ce groupe on distingue : - C. f t u s , avec deux sous-espces: C. ftus subsp. f t u s , responsable de septicmies chez l'immuno-dprim, il est aussi pathogne pour les bovins et les ovins ; C. ftus subsp. venerealis est responsable d'avortements et de strilit du btail. - C. jejuni est aujourd'hui reconnu comme une bactrie frquemment responsable de diarrhes chez l'homme. - C. coli est proche de C. jejuni et a un pouvoir pathogne identique. C - Autres espces D'autres espces rcemment reconnues sont rattaches au genre Campylobacter : C. laridis est frquent chez les mouettes, C.fecalis est trouv chez le btail, mais pas chez l'homme, C. hyointestinalis donne des entrites chez le porc, C. cinaedi et C.fennelliae ont t trouvs dans le rectum d'homosexuels, C. cryaerophila et C. nitrofigilis n'ont t trouvs que dans l'environnement. C. pylori ou C. pyloridis souvent associ des lsions de la muqueuse de l'estomac, est aujourd'hui class dans le genre Helicobacter.

III - HABITAT ET PIDMIOLOGIE Les Campylobacter sont des bactries trouves dans le tube digestif des animaux, notamment les volailles, les ovins et les porcs. Les animaux de compagnie (chien et chat) ont t incrimins comme vecteurs de Campylobacter. La contamination de l'homme se fait par voie digestive. Les cas de campylobactriose sont le plus souvent sporadiques. L'eau ou des laitages contamins ont t l'origine d'pidmies. IV - PHYSIOPATHOLOGIE En raison de leur grande mobilit les Campylobacter sont aptes traverser le mucus. Ils peuvent pntrer dans les entrocytes. Le caractre invasif de la bactrie se traduit par la prsence de leucocytes et de sang dans les selles des malades. Des toxines ont t mises en vidence chez des souches de C. jejuni. L'une d'elles a des proprits voisines de la toxine cholrique. Une autre toxine aurait une activit cytotoxique. Leur rle exact est encore prciser.

Chapitre XXIV - Campylobacter________________________________________________291

V - POUVOIR PATHOGNE A - Pour l'homme - C. ftus subsp. ftus. Il est responsable de septicmies point de dpart digestif survenant chez la femme enceinte ou chez des sujets ayant une maladie sous-jacente : cirrhose, hmopathie, SIDA etc... Des infections localises (cardiaques, mninges, articulaires) ont aussi t dcrites. - C. jejuni et C. coll. Ils sont beaucoup plus souvent rencontrs. Ils sont cause d'entrites qui sont plus frquentes chez l'enfant vivant dans des conditions d'hygine prcaires. Aprs une incubation de 1 3 jours, survient une diarrhe fbrile avec parfois du sang dans les selles. Les douleurs abdominales et les vomissements sont habituels. La gurison survient spontanment en une semaine environ. Les bactrimies sont peu frquentes. Quelques complications infectieuses (appendicites, cholcystites, pritonites) ou post-infectieuses (arthrites) ont t signales. B - Pour l'animal - C. ftus subsp. ftus se rencontre comme commensal dans l'intestin des bovins, ovins, porcins et volailles. A partir de l'intestin la bactrie peut avoir une diffusion hmatogne ; l'infection peut se localiser aux voies gnitales et causer des avortements sporadiques . - C. ftus subsp. venerealis ne se trouve que chez les bovins chez lesquels il provoque la strilit enzootique d'origine vnrienne. VI - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A - Les Campylobacter sont micro-arophiles Ils ont besoin pour leur croissance d'une atmosphre ayant une teneur rduite en oxygne, mais ils ont un mtabolisme respiratoire et ne se dveloppent pas en anarobiose. Le mlange gazeux le plus favorable leur croissance contient : 5 % d'oxygne, 10 % de CO^ et 85 % d'azote. Il est le plus aisment obtenu en utilisant un gnrateur adapt plac dans une jarre pour anarobies. B - Milieux de culture Les Campylobacter se-dveloppent sur glose Columbia additionne de 5 % de sang. Us se dveloppent aussi sur Brucella Agar et sur milieu de Mueller-Hinton. La croissance en milieu semi-glose (0,15 % d'agar) comme le bouillon thioglycolate est meilleure qu'en milieu liquide. Des milieux slectifs pour rechercher les Campylobacter dans les selles ont t mis au point. Ils contiennent un mlange d'antibiotiques inhibant la plupart des bactries de la coproflore : - milieu de Butzier : bacitracine, novobiocine, cycloheximide, cfazoline, colistine. - milieu de Skirrow : vancomycine, trimthoprime, polymyxine. - milieu de Blaser : vancomycine, trimthoprime, polymyxine, cfalotine, amphotricine.

292

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

Les Campylobacter se dveloppent 37C, mais une temprature d'incubation de 42C favorise la croissance de C. jejuni. C - Aspect des colonies Sur milieu glose les colonies apparaissent en 2 4 jours. Elles mesurent 1 2 mm de diamtre. Elles sont plates, gristres et translucides. Elles peuvent avoir un bord irrgulier. Lorsque la glose n'est pas parfaitement sche, les colonies peuvent s'taler. Elles ont parfois un aspect mucode. Lorsque les colonies sont ges, les corps bactriens deviennent coccodes. Cette forme de dgnrescence est irrversible. D - Caractres biochimiques Tous les Campylobacter rduisent les nitrates en nitrites et sont oxydase (+). Les espces ayant un intrt mdical possdent toutes une catalase. Ils n'hydrolysent pas les sucres. C. jejuni se distingue par son aptitude hydrolyser l'hippurate. Les caractres qui permettent de distinguer les principales espces de Campylobacter rencontrs en mdecine humaine sont indiqus dans le tableau ci-dessous :
Croissance 25C 42C
+ + + Sensibilit Ac. nalidixique cfalodne R S S(l) Hydrolyse de l'hippurate + -

Espce

C. ftus
C. jejuni C. coli

S
R R

(1) C. tandis se distingue par sa rsistance l'acide nalidixique.

VII - RECHERCHE DE C. JEJUNI DANS LES SELLES - Elle doit tre effectue sur des selles frachement mises ou conserves +4C. - L'examen direct au microscope contraste de phase ou au fond noir d'une goutte de suspension fcale est un temps essentiel. Il permet souvent de reconnatre des bacilles ayant la mobilit caractristique. - L'examen microscopique des selles aprs coloration au bleu de mthylne peut montrer des polynuclaires en quantit importante qui sont le tmoin du pouvoir invasif de la bactrie. - La culture est gnralement faite par ensemencement des milieux slectifs dcrits plus haut. Une autre possibilit est de filtrer une suspension de selles sur un filtre de 0,65 [l qui est ensuite pos directement sur le milieu glose et laiss en place une heure. IX - TRAITEMENT ANTIBIOTIQUE Les formes septicmiques ou autres que digestives de campylobactriose justifient un traitement antibiotique par voie gnrale.

Chapitre XXIV - Campylobacter

______________________

293

Pour l'entrite Campylobacter dont la gurison est spontane, la ncessit d'un traitement antibiotique se discute. L'antibiotique de choix est alors l'rythromycine qui permet de raccourcir la dure du portage digestif. Les Campylobacter sont sensibles aux aminosides, aux ttracyclines, au chloramphnicol et la combinaison amoxicilline-acide clavulanique. La sensibilit l'ampicilline est inconstante. Ils sont rsistants la colistine, au cotrimoxazole, la rifampicine et la cfalotine.

HELICOBACTER
HISTORIQUE
II y a bientt 100 ans que des bactries en forme de spires, comme les spirochtes, ont t observes dans l'estomac de l'homme ou des animaux. Il y a environ 50 ans que l'on sait que la muqueuse gastrique possde une activit urasique capable de transformer l'ure en ammoniac. Ces observations sont aujourd'hui expliques par l'existence de Helicobacter pylori. La dcouverte d'une bactrie incurve qui constitue une nouvelle espce bactrienne dsigne comme Campylobacter puis Helicobacter pylori semble devoir modifier bien des aspects de la gastro-entrologie. En 1979, Warren, un auteur australien, a observ sur des chantillons de muqueuse antrale des bactries incurves qui furent alors appels Campylobacter-like organisms. Ces bactries taient prsentes dans presque tous les chantillons reus et dont la plupart avaient l'aspect histologique d'une gastrite chronique active. Marshall et Warren constataient en 1982 que ces bactries taient gnralement prsentes chez les patients pour lesquels une indication de gastroscopie tait pose et cette prsence tait indpendante de la nature de la maladie ou des symptmes en cause. Les mmes auteurs ont ensuite fait un travail prospectif sur 100 malades soumis une gastroscopie et une biopsie de la muqueuse. Une bactrie incurve Gram ngatif micro-arophile et catalase positive a t trouve chez 95 % des malades ayant une gastrite chronique active. Les isolements ont t positifs chez 70 % des malades ayant un ulcre gastrique et 90 % des malades ayant un ulcre duodnal. Par contre, la bactrie n'a pas t isole partir d'chantillons de muqueuse saine.

1 - DEFINITION ET CLASSIFICATION Les Helicobacter sont des bacilles Gram ngatif incurvs ou en forme de C, de U, ou de S, mobiles par la prsence de 4 6 flagelles polaires. Les bacilles sont microarophiles, de croissance difficile et oxydase (+). Deux espces sont dcrites : - H. pylori, isol de la muqueuse gastrique des primates, - H. mustelae, isol de la muqueuse gastrique du furet, et dont il ne sera pas parl ci-dessous. II - HABITAT ET EPIDEMIOLOGIE L'homme est le seul rservoir connu de H. pylori. Le mode de transmission n'est pas connu. H. pylori a t trouv dans le monde entier. Il est isol avec une particulire frquence dans l'estomac des ulcreux ou des sujets atteints d'une gastrite, mme asymptomatique.

294

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

III - PHYSIOPATHOLOGIE H. pylori est mobile dans le mucus. Grce des adhsines il est capable d'adhrer aux cellules de la muqueuse de l'estomac o on le trouve dans les espaces intercellulaires. L'urase que possde H. pylori permet la production d'ions d'ammonium capables de neutraliser l'acidit gastrique, ce qui permet la bactrie de se multiplier. Une protine cytotoxique produite par la bactrie empcherait les cellules mucus de produire un mucus protgeant la muqueuse de l'acidit. IV - POUVOIR PATHOGENE Plusieurs tudes montrent que H. pylori joue un rle tiologique important dans la gastrite de type B (gastrite antrale chronique active) et dans la pathognie de l'ulcre gastro-duodnal). L'radication de H. pylori de la muqueuse est corrle avec une diminution de la frquence des rechutes de l'ulcre duodnal. V - ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE H. PYLORI A - Prlvement Des biospsies gastriques sont effectues au cours d'une gastroscopie. Les prlvements pour l'examen bactriologique sont, soit placs dans du srum physiologique +4C et ensemencs dans l'heure, soit placs dans un milieu de transport adapt. La benzocane et le simethicone ont sur H. pylori un effet inhibiteur que n'a pas la lidocane. La bactrie n'est pas retrouve dans le liquide gastrique. B - Mise en vidence de l'activit urasique Elle peut tre recherche directement soit en salle de gastroscopie, soit au laboratoire partir d'un fragment biopsique. C - Examen microscopique Un broyt d'un fragment biopsique est color par la mthode de Gram. Des bacilles Gram ngatif spirales ou incurvs dont la rpartition sur le frottis est htrogne sont trouvs. Un anticorps monoclonal a aussi t utilis pour la mise en vidence de H. pylori par immunofluorescence directe. C - Mise en culture Sur glose chocolat au sang de cheval enrichie de 1 % d'Isovitalex, incube 37C, en microarophilie (10 % de CO^) et atmosphre humide, de petites colonies (1 mm) transparentes, lisses et rgulires se dveloppent en 3 7 jours. Le milieu peut tre rendu slectif par addition de vancomycine (6 mg/1) et de cefsulodine (5 mg/1). L'identification est fonde sur la morphologie des bacilles au Gram :

Chapitre XXTV - Campylobacter

_________ _____________________________________295

l'urase trs active, les ractions d'oxydase et catalase positives. Une phosphatase alcaline et une yGT peuvent aussi tre mises en vidence. Les autres caractres sont ngatifs. VI - DIAGNOSTIC INDIRECT Le test l'urase (ou breath test) consiste faire ingrer au patient de l'ure marque au ^C et dtecter aprs 20 minutes dans l'air expir le CO^ marqu provenant de la dgradation de l'ure par l'urase. La mise en vidence d'anticorps sriques peut tre faite par fixation du complment, immunoblot ou agglutination de particules de latex sensibilises. Mais l'interprtation est dlicate puisque prs de 50 % des sujets de 50 ans possdent des anticorps dirigs contre H. pylori. VII TRAITEMENT

Les indications du traitement sont encore mal prcises. H. pylori est sensible aux bta-lactamines et aux aminosides. Il est rsistant au trimthoprime-sulfamthoxazole. Le sous-citrate de bismuth a une action lytique sur H. pylori mais est incapable lui seul d'radiquer la bactrie. Le traitement prconis associe ampicilline, mtronidazole et sous-citrate de bismuth. Son efficacit doit tre contrle par vrification de l'radication de la bactrie un mois aprs arrt de ce traitement.

BIBLIOGRAPHIE
FAUCHERE J.L., ROSENEAU A., Campylobacter et Helicobacter en pathologie digesve humaine. Mdecine/Sciences, 1991,7,138-152.

Campylobacter
MEGRAUD F., LATRILLE J., Campylobacter jejuni en pathologie humaine , I - Aspects cliniques et thrapeutiques. Path. Biol, 1981, 29, 245-253. II - Diagnostic biologique et pidmiologie, Path. Biol., 1981,29, 305-314. PENNER J.L., Th genus Campylobacter : a dcade ofprogress , Clin. Microbiol. Rev., 1988, 1, 157-172. WALKER R.L, CALDWELL M.B., LEE E.C., et al., Physiopathology of Campylobacter enteritis , Microbiol. Rev., 1986, 50, 81-94.

Helicobacter
BLASER M.J., Helicobacter pylori and th pathogenesis of gastroduodenal inflammation , J . Infect. Dis., 1990, 161, 626-633. GOODWIN C.S., ARMSTRONG J.A., Microbiological aspects a! Helicobacter pylori . Eur. J Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1990, 9, 1-13. MARSHALL B.J., Campylobacter pyloridis and gastritis , J . Infect. Dis., 1986,153, 650-657. MEGRAUD F., BONNET F., GARNIER M., LAMOULIATTE H., Characterization of Campylobacter pyloridis by culture, enzymatic profile and protein content , J . Clin. Microbiol., 1985, 22, 1007-1010.

Chapitre XXV BRUCELLA

HISTORIQUE
C'est D. Bruce, mdecin britannique, qui a isol Malte en 1887 la bactrie responsable de la fivre mditerranenne encore appele fivre de Malte, fivre ondulante, ou mlitococcie. Le rle de la chvre dans sa transmission fut rapidement tabli.

1 - CARACTRES GNRAUX Les bactries du genre Brucella sont des petits coccobacilles (0,5 1,5 |J.m de long) Gram ngatif, immobiles, ne formant pas de spore, cultivant mal sur milieux ordinaires. Arobies stricts, leur croissance est souvent amliore par le CO^. Bactries multiplication intra-cellulaire facultative, elles peuvent infecter les animaux ou l'homme en provoquant une maladie, la brucellose, d'abord aigu, puis chronique. Il - CLASSIFICATION Le genre Brucella comprend 6 espces. - Trois espces principales peuvent infecter l'homme. Ce sont : - B. melitensis : trouve chez la chvre et le mouton ; - B. abortus : agent de l'avortement des bovins ; - B. suis : trouve chez le porc et le livre. - Trois autres espces, beaucoup plus rares, sont : B. ovis, B. neotomae. III - HABITAT ET PIDMIOLOGIE Les Brucella sont responsables d'une anthropozoonose qui touche le monde rural et est rpandue dans le monde entier. La brucellose est particulirement frquente sur le pourtour du bassin mditerranen.

B. canis et

Chapitre XXV -Brucella

297

A - Le rservoir de germes II est constitu par les animaux d'levage : classiquement caprins et ovins pour B. melitensis, bovins pour B. abortus et porcins pour B. suis. En fait, ce ne sont que des htes de prdilection car la spcificit d'espce n'est pas rigoureuse. La maladie animale est souvent inapparente. Chez la femelle gravide, elle se manifeste par des avortements. La prsence d'rythritol dans les tissus ftaux et placentaires des animaux stimule la multiplication des Brucella et explique ce viscrotropisme. Les scrtions vaginales des animaux malades dissminent la bactrie dans leur environnement (litires, fumier). L'atteinte de la glande mammaire entrane l'excrtion de Brucella dans le lait. Un meilleur contrle de la brucellose animale entrane une diminution du nombre de cas chez l'homme. B - La contamination humaine Brucella melitensis reste dominante dans la brucellose humaine en France, mais la proportion de B. abortus augmente sensiblement.
1. Elle est directe dans la majorit des cas (70 %)

L'homme se contamine par voie cutane. Les Brucella pntrent dans l'organisme la faveur d'une excoriation cutane mme minime. Elles peuvent mme traverser la peau saine. Une contamination conjonctivale est possible. La brucellose est une maladie professionnelle qui atteint surtout les ruraux (vtrinaires, bergers, marchands de bestiaux etc...). La frquence des contaminations des personnels de laboratoire est souligner. Chez ces derniers la contamination par arosols a t dcrite. Deux malades sur trois sont des hommes en ge de travailler. 2. La contamination indirecte, digestive est plus rare Elle est l'origine de la maladie chez des vacanciers ou des citadins. Elle se fait par ingestion de lait cru (de chvre ou de brebis) ou par consommation de fromage frais de fabrication artisanale. Il n'existe pas de contamination interhumaine. Le nombre de cas dclars par an est en diminution depuis 1978. En 1989, 164 cas de brucellose ont t dclars aux autorits sanitaires.
Taux annuel moyen d incidence des cas de brucellose humaine dclars (1988 - 19891

298

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

volution du nombre d cas de brucellose humaine dclars entre 1960 et 1989.

source : Bulletin pidmiologique Hebdomadaire n 36/1990

IV - PHYSIOPATHOLOGIE La brucellose est une septicmie d'origine lymphatique. A partir de la porte d'entre cutane ou digestive, les Brucella gagnent par voie lymphatique le premier relais ganglionnaire et s'y multiplient. Puis elles essaiment par voie lymphatique ou sanguine pour coloniser les organes ayant une trame rticulo-endothliale importante (ganglions, moelle osseuse, foie, rate). La rptition des dcharges bactriennes se traduit par une fivre ondulante. Des localisations osto-articulaires, glandulaires, hpato-splniques ou neuromninges peuvent survenir et continuer voluer pendant la phase subaigu. Les Brucella intra-cellulaires persistent des annes dans l'organisme, ce qui entrane une raction immune de type hypersensibilit retarde. V - POUVOIR PATHOGNE CHEZ L'HOMME Aprs une incubation de 2 4 semaines, la brucellose aigu septicmique est caractrise par la fivre ondulante sudoro-algique. Bien supporte, cette fivre peut passer inaperue. Les formes focalises (ostoarticulaires, neuro-mninges etc...) peuvent apparatre au dcours des formes septicmiques ou tre d'emble isoles. Les formes mineures inapparentes, caractrises par l'absence de localisation, aboutissant la brucellose chronique invalidante ou patraquerie sont frquentes. En milieu rural, il faut considrer comme brucellose possible tout syndrome fbrile inexpliqu. VI - ISOLEMENT ET IDENTIFICATION D'UNE BRUCELLA II est indispensable que le clinicien prcise au laboratoire qu'il demande une recherche de Brucella pour que les conditions de culture appropries soient mises en npnvrp oeuvre. A - L'hmoculture Au cours de la brucellose, elle est : constamment positive pendant la phase aigu, frquemment positive pendant la phase subaigu, exceptionnellement positive pendant la phase chronique.

Chapitre XXV -Brucella________________________________________________________299

Il est recommand d'ensemencer le sang dans des flacons de Castaneda, flacon diphasique (contenant un milieu glose et un bouillon) avec une atmosphre de 10 % de C2. Les flacons sont conservs classiquement 6 semaines 37C car les colonies de Brucella sont parfois trs lentes se dvelopper en primo-culture. Nanmoins, la croissance de la bactrie s'effectue le plus souvent en quelques jours. " B - Autres produits pathologiques La recherche de Brucella peut aussi se faire partir de ganglions lymphatiques, moelle osseuse, liquide de ponction articulaire, liquide cphalo-rachidien, pus divers. Les liquides sont ensemencs comme le sang, en flacon de Castaneda. Les tissus sont broys et ensemencs sur des milieux solides adquats (Brucella agar, glose Albimi, glose Trypticase Soja) incubs 37C en atmosphre de 10 % de CO;. C - Caractrisation du genre Brucella 1. La lenteur de croissance l'isolement est caractristique II faut toujours plus de 48 heures et mme parfois plusieurs semaines pour obtenir des colonies partir d'un produit pathologique. Les colonies sont petites (0,5 mm de diamtre), lisses, translucides, bords rguliers. Elles ont parfois une couleur de miel et sont constitues de petits coccobaciies Gram ngatif. 2. Les caractres suivants sont positif s arobiose stricte catalase oxydase nitrate-rductase urase (immdiate pour B. suis, ngative pour B. ovis) 3. Les autres caractres mtaboliques sont ngatifs D - Caractrisation de l'espce (voir tableau I) - Exigence en CO^. En France, 96 % des souches de B. abortus exigent une atmosphre de 10 % de CO^ pour leur croissance. B. melitensis et B. suis ne sont jamais exigeantes. C'est un bon critre d'orientation. - Production d'H2 S. B. melitensis n'en produit pas alors que les souches de B. abortus et B. suis en produisent en 24 heures (mthode du papier au sous-actate de plomb). - Action bactriostatique des colorants. La fuchsine basique et la thionine certaines concentrations ont une action bactriostatique. La thionine inhibe B. abortus et la fuchsine inhibe B. suis. Les caractres ci-dessus permettent de diffrencier les principales espces de Brucella. Nanmoins il existe des souches atypiques qui ne correspondent pas ce schma d'identification. Le recours un laboratoire spcialis est alors ncessaire.

300

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

TABLEAU 1 CARACTRES DIFFRENTIELS DES ESPCES PRINCIPALES VE BRUCELLA. Espce Exig. en 002 Production de HaS Croissance en prsence de Thionine B. melitensis B. abortus B. suis + + + ++ + Fuchsine basique + + Agglutination avec srums monospcifiques (1) A + + M +

(1) : A = smti-abortus ; M = smti-melitensis.

E - Dtermination du biotype Faite en laboratoire spcialis, elle fait appel 3 types de techniques 1. Agglutination par des srums monospcifiques, anti-Abortus (A), anti-Melitensis (M).
Antignes de surface des Brucella : - Bactries en phase S (smooth) Toutes les espces suivantes possdent deux antignes de surface A et M qui sont agglutinognes : B. melitensis, B. abortus, B. suis et B. neotomae. La quantit de ces antignes diffre selon les espces : M est prdominant chez B. melitensis, A est prdominant chez les 3 autres espces. Un srum anti-brucella global agglutine les 4 espces. Par saturation, il est possible d'obtenir des srums monospcifiques anti A ou anti M. - Bactries en phase R (rough) Les spcificits A et M sont remplacs par un antigne R commun toutes les Brucella, y compris B. ovis et B. canis qui n'ont ni A ni M.

2. Lysotypie par les phages Tbilissi (Tb) et Weybridge (We). 3. tude du mtabolisme oxydatifdes sucres Elle se fait par une mthode manomtrique. On reconnat 3 biotypes pour B. melitensis, 9 biotypes pour B. abortus et 4 biotypes pour B. suis. VII - DIAGNOSTIC IMMUNOLOGIQUE Les symptmes de la brucellose sont peu caractristiques, aussi le diagnostic de la maladie n'est souvent voqu qu' un stade o les hmocultures sont ngatives. Dans cette situation, les mthodes immunologiques ont toute leur importance, car elles permettent un diagnostic indirect. A - Ractions srologiques Elles peuvent donner des rsultats discordants car elles ne dclent pas toujours les mmes classes d'anticorps. Aussi il peut y avoir intrt pratiquer simultanment deux ou trois de ces ractions.

Chapitre XXV -Brucella________________________________________________________301

1. Srodiagnostic de Wright ou raction d'agglutination lente a/ Principe C'est la plus classique des ractions srologiques de bmcellose. Elle consiste rechercher l'agglutination des Brucella (souche de B. abortus) en prsence de dilutions du srum tudier. Cette raction met en vidence les IgM et les IgG. Elle est la plus prcocement positive au cours de la maladie (environ 10 15 jours aprs le dbut). C'est une bonne mthode de diagnostic de la brucellose aigu, mais elle se ngative rapidement. Elle est parfois ngative dans les brucelloses subaigus et presque toujours ngative dans les brucelloses chroniques. bl Interprtation Une agglutination 1/80 est positive. Mais une agglutination un titre infrieur doit tre considre comme suspecte d'une brucellose au dbut ou au dclin, et faire pratiquer un nouvel examen une ou deux semaines plus tard.
EXPRESSION DU SERODIAGNOSTIC DE WRIGHT en Units Internationales Pour pouvoir comparer valablement les rsultats obtenus dans diverses rgions, la ncessit s'est impose de prparer des antignes brucelliques d'agglutinabilit identique et donc de disposer d'un srum agglutinant talon. Pour exprimer le srodiagnostic de Wright en Units Internationales, il faut disposer d'un talon 1 000 Units, que l'on manipule en parallle avec les srums tudier. On note, d'une part, le titre obtenu avec l'talon et, d'autre part, avec un srum, et l'on pratique une rgle de trois : Titre en UI = 1 000 x inverse du titre du srum tudier Inverse du dtre du srum talon obtenu Exemple : Titres obtenus : srum talon . . . . . . 1/1280 srum tudi...... 1/640 Titre en UI du srum tudi : 1 000 x 640 =500 Units 1 280 En notation unitaire, on considre que le srodiagnostic est positif pour un titre S 100 UI._____

cl Causes d'erreurs - Faux positifs De fausses agglutinations peuvent tre dues la parent antignique entre les Brucella et d'autres bactries ; Yersinia enterocolitica srotype 09, Vibrio cholerae (vaccination), Francisella tularensis et rarement Escherichia coli 0 157. Chez les anciens mlitococciques, le taux d'agglutination peut s'lever d'une faon transitoire la suite d'une infection banale ou d'une vaccination htrologue. L'injection de mlitine ne semble pas modifier le taux des agglutinines antibrucelliques dans le srum d'un patient. Cependant, il est prudent d'effectuer le prlvement pour srodiagnostic avant l'intradermoraction.
- Faux ngatifs

Recherche d'anticorps bloquants. Des anticorps bloquants ou incomplets apparaissent dans le srum de quelques malades, surtout la phase de brucellose chronique. Ce sont des IgA ou des IgG qui bloquent les sites antigniques la surface des bactries utilises pour le srodiagnostic de Wright, sans provoquer d'agglutination. Le srodiagnostic de Wright apparat comme ngatif chez ces malades.

302

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

Un srodiagnostic de Wright ngatif doit faire rechercher les anticorps bloquants soit par la mthode indirecte de Coombs, soit par un blocking-test . Ce procd consiste ajouter dans les tubes du srodiagnostic de Wright rests ngatifs, une goutte de srum positif. S'il ne s'y produit pas d'agglutination c'est qu'elle est inhibe par les anticorps bloquants fixs sur les Brucella. 2. preuve l'antigne tamponn (EA.T.) ou raction l'antigne au Ros de Bengale ou Card-Test. C'est une raction rapide d'agglutination sur lame. Elle utilise une suspension en milieu acide tamponn de Brucella inactives et colores par le ros bengale. Ne mettant en vidence que les IgG, cette raction est positive un peu plus tardivement que le srodiagnostic de Wright, mais elle est trs sensible et reste plus longtemps positive. Sa bonne spcificit et sa simplicit en font une raction trs utile pour les enqutes pidmiologiques.
TABLEAU n MTHODE DE DIAGNOSTIC DE LA BRUCELLOSE EN FONCTION DU STADE DE LA MALADIE Stade de lii brucellose Aigu Subaigu ou focalise Chronique Hmocultures +++ + Wnght E.A.T. ou Ros Bengale +++ Fixation du complment +++ Immunofluorescence +++ + Intradermoraction + +++

+ +++

3. Raction de fixation du complment De mise en oeuvre dlicate, la raction de fixation du complment met en vidence les IgG. Elle est donc, elle aussi, plus tardivement positive et reste plus longtemps positive. Pour les srums ngatifs en agglutination et prsentant des taux gaux ou suprieurs 1/10 en fixation du complment, la brucellose semble devoir tre incrimine. Cependant cette raction peut tre faussement positive dans les mmes circonstances que le srodiagnostic de Wright. 4. Immunofluorescence indirecte Cette raction se positive un peu plus tardivement que la sro-agglutination de Wright. Elle est trs utile dans les brucelloses chroniques, car elle dcle encore la prsence d'anticorps alors que les autres ractions sont devenues ngatives. La relative complexit de la manipulation lui font prfrer pour les enqutes pidmiologiques l'preuve l'antigne tamponn, beaucoup plus simple. 5. Contre-immunolectrophorse Contrairement aux techniques ci-dessus qui utilisent des antignes lipopolysaccharidiques, cette technique utilise un antigne protique extractible de Brucella qui est trs spcifique.

ChapiireXXV-flrucrifa____________________________________________________303

B - Intradermoraction La mise en vidence de l'allergie brucellienne par intradermoraction peut tre le seul signe biologique d'une brucellose chronique.
1. La mlitine de Burnet

La mlitine de Bumet est un filtrat de culture en bouillon de Brucella melitensis. L'injection intradermique (0,1 ml) se fait la face antrieure de l'avant-bras. Pour viter la cause d'erreur due une hypersensibilit aux protines du bouillon qui a servi la prparation de la mlitine, on pratique l'autre avant-bras une injection tmoin de bouillon, qui doit rester ngative. La lecture se fait de 24 48 heures aprs l'injection. Une raction positive se caractrise par une zone rythmateuse et un dme local pouvant s'apprcier au toucher. Il ne faut pas tenir compte d'une raction prcoce et fugace. L'apparition d'une allergie la mlitine est plus tardive que celle des agglutinines sanguines. Une intradermoraction la mlitine positive persiste trs longtemps aprs la gurison de la maladie, et souvent toute la vie. Elle ne signifie pas obligatoirement une maladie active.
2. La fraction phnol-soluble

Cette fraction est extraite d'une souche dlipide de B. abortus. Elle est utilise comme antigne par voie intradermique pour dpister l'tat allergique d'un sujet vis vis de la brucellose. Utilisable pour le diagnostic de la maladie, ce test intradermique est prconis pour les sujets exposs candidats la vaccination. VIII - TRAITEMENT A - Formes aigus et formes focalises Les cyclines sont trs actives cause de leur bonne pntration dans les cellules. Les souches de Brucella rsistantes sont rares. Les autres antibiotiques actifs sont : streptomycine, rifampicine, chloramphnicol et sulfamides. Le traitement usuel, dont la dure est de six semaines, associe la doxycycline la rifampicine. Il a prouv une meilleure efficacit que l'ancienne association ttracycline et streptomycine. B - Formes chroniques L'antignothrapie est la seule efficace dans ces formes. Une dsensibilisation doses progressives est faite en utilisant : - soit une suspension de B. melitensis tues par chauffage, injecte par voie sous-cutane ; - soit la fraction antignique phnol-insoluble injecte par voie intra-dermique. IX - PRVENTION L'incidence de la brucellose humaine est fonction de l'importance de la maladie dans le cheptel et de la prophylaxie de la maladie animale. Les mesures prventives sont :

304

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

dpistage des animaux contamins (par examen srologique et contrle des produits laitiers) ; abattage des animaux malades ; vaccination des femelles jeunes. chez l'homme, la vaccination des professionnels exposs est conseiller. Les vaccins tus ou vivants sont aujourd'hui remplacs par l'emploi de fractions antigniques mieux tolres et provoquant une bonne immunit. L'extrait antignique, appel fraction PI (phnol-insoluble), extrait de la paroi de B. melitensis et constitu de glycoprotines, confre une immunit de 18 mois environ. La vaccination ne doit tre effectue qu'aprs l'exclusion d'une atteinte brucellique par dpistage de l'tat allergique du sujet vis--vis de la brucellose.

BIBLIOGRAPHIE
BERTRAND A., SERRE A., JANBON F., VENDRELL J. P., Aspects immunologiques de la brucellose : tude volutive et valeur pratique de diverses explorations biologiques , Md. Mal. Inf-, 1982, 12, 582-587. LAUDAT P., AUDURIER A., CHOUTET P. et al., Srologie de la brucellose : valuation comparative des ractions d'agglutination, de fixation du complment, d'immunofluorescence indirecte et de la contre-immunolectrophorse , Med. Mal. Infect., 1987,17, 58-61. STASKWICZ J., LEWIS C.M-, COLVILLE J., ZERVOS M., BAND J., Outbreak of Brucella melitensis among microbiology laboratory workers in a community hospital. J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 287-290. YOUNG E. J., Human brucellosis , Rev. Infect. Dis, 1983,5. 821-842.

Chapitre XXVI LEGIONELLA


HISTORIQUE
L'histoire de la dcouverte de ce nouveau genre bactrien constitue un modle de recherche pidmiologique et bactriologique par la remarquable organisation de l'enqute ralise sur le terrain et les moyens dploys. Du 21 au 24 juillet 1976 a eu lieu l'Htel Bellevue-Stratford de Philadelphie, le 58e congrs de l'American Lgion (anciens combattants). Parmi les 4400 participants, 182 personnes (lgionnaires et accompagnants) furent atteintes de pneumopathie, 15,9 % en moururent. Seize autres personnes prsentrent des formes asymptomatiques dcouvertes a posteriori. Des cas identiques (appels pneumonies de la grand-rue ) furent observs chez des personnes qui n'taient pas entres dans l'htel, mais s'taient trouves dans la rue proche durant le mme mois de juillet ; de mme, d'autres cas furent observs chez des participants d'autres reunions dans le mme htel. La notion d'pidmie n'apparut pas tout de suite car la plupart des cas ne se dclarrent qu'aprs la fin du congrs et ce n'est que trois jours plus tard que les praticiens de la ville alertrent les services sanitaires, dclenchant ainsi une vaste enqute pidmiologique. Il apparut alors que la contamination s'tait faite par voie arienne dans le hall de l'htel ou sur le trottoir. L'agent causal, infectieux ou non, fut alors activement recherch. On chercha ainsi longtemps un mtal ou un autre agent toxique dans les tissus des sujets dcds ; d'autre part, on employa 14 types de milieux bactriologiques ou mycologiques et 13 types de cultures cellulaires afin de mettre en vidence un ventuel agent infectieux. Finalement, le 18 janvier 1977, Mac Dade et coll. annoncrent qu'une bactrie Gram ngatif avait t isole de fragments pulmonaires provenant de 4 des sujets dcds. Ces broyais de poumon furent inoculs, par voie pritonale, des cobayes qui prsentrent en quelques jours une maladie fbrile mortelle. Les examens de frottis de foie et de rate montrrent de nombreux bacilles et l'inoculation d'un broyt de ces organes dans la membrane vitelline d'oeufs embryonns entrana leur mort en 4 6 jours. Le rle tiologique de cette bactrie dans l'pidmie de Philadelphie fut dmontr par immunofluorescence indirecte sur des srums de convalescents de la maladie. Ultrieurement, des enqutes srologiques rtrospectives permirent de rattacher cette maladie plusieurs pidmies de pneumopathies aigus inexpliques. En 1974 Philadelphie, vingt personnes participaient un congrs l'Htel Bellevue-Stratford, onze dveloppaient une pneunopathie svre, deux en dcdaient. En 1973 Benidorm en Espagne, huit touristes cossais contractaient des infections pulmonaires, trois en mouraient. Ils avaient tous sjourn dans le mme htel en juillet. En 1965 Washington D.C., on recensait l'hpital psychiatrique Sainte-Elisabeth 81 malades atteints de pneumonie grave dont 14 dcdaient. L'infection avait touch les sujets dormant la fentre ouverte sur le parc et ceux se promenant dans ce mme parc o des travaux de terrassement taient effectus. En 1968 Pontiac, Michigan, on recensait 144 cas de maladies fbriles aigus bnignes chez les employs et les clients d'un centre de sant. L'infection tait synchronise avec la mise en marche du systme de climatisation. En 1943, Tatiock avait isol une souche de L. micdadei sous l'appellation Rickettsia-like . On constata donc qu'il ne s'agissait pas d'une maladie nouvelle. Finalement, en 1980, cette bactrie fut dnomme Legionella pneumophila.

306

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

TAXONOMIE - CLASSIFICATION Les Legionella appartiennent une nouvelle famille bactrienne : celle des Legionellaceae. La classification gnralement admise est celle de Brenner : la famille des Legionellaceae ne comporte actuellement qu'un seul genre : Legionella, avec prs d'une trentaine d'espces identifies par hybridation ADN/ADN et tude en chromatographie de partage gaz-liquide (tableau I). L'espce type est L. pneumophila qui est la plus frquente en pathologie mdicale et qui comporte 14 srogroupes. Certains auteurs mentionnent de nettes diffrences parmi les espces du genre Legionella et parlent de bactries voisines dnommes Fluoribacter (F. bozemanae, F. dumoffii, F. gormanii) Tatiockia (L. micdadei, L. maceachernii).
TABLEAU 1 PRINCIPALES ESPCES DE LEGIONELLA ACTUELLEMENT RENCONTRES EN PATHOLOGIE MDICALE OU DANS L'ENVIRONNEMENT ESPCES L. pneumophila (14 srogroupes) L. anisa L. birminghamensis L. bozemanii (2 srogroupes) L. cincinnatiensis L. dumoffii L.feeleii (2 srogroupes) L. hackeliae (2 srogroupes) L. jordanis L. longbeachae (2 srogroupes) L. maceachernii L. micdadei L. oakridgensis L. tucsonensis L. wadsworthii L. cherii L. erythra L.fairfieldensis L. gormanii L. jamestowniensis L. parisiensis L. rubrilucens L. sainthelensi L. spiritensis SOURCES D'ISOLEMENT tissu pulmonaire, circuit de refroidissement pleursie, eau chaude pneumonie tissu pulmonaire pneumonie pneumonie pneumonie pneumonie biopsie pulmonaire, eau de rivire aspiration transtrachale, pneumonie pneumonie, citerne d'eau potable sang, pneumonie pneumonie pneumonie pneumonie citerne d'eau potable circuits de refroidissement circuit de refroidissement terre terre humide circuit de refroidissement eau du robinet fontaine tang___

___

II - COLOGIE A - Habitat Les Legionella sont des bactries aquatiques banales de notre environnement naturel. On les trouve dans l'eau (chaude de prfrence) o leur survie est longue : lacs, rivires, marais, terres humides, conduites d'eau ; dans l'air : vapeur d'eau, arosols, nbulisateurs.

Chapitre XXVI -Legionella

307

L'tude des cas de lgionellose a montr que la prsence du germe est lie la proximit de travaux de terrassement, de rservoirs hydriques, d'arosols engendrs soit par les tours de rfrigration des systmes de climatisation, soit par les pommeaux de douches, les robinets grand ouverts... Ces bactries aux conditions de culture pourtant exigeantes peuvent s'y dvelopper, atteignant des concentrations de l'ordre de 106 bactries par litre. Il semble que la prsence d'une flore microscopique associe (Pseudomonas, Flavobacterium, protozoaires...) facilite la croissance des Legionella. On insiste notamment sur le rle des amibes libres (genres Acanthamoeba et Naegleri) qui, en ingrant sans les dtruire les Legionella, semblent leur fournir de parfaites conditions de survie et de dissmination. Ces bactries sont tues par une chaleur suprieure 65C et la chloration de l'eau. B - pidmiologie II a t montr que les Legionella (essentiellement L. pneumophila srogroupe 4) taient prsentes dans 60 % des prlvements d'eaux effectus en ville. Par ailleurs la prvalence des Legionella dans les pneumonies est modeste (environ 4 %), il semble donc que la notion de terrain soit trs importante. La prsence de Legionella dans un prlvement d'eau ne doit donc pas inquiter, hormis dans un service d'immunodprims (greffs, hmopathies) o la strilisation de l'eau devra tre envisage. D faut noter qu'il n'y a pas de transmission d'un individu l'autre et que le portage sain est exceptionnel. Pour surveiller les contaminations humaines, la lgionellose est aujourd'hui une maladie dclaration obligatoire (voir annexe).

III - POUVOIR PATHOGNE A - Pouvoir pathogne naturel Les infections humaines sont gnralement dues L. pneumophila (90 % des cas), les autres espces tant plus rarement en cause et leur pathognicit encore mal connue. Les lgionelloses surviennent en gnral sur un terrain particulier. Elles touchent plus souvent l'homme de plus de 50 ans, le fumeur, l'thylique, les personnes porteuses d'une affection cardiopulmonaire chronique, d'une insuffisance rnale chronique ou d'un diabte, les sujets en tat d'immunodpression cellulaire. 1. Forme clinique habituelle : la maladie des lgionnaires L'incubation dure 2 10 jours. Aprs un dbut progressif, le malade prsente la phase d'tat : un syndrome infectieux intense et une atteinte respiratoire (pneumonie extensive mal systmatise), souvent associe un panchement pleural. Dans 1/4 des cas, il existe des troubles neurologiques sans signes de focalisation (cphales, confusion mentale, crises convulsives). La ponction lombaire est le plus souvent normale. Il existe rarement une mningite, une encphalite, une polyradiculonvrite. Le mcanisme le plus souvent avanc est celui d'une toxine neurotrope. Les troubles digestifs sont frquents (diarrhes notamment).

308____________________________Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

Dans le tableau biologique, il existe souvent des signes biologiques d'atteintes hpatique et rnale ; on note aussi une hyponatrmie et une hypophosphormie. Le diagnostic de lgionellose est donc voquer devant une pneumopathie trs fbrile extensive associe des manifestations extra-pulmonaires (diarrhe) survenant sur un terrain privilgi, pour laquelle les examens bactriologiques usuels sont ngatifs.
2. Autres formes cliniques

al Lgionellose des immunodprims (lgionelloses nosocomiales) Les sujets transplants, les malades ayant une leucmie tricho-leucocytes, ou un cancer bronchique constituent des groupes trs haut risque. Pour les sujets atteints de SIDA, cancers gnitaux ou du sein, ce risque semble plus faible. L'tiologie gnralement plurimicrobienne et un terrain fragile font que l'volution est souvent trs grave avec un taux de ltalit trs lev (environ 40 %).
bl La fivre de Pontiac

C'est une atteinte bnigne des voies ariennes suprieures, cause par une souche particulire de L. pneumophila srogroupe 1. L'incubation est courte (36 heures), les clichs pulmonaires sont normaux, la gurison est spontane en quelques jours. cl Les formes inapparentes sont frquentes Les tudes srologiques montrent que plus de 10 % de la population a un taux lev d'anticorps aa-pneumophila srogroupe 1. dl Autres formes hmatologiques, rnales, crbrales, cutanes, cardiaques (valve artificielle) ou musculaires. B - Pouvoir pathogne exprimental Le cobaye inocul par voie intra-pritonale dveloppe une maladie fbrile voluant vers la mort en quelques jours. On observe pendant les 4 premiers jours une pritonite, puis le germe passe dans les vaisseaux sanguins et les lymphatiques. Des foyers de ncrose apparaissent ensuite au niveau de la rate, du foie, des poumons o l'on retrouve ces germes en grand nombre. Les bacilles sont phagocyts par les monocytes-macrophages, cellules dans lesquelles les Legionella peuvent survivre. La lyse de ces cellules immunitaires est l'origine de la dissmination microbienne. Une raction d'hypersensibilit retarde (HSR) a t mise en vidence chez des cobayes sensibiliss aprs inoculation de bactries vivantes ou tues par la chaleur. Cette HSR est dtecte par l'antigne protique commun aux divers srogroupes de L. pneumophila. Cette bactrie possde une endotoxine dont l'activit in vivo est beaucoup plus faible que celle des autres bactries Gram ngatif. L. pneumophila, L. micdadei, L. bozemanii possdent un antigne de virulence mip (macrophage infectivity potentiator) dont le gne port par un plasmide a t clone et squence.

Chapitre XXVI - Legwwlla______________________________________________________309

IV - DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DES INFECTIONS A LEGIONELLA A - Prlvements utiliss et conditions de transport La recherche peut tre effectue sur des lavages broncho-alvolaires de prfrence ou sur des ponctions transtrachales, des biopsies pulmonaires, des culots de centrifugation de liquide pleural, des hmocultures, des fragments d'organes divers, ventuellement des urines, des selles. Tous ces prlvements seront recueillis le plus strilement possible pour viter une contamination. Pour prvenir la dessication on ajoutera un peu d'eau strile (ne pas employer de srum physiologique qui risque d'inhiber la culture). De mme, lors du prlvement, il est prfrable d'viter les anesthsiques locaux (lidocane). Si le dlai de transport au laboratoire excde 30 minutes, il est conseill de conserver le prlvement + 4C. Si l'acheminement est diffr de plus de 24 ou 48 heures, le prlvement sera congel -20C au minimum. Ces prcautions sont valables pour les cultures et pour les recherches par immunofluorescence directe. B - Recherche de Legionella par immunofluorescence directe dans les produits pathologiques 1. Principe On utilise des anticorps dirigs contre les diverses espces et diffrents srogroupes de Legionella. existe galement un anticorps monoclonal spcifique de l'espce Legionella pneumophila qui reconnait un antigne protique situ sur la membrane externe de tous les srogroupes connus de L. pneumophila. Ces anticorps sont conjugus de la fluorescine. Chez un malade trait depuis moins de 3 jours, cet examen est encore possible quoique moins sensible, mais la lecture est plus difficile, les corps bactriens perdant leur morphologie habituelle. De plus il existe une fluorescence de fond due la lyse bactrienne. L'IFD peut tre pratiqu sur les produits frais ou conservs dans le formol ou dans la paraffine. 2. Ralisation pratique On effectue plusieurs frottis en couche mince, l'un est color par la technique de Gram pour appcier la flore dominante. A noter que les Legionella ne sont pas visualises par la coloration de Gram usuelle. Cette bactrie est colore au Gram en utilisant de la fuschine phnique basique. Il apparat alors Gram ngatif. Pour l'IFD on utilise gnralement 3 pools de conjugus fluorescents : - A : L. pneumophila srogroupes 1, 2, 3 et 4. - B : L. pneumophila 5 et 6, L. dumoffii, L. longbeachae 1. - C : L. gormanii, L. micdadei, L. longbeachae 2, L. bozemanii. L'examen sera dit positif si on voit plus de 5 petits bacilles franchement fluorescents (vert pomme) et ayant une morphologie typique (souvent incurvs, polymorphes). Ces bacilles sont intra et extra-leucocytaires. 3. Intrt - Limites L'intrt majeur de cette technique est sa rapidit (environ 1 h). Sa sensibilit est mdiocre et fonction du prlvement examin (30 50 %). Un examen ngatif ne doit donc pas faire liminer ce diagnostic, il est obligatoire de pratiquer des cultures.

310

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

La spcificit est bonne, mais il peut exister quelques ractions croises avec Pseudomonas, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Bacteroidesfragilis. La spcificit est amliore par l'emploi d'anticorps monoclonaux. C - Culture et isolement 1. Milieux de culture Legionella ne peut tre cultive sur les milieux usuels. Divers milieux ont t successivement utiliss. Actuellement on n'utilise plus que le Buffered Charcoal Yeast Extract additionn d'acide alpha-cto-glutarique ou BCYE alpha incub 35C sous 2,5 5 % de CO;,. Ce milieu est rendu slectif par l'adjonction de diffrents antibiotiques. On utilise le plus souvent un mlange : vancomycine, cfamandole, polymyxine B, anisomycine. Pour les prlvements de l'environnement on a prconis d'ajouter un mlange : glycine, vancomycine, polymyxine (milieu GVP).

Dans la prparation de ces milieux, il est indispensable d'apporter une attention


particulire la qualit des ingrdients et leur ordre d'adjonction ainsi qu'aux conditions de pH final qui doit tre rigoureusement compris entre 6,85 et 6,95. L'inoculation au cobaye a longtemps t utilise. Ses rsultats sont tardifs. 2. Ralisation pratique Avant l'ensemencement, il peut tre utile de dcontaminer les prlvements pluri-microbiens tels que aspirations trachales ou lavages broncho-alvolaires. Pour ce faire, le prlvement est trait par un tampon HC1 - KC1 pH 2,2. Dans le cas de contamination par Pseudomonas aeruginosa, on traitera le prlvement par la chaleur (1 2 mn une temprature infrieure ou gale 60C). Chaque prlvement est ensuite ensemenc sur 6 botes de milieu BCYE-alpha : 3 BCYE-alpha simple et 3 BCYE-alpha slectif. Chacune des botes de ces deux milieux est ensemence avec le prlvement pur, dilu 10'2 et 10"4 en eau distille afin de diminuer la concentration des inhibiteurs naturels prsents dans les produits, d'ventuels antibiotiques et de contaminants. En ce qui concerne les prlvements sanguins, Legionella peut crotre dans des milieux spciaux pour hmoculture (Bactec). 3. Isolement et identification al Morphologie et structure de la bactrie Ce sont des bacilles courts ou des cocco-bacilles de 1 2 p.m de long sur 0,5 0,7 p.m de large, arobies stricts. In vitro, on observe des bactries filamenteuses (jusqu' 100 u.m de long). Ils sont mobiles par un flagelle polaire unique. In vivo, ils peuvent tre intracellulaires. bl Caractres culturaux II s'agit d'un bacille de culture difficile ne poussant que lentement (2 15 jours en moyenne, voire plus dans les hmocultures). La croissance est optimale pour une temprature de 35C, les limites se situant entre 25 et 48C.

Chapitre XXVI -Legtonella_____

______

_________

_____

311

C'est un germe arobie strict, exigeant en cystine et en fer, qui pousse mieux en prsence de 2,5 5 % de CO^. Les botes de Ptri seront examines tous les jours (pendant 15 jours) la loupe binoculaire. Quand les colonies apparaissent, elles ont un aspect typique dit en verre frite et peuvent tre pigmentes (du bleu au ros selon les espces), pigment plus intense en lumire UV. Cet aspect typique, mais non spcifique n'est gnralement observ que pendant 24 h. Toutes ces colonies seront prleves et rensemences sur BCYE-alpha dpourvu de cystine et sur glose au sang. Une identification du genre Legionella peut alors tre faite quand les arguments suivants sont runis : - aspect typique de culture sur BCYE-alpha, - absence de culture sur BCYE-alpha dpourvu de L-cystine, sauf pour L. jordanis et L. oakridgensis. - absence de culture sur glose au sang. L'identification de l'espce peut parfois tre ralise l'aide de diffrents caractres biochimiques. On retiendra de l'espce un caractre toujours positif (la catalase) et des caractres toujours ngatifs : acidification des hydrates de carbone, nitratase, urase (tableau II). La confirmation ncessitera souvent l'analyse des acides gras ramifis en chromatographie en phase gazeuse (GLC), des ubiquinones en CLHP, voire l'tude du gnome par hybridation ADN/ADN.
TABLEAUn CARACTRES D'IDENTIFICATION DES PRINCIPALES ESPCES DE LEGIONELLA Oxydase Gladnase B-lactamase Hydrolyse de l'hippura te + faible Besoin en cystine + + + + + + + + + + + + +

L. pnewnophila L. longbeachae L. oakridgensis L. micdadei L. dermoffii L. gormaii L. bozemanii L. jordanis L. wadsworthii L. anisa L.feelei L. sainthelensi L. birminghamensis L. cincinnatiensis L. maceachernii

+ + + + + +

+ + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + -

cl Intrt de l'isolement Seul l'isolement du germe permet une certitude diagnostique absolue. De plus, l'isolement de Legionella constitue le seul argument diagnostique biologique lorsque l'IFD et la srologie sont ngatives. La comparaison des souches isoles chez les malades et dans leur environnement a un intrt pidmiologique majeur pour dterminer l'origine exacte de la contamination.

312

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

D - Srologie par immunofluorescence indirecte (IFI) 1. Principe L'antigne est, soit Legionella cultive sur oeuf embryonn et tue par le formol (antigne de Taylor, le plus utilis en Europe en raison de sa plus grande sensibilit), soit Legionella cultive sur milieu artificiel et tue par le formol et la chaleur (antigne de Wilkinson). L'antigne est fix par l'actone sur lame. La technique utilise est celle de l'IFI habituelle en utilisant un conjugu fluorescent anti-gamma-globulines humaines totales.
2. Ralisation pratique

On prlve un premier srum le plus tt possible, puis un srum tous les 8 jours (pendant 6 8 semaines parfois) pour observer une ventuelle sroconversion parfois tardive. Compte-tenu du nombre d'espces et de srogroupes de Legionella, il est matriellement impossible de tester en routine les srums vis--vis des antignes correspondant toutes les espces de Legionella connues. Cette tude srologique est facilite par l'existence de ractions croises entre diffrents srogroupes de L. pneumophila et des ractions croises entre diffrentes espces de Legionella. En pratique, on utilise des pools d'antignes : L. pneumophila 1 4 et 5-6 ainsi que l'antigne monovalent L. pneumophila 1. En cas de positivit vis--vis d'un pool d'antignes, un titrage est effectu vis--vis de chacun des antignes monospcifiques. Pour L. pneumophila et en utilisant l'antigne de Taylor, le diagnostic est considr comme certain lorsque le titre d'anticorps s'lve de moins de 1/16 plus de 1/646 et comme trs probable lorsque le titre est stable 17128e3. Intrt

II permet souvent de confirmer une suspicion clinique du diagnostic et est parfois le seul moyen de confirmer un diagnostic. La sensibilit avoisine 80 %. Avec l'antigne de Taylor, la spcificit est bonne. Il est noter qu'il existe des faux positifs (Chiamydia et Mycoplasma, Pseudomonas). La recherche d'IgM n'a pas d'intrt pour cette srologie. E - Autres techniques 1. Dtection des anticorps par agglutination sur lame Cette technique facile d'emploi est intressante pour L. pneumophila avec des rsultats proches de l'IFI ; mais il existe de nombreuses ractions croises entre les autres espces de Legionella.
2. Dtection des antignes solubles par ELISA

Les antignes solubles de L. pneumophila 1 peuvent tre dtects dans le srum et les urines l'aide d'un test ELISA utilisant des anticorps polyclonaux et monoclonaux. La sensibilit dans les urines est proche de 80 % et la spcificit de l'ordre de 99 %.

ChayaeXXVI-Legiom-lla

_______

____ ____________

_______

313

3. Autres mthodes de dtection L'amplification gnique in vitro pourrait aboutir prochainement une amlioration du diagnostic direct de cette bactrie.
V - TRAITEMENT - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES

In vitro, L. pneumophila est sensible la rifampicine, au cfotaxime, l'rythromycine, aux aminosides, aux ttracyclines, au chloramphnicol, aux pnicillines, aux nouvelles quinolones. Ce germe produit souvent une bta-lactamase active sur les cphalosporines. Ces donnes ne concident pas avec les rsultats cliniques et le traitement classique est bas sur l'rythromycine par voie intra-veineuse actuellement associe la rifampicine. Les fluoroquinolones sont de plus en plus employes seules ou en association.

CONCLUSION
Les Legionella reprsentent actuellement 5 10 % des tiologies des pneumopathies atypiques, et sont ce titre responsables d'une volution dfavorable chez un certain nombre de patients immunodprims. Leur isolement est actuellement la porte de tout bon laboratoire qui veut s'en donner les moyens. Par contre, cet isolement tant long et fastidieux, il faut que ces demandes d'examen soient justifies par une relle suspicion clinique.

BIBLIOGRAPHIE
BORNSTEIN N., MARMET D., SURGOT M., FLEURETTE J., Le diagnostic bactriologique et srologique des lgionelloses , Annales du Contrle de qualit national en bactriologie, 1989. BRENNER D.J. et al., Ten new species of Legionella , Int. J. Syst. Bacteriol., 1985, 35, nl,
50-59.

DESPLACES N., NAHAPETIAUX K., DOURNON E., Inventaire des Legionella dans l'environnement parisien , Presse Md., 1984,13, n 31, 1875-1879. DOURNON E., BURE A., DESPLACES N., MEYOHAS M. C., CHRISTOL D., Le diagnostic biologique de la maladie des Lgionnaires en 1983 , Md. et Hyg., 1983, 41, 1017-1024. EDELSTEIN P. H., Environmental aspects of Legionella , ASM News, 1985, 51, 9, 460-467. EDELSTEIN P. H., Laboratory diagnosis of infections caused by Legionellae , Eur. J . Clin. Microbiol., 1987, 6, 4-10. FLEURETTE J., Lgionellose , EMC Paris, Maladies Infectieuses, 1982, 8021 A10, 4. MAHBUBANI M.H., BEJ A.K., MILLER R., HAFF L., DICESARE J-, ATLAS R.M.. Dtection of Legionella with polymerase chain reaction and gne probe methods , Mol. Cell. Probes, 1990,4, 175-187. WINN W.C., Lgionnaires disease : Historical perspective , Clin. Microbiol. Rev., 1988, 1, 60-81. A signaler : "Colloque Legionella" Lyon Mai 1987, OMS - LNS - SFM, (J. Fleurette, N. Bomstein, D. Marmet, M. Surgot eds). Collection Fondation Marcel Mrieux, 379 p. "Legionella" Proceedings of th 2nd International Symposium. (C. Thomsberry, A. Balows, J.C. Feeley, W. Jakubowski eds), American Society for Microbiology, Washington D.C., 1984, 371p.

Chapitre XXVII BORDETELLA

HISTORIQUE
En 1900, Bordet dcrivait un bacille Gram ngatif comme agent de la coqueluche. En 1906, Bordet et Gengou ont russi faire pousser ce bacille sur un milieu glose pepton base de pomme de terre et additionn de sang. La coqueluche a t longtemps une cause importante de mortalit infantile. La vaccination a permis de faire disparatre en France cette cause de mortalit. Nanmoins des pidmies pourraient rapparatre si la vaccination n'tait pas suffisamment applique.

I - DFINITION ET CLASSIFICATION Les Bordetella sont des coccobacilles (0,5 1 |J.m de long et 0,2 0,4 u.m de large) Gram ngatif, disposs seuls ou par paires mais rarement en courtes chanettes ; - arobies stricts, mtabolisme respiratoire ; - ne fermentant aucun hydrate de carbone et ne produisant pas de gaz ; - exigeants en nicotinamide et en drivs soufrs (cystine), mais pas en facteur X ou V ; - leur G + C % est compris entre 61 et 70 ; - ayant un tropisme pour les muqueuses respiratoires des mammifres. Trois espces principales, dont l'homologie ADN/ADN est trs voisine, sont rencontres chez l'homme : B. pertussis, B. parapertussis et B. bronchiseptica. B. aviwn est une espce isole chez les dindes et les dindonneaux. II - POUVOIR PATHOGNE La coqueluche, maladie infectieuse des voies respiratoires suprieures, est gnralement due B. pertussis. Aprs une incubation silencieuse d'environ une semaine, la priode d'invasion est marque par un catarrhe rhino-trachobronchique qui constitue la phase la plus contagieuse. Elle est suivie par la priode des quintes o le diagnostic clinique est vident en raison de la toux paroxystique (chant du coq). Atteignant surtout les jeunes enfants, la coqueluche chez le nourrisson de moins de 3 mois est une maladie grave parfois mortelle, la mort survenant par asphyxie. Les infections secondaires et les complications neurologiques sont redouter. B. parapertussis peut aussi tre responsable de syndromes coquelucheux.

Chapitre XXVH - Bordetella______________________________________________________315

B. bronchiseptica est un pathogne des voies ariennes suprieures des animaux domestiques, responsable de la rhinite atrophique du porc. Rarement isole chez l'homme, cette bactrie provoque des pseudocoqueluches. III - HABITAT - PIDMIOLOGIE B. pertussis a comme rservoir unique l'homme. On pense que des adultes immuns puissent tre les porteurs du bacille au niveau de leur muqueuse oro-pharynge et le transmettre ainsi des enfants non immuniss. La contamination se fait par voie arienne. La coqueluche volue selon un mode endmo-pidmique. Dans les pays o la protection vaccinale est bonne, les pidmies sont rares. Par contre dans les pays o le taux d'immunisation des enfants est faible (infrieur 50 %), des pidmies importantes peuvent survenir. Plus de 100 000 cas de coqueluche ont t observs en Grande-Bretagne en 1977. En 1982 plus de 1 000 cas par semaine y taient notifis. En France on estime 1000 par an le nombre de cas de coqueluche hospitaliss. Il s'agit d'enfants de moins de un an. On a constat une recrudescence de la coqueluche en Australie partir de 1987. L'incidence de la coqueluche dans les pays europens a diminu en grande partie grce la vaccination alors que cette maladie serait en augmentation aux USA. B. pertussis a aussi t isole fortuitement chez des malades atteints de Sida dont les scrtions bronchiques avaient t ensemences sur milieu BCYE pour recherche des Legionella. IV - PHYSIOPATHOLOGIE La coqueluche, toxi-infection B. pertussis est une maladie essentiellement broncho-pulmonaire, le bacille a un tropisme pour les cellules cilies de l'pithlium respiratoire. Les bactries adhrent aux cils vibratiles des cellules, provoquent une paralysie des cils et une activation des scrtions muqueuses. Les cellules lses et les scrtions sont limines par la toux. A la phase d'tat de la maladie, il n'y a plus de B. pertussis viables dans les scrtions. Les signes cliniques observs sont alors dus des facteurs de virulence librs par la bactrie. B. pertusis possde plusieurs antignes, un antigne capsulaire polyosidique, un antigne somatique thermostable correspondant l'endotoxine des bactries Gram ngatif. Plusieurs facteurs de virulence sont produits : la toxine pertussique (PT), c'est une toxine protique libre partiellement par le germe (diffrents synonymes ont t employs pour dsigner cette toxine, refltant ses diverses activits : HSF, histamine-sensitizing factor, LPF, lymphocytosis-promoting factor et IAP, islet-activating protein). Cette protine oligomrique de 117 kDa agit sur diffrentes cellules eucaryotes en augmentant la concentration intra-cellulaire de l'AMPc (en particulier dans les cellules pithliales du tractus respiratoire). Elle agit sur le site rgulateur ngatif ( G-protine) de l'adnylate-cyclase membranaire en levant l'inhibition de cette enzyme par une raction d'ADP-ribosylation. Elle provoque une hyperlymphocytose qui est un signe clinique important dans cette maladie. l'adnylate-cyclase exocellulaire de B. pertussis est excrte sous la forme d'une protine de 200 kDa dont un fragment de 43 kDa correspond l'adnylate-cyclase, les autres parties possdant des fonctions de fixation et d'intemalisation, elle possde

316

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

une activit hmolytique, elle est active par la calmoduline intra-cellulaire. Son rle essentiel est d'augmenter le pool d'adnylate-cyclase intra-cellulaire et de diminuer les fonctions phagocytaires des polynuclaires et des macrophages. les hmagglutinines sont impliques dans l'attachement de B. pertussis aux cellules pithliales. L'hmagglutinine filamenteuse ou FHA, est porte par des pili. d'autres toxines ont t dcrites : une toxine dermoncrotique (HLT = heat labile toxin), une cytotoxine trachale (TCT = trachal cytotoxin) agissant sur les cellules

cilies.
V - DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE LA COQUELUCHE A - Isolement et identification de B. pertussis 1. Le prlvement II doit tre prcoce, ds l'apparition des premiers signes cliniques. En effet, les bactries se rarfient ds l'apparition des quintes. Le recueil des mucosits se fait soit l'aide d'un couvillon souple en alginate de calcium ou en dacron, introduit par la narine jusqu' la fosse nasale postrieure, soit l'aide d'une sonde souple monte sur une seringue. Les autres mthodes de recueil sont dconseiller car elles donnent des rsultats trs infrieurs.

SCHMA RECUEIL DES MUCOSITS

2. Milieu de culture Les milieux de culture doivent tre ensemencs sans dlai, au lit du malade ou dfaut en utilisant un milieu de transport (milieu de Regan et Lowe ou Stainer et Scholte). Au sortir de l'organisme, B. pertussis ne pousse pas sur glose ordinaire. - Le milieu de Bordet-Gengou C'est un milieu glose empirique constitu d'une infusion de pomme de terre, de glycrine et de NaCl auquel est ajout 15 % de sang frais strile d fibrine de cheval, de mouton ou de lapin. Le rle du sang est de neutraliser certains inhibiteurs de la croissance de B. pertussis, tels les acides gras. Dans le milieu de Regan on ajoute galement du charbon activ.

Chapitre XXVH - Bordetella______________________________________________________317

Le milieu peut tre rendu slectif par addition de mticilline la concentration finale de 2,5 Ug/ml ou mieux de la cfalexine la concentration finale de 40 (Ag/ml. Il existe galement un milieu synthtique liquide, le milieu de Stainer et Scholte. - Incubation Elle se fait 35-36C pendant 7 jours. Il est important d'utiliser un systme permettant d'viter la dessication de la glose (ruban adhsif, papier d'aluminium ou jarre) pour raliser une atmosphre humide favorable la croissance. 3. Observation des colonies B. pertussis pousse lentement. Les colonies apparaissent rarement avant le 3e jour d'incubation. - Au sortir de l'organisme les colonies sont minuscules, lisses, bombes, ont un aspect en gouttes de mercure . Elles s'entourent progressivement d'une zone d'hmolyse. Cela correspond la phase I. Les colonies sont smooth et les corps bactriens coccodes. - Aprs repiquage, les colonies prennent un aspect rugueux et poussent sur glose ordinaire. Cela correspond la phase IV, ou formes rough. Les corps bactriens peuvent tre filamenteux. 4. Identification de B. pertussis L'identification est dlicate compte tenu de nombreux caractres ngatifs pour ce bacille. La recherche de l'oxydase est positive. Les diffrents caractres sont indiqus dans le tableau. L'identification peut tre complte ou confirme par un test d'agglutination sur lame utilisant un srum anti B. pertussis. De mme, on peut identifier B. pertussis par immunofluorescence directe partir des colonies. Il a t dcrit une aide l'identification par la dtermination des acides gras cellulaires par chromatographie en phase gazeuse. B - Autres mthodes de diagnostic - L'immunofluorescence directe. Faite sur les mucosits, c'est un examen qui a l'avantage de la rapidit de la rponse, mais son interprtation demande de l'habitude et il est moins sensible que la culture. L'interprtation est dlicate et sujette des erreurs, elle est fonction de l'exprimentateur. Il peut y avoir des faux positifs (raction croise avec Legionella) et des faux ngatifs. On peut trouver 70 % de positivit dans les formes datant de moins de 3 semaines et seulement 10 % aprs la prise d'rythromycine. -La mise en vidence des anticorps sriques est un examen dont le rsultat tardif a peu d'intrt pour le diagnostic. Un test ELISA a t dvelopp mais ne peut remplacer la culture et il faut remarquer que cette technique est trs peu performante chez les enfants de moins de 4 mois. Une recherche des IgA anti B. pertussis a t propose partir des scrtions rhinopharynges. - La recherche de l'adnylate cyclase produite par le germe (A) Elle est ralise partir du frottis naso-pharyng, immerg immdiatement pendant quelques secondes dans le milieu de Stainer et Scholte auquel sont ajouts de l'ATP et de la calmoduline. Le milieu est incub 18 heures 37C : l'AMPc form est mesur par une mthode de radiocomptition. Cette mthode, rcemment introduite, est sensible, fiable et surtout rapide. Elle est d'une grande utilit pour le diagnostic de coqueluche chez les nourrissons de moins de 3 mois et les enfants immunodprims.

318

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

Les perspectives de diagnostic s'amlioreront avec la mise en vidence dans les prlvements de PT ou/et FHA l'aide d'anticorps monoclonaux et l'apport de sondes oligonuclotidiques de synthse (gnes de PT ou FHA) et par amplification gnique in vitro (PCR).
TABLEAU
TEST

B. pertussis 3-5 jours -a + -

B. parapertussis 2 jours -a + -

B. bronchiseptica Ijour + + + + +

Dlai de croissance sur milieu de Bordet-Gengou Croissance sur glose nutritive Mobilit Oxydase Urase Nitrate-rductase

a) : Seuls les variants avirulents se dveloppent ; ils produisent un brunissement du milieu dans le cas de B. parapertussis.

VI - AUTRES BORDETELLA A - Bordetella parapertussis Elle se caractrise par : - sa croissance plus rapide (36 48 heures) sur glose de Bordet-Gengou avec un halo d'hmolyse net - une urase (24 h) - une subculture plus facile sur glose nutritive ou en bouillon - un brunissement de la glose de Bordet-Gengou due la prsence d'une tyrosinase. B - Bordetella bronchiseptica Se reconnat par : - sa croissance facile et rapide (24 h) sur glose ordinaire - la croissance sur glose de Mac Conkey - la culture sur milieu au citrate de Simmons - sa mobilit due une ciliature pritriche - la rduction des nitrates en nitrites (milieu supplment en NAD) - la prsence d'une urase trs active (1 4 h), ce qui la distingue de Alcaligenes. Des souches responsables de rhinotrachite du dindon ont t dsignes comme B. bronchiseptica-like . Elles se distinguent par l'absence de nitrate-rductase en milieu classique(mais cette raction est positive si on ajoute du NAD) et d'urase. Elles sont aujourd'hui dsignes comme B. avium. VII - VACCIN ANTICOQUELUCHEUX A - Prparation et modalits d'administration C'est une suspension contenant 5 milliards de B. pertussis par ml, inactive par un chauffage 56C.

Chapitre XXVII - Bordetella______________________________________________________319

II peut tre administr l'enfant ds l'ge de 3 mois (entre le 3e et le 6e mois) en sous-cutane profonde raison de 3 injections espaces d'un mois et un rappel aprs un an. Il peut tre associ d'autres vaccins. B - Efficacit La vaccination a pratiquement fait disparatre en France les pidmies de coqueluche et la mortalit due cette maladie. Le vaccin confre une immunit de 3 4 ans dont la qualit peut varier d'un lot de vaccin l'autre. Il entrane une augmentation des agglutinines, mais il n'y a pas de paralllisme avec le degr de protection. La couverture vaccinale est de 80 95 % aprs 3 injections. C - Critres d'activit Cette activit est juge classiquement par une preuve de survie de souris immunises aprs injection intracrbrale de B. pertussis. L'activit d'un lot de vaccin est compare celle d'un vaccin de rfrence par la mesure de survie chez des souris immunises. Elle s'exprime en units internationales et doit tre suprieure ou gale 4 UI. Un modle de protection de la souris contre une infection respiratoire par arosol a t mis au point plus rcemment. Il permet de juger de l'efficacit des antignes protecteurs. D - Inconvnients et contre-indications Le vaccin anticoquelucheux peut entraner des ractions locales ou gnrales (fbricule). Mais ce sont les accidents neurologiques (encphalopathies), dont le risque est valu environ 1 pour 300 000 vaccins, qui sont la cause de dsaffection pour ce vaccin dans certains pays. Le risque d'accident vaccinal grave est nettement infrieur au risque de mortalit par la coqueluche. Les antcdents neurologiques, mme de simples convulsions hyperpyrtiques sont une contre-indication la vaccination. E - Perspectives Le vaccin actuel constitu par des corps bactriens entiers inactivs est efficace mais empirique. L'emploi de fractions bactriennes plus immunognes et mieux tolres comme la toxine pertussique ou l'hmagglutinine filamenteuse est toujours en cours d'tude. Deux vaccins acellulaires sont dvelopps, l'un au Japon, l'autre en France, bass principalement sur deux antignes FHA et toxine dtoxifie, leur efficacit srologique est certaine mais la valeur protectrice des anticorps est difficile apprcier en raison de la difficult de comparer deux populations et de la rgression du nombre de cas de coqueluche. VIII - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES L'antibiothrapie n'a pas une influence significative sur l'volution d'une coqueluche dclare dont les signes cliniques sont dus des facteurs toxiques plus qu' la prsence de bactries. B. pertussis est rsistant la pnicilline et la bacitracine.

320

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

Les antibiotiques actifs in vitro sont : l'rythromycine, la rifampicine, les ttracyclines, les cphalosporines de 3e gnration, le chloramphnicol, les fluoroquinolones, le co-trimoxazole et la gentamicine. Il semble que l'rythromycine soit l'antibiotique le plus actif pour prvenir l'infection chez des sujets qui ont t en contact avec des coquelucheux.

BIBLIOGRAPHIE
ALONSO J.M., BREZIN C., RAY B., Bordetella pertussis et la coqueluche , Bull. Inst. Pasteur, 1985,83, 19-31. ALONSO J.M., Le diagnostic bactriologique des infections Bordetella , Md. Mal. Infect., 1986, 16, 432-435. FRIEDMAN R.L., Pertussis : th disease and new diagnostic methods , Clin. Microbiol. Rev., 1988,1, 365-376. GILLIGAN P.H., FISHER M.C., Importance of culture in laboratory diagnosis of Bordetella pertussis infections , J . Clin. Microbiol., 1984, 20, 891-893. HALPERIN S.A., BORTOLUSSI R., WORT A.J., Evaluation of culture, immunofluorescence, and serology for th diagnosis of pertussis. J . Clin. Microbiol., 1989, 27, 7'52-757. MICHEL-BRIAND Y., Bordetella in Le Minor et Vron, Bactriologie Mdicale, Flammarion, Paris, 1990, 678-691. ROBBINS J.B., Toward a new vaccine for pertussis , in Microbiology, American Society for Microbiology, Leive L. and Schlessinger D-, Editors, Washington D.C-, 1984, 176-183.

Chapitre XXVffl FRANCISELLA TULARENSIS


Francisella tularensis a t isole aprs la survenue d'une maladie nouvelle, pseudo-peste de l'cureuil, observe dans le Comt de Tulare en Californie en 1911. En 1921, Francis, bactriologiste amricain, tudie l'agent causal et la pathognie et fait le rapprochement avec une maladie connue chez le lapin et les bovins depuis le dbut du sicle dans l'Ouest amricain. Il reconnat le premier cas humain aprs contamination de laboratoire.

1 - CARACTRES GNRAUX . Il s'agit d'un bacille de petite taille (0,2 x 0,2-0,7 p-m), polymorphe, Gram ngatif, coloration bipolaire et immobile. Arobie strict, sa culture est lente sur milieux spciaux enrichis. Il est catalase positive, oxydase ngative, produit du SH^ et acidifie certains sucres sans production de gaz. Le genre Francisella est constitu de deux espces : F. tularensis, agent de la tularmie et F. novicida isole une seule fois et non pathogne. II - HABITAT ET PIDMIOLOGIE La tularmie est une maladie animale occasionnellement transmise l'homme. F. tularensis a une large distribution limite l'hmisphre Nord, mais les rgions o les infections sont les plus frquentes sont l'Amrique du Nord, aux U.S.A. et l'U.R.S.S., dans les rpubliques du Sud. La bactrie a pu tre isole chez plus d'une centaine d'animaux sauvages et dans l'eau des zones o vivent ces animaux. Tous les mammifres, sauf l'homme, font une septicmie et les bactries sont prsentes partout au niveau du cadavre. En France, les cas humains surviennent dans la majorit des cas (99 %) aprs un contact avec un livre malade ou un cadavre de livre. La contamination se fait par voie cutane (la taille de la bactrie lui permettant de traverser la peau saine) ou par voie muqueuse, oculaire ou digestive (pharynge). La contamination peut survenir beaucoup plus rarement aprs piqre d'insecte, inhalation, morsure (chien, taupe,...), immersion en eau doue. La maladie est apparue dans l'Est de la France en 1946 et s'est implante dans diffrentes rgions, Alsace, Indre, Prigord o elle est observe sur un mode sporadique. La contamination humaine est lie la maladie du livre et la survenue d'pizooties. Elle sera thoriquement plus frquente en priode d'ouverture de la

322

Section VI - BACILLES GRAM NGATIF AROBIES STRICTES

chasse et des cas survenant en dehors de cette priode pourront ne jamais trouver d'explications satisfaisantes (braconnage...). La maladie est peu frquente, avec une estimation de 20 cas humains environ en France en 1986. III - POUVOIR PATHOGNE NATUREL Aprs 4-6 jours d'incubation survient une manifestation locale au point de pntration (cutan, oculaire, pharyng), plus ou moins fbrile (pseudo-grippal), accompagne d'une raction ganglionnaire. Selon la porte d'entre, diffrents tableaux sont possibles : - forme ulcro-ganglionnaire des membres, la plus frquente ; le plus souvent au niveau des membres suprieurs avec des lsions cutanes vsiculo-pustuleuses et une adnopathie axillaire volumineuse qui volue vers une suppuration strile tranante ; - forme oculaire rare, avec conjonctivite unilatrale douloureuse et adnopathie pr-auriculaire ; - forme amygdalienne, angineuse avec adnopathies sous-maxillaire et jugulocarotidienne. IV - PHYSIOPATHOLOGIE - FACTEURS DE VIRULENCE La bactrie pntre dans l'organisme par la peau ou les muqueuses, indpendamment de toute lsion. A partir de la zone de pntration o se dveloppe une petite ulcration, la bactrie infecte le systme rticulo-endothlial et gagne par voie lymphatique les ganglions satellites, forme des granulomes et des zones de ncrose (micro-abcdation), rapidement strilises avec persistance de la suppuration. La septicmie, qui est la rgle chez l'animal, n'est jamais observe chez l'homme. Dans l'organisme les souches virulentes possdent une capsule qui ne semble ni immunogne ni toxique. L'infection naturelle confre une immunit qui va persister plusieurs annes. Les anticorps agglutinants restent un titre lev pendant longtemps. V - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE - Produits pathologiques Au dbut de la maladie, la bactrie est prsente au niveau de la srosit de la lsion locale. Au niveau du ganglion la bactrie est prsente pendant un temps court et l'auto-strilisation survient aprs moins d'une semaine d'volution. B - Examen direct F. tularensis est un petit bacille Gram ngatif, coloration bipolaire, mieux visible aprs coloration de Giemsa. Les souches virulentes possdent une capsule.

C - Culture
Cette bactrie ne peut pas tre cultive sur les milieux usuels qui doivent tre enrichis avec de la cystine ou de la thiamine et des globules rouges (humains, de lapin

Chapitre XXVIII - Francisella ____

____________________

_________

323

ou de mouton) (milieu de Francis, glose ordinaire + cystine, glucose et sang de lapin) ou base de jaune d'uf. La culture est ralise 37C en arobiose et les colonies apparaissent en 2-4 jours. Les risques de contamination partir des cultures sont trs grands et imposent des prcautions particulires. En pratique, le diagnostic direct n'est jamais ralis, sauf dans des laboratoires spcialiss. D - Identification - Pouvoir pathogne exprimental En fonction de caractres biochimiques, deux biovars sont dcrits, F. tularensis biovar tularensis et biovar palaearctica. Diffrents animaux, en particulier les rongeurs de laboratoire, sont sensibles l'infection exprimentale. La souris est sensible et toutes les voies d'inoculation peuvent tre utilises y compris la voie cutane par simple friction de la peau pile. Cette technique est prcieuse pour les tudes pidmiologiques ou les recherches partir de cadavres d'animaux. E - Diagnostic indirect La recherche d'anticorps agglutinants est l'lment essentiel du diagnostic biologique. L'antigne est une suspension de bactries tues. Les anticorps apparaissent partir du 10e jour et atteignent un titre maximal en 1 2 mois (1/1000 ou plus) et vont persister pendant des annes. Il existe une parent antignique avec les Brucella et des ractions croises ont t observes lors de brucellose. Toute prsence d'anticorps agglutinants, mme un taux faible, doit tre confirme par l'examen d'un deuxime srum. La recherche de l'hypersensibilit la tularine (autolysat de bactries chauffes) aprs injection intra-dermique (tularino-raction) est spcifique mais n'est plus ralisable par manque de ractif. VI - TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE Les souches sont sensibles aux diffrents antibiotiques de la famille des aminoglycosides, aux ttracyclines, au chloramphnicol, qui sont utiliss pour le traitement. La prophylaxie repose sur l'information des personnes exposes (chasseurs, gardes chasse, braconniers !, travailleurs agricoles,...) en particulier lors de manipulation de cadavres d'animaux en zone infecte. Elle repose aussi sur la surveillance sanitaire des livres imports de pays d'Europe Centrale pour la repopulation de zones de chasse. Une protection efficace des sujets exposs est obtenue avec un vaccin base de bactries vivantes attnues (utilis en U.R.S.S.).

SECTION VH BACTERIES ANAEROBIES

GENERALITES SUR LES BACTERIES ANAEROBIES STRICTES

1 - PHYSIOLOGIE Les bactries anarobies strictes sont des bactries hypersensibles l'action de l'oxygne (anoxybiontiques). Elles produisent leur nergie et effectuent leurs ractions de biosynthse en l'absence de cet accepteur d'lectrons. La plupart (exceptions) ne possdent pas les enzymes classiques des systmes dits respiratoires : cytochromes, catalase, peroxydase. Elles, produisent leur nergie au cours de processus fermentatifs. \ Ces bactries ne poussent pas en prsence de 20 % d'oxygne, donc en prsence d'air atmosphrique. Leur degr de sensibilit l'oxygne est cependant trs variable. La plupart des anarobies strictes ayant un intrt en pathologie infectieuse sont des anarobies modres (tolrant de 0,1 5 % d'O^), d'autres ne tolrent que des pressions d'oxygne infrieures 0,1 % (bactries EOS) (extremely oxygen sensitive bacteria). Les bactries EOS tudies chez l'homme de faon trs rcente, paraissent dnues de tout pouvoir pathogne et sont des bactries commensales du tube digestif et de la peau. Elles jouent sans doute un rle important en raison de leurs potentialits mtaboliques, et auraient dans le tube digestif un rle de barrire vis--vis des autres bactries pathognes en favorisant l'quilibre de la flore intestinale. Leur tude et leur taxonomie ne rentrent pas dans le cadre de cet ouvrage.

II - MTHODES DE CULTURE ET D'IDENTIFICATION L'tude, la culture et l'identification des bactries anarobies ayant un intrt mdical demandent des milieux privs d'oxygne ou dans lesquels le potentiel redox est bas (rh). Les techniques habituelles de la bactriologie sont applicables la culture et l'identification des bactries anarobies strictes. Les techniques pour liminer l'oxygne sont varies :

326

Section VII - BACTRIES ANAROBIES

- milieux liquides ports bullition pour chasser l'oxygne (rgnration), - action du vide et remplacement par un gaz inerte, - milieux solides prrduits en atmosphre anarobie (CO^ 5 %, H^ 10 %, N^ qsp). La culture est favorise par la prsence de substances rductrices groupements thiols : thioglycolate, cystine... Le milieu tant priv d'oxygne, la culture et l'identification des bactries anarobies se poursuivent en vitant le contact avec l'oxygne de l'air ambiant : - soit dans une verrerie adapte ralisant le plus petit contact possible avec l'atmosphre : glose profonde, tube de Veillon, flacons tranglement pour hmoculture, milieux spciaux commercialiss pour hmoculture anarobie avec atmosphre inerte, - soit par adsorption sur du pyrogallol alcalin (mthode ancienne), - soit dans de petites enceintes hermtiques (mlange gazeux anarobie), jarres anarobies, - soit par des moyens modernes et plus efficaces qui se dveloppent de plus en plus dans les grands laboratoires : chambres anarobies dites chambres de Frter. L'atmosphre anarobie y est contrle : mlange ternaire CO^ 5 %, H^ 10 %, N^ qsp ; thermostate 37C en prsence de catalyseur (chlorure de palladium) pour liminer les traces de O^. Toutes les oprations bactriologiques aprs le prlvement (conserv l'abri de l'air) y sont effectues. L'atmosphre d'anarobiose continue ralise en chambre anarobie permet certainement de traiter dans les meilleures conditions les prlvements pour rechercher les anarobies. Le systme en jarres anarobies est le plus courant et le mieux adapt aux besoins d'un petit laboratoire. Cependant il faut ouvrir les jarres pour observer les cultures, les repiquer etc... d'o une mortalit importante des cultures. C'est pourquoi on prpare des poches en plastic transparent dans lesquelles on fait l'anarobiose et qui permettent l'observation des boites sans rompre l'anarobiose. Les ractions d'identification des bactries anarobies strictes font appel aux fermentations classiques d'hydrates de carbone, la mise en vidence de la production d'enzymes, la dtermination par chromatographie en phase gazeuse des produits finaux des mtabolismes fermentaires (ac. actique, propionique, iso-butyrique, butyrique, iso-valrique, valrique, iso-caproque, caproque, heptanoque) raliss partir de milieux de cultures liquides anarobies standardiss... Le pouvoir pathogne exprimental sur le cobaye ou la souris permet de reproduire, dans le cas des anarobies toxinognes, une maladie animale caractristique de la toxine labore par le germe. La neutralisation de l'effet de la toxine par un immunsrum spcifique permet le diagnostic du germe et du type de toxine, rendant ainsi possible dans certains cas d'instituer une srothrapie spcifique. III CLASSIFICATION SCHMATIQUE DES BACTRIES ANAROBIES STRICTES (ayant un intrt en Bactriologie Mdicale) (Tableau I)

A ct de nombreuses espces saprophytes, deux groupes sont l'origine de maladies chez l'homme (ni contagieuses, ni pidmiques) : - les anarobies sporules, - les anarobies non sporules.

Gnralits sur les bactries anarobies strictes

327

TABLEAU 1 APERU DE LA CLASSIFICATION DES BACTRIES ANAROBS STRICTES ET FRQUENCE D'ISOLEMENT DANS LES PRODUITS PATHOLOGIQUES D'ORIGINE HUMAINE. Bacilles Grain ngatif non sporuls 1) Bacteroides : B.fragilisetB.thetaiotaomicron tant les plus frquents, B.vulgatus, B.distasonis, B.uniformis, B.ovatus rare 2) Porphyromonas : P.melaninogenica, P.intennedia, P .asaccharolytica 3)Prevotella : P.oralis, P.buccalis et P .veroralis P.bivia, P.disiens, P.oris, P.buccae Fusobacterium F.nucleatum F .necrophorum F.mortiferwn F.varium Cocci Gram positif Peptostreptococcus P.magnus P.asaccharotyticus P.prevotii P Janaerobius Peptococcus P.niger Cocd Gram ngatif Veillonella parvula 45% Incidence 24 39 %

16 22 %

5 10 % (variable) (16% prsent essentiellement au niveau du tractus respiratoire) rares rares 13% 6 17 % 46 % 11 14 %

Bacilles Gram positif non sporuls Actinomyces (A.israelii, A.naeslundii, A.odontolyticus, A.viscosus) Arachnia sp. A.propionica Bifidobacterium B.dentium B.adolescentis Propionibacterium sp. P.acnes Eubacterium sp. E.lentum Badiles gram positif sporuls Clostridium C-perfringens C.ramosum C.difficile C.septicum C.paraputrificwn C.tertiwn C.sporogenes C.histolyticum C.novyi, C.tetani, C.botuliniim

- Anarobies sporules. Bacilles telluriques Genre Clostridium. Bactries prsentes dans le sol et pouvant survivre grce leur spore thermorsistante En pathologie on les rencontre :

328

Section VII - BACTRIES ANAROBIES

- dans les gangrnes gazeuses, - dans des intoxications et des affections o une toxine neurotrope dtermine dans l'organisme des ractions tout fait caractristiques : ttanos, botulisme. Clostridium perfringens peut tre l'agent soit de gangrnes gazeuses, soit de septicmies, soit d'entrocolites. B - narobies non sporules. Flore de Veillon La plupart des bactries anarobies strictes non sporules font partie de la flore commensale et saprophyte de l'homme. Elles constituent la flore endogne dite de Veillon, par opposition la flore prcdente d'origine tellurique. Ces bactries sont abondantes dans : - le tube digestif (majeure partie de la flore intestinale), - cavit buccale, rhino-pharynx, - partie suprieure de l'appareil respiratoire. Elles peuvent dterminer, l'occasion d'un affaiblissement des dfenses de l'organisme ou en association avec d'autres germes, soit des infections putrides, soit des septicmies. IV CIRCONSTANCES DANS LESQUELLES ON DOIT RECHERCHER DES ANAROBIES (Tableau n)

En dehors des intoxinations et toxi-infections alimentaires (botulisme et toxi-infection alimentaire C. perfringens) et en dehors du ttanos, on recherchera des germes anarobies : - dans toute hmoculture (5 10 % peuvent contenir des anarobies), - dans toute suppuration ferme surtout lorsqu'elle dgage une odeur ftide, - lorsque l'on constate du gaz au site de l'infection (crpitation, suspicion de myoncrose), - dans toute infection secondaire une morsure, une injection intramusculaire, un traumatisme, une intervention chirurgicale (chirurgie digestive, des voies gnitales, orthopdique), une thrapeutique par aminoside et/ou bta-lactamines se rvlant inefficace, - dans toute infection situe proximit d'une muqueuse (anale, buccale, gnitale), - chaque fois que dans un prlvement on trouve des germes Gram (+) ou (-) l'examen direct, mais que la culture arobie est ngative. V - FACTEURS FAVORISANT LES INFECTIONS A ANAROBIES Le potentiel redox d'un tissu normal est de -0,1 0,2 V, valeur au dessus de laquelle la croissance d'un anarobie n'est pas possible. La croissance d'un germe anarobie n'est exponentielle que lorsque ce potentiel redox est plus faible (-0,5V). Ce potentiel est abaiss par : - le dveloppement de bactries anarobies facultatives, - un apport insuffisant de l'oxygne : dans les maladies vasculaires (artrite, diabte), traumatisme avec ncrose tissulaire, hmatome, corps tranger, injection de certaines substances mdicamenteuses effet vaso-constricteur,

ff

Gnralits sur les bactries anarobies strictes

329

TABLEAU n INCIDENCE RELATIVE DES BACTRIES ANAROBIES STRICTES DANS DIVERSES INFECTIONS Incidence % Bactrimies - Septicmies Systme Nerveux central Abcs crbraux Empyme sous durai Mningites Tte et cou Sinusite chronique Abcs priodondques Infodons de la cavit buccale Sphre pleuro-pulmonaire Pneumonies d'aspiration Abcs du poumon Pneumonies ncrosantes Empymes Bronchites chroniques Infections abdominales Pritonites Abcs hpatiques Infections gyncologiques Salpingites, pritonites pelviennes Abcs tubo-ovariens Avortements septiques et endomtrites Infections des tissus mous Gangrnes gazeuses et myoncroses Cellulites Infections urinaires MD = mal document 5-10 90 50 faible 50 100 MD 80-90 90 85 75 MD 90 50 50 90 70 100 lev faible

- un facteur diminuant la rsistance de l'organisme et modifiant l'quilibre de la flore bactrienne (cancer, radiothrapie, immunodpresseurs, traitements antibiotiques inadapts).

BIBLIOGRAPHIE
Les anarobies. Actualits en 1990. Mdecine et Maladies Infectieuses. Tome 20. Numro hors srie. Dcembre 1990.

Chapitre XXIX COCCI ANAROBIES

Au sein des cocci anarobies pathognes pour l'homme, on distingue des cocci : - Gram positif : Peptococcus et Peptostreptococcus, - Gram ngatif : Veillonella. Ces espces occupent une place apprciable au sein des bactries anarobies strictes isoles en pathologie, puisque les cocci Gram positif reprsentent d'aprs les tudes franaises entre 11 et 37 % des souches anarobies rencontres en milieu hospitalier. 1 - CLASSIFICATION On distingue parmi les cocci Gram positif non sporuls quatre genres principaux se diffrenciant sur les critres regroups dans le tableau I.
TABLEAU 1 CARACTRES DIFFRENTIELS DES COCCI A GRAM POSITIF ANAROBIES Rwninococcus GC % Sucres fermentes Peptones fermentes Produc. butyrate Nombre d'espces Habitat Pouvoir pathogne 39-46 + 8 Peptostreptococcus 27-35* V V V 11 muqueuses, intestin + ** humain Peptococcus 50-51 + V 1 muq. intestin + V = variable Coprococcus 39-42 + + 3 rumen,intestin**

rumen

''' except P. productus 44-45

Des remaniements rcents ont eu lieu entre Peptococcus et Peptostreptococcus reposant sur les rsultats des GC %, alors qu'auparavant, la distinction se faisait sur la morphologie. Schmatiquement : - les Peptococcus sont des cocci en amas, paires, ttrades, - les Peptostreptococcus sont des cocci en chanettes pour certaines espces (P. anaerobius, P. micros, P. productus), ils se prsentent sous forme d'amas ou de ttrades pour P. prevotii et P. magnus. L'espce Veillonella parvula reprsente la seule espce de cocci Gram ngatif anarobie pathogne pour l'homme. Le GC % est de 36-43. Les Veillonella sont oxydase (-).

Chapme XXIX - Cocci anarobies

331

II - HABITAT Les cocci anarobies sont largement reprsents au sein de la flore normale de l'homme, en particulier au niveau de la bouche, de l'arbre respiratoire, de l'intestin, et du tractus urognital. III - POUVOIR PATHOGNE Les germes sont retrouvs soit isolment, soit en association avec d'autres espces anarobies strictes et/ou avec des arobies. Les tableaux cliniques sont varis. Ces cocci sont impliqus dans des : - bactriennes et septicmies (notamment P. magnus), - infections intra-abdominales, post chirurgicales, - atteintes articulaires (arthrites, souvent sur arthroplasties), ou osseuses (ostomylites) notamment P. magnus, - infections dentaires, cervico-faciales, - infections respiratoires, infections gnitales fminines etc... Les infections P. indolicus sont exceptionnelles chez l'homme. IV - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A - Caractres morphologiques Cocci Gram positif, pouvant parfois prendre un aspect allong voire coccobacillaire ; ils sont disposs en paires, en petits groupes ou en chanettes. La taille des lments est variable, trs petits pour P. micros ( 0,3-0,5 prn), gros pour/1, magnus (0,7-1,2 pm). V. parvula se prsente soit en lments isols, soit en diplocoques, amas ou courtes chanettes, les lments sont de petite taille 0,3-0,5 \\m. B - Caractres culturaux Ces germes se dveloppent facilement sur les diffrents milieux usuels en anarobiose (cur-cervelle, Schaedier supplment en sang de mouton...). Dans les prlvements polymicrobiens, on peut recourir un milieu slectif contenant de la nomycine. P. anaerobius a sa croissance favorise par une co-culture avec Clostridium perfringens, sans que le mcanisme de cette stimulation soit connu. La culture est relativement lente et l'apparition des colonies demande souvent 48 heures voire plus. P. niger labore un pigment noir sur glose au sang. Les colonies de Veillonella convexes, translucides, donnent une fluorescence rouge en lumire ultraviolette. C - Caractres biochimiques La culture lente ncessite souvent un dlai de lecture des ractions biochimiques de 3 5 jours. Les principaux critres biochimiques sont regroups dans le Tableau II. Des kits rapides peuvent tre utiliss : Miniteck, API 20A... L'tude des produits terminaux de fermentation, en chromatographie gaz liquide est galement intressante. Elle rvle notamment la production d'acide butyrique et

332

Section VII - BACTRIES ANAROBIES

caproque par P. niger ; acide butyrique et lactique par P. tetradius ; d'acide actique par tous les autres Peptostreptococcus... V. parvula produit surtout des acides actique et propionique. La sensibilit de P. anaerobius au polyanthol sulfbnate de sodium (SPS) avec une inhibition d'au moins 12 18 mm autour des disques du commerce et l'aptitude de cette espce dgrader la tyrosine, constituent des lments d'appoint pour le diagnostic.
EN CHIFFRE COCCI A GRAM POSITIF ANAROBIES - Ils reprsentent de 11 30 % des anarobies isols chez l'homme - L'importance relative des espces parmi l'ensemble des anarobies est la suivante* P.magnus 13 % P.asaccharolyticus 5 % P.anaerobius 3 % P.micros 2% P.prevotii 2% *statistiques de la Mayo Clinic. COCCI A GRAM NGATIF ANAROBIES - Veillonella parvula reprsente selon les auteurs entre 1 et 16 % des isolements anarobies. TABLEAU n IDENTIFICATION DES PRINCIPALES ESPECES DE COCCI ANAROBS Espces Peptococcus niger Peptostreptococcus anaerobius asaccharolyticus indolicus magnus micros prevotii productus tetradius Veillonella parvula * ND = non dtermin Gram Glucose + + + + + + + + + + + + + + + + + Saccharose Lactose + + Nitrate Indole Coagulase

+ ND*

V - DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE Prlvements : ils doivent tre effectus et transports en respectant les rgles gnrales concernant les prlvements supposs contenir des anarobies. Les prlvements contenant ces cocci sont varis : hmocultures, pus d'abcs, pus abdominaux, pus osseux, liquides de ponction (articulaire, pleurale...), prlvements gnitaux. Culture : flacons d'hmocultures anarobies (de prfrence sans SPS), des milieux liquides (Rosenow ou Thioglycolate) et des milieux solides en sparation, non slectifs

Chapitre XXK - Cocci anarobies

333

(glose au sang...), slectifs pour les cocci Gram positif (glose au sang + nomycine ou gentamicine). L'incubation se fait soit en jarre anarobie, soit de prfrence pour les Veillonella en enceinte anarobie. Les cultures sont souvent lentes et l'observation doit tre poursuivie au moins 3 5 jours. L'identification est base sur : - la morphologie, l'examen des colonies en UV, - les galeries biochimiques, la sensibilit au polyanthol sulfonate de sodium (SPS), - l'identification des produits terminaux en chromatographie en phase gazeuse. VI - SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES La pnicilline G est le traitement de choix des infections dues ces cocci anarobies. La clindamycine ou le chloramphnicol reprsentent des alternatives. Toutes les souches ne sont pas sensibles au mtronidazole et les ttracyclines sont peu actives.

BIBLIOGRAPHIE
EZAKI T, YAMAMOTO N, NINOMIYA K, SUSUKI S, YABUUCHI E., Transfer of Peptococcus indolicus, P. asaccharolyticus, P. prevotii and P. niger to th genus Peptostreptococcus and proposai of Peptostreptococcus tetradius sp.nov. . Int. J . Syst. Bacteriol., 1983, 33, 683-698. HOFSTADT T. Current taxonomy of medically important non sporing anaerobes . Rev. Infect. Dis., 1990, 12 suppl. 2, S122-S125. HOLDEMAN MOORE L.V., JOHNSON J.L., MOORE W.E.C., Peptococcus. Peptostreptococcus . Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol 2, P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, J.G. Holt, Ed. Williams & Wilkins, Baltimore, 1986. HUSS V.A.R., FESTL H., SCHLEIFER K.H., Nucleic acid hybridization studies and deoxyribonucleic acid base compositions of anarobie, gram-positive cocci , Int. J . Syst. Bacteriol., 1986, 34, 95-101.

Chapitre XXX CLOSTRIDIUM

GNRALITS SUR LES CLOSTRIDIUM


Les Clostridium sont des bacilles Gram positif sporuls, anarobies stricts. 1 - CLASSIFICATION Parmi les bacilles et cocci Gram positif formant des endospores, on distingue diffrents genres :
Bacilles
Arobies Anarobies stricts Bacillus Sporolactobacillus Oscilhspira Clostridium Desulfomaculum

Cocri
Sporosarcina

L'observation de la spore n'est pas toujours vidente, et pour mettre celle-ci en vidence on utilise les proprits confres par cette structure : - rsistance au chauffage 70C durant 10 mn, - rsistance l'thanol (95 %) 45C ou utilisation des milieux favorisant la sporognse. Cette recherche directe ou indirecte de la spore a un intrt pour diffrencier les Clostridium des autres bacilles Gram positif anarobies stricts non sporuls : - Eubacterium - Propionibacterium - Bifidobacterium qui sont classs dans le Bergey's Manual parmi les Bacilles non sporuls rguliers ou irrguliers . Au sein des Clostridium, une classification schmatique reposant sur la l'hydrolyse de protines et la fermentation des glucides est commode pour classer les Clostridium en quatre groupes.

ChllpitteXXX-Ciaflrtdiiim

____ ____________________

___335

Clostridium Groupe 1

Activits Protolytique + + faible ou -

Glucidolytique + +

n m
IV

Espces C.botulinum (A, B, F), C.sporogenes, C.sordellii C.histolyticum C.perfringens, C.botitl inum(C,D,E,G)... C.tetani

La validit de cette classification est confirme par les rsultats obtenus par hybridation ADN-ADN et ADN-ARNr. L'tude du GC % fait apparatre deux groupes de Clostridium '. - le premier, GC % 24-29, regroupe C. bifermentans, C. botulinum, C. cadaveris, C. difficile, C. fallax, C. limosum, C. novyi, C. perfringens, C. septicum, C. sordellii, C. sporogenes et C. ttant, - le second, GC % 41-49, regroupe C. innocuum, C. sphnodes et C. symbiosum. II - HABITAT La plupart des espces de Clostridium sont des bactries telluriques, mais sont galement isoles dans l'intestin et les selles de l'homme et de divers animaux. Ainsi la prsence de Clostridium dans les eaux ou les aliments par exemple signe en gnral une contamination fcale. III - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES A - Caractristiques morphologiques : (figure 1) Ce sont des bacilles Gram positif, dont la paroi contient habituellement de l'acide mso-diaminopimlique. Ils sont mobiles par ciliature pritriche ou immobiles. Ils produisent des endospores ovales ou sphriques qui peuvent dformer la bactrie.
FIGURE 1 MORPHOLOGIE DE QUELQUES ESPCES DE CLOSTRIDIUM SUR MILIEUX USUELS

336

Section VII - BACTRIES ANAROBIES

B - Caractristiques mtaboliques Ce sont des bactries anarobies strictes, dont la tolrance vis--vis de l'oxygne varie selon les espces, quelques espces peuvent (sans sporuler) pousser en prsence d'oxygne. Les Clostridium sont usuellement dpourvus de catalase. Les Clostridium produisent habituellement des acides organiques et des alcools partir des hydrates de carbone et des peptones. La connaissance du comportement des espces sur le plan : de la protolyse, de la production d'indole, la possession d'une urase, des fermentations sucres : glucose, esculine, lactose, saccharose, mannitol..., de la production d'acides caproque, butyrique, isovalrique, propionique..., des lipides et phospholipides, permet de faire le diagnostic de l'espce (Tableau I).
TABLEAU 1 CARACTRISTIQUES DES PRINCIPALES ESPCES DE CLOSTRIDIUM GROUPE Espce 1 II

IV

c. c. c. c. C. C. C. C. C. botulinum sporogenes sordellii histolyticum oedematiens septicwn perfringens difficile tetani (novyi) A.B.F
+ + d + + d + + + + + + + + + + + + + + + + + + + . . . + faible + + + + + + + d d + d + + + + + + -. + + + + d + AB * + + + + + ++ + + + + d + d + d + + + d + d + + +

Mobilit Production H; Lcithinase Upase Urase Indole Gladnase Digestion lait Hmolysines Fermentation : Glucose Maltose Lactose Saccharose Salicine Mannitol Toxines

+ *

* Une neutralisation par un srum spcifique est indispensable pour l'identification d : variable selon les types et les souches

IV - POUVOIR PATHOGNE Le pouvoir pathogne est li des toxines et/ou des activits enzymatiques. Schmatiquement les principaux aspects sont regroups ci-dessous.
TABLEAU CLINIQUE Ttanos Botulisme Intoxication alimentaire Entrite ncrosante Colite pseudo-membraneuse Gangrne gazeuse ESPCE IMPLIQUE C.tetani C.botulinum C.perfringens C.perfringens C.difficile C.perfringens, C.septicum, C.novyi, C.sordellii.

Chapitre XXX - Clostridium

___

337

En milieu hospitalier les Clostridium reprsentent un peu plus de 10 % de tous les isolats de bactries anarobies (Tableau II).
TABLEAUn RPARTITION DES SOUCHES DE BACTRIES ANAROBS D'APRS QUELQUES ENQUTES RALISES EN FRANCE ET AUX U.S.A. F R A N C E | U.S.A. FRANCE Auteur Lieu Anne Total des souches BACILLES Qram - : Bfragilis P melaninogenica Autres Fusobacteriwn Gram + \Clostndiwn Eubacterium Propionibacterwm Autres sans spores COCCI Gram - : Veillonella Gram + : Pepfococcus Peptostreptococcus J 3% 37% 2% 1% 16%* 11% 16% 2% 12% 6% 2% 17% 4% 17% 15% 8% 35% H 6% 37% | 6% 27% 12% 3% 4% 14% 4% 7% 2% 10% -1 13% 5% 13% 6% 6% 2% 9% 12% 20% 5% 13% 6% 9% 2% 23% 8% 2% 11% 4% 17% 2% Beerens Lille 1965 474 Sedallian Monteil Denis Sirot Strasbourg Limoges France Annecy 1976 1973-1978 1976-1980 1980-1984 1998 852 826 2409 AUen Indiana 1975-1978 5058

4% 4%

8%

H 11% ]25%

* Le pourcentage lev de Veillonella est li une tude systmatique des flores trachales

338

Section VU - BACTRIES ANAEROBIES

CLOSTRIDIUM BOTULINUM
Cette bactrie est responsable d'une neuro-intoxication, le botulisme. Le plus souvent la maladie est conscutive l'ingestion de toxine prforme dans un aliment contamin par cette espce. Cette maladie cosmopolite est redoutable. HISTORIQUE
Le terme de botulisme est li au fait que les premiers cas cliniques dcrits taient conscutifs l'ingestion de saucisse (du latin botulus). En 1895 Van Ermengen dcrit le germe et la maladie. Diffrents srotypes ont t dcrits depuis cette date, Gimenez et Ciccarelli ont montr que certaines souches pouvaient produire deux toxines.

I - CLASSIFICATION C. botulinum regroupe diffrentes expces produisant une neurotoxine qui est responsable d'un mme syndrome clinique : le botulisme. Les souches de C. botulinum ont un CG% compris entre 26 et 28 %, contre 22 55 % pour l'ensemble des Clostridium. La nomenclature habituelle distingue quatre groupes de C. botulinum : - Groupe I. Souches protolytiques. Types toxiniques A, B, F - Groupe II. Toxine de type E et souches non protolytiques de type B et F. - Groupe III. Toxines de type C et D, le plus souvent aviaires. - Groupe IV. Toxine de type G ; le nom de C. argentinense a t propos la place de C. botulinum pour dsigner ces souches. La situation est complique par le fait que d'autres Clostridium : C. baratii et C. butyricum sont capables de produire de la toxine botulinique (Tableau I). II - HABITAT - TRANSMISSION C. botulinum est un germe tellurique trs rpandu dans la nature, mais la maladie est rare, car l'ingestion de la bactrie ne produit en gnral pas d'effets. La bactrie existe sous forme de spores dans la terre, la boue et l'eau. Les vgtaux sont contamins par la spore (fruits, lgumes, fourrages). La spore est prsente dans l'intestin de nombreux animaux : quids, moutons, et porcs. Les poissons se contaminent au contact de la boue. Pour qu'il y ait maladie, il faut qu'il y ait ingestion d'une quantit suffisante de toxine. Cette toxine n'est produite que si la spore survit dans l'aliment pour donner une forme vgtative productrice de toxine. La contamination de la viande peut survenir de deux manires : - l'abattage en priode de digestion : la bactrimie post-prandiale entrane une diffusion dans les muscles, - du fait d'une souillure par le contenu intestinal, La persistance des spores est favorise par : - une mauvaise conservation de l'aliment (fumage et saumurage dfectueux), - une strilisation insuffisante (temprature infrieure 100C). La transformation de la spore en forme vgtative devient possible dans plusieurs conditions :

'f-

Chapitre XXX -Clostridium

339

- salure insuffisante (NaCl infrieur 10 %, acide actique infrieur 2 %), - temprature proche de la temprature ambiante permettant la multiplication de la bactrie, - anarobiose ralise dans des aliments, au contact de l'os pour les jambons, sous la couche de graisse (pts), ou du fait d'emballages tanches, - prsence de glucides (conserves de fruits et lgumes). La production de la toxine dans l'aliment demande un certain dlai, en moyenne huit jours 26C. La libration serait favorise par des associations microbiennes qui lysent C. botulinum. La toxine tant thermolabile, l'aliment est dangereux quand il est ingr cru. Exceptionnellement le botulisme peut se dvelopper par production de toxine au niveau d'une plaie infecte ou au niveau de l'intestin. III - PHYSIOPATHOLOGIE On distingue deux formes de botulisme : l'intoxication et la toxi-infection. Chez certains nourrissons C. botulinum. s'implante dans l'intestin et libre la toxine synthtise in situ. Toxine et bactrie ingres passent sans dommage la barrire gastrique. La toxine retrouve dans l'intestin correspond la toxine ingre et la toxine libre lors de la lyse bactrienne, cette toxine rsiste donc l'acidit gastrique et aux sucs digestifs. Une fois dans l'intestin elle passe dans les lymphatiques puis dans le sang et va se fixer sur le tissu nerveux. L'intoxication se traduit par une paralysie gnrale (de type flasque) de l'activit neuromusculaire et du systme nerveux autonome. L'action de la toxine s'exerce surtout sur le systme nerveux priphrique, la diffrence de la toxine ttanique qui agit surtout sur le systme nerveux central. Chez l'homme, il y a une diminution de l'activit : - du nerf vague, - des nerfs de contraction vsicale, des organes scrtoires, oculomoteurs, - des motoneurones. Mode d'action : La toxine empche la transmission cholinergique dont le mdiateur est l'actylcholine et agit surtout sur les terminaisons nerveuses - des fibres nerveuses prganglionnaires parasympathiques, sympathiques et du systme nerveux autonome, - des fibres du systme nerveux parasympathique, - des fibres des motoneurones innervant les muscles stris. Mcanisme : L'actylcholine agit de la manire indique sur la figure 1 au niveau de la plaque neuromusculaire. La toxine inhibe la libration de l'actylcholine, en empchant l'activation du mcanisme de libration par les ions a"1"1". IV - POUVOIR PATHOGNE NATUREL A - Pour l'animal Les bovins contractent la maladie par ingestion de fourrages moisis, contamins par des cadavres de rongeurs (botulisme A, B ,D).

340

Section VU - BACTRIES ANAEROBIES

Terminaison Prsynapdque

Site d'action de la toxine botulique qui inhibe la libration de l'actylcholine partir des vsicules.

membrane prsynapdque

r^n Rcepteur d'actylcholine Actylcholine Estrase ouverture l Na+ T K4' du canal d'o '

espace synaprique Membrane postsynapdque

1
T

muscle

FIGURE 1 SITE ET MODE D'ACTION DE LA TOXINE BOTULIQUE AU NIVEAU DE LA PLAQUE NEUROMUSCULAIRE

Les ovins peuvent aussi tre touchs. Le botulisme quin peut dcimer des curies entires (botulisme B). Le botulisme aviaire (botulisme C) provoque des paralysies flasques des muscles du cou. Exprimentalement si le cobaye est l'animal de choix, les souris sont trs sensibles galement la toxine, comme le singe, le chat et le lapin. B - Pour l'homme II s'agit souvent de petites pidmies familiales ou touchant les convives d'un mme repas. 1. C'est essentiellement une intoxination lie l'ingestion de toxine prforme Les aliments impliqus sont classiquement : - les conserves familiales, artisanales insuffisamment strilises, les viandes surtout de porc : jambons fums, confits, foie gras (botulisme B) - les fruits et lgumes souills par de la terre, notamment aux U.S.A. (botulisme A) - les poissons de mer ou de rivire : conserves, poissons crus ou fums responsables de botulisme E et F (U.R.S.S., Canada, Japon...). Aprs ingestion de l'aliment contamin on distingue : - La priode d'incubation qui peut tre de 8 12 heures en cas de botulisme suraigu, mais qui peut atteindre 2 3 semaines.

Chapitre XXX - Clostndium

341

- La priode d'invasion retrouve dans la moiti des cas, comportant des signes digestifs non spcifiques (nauses, vomissements, diarrhe). - La phase d'tat caractrise dans les formes typiques par al Des troubles moteurs : - oculaires : avec comme premier signe la paralysie de l'accommodation avec vision floue de prs, suivie de mydriase, puis d'atteintes extrinsques (ptosis, strabisme, diplopie), - buccopharyng : avec dysphagie douloureuse pouvant entraner des fausses routes, - sophagiens, coliques, vsicaux..., d'autres paralysies peuvent toucher les muscles du dos, de la nuque, des membres voire le diaphragme. bl Des troubles secrtaires : Avec tarissement des scrtions lacrymales, salivaires, de l'ensemble du tractus digestif, sudoral, lact. L'asschement des muqueuses favorise les surinfections.
cl Des signes ngatifs :

Pas de fivre, pas d'atteinte cardiovasculaire, pas de troubles de la conscience ; et de plus les paramtres biologiques du LCR sont dans la limite de la normale. - L'volution est le plus souvent favorable en France (4 % de dcs), plus grave aux tats Unis (50-60 % de dcs). Les formes mortelles se retrouvent souvent parmi les formes incubation courte et avec certains srotypes (types A et E). Le pronostic varie galement avec la quantit d'aliments ingre et avec le degr d'hydratation des aliments. Les aliments trs hydrats contiennent plus de toxine.
2. C'est plus rarement une taxi-infection

Le germe est alors isol chez le malade lui-mme au niveau de plaies souilles avec gangrne ou au niveau des sites d'injections parentrales (plus de 40 cas aux USA). Rcemment des cas de mort subite du nourrisson ont t attribus C. botulinum. Le germe ingr, par exemple avec des aliments lacts contenant du miel, s'implante dans l'intestin et y scrte sa toxine. Il y a toxinognse endogne, puis apparition de constipation, de troubles respiratoires et de dcs (enfants vers la 12e semaine). Cette tiologie a t retrouve dans 4,7 % des 21 cas de mort subite, rapports par Amon et seraient dus des types toxiniques rares (C, F et G) dont le pouvoir pathogne chez l'homme n'est pas toujours bien document. On ne sait pas trs bien pourquoi le germe peut s'implanter dans la flore intestinale de l'enfant de moins de 1 an, mais il faut noter que dans un certain nombre de cas exceptionnels chez l'adulte cette colonisation peut exister. Chez certains animaux cette implantation ne peut se faire que durant une priode trs courte de la vie.
LE BOTULISME EN CHIFFRES En France entre 1936 et 1939:15 cas entre 1939 et 1945 : 1000 cas entre 1971 et 1978: 454 cas actuellement prs de 60 cas/an Mortalit : en France : 4 % aux USA : 50-60 %

342

Section VII - BACTRIES ANAROBIES

TABLEAU 1 PIDMIOLOG SUIVANT LE SROTYPE DE CLOSTRIDIUM BOTUUNUM Srotype Hte le plus habituel bovin, ovin rongeur volaille (oie) intestin du porc (pas de maladie) btail, volaille, oiseaux C D rat, chat (pas de maladie), cheval, bovin, porc Aliment responsable Rpartition gographique Mortalit

lgumes : haricots, petits pois tats-Unis viande jambon, lard sal confit d'oie conserves de petits pois pt de campagne jambon (Tchad)

35% 60%

France +++ 3% Europe continentale environ 10 % environ 50 % tats-Unis rare(Afrique, Amrique) affection exceptionnelle (Afrique, Australie)

35%

poisson

poisson (en saumure, U.R.S.S. fum) laushi (pourtour de (condiment base la Baltique) de poisson ferment) Japon lgumes (conserves Canada familiales) tats-Unis crabe, poisson mer et rivire rare (Danemark) (Argentine)

30% 40%

F G

poisson

jamais chez l'homme

V - CARACTRES BACTRIOLOGIQUES
A - Forme vgtative 1. Morphologie

C. botulinum est un bacille Gram positif (faible) aux extrmits arrondies de 4-8 pm sur 0,9-1,2 [im. Il est mobile (6 20 cils pritriches). Il n'est pas capsul. Dans les cultures jeunes, on peut observer de courtes chanettes. A l'inverse dans les cultures ges, on observe des formes d'involution vacuolaires et des spores.
2. Cultures

C'est un germe anarobie strict pour lequel les meilleures conditions de croissance sont une temprature de 26 28C et un pH alcalin (8 8,4). Aspect des colonies : - en glose profonde VF ou VL additionne de sang, de jaune d'uf, elles sont lenticulaires, les parois sont lisses, parfois pineuses en oursin (Figure 2). - en surface les colonies sont circulaires et jauntres.

Chapitre XXX -Clostridium

___

_____

__________________343

FIGUREZ ASPECT DES COLONIES DE C. BOTULINUM EN MILIEU SEMI-SOLIDE (COLONIES LISSES ET PINEUSES)

3. Caractres biochimiques (Tableau II) La principale source nergtique est glucidique : glucose, maltose, lvulose... en librant des acides actique, butyrique (odeur de beurre rance caractristique), et en plus faible quantit acide lactique. Les souches de type D sont plus glucidolytiques ; les souches de type C le sont moins. Action protolytique : protolyse plus ou moins marque selon les types. A et B sont glatine (+), dcarboxylase (+), dsaminase (+)..., C, D et E sont peu protolytiques. Le type B produit une hmolysine. Pouvoir lipolytique trs marqu pour C. botu.linu.rn A, B et F. Pouvoir rducteur lev pour A, faible pour B, C, E.
TABLEAUn CARACTRISTIQUES DES ESPCES DE CLOSTRIDIUM PRODUCTRICES DE NEUROTOXINE Groupes Types de toxines A.B.F B.E.F C,D G F E Production Ftermentatior> sucres Lcithinase Lipase . + + ~ + + + ~ + + + + + Hydrolyse glatine + + + + " Mtabolites volatils* A.B.iB.iV A,B A3.P A3.iB.iV

I.C.botulinum II. C.botulinum III. C.botulinum IV. C-argentinense Divers C.baratii C.butyricum

A3
A3

* dtermins en chromatographie gaz-liquide A. Ac. actique, B. Ac.butyrique, iB. Ac. isobutyrique, P. Ac. propionique, iV. Ac.isovalrique 4. Vitalit rduite

Bactrie vgtative dtruite en 30 minutes 60C ou en 2 minutes 80C, mais dans ces conditions la sporulation est rapide. B - Spore La sporulation est favorise par les conditions de vie difficiles et par l'arginine. La spore est ovode, dformante, subterminale. La spore est trs thermorsistante, ainsi en 8 minutes 115C on tue 95 % des spores, les 5 % restantes rsistent 5-10 minutes 120C. La thermorsistance est variable selon les srotypes, diminuant dans l'ordre suivant C, A, B, D, E ; elle est favorise par une faible salure (1 6 %o) ou les lipides. La spore rsiste aux antiseptiques : il faut 24 heures pour dtruire les spores avec du formol 20 %. C. botulinum srotype A est l'une des bactries les plus radiorsistantes.

344

Section vn-BACTRIES ANAROBIES

Les spores de C. botulinum sont galement assez rsistantes divers agents bactricides : U.V., hypochlorite, alcool, ammoniums quaternaires. La germination est inhibe par le NaCl (10 15 %), certains acides gras et des substances antibiotiques produites par certaines bactries, tel B. subtilis. C - Toxine 1. Production - Elle est scrte par la bactrie en phase exponentielle de croissance ; elle est en partie endocellulaire et passe secondairement dans le milieu extrieur lors de la lyse des bactries. - Elle est parfois scrte sous forme inactive : protoxines A et E, et active par des enzymes protolytiques de la bactrie. - Les milieux utiliss pour obtenir une bonne synthse de la toxine sont base d'hydrolysat de casine ou de bouillon VF glucose 5 %o. La temprature optimale de synthse est comprise entre 30 et 37C, elle est inhibe en dessous de 10C, mais pas par une temprature ambiante de 25C. - L'optimum de production dans les cultures se situe vers le 6e jour. - La synthse de la toxine, au moins pour les types C et D, est sous la dpendance de phages lysognes, les souches non lysognes n'tant pas virulentes. De mme la prsence de plasmides a t corrle notamment avec la production de la toxine G.
2. Proprits

La toxine est de nature protique, le poids molculaire est lev (Tableau III) allant de 141 kDa 170 kDa. On distingue une chane lourde (100 kDa) et une chane lgre (50 kDa) lies par un pont disulfure. La toxine est initialement synthtise sous la forme d'une seule chane qui est ensuite scinde par une enzyme protolytique d'origine endogne ou exogne. Au sein du type C on distingue une neurotoxine majeure dite C; et une seconde toxine mineure C^ diffrente ayant une action sur la permabilit vasculaire et une action ltale. Pendant longtemps on a pens que les PM taient beaucoup plus levs allant jusqu' 900 kDa, mais les toxines existent sous forme de polymres. La toxine a pu tre obtenue sous forme cristallise. Les toxines sont riches en asparagine et en glutamine.
TABLEAU m POIDS MOLCULAIRES DES TOXINES BOTULIQUES (D'APRS SEBALD). Type immunologique toxine A B Ci C2 D E F * toxines diffrentes 145000 167000 141000 nd 147000 155000 Poids molculaire sous-units chane lgre chane lourde 97000 104000 98000 105 OOO* nd 102000 105000 53000 59000 53000 50 OOO* nd 50000 56000

n d . non dtermin

Chapitre XXX-Ctoanduim

345

3. Toxicit

C'est la substance la plus active parmi les produits biologiques connus : 1 mg de toxine A cristallise reprsente 31 millions de DMM souris et 1,2 millions de DMM kg cobaye. La toxicit dpend : - de la voie d'administration. La voie orale est la moins efficace. Sous forme dshydrate, le simple contact de la toxine avec la conjonctive a provoqu le dcs d'un chercheur, - de l'animal, souris et cobaye sont trs sensibles. Le dosage de la toxine s'effectue par tude du pouvoir pathogne pour la souris (DMM, DL 50), par hmagglutination passive, par prcipitation (floculation initiale de Ramon)... Les toxines sont antigniques, transformables en anatoxine par le formol et la chaleur.
4. Stabilit

Les toxines sont : - thermolabiles dtruites 80C en 15 minutes, en 10 minutes 100C, les toxines C et D sont les plus thermorsistantes ; - sensibles aux oxydants (eau de Javel), la lumire ; - stables pH 3, et rsistent donc l'acidit gastrique chez l'homme ; les vautours possderaient des enzymes digestives dtruisant la toxine contenue dans les cadavres. 5. Srotypes On connat actuellement 7 srotypes dsigns par les lettres A G. La rpartition des srotypes, l'habitat, la zone gographique de chaque srotype, ainsi que la mortalit qui leur incombe figurent dans le tableau I. Le type B est presque toujours en cause en France.
6. Usage thrapeutique

La neurotoxine de type A est utilise dans le traitement de troubles neuromusculaires (dystonie spastique et torticolis spasmodique) et ophtalmologiques (strabisme, blpharospasme). D - Autres antignes En dehors des toxines, il existe des facteurs hmolytiques, hmagglutinants, qui ne paraissent pas lis la toxine. On reconnait aussi des antignes somatiques thermostables et des antignes flagellaires thermolabiles. On a reconnu 3 sous-types H pour les souches A et 4 pour les souches B. VI - DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DU BOTULISME A - Recherche de la toxine dans le srum du malade Cet examen a un grand intrt. Il permet le diagnostic des formes frustes ou porte d'entre non digestive. La toxinmie apparat vers le 2e jour de la maladie et persiste 2 3 semaines. Cet examen doit tre pratiqu avant administration ventuelle au malade de srum antibotulinique ou de mdications neurotropes. Il ncessite environ 20 ml de sang.

346

Section VH- BACTRIES ANAROBIES

La toxmie est recherche par inoculation par voie intra-pritonale du srum du patient la souris, en utilisant des animaux protgs par les divers antisrums et des animaux non protgs. Dans des cas exceptionnels, la recherche de la toxine peut se faire dans les selles ou les produits de vomissements du malade, une aspiration gastrique, voire dans le srum ou les viscres post-mortem. B - Recherche de la toxine dans l'aliment suspect II est indispensable lors d'une suspicion d'un botulisme de retrouver les aliments suspects et de les adresser en mme temps que le patient l'tablissement hospitalier.
1. Mise en vidence de la toxine

Elle se fait par la recherche du pouvoir pathogne sur animal et preuve de l'animal protg. - on prlve la zone suspecte de l'aliment, par exemple pour les jambons la moelle osseuse, la zone situe prs de l'os l o la chair a un aspect ros ; - on broie les tissus prlevs dans du srum physiologique ou un tampon, on broie le tout en maintenant une temprature basse, on centrifuge basse vitesse pour liminer les grosses particules, on pourra rechercher le germe sur le culot, la toxine sera recherche sur le surnageant ; - pour la recherche et le titrage de la toxine, on inocule des souris avec des volumes croissants de surnageant par voie intra-pritonale : 0,1 - 0,25 - 0,5 1 ml (5 souris par dose). On utilise parfois l'aveugle, pour un premier screening 0,25 ml par souris mais le titrage sera important pour russir ultrieurement la neutralisation ; - l'preuve de sro-neutralisation permettra de vrifier que c'est bien de la toxine botulique qui a tu l'animal non protg, mais aussi de dterminer le srotype en cause. Pour cela on met en prsence un certain volume de surnageant (2 10 DMM) et du srum anti A, le mme volume de surnageant et du srum anti B, etc. Aprs avoir laiss en contact durant 30 minutes 37C, on injecte chaque mlange plusieurs animaux par voie intrapritonale (Schma). La prsence de toxine est rvle par le dcs des animaux en 24 ou 48 heures dans un tableau de paralysie flasque. Le type toxinique sera reconnu par la neutralisation de ce pouvoir pathogne l'aide de l'antisrum spcifique. Cette mise en vidence de la toxine se heurte cependant un certain nombre de difficults qu'il ne faut pas ngliger : la mort de l'animal peut ne pas tre due une action toxinique. En effet, la prsence de mtaux lourds, d'autres toxiques ou l'hyperosmolarit cre lors de l'inoculation peuvent amener des erreurs de diagnostic.

Chapitre XXX - Clostridium

347

/minent
Prlvement zone suspecte (pies de l'os pour jambon) broyer ajouter srum physiologique laisser en contact 20 minutes centrifuger basse vitesse la toxine est dans le surnageant pour l'preuve de sroprotection partir de 2 10 DMm Utiliser pour chaque essai 5 souris ou 1 cobaye surnageant inocul l'animal non protg surnageant + srum andA contact 30 mn 37C inoculation Dcs 24-36 h surnageant + srum andB contact inoculation Vivant surnageant + srum andC contact inoculation Dcs 24-36 h

(
Dcs 24-36 h

SCHMA , , DU TYPAGE DE LA TOXINE PAR EPREUVE DE L'ANIMAL PROTG (Exemple toxine type B)

2. Isolement du germe Pour la culture, on part soit du culot, soit du surnageant si la centrifugation a t peu rapide. On traite alors l'extrait par la chaleur durant 30 minutes 75C ou 10 minutes 100C pour slectionner les spores. On ensemence ensuite un milieu VF glucose, qui est plac 33C durant 7 8 jours. On recherche alors la production de toxine sur la culture par i