PROTOCOLE D’EXTRACTION

Préparation du kit :
A. Solution wash 1 ,ajouter 125ml de l’isopropanol
B. Solution wash 2 ,ajouter 232 ml de l’éthanol
- Mélanger par retournement 5fois
C. lysis working solution :
-250 ul lysis/Binding solution concentrate
-02ul ARNc
-10ul lysis Enhancer
-volume finale :262ul pour un échantillon
*lysis Enhancer ne doit être ajouter qu’au moment de l’utilisation
D. Bead Mix :
- 250 ul d’isopropanol
- 10ul nucleic acid binding
-volume finale : 260ul pour un échantillon
* la préparation de Bead Mix doit être faite au moment
d’utilisation.
 Extraction :

1. 260ul lysis working solution

2. 200ul échantillon1
3. 5ul du MS2
-incuber 10mn a T° ambiante
4. Ajouter 260ul de Bead mix qui doit être mélangé avant utilisation
5. Agiter ou vortexer pendant 10 mn a vitesse max
6. Placer les tubes dans le Rack magnétique pendant 1mn puis aspirer le
surnagent
7. Enlever les tubes du rack et ajouter 300ul Wash1 et agiter 1 mn
(refaire l’étape 6)
8. Répéter une 2ème fois le lavage avec Wash 1 (refaire l’étape 6)
9. Enlever les tubes du rack et ajouter 450ul Wash 2, agiter 1mn (refaire
l’étape 5)
10. aspirer le liquide restant dans les tubes, Laisser les tubes dans le rack
bouchons ouverts pour sécher pendant 5mn,
11. Enlever les tubes du rack et ajouter 90ul d’éluant, agiter ou vortexer
pendant 10mn a vitesse max
12. Placer les tubes dans le rack et laisser 2mn, puis aspirer complètement
l’éluant et transférer le dans les eppendorfs à extraits

1
- pour le contrôle négatif : 200ul de l’eau ARNase Free
- pour les malades : 200ul de l’ échantillon