Comparaison Entre Le Kit

ROYAUME DU MAROC
Université Mohammed V - Rabat Faculté de Médecine et de Pharmacie RABAT
Année 2021 N°: MM0072021
Mémoire de fin d’études
MASTER DE «BIOTECHNOLOGIE MEDICALE»

OPTION: «Biomédicale»
Intitulé
PCR SARS-CoV-2 :
COMPARAISONSoutenuENTRE par :
LE NOUVEAU KIT
Comparaison entre ANZI
le HASNA
kit
MAScIR MAScIR SARS-CoV-
2 M 0.2 et le kit GeneFinderTM COVID-19 Plus
SARS-CoV-2 M 0.2 ET LE KIT DE REFERENCE
RealAmp Kit
Devant le jury composé de :
Pr. OUADGHIRI Mouna, Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat, Président
Pr. KABBAJ Hakima, Professeur de Microbiologie C.H.U Ibn Sina, Faculté de
Médecine et de Pharmacie de Rabat, Encadrant
Pr. EL ANNAZ Hicham, Professeur Agrégé en Virologie H.M.I.MV, Faculté de
Médecine et de Pharmacie de Rabat, Examinateur
Dédicace
A mes chers parents
Pour tous leurs sacrifices, leur amour, leur tendresse, leur soutien et leurs
prières tout au long de mes études,
A mes chères sœurs
Pour leurs encouragements permanents, et leur soutien moral,
A mes chers frères
Pour leur appui et leur encouragement,
A toute ma famille
Pour leur soutien tout au long de mon parcours universitaire,
A notre maître et encadrant de thèse Madame le Professeur KABBAJ
Hakima Professeur de Microbiologie C.H.U Ibn Sina
C’est un privilège et un honneur pour moi de vous avoir comme encadrent
afin de mener ce travail de fin d’étude.
Nous vous remercions d'avoir accepté d'encadrer ce travail malgré vos
nombreuses obligations.
Votre sérieux, votre rigueur de travail, ainsi que votre dévouement
professionnel sans limites sont l’objet de notre admiration, et un exemple
dans l’exercice de la profession.
Veuillez accepter, cher maître, l’expression de ma gratitude et de ma
profonde reconnaissance.
A notre maitre et président Professeur OUADGHIRI Mouna
Nous vous remercions pour vos efforts fournis pour nous offrir un enseignement
de qualité. Que ce travail soit un témoignage de notre sincère reconnaissance et
profonde gratitude.
A notre juge de thèse Monsieur le Professeur Hicham EL ANNAZ
Professeur Agrégé en Virologie H.M.I.MV
Nous vous remercions pour la gentillesse et la spontanéité avec lesquelles
vous avez bien voulu faire partie de notre jury. Nous voudrions être dignes
de la confiance que vous nous avez accordée et vous prions, cher Maître, de
trouver ici le témoignage de notre sincère reconnaissance et profonde
gratitude.
A toute personne
Qu’a contribué à la réussite de ce travail
Que ce travail soit l’accomplissement de vos vœux tant allégués, et le fruit de
votre soutien infaillible.
Remerciements
En préambule à rapport de projet de fins d’études nous remerciant ALLAH
qui m’a aidé, et m’a donné de la patience, et le courage durant ces années d’étude.
Je souhaite adresser mes remerciements les plus sincères aux personnes qu’ont
m’apporté leur aide et qui ont contribué à l’élaboration de ce projet ainsi qu’à
la réussite de cette année universitaire.
Ces remerciements vont tout d’abord au corps professoral et administratif de
la faculté de Médecine et Pharmacie Rabat, et en particulier le laboratoire de
biotechnologie pour la richesse et la qualité de leur enseignement, et qui déploient
de grands efforts pour nous assurer une formation de haut niveau.
Je tiens à remercier sincèrement et très chaleureusement le personnel du
Laboratoire Central de Virologie de rabat, et en particulier Pr. KABBAJ
Hakima qui m’a permis de bénéficier de son encadrement, les conseils qu’il nous a
fourni, la patience, la confiance qu’il nous a témoigné ont été déterminants dans
la réalisation de mon projet.
Mes remerciements sont adressés également au Pr. OUADGHIRI Mouna pour
son accueil, et son coopération lors des recherches des sujets. Nous sommes
reconnaissants pour le temps qu’il nous a consacré et son aide tout au long de
cette expérience enrichissante.
Enfin, j’adresse mes plus sincères remerciements au Pr. IBRAHIMI Azeddine et
toutes les équipes pédagogiques et techniques de notre faculté pour leurs efforts
fournies lors de cette période critique pour nous offrir un environnent de travail
à distance.
Abstract
Title: COMPARISON BETWEEN THE SARS-CoV-2 M 0.2 MAScIR KIT AND THE
GeneFinderTM COVID-19 Plus RealAmp Kit
Author: ANZI HASNA
Keywords: SARS-CoV-2, RT-PCR, MAScIR SARS-CoV-2 M 0.2, GeneFinderTM

COVID-19 plus RealAmp Kit
SARS-CoV-2 infection is a worldwide public health problem, and understanding and

monitoring the genetic evolution of the virus, its characteristics, and its stability are
particularly important for controlling the spread of the disease and especially for the
development of a large number of diagnostic tests targeting the different genes of the virus.
The objective of this study is to make a comparison between the new MAScIR SARS-CoV-2
M kit 2.0 and the reference kit GeneFinderTM COVID-19 Plus RealAmp kit which are
qualitative tests based on RT-qPCR technology allowing the detection of the RNA of the
SARS-COV-2 virus
This study was carried out at the Central Virology Laboratory of the Ibn Sina University
Hospital in Rabat on samples taken by nasopharyngeal or oropharyngeal swabs, for the
search of the SARS-COV-2 genome by RT PCR. It included 61 samples of which 38 were
strong positive, 14 were weak positive, and 9 were negative and three thermocyclers (ABI
7500 Applied Biosystems, QuantStudio™ 5 Applied Biosystems, and Exicycler™ 96
Bioneer.)
The qualitative results of this comparison were in overall agreement. No discordance with
clinical impact was detected. The sensitivity and specificity of the MAScIR SARS-CoV-2 M
2.0 kit were estimated to be 100%, using the GeneFinder assay as a reference.
Our study concluded that the results of the search parameters met the vendor's
recommendations and were consistent with the results of the reference technique.
Résumé
Titre : COMPARAISON ENTRE LE NOUVEAU KIT MAScIR SARS-CoV-2 M 0.2

ET LE KIT DE REFERENCE GeneFinderTM COVID-19 Plus RealAmp Kit
Auteur : ANZI HASNA
Mots clés: SARS-CoV-2, RT-PCR, MAScIR SARS-CoV-2 M 0.2, GeneFinderTM

COVID-19 plus RealAmp Kit
L’infection à SARS-CoV-2 constitue un problème de santé publique à l’échelle mondiale. La

compréhension et le suivi de l'évolution génétique du virus, de ses caractéristiques, et sa
stabilité sont particulièrement importants pour contrôler la propagation de la maladie et
surtout pour le développement de très nombreux tests diagnostiques ciblant les différents
gènes du virus.
L’objectif de cette étude est de faire une comparaison entre le nouveau kit MAScIR SARS-
CoV-2 M kit 2.0 et le kit de référence GeneFinder TM COVID-19 Plus RealAmp kit qui sont
des tests qualitatifs basés sur la technologie RT-qPCR permettant la détection de l’ARN du
virus SARS-COV-2.
Cette étude a été réalisée au Laboratoire Central de Virologie du CHU Ibn Sina de Rabat sur
des échantillons prélevés par écouvillonnages nasopharyngés ou oropharyngés, pour la
recherche du Génome du SRAS-COV-2 par RT PCR. Elle a portée sur 61 échantillons dont
38 étaient des échantillons fortement positifs, 14 étaient faiblement positifs et 9 étaient
négatifs et sur trois thermocyleurs (ABI 7500 Applied Biosystems, QuantStudio™ 5 Applied
Biosystems et Exicycler™ 96 Bioneer.)
Les résultats qualitatifs de cette comparaison étaient globalement concordants. Aucune

discordance ayant un impact clinique n’a été détectée. La sensibilité et la spécificité du kit
MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 ont été estimées à 100%, en prenant le test GeneFinder comme
référence.
Notre étude a permis de conclure que les résultats des paramètres de recherche répondent aux
recommandations du fournisseur et sont cohérents avec les résultats de la technique de
référence.
‫ملخص‬
‫ومجموع‬
‫المقارنة بين المجموعة الجديدة ‪MASCIR SARS-CoV-2 M 0.2 KIT‬‬ ‫العنوان‪:‬‬
‫ة‬
‫‪ GENeFinderTM COVID-19 Plus RealAmp Kit‬المرجعية‬
‫الكاتب ‪ :‬عنزي حسناء‬
‫‪SARS-CoV-2, RT-PCR‬‬
‫الكلمات المفتاح ‪, MASCIR SARS-CoV-2 M 0.2 KIT :‬‬
‫‪GENeFinderTM COVID-19 Plus RealAmp Kit‬‬
‫يعتبر فهم ومراقبة التطور الجيني لفيروس وخصائصه‬ ‫مشكلة صحية عامة عالمية‪.‬‬ ‫تعد عدوى ‪SARS-CoV-2‬‬
‫وخاصة لتطوير عدد كبير من االختبارات‬ ‫السيطرة على انتشار الفيروس‬ ‫واستقراره أم ً را مه ًما بشكل خاص في‬
‫التشخيصية التي تستهدف الج ني ات المختلفة لفيروس‪.‬‬
‫الهدف من هذه الدراسة هو إجراء مقارنة بين مجموعة ‪ M SARS-CoV-2 MAScIR 2.0‬الجديدة ومجموعة‬
‫‪ RealAmp Plus COVID-19 TM GeneFinder‬المرجعية والتي تعد اختبارات نوعية تعتمد على تقنية ‪-RT‬‬
‫‪ qPCR‬التي تسمح باكتشاف ‪ RNA‬فيروس ‪. -SARS-COV 2‬‬
‫أجريت هذه الدراسة في المختبر المركزي لفيروسات بمستشفى جامعة ابن سينا بالرباط على عينات مأخوذة بواسطة‬
‫مسحات أنفية أو بلعومية ‪ ،‬لبحث عن جينوم ‪ SARS-COV-2‬بواسطة ‪ PCR .RT‬تم إجراؤه على ‪ 16‬عينة ‪ ،‬منها ‪83‬‬
‫عينة كانت إيجابية بشدة ‪ 61 ،‬منها كانت إيجا يب ة ضعيفة و ‪ 9‬سلبية وعلى ثالثة أجهزة تسخين ( ‪Applied 7500 ABI‬‬
‫‪ QuantStudio ™ 5 Applied Biosystems ،Biosystems‬و ‪).Exicycler ™ 96 Bioneer‬‬
‫كانت النتائج النوعية لهذه المقارنة متسقة على نطاق واسع‪ .‬تم الكشف عن عدم وجود اختالفات مع التأ يث ر السريري‪ .‬تم‬
‫تقدير حساسية وخصوصية مجموعة ‪ M SARS-CoV-2 MAScIR 2.0‬بنسبة ‪ ، ٪ 611‬باستخدام اختبار‬
‫‪ GeneFinder‬كمرجع‪.‬‬
‫أتاحت دراس نت ا استنتاج أن نتائج معايير البحث تلبي توصيات المورد وتتوافق مع نتائج التقنية المرجعية‪.‬‬
Table des Matières
INTRODUCTION......................................................................................................................1
1 PREMIERE PARTIE : GENERALITES CONCERNANT LE SARS-COV-2 3
I. Historique.......................................................................................................................4
II. Rappels virologiques.....................................................................................................5
1. Taxonomie et classification.....................................................................................5
a. Taxonomie.........................................................................................................5
b. Réservoirs primaires et hôtes de coronavirus....................................................6
c. Origine du SARS-CoV-2.................................................................................10
2. Structure et génome du SARS-CoV-2....................................................................10

a. Structure du virus.............................................................................................10
b. Structure du génome.......................................................................................16
3. Cycle de réplication virale du SARS-CoV-2..........................................................20
4. Variabilités génétiques...........................................................................................23
III. Épidémiologie...........................................................................................................27
1. Modes de transmission............................................................................................27
2. Contagiosité et période d’incubation.......................................................................28
IV. Histoire naturelle de la COVID-19…........................................................................29
1. Physiopathologie...................................................................................................29
2. Manifestations cliniques.......................................................................................32
V. Diagnostic virologique...............................................................................................34
1. Cinétique des marqueurs...................................................................................34

2. Prélèvement......................................................................................................36
3. Techniques de diagnostic et interprétation.......................................................38
3.1. Diagnostic direct.......................................................................................38
3.2. Diagnostic indirect....................................................................................41
3.3. Interprétation............................................................................................42
VI. Aspect préventif et thérapeutique...........................................................................43
1. Mesures barrières...............................................................................................43
2. Vaccin................................................................................................................44
3. Traitement..........................................................................................................47
2 DEUXIEME PARTIE : COMPARAISON ENTRE LE NOUVEAU KIT MAScIR SARS-
CoV-2 M 0.2 ET LE KIT DE REFERENCE GeneFinderTM COVID-19 Plus RealAmp Kit
I. Matériels et méthodes...................................................................................................50
1. Echantillons...........................................................................................................50
2. Extraction des acides nucléiques...........................................................................50
3. Amplification des acides nucléiques......................................................................54

a. Procédure analytique du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 0.2..............................54
b. Procédure analytique du kit GeneFinderTM COVID-19 Plus RealAmp Kit.......55
III. Résultats....................................................................................................................61
1. Performance analytique...........................................................................................61
a. Etude de la répétabilité et de reproductibilité (précision)...................................61
b. Résultats du test de spécificité.............................................................................65
c. Résultats du test de sensibilité.............................................................................67
d. Exactitude / comparaison inter-laboratoire..........................................................70
2. Résultats de la comparaison entre le nouveau kit MAScIR SARS-CoV-2 M 0.2 et

le kit de référence GeneFinder TM COVID-19 Plus RealAmp
Kit..........................................................................................................................71
IV. Discussion.................................................................................................................80
V. Conclusion.................................................................................................................85
Liste des abréviations
ACE2 : Enzyme de conversion de l'angiotensine 2

ADN : Acide désoxyribonucléique
AngII: Angiotensine 2
ARN : Acide Ribo Nucléique
ARNm : Acide Ribo Nucléique messager
AT1 : Angiotensine 1
CatB/L : catB/L-alanine-DL-glutamate épimérase
CD147 : Cluster de Différenciation 147
CMH: Complexe majeur d'histocompatibilité
CMIA: Chemiluminescent Microparticule Immunoassays
CoV: Coronavirus
COVID-19: COronaVIrus Disease 2019
CPA : Cellules Présentatrices d'Antigènes
CT : Cycle Threshold
CTD: Domaine carboxyl-terminal
EEQ : Evaluation externe de la qualité
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FDA: Food and Drug Administration
GISAID: Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data
IBV: Infectious Bronchitis Virus
IC: Contrôle interne
ICTV : Comité International de Taxonomie des Virus
IFN : Interferon
IL-6 : Interleukine-6
LBA : Lavage bronchoalvéolaire
MAScIR: Moroccan Foundation for Advanced Science Innovation
and MERS-CoV : Coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-
Orient MHV: Mouse Hepatitis Virus
NIH: National Institutes of Health
NSP : Protéines non structurelles
NTD : Domaine N-terminal
OC : Culture d'organes
OMS : Organisation mondiale de la santé
ORF: Open Reading Frame
PCR: Polymerase Chain Reaction
PEDV: Porcine Epidemic Diarrhea Coronavirus
RDB: Receptor Binding Domain
RdRp : ARN polymérase ARN-dépendante
RE : Réticulum Endoplasmique
RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
SARS-CoV : Severe Acute Respiratory Syndrome
Coronavirus SDRA : Syndrome de détresse respiratoire aiguë
TDR: Test Diagnostic Rapide
TMPRSS2: Transmembrane Serine Protease 2
TM2: Domaine Transmembranaire 2
2019-nCoV : Nouveau Coronavirus 2019
3CLpro : 3C-like protease
Liste des figures
Figure 1 : Classification et taxonomie des coronavirus humains (HCoV)................................6
Figure 2 : Arbre phylogénétique des coronavirus (CoV)........................................................8
Figure 3 : Origines animales des coronavirus humains............................................................9
Figure 4 : Structure schématisée du SARS-CoV-2.................................................................13
Figure 5 : Structure de la sous-unité S2, le domaine N-terminal (NTD) et le domaine de
liaison au récepteur (RBD).......................................................................................................14
Figure 6 : Structure du domaine de liaison au récepteur (RBD) ET Le site actif de l'ACE2 15
Figure 7 : Présentation schématique de l'organisation du génome du SRAS-CoV-2, des
ARNm sous-génomiques canoniques et de la structure du virion...........................................17
Figure 8 : Schéma montrant le cycle de vie du SARS-CoV-2 dans les cellules hôtes...........22
Figure 9 : Variants préoccupants (OMS Septembre 2021)….................................................25
Figure 10 : Distribution régionale des variants dans les nouvelles séquences........................26
Figure 11 : Risque de transmission du SARS-CoV-2 par des personnes asymptomatiques
dans différentes situations........................................................................................................28
Figure 12 : Schéma résumant les cibles virales de l’immunité humorale et cellulaire dirigée
contre le SARS-CoV-2...........................................................................................................31
Figure 13 : Facteurs de sévérité et présentation clinique de l’infection à SARS-CoV- 2.......33
Figure 14 : Formes de gravité de la maladie...........................................................................33
Figure 15 : Cinétique et variation estimée dans le temps des tests de diagnostic pour la
détection de l'infection par le SRAS-CoV-2 par rapport à l'apparition des symptômes..........35
Figure 16 : Coupe sagittale des voies aériennes supérieures illustrant les modalités de
réalisation d’un prélèvement rhino-pharyngé avec un écouvillon............................................36
Figure 17 : courbe Diagnostic biologique de l’infection à Sars-CoV-2 : stratégies et
interprétation des résultats........................................................................................................37
Figure 18 : Résultat d’un test rapide positif et négatif.............................................................42
Figure 19 : Types de vaccins COVID-19...............................................................................46
Figure 20 : Protocole national thérapeutique COVID-19........................................................48
Figure 21 : Extracteur BIOER, unité COVID-19 LCV...........................................................52
Figure 22 : Extracteur Big-Fish, unité COVID-19 LCV........................................................52
Figure 23 : Extracteur MolArray, unité COVID-19 LCV.......................................................53
Figure 24 : Extracteur Maxwell Promega, unité COVID-19 LCV..........................................53
Figure 25 : L’amplificateur QuantStudio 5™ 5 Applied Biosystems unité COVID-19 LCV...57
Figure 26 : Résultat négatif toutes les cibles (CI, S, RdRp) sont négatives..........................59
Figure 27 : Résultat positif toutes les cibles (CI, S, RdRp) sont positives..............................59
Figure 28 : Graphe Levey-Jenning (à gauche) et répartition des valeurs autour de la moyenne
(à droite) des résultats de la reproductibilité.........................................................................64
Figure 29: Résultat du test de sensibilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 (Cible S: en
vert, Cible RdRp: en bleu, CI : en rouge).................................................................................68
Figure 30: Résultat du test de sensibilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 du gène S…68
Figure 31: Résultat du test de sensibilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 du gène RdRp...69
Figure 32: Résultat du test de sensibilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 du CI...........69
Figure 33: Résultat de l’application de la méthode de Bland et Altman sur la cible RdRp (A
Résultats sur QS5 et B résultats sur ABI 7500)........................................................................79
Liste des tableaux
Tableau 1 : Caractéristiques des gènes exprimés par le SARS-CoV-2...................................18

Tableau 2 : Protéines non structurales (NSP) du SARS-CoV-2 et leurs fonctions
moléculaires..............................................................................................................................19
Tableau 3 : Interprétation clinique des résultats des tests diagnostiques.................................42
Tableau 4 : Fluorophores et gène correspondants du Kit MAScIR SARS-CoV-2 M kit 2.0.......54
Tableau 5 : Composition / Volume par réaction d’amplification du Kit MAScIR SARS-CoV-2 M kit
2.0.......................................................................................................................................................... 54
Tableau 6 : Fluorophores et gène correspondants du Kit GeneFinderTM COVID-19 Plus RealAmp
Kit....................................................................................................................................................... 56
Tableau 7 : Composition / Volume par réaction du Kit GeneFinderTM COVID-19 Plus RealAmp
Kit.................................................................................................................................................... 56
Tableau 8 : Interprétation des résultats...................................................................................60
Tableau 9 : Résultats du test de répétabilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0.................61
Tableau 10 : Résultats du test de reproductibilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2...........62
Tableau 11 : Résultats du test de spécificité analytique du nouveau kit MAScIR SARS-CoV-
2 M 2.0.................................................................................................................................65
Tableau 12 : Résultats de l’évaluation externe de la qualité (EEQ) du kit MAScIR SARS-
CoV-2 M 2.0.......................................................................................................................70
Tableau 13 : Comparaison entre le Kit MAScIR SARS-CoV-2 M et le Kit de référence kit
Genefinder................................................................................................................................71
Tableau 14 : Comparaison qualitative des résultats des deux kits de RT-PCR SARS-COV-
2................................................................................................................................77
INTRODUCTION
L'année 2019 s'est terminée par l'apparition de groupes de patients atteints de pneumonie de
cause inconnue à Wuhan, en Chine.
Les résultats des enquêtes ont conduit à l'identification d'un nouveau coronavirus chez les
patients atteints (1). Suite à son identification le 7 janvier 2020 par le centre chinois de
contrôle et de prévention des maladies, le nouveau virus et la maladie ont été officiellement
dénommé SARS-CoV-2 (pour le coronavirus-2 du syndrome respiratoire aigu sévère) et
COVID-19 (Pour COronaVIrus Disease 2019), respectivement, par l'Organisation mondiale
de la santé (OMS) (2) et l’ICTV. Le 11 mars 2020, l'OMS a annoncé publiquement l'épidémie
de SRAS-CoV-2 comme une pandémie mondiale (3).
Le virus affecte principalement le système respiratoire provoquant un large panel de
présentations cliniques ; de l’infection asymptomatique aux formes graves avec SDRA
(syndrome de détresse respiratoire aigu) nécessitant une prise en charge en réanimation. Des
signes d’une infection respiratoire avec fièvre, toux et asthénie sont observés chez la majorité
des malades symptomatiques (4). La mortalité est élevée chez les personnes âgées (plus de 60
ans) et chez les personnes souffrant de comorbidités. (5).
Le SARS-CoV-2 appartient à la famille des coronavirus (CoV) et est le septième coronavirus
pathogène pour l’Homme. C’est un virus enveloppé avec un génome à ARN simple brin de
polarité positive d’environ 29,8 à 29,9 kb avec 10 cadres de lecture ouverts (ORF) codant
pour environ 30 protéines. L’ORF1ab code pour 16 protéines non-structurales, dont la RdRp,
Les autres ORF codent entre autre, pour quatre protéines structurales ; la glycoprotéine S, qui
est l’épitope des anticorps neutralisants et le site d’attache au récepteur ACE, la protéine N
(nucléoprotéine), la protéine d’enveloppe E et la matrice M. Les gènes codant pour la
RdRp et les protéines structurales sont les cibles recherchées par les tests PCR.
Etant un virus à ARN, les mutations sont habituelles et peuvent engendrer des variants
d’intérêt tel que les variants Alpha, Bêta, Gamma, Delta ou encore fin Novembre 2021
Omicron. Ces mutations peuvent avoir un impact sur la contagiosité, l’efficacité des vaccins,
la sévérité de la maladie ou encore le diagnostic virologique (6).
1
De très nombreux tests diagnostiques ont été développés et mis sur le marché dans un délai
très court pour faire face à la pandémie. La technique RT-PCR est la méthode de référence
pour le dépistage et le diagnostic de l’infection à SARS-CoV-2 (7).
Plusieurs kits sont disponibles dans le marché et les cibles virales les plus utilisées sont situés
dans les gènes : S (Spike), E (enveloppe), N (nucléocapside) et RdRp (ARN polymérase ARN
dépendante de l’ORF1ab).
L’objectif principal de cette étude est de faire une comparaison au laboratoire central de
virologie du CHU Ibn Sina de Rabat, entre le nouveau kit MAScIR SARS-CoV-2 M kit 2.0
et le kit de référence GeneFinderTM COVID-19 Plus RealAmp kit qui sont des tests
qualitatifs basés sur la technologie RT-qPCR permettant la détection de l’ARN du virus
SARS-COV-2.
2
PREMIERE PARTIE :
GENERALITES CONCERNANT LE SARS-COV-2
3
I. Historique
En 1930, les chercheurs américains Schalk et Hawn ont signalé une nouvelle
maladie respiratoire chez les poussins, se caractérisant par une détresse respiratoire
aigue. Le virus responsable est appelé : virus de la bronchite infectieuse aviaire
(Infectious Bronchitis Virus, IBV).
En 1965 Les chercheurs britanniques David Tyrrell et Malcolm Bynoe caractérisent
à partir d’écouvillonnage respiratoire d’un jeune garçon présentant un rhume typique
une souche virale, appelée B 814 (8).
En 1966, les chercheurs Hamre et Procknow de l'Université de Chicago ont rapporté
qu'ils avaient été cultivés dans des cultures de cellules rénales embryonnaires
humaines inoculées avec des échantillons des voies respiratoires d'un patient atteints
de rhume, la souche virale, appelée 229 E, dont le matériel génétique est composé
d'ARN (9).
En 1967, Kenneth McIntosh des National Institutes of Health (NIH, Bethesda, Maryland) et
ses collaborateurs ont découvert une nouvelle souche de virus appelée OC43, dont la forme
était très similaire au virus de la bronchite infectieuse aviaire. Ce virus a été isolé à partir
d'explants de tubes humains stockés en culture d'organes, d'où le « OC » dans le nom du virus
(10).
Le 16 novembre 1968, le magazine "Nature" a rapporté qu'un groupe de virologues avait
déterminé le nom "coronavirus" pour un nouveau groupe de virus sur la base de critères
morphologiques complets (11).
Entre novembre 2002 et juillet 2003, un agent infectieux a causé une épidémie de pneumonie
atypique dans la province de Guangdong, Sud de la Chine. Se caractérisant généralement par
une fièvre élevée et des symptômes respiratoires légers, mais évoluant rapidement vers une
pneumonie en quelques jours. L’agent responsable du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère
(SRAS) est nommé SARS-CoV ayant infecté 8437 individus et causé 813 décès dans le
monde représentant ainsi la première pandémie bien documentée de ce siècle (12).
Le MERS-CoV, est apparu pour la première fois en 2012 en Arabie saoudite. Ce syndrome
respiratoire du Moyen-Orient affecte les voies respiratoires, provoquant de la fièvre et de la
toux, et la mort dans environ 30% des cas. Le virus a ensuite été trouvé dans plusieurs pays du
Moyen-Orient. Depuis lors, 1 219 cas ont été diagnostiqués, entraînant 449 décès. L'épidémie
est encore très limitée géographiquement.
4
Une épidémie de pneumonies de cause inconnue a été découverte et décrite à Wuhan, dans la
province du Hubei, en Chine, en décembre 2019. La découverte d’un nouveau coronavirus a
été déclarée urgence de santé publique de portée internationale par l’Organisation mondiale
de la santé (OMS) Le 9 janvier 2020. Appelé pour la première fois 2019-nCoV puis SARS-
CoV-2, ce virus est différent du virus SARS-CoV et il est également différent du virus
MERS-CoV.
La pandémie COVID-19 a été déclarée par l’OMS le 11 mars 2020 (13).
II. Rappels virologiques
1. Taxonomie et classification
a. Taxonomie
La classification des Coronavirus comme le rapporte le Comité International de Taxonomie

Virale (ICTV) est fondée sur Cinq domaines essentiels étant les seuls conservés dans tous les
virus de l’ordre Nidovirales (3CLpro, NiRAN, RdRp, ZBD et HEL1), ils ont été retenus pour
servir à sa constitution (14).
Les Coronavirus (virus enveloppés à ARN monocaténaire de polarité positive) forment une
famille de 39 espèces réparties en 27 sous-genres, 4 genres et 2 sous familles. Les coronavirus
(CoV) appartiennent à l'ordre des Nidovirales, dans la famille des Coronaviridae on trouve la
sous-famille des Coronavirinae composée de quatre genres : Alphacoronavirus (alpha-CoV),
Betacoronavirus (beta-CoV), Gammacoronavirus (gamma-CoV) et Deltacoronavirus (delta-
CoV). Le genre Betacoronavirus est subdivisé en 4 clades, nommés « A, B, C, et D » (15)
(Figure1).
5
Figure 1 : Classification et taxonomie des coronavirus humains (HCoV) (16).
Les sept coronavirus sont :
Alphacoronavirus: • Hcov-229E et HCoV-NL 63
Betacoronavirus: • Clade A: OC43 et HKU1 • Clade B: SARS-CoV et SARS-CoV-2
• Clade C: MERS-CoV
b. Réservoirs primaires et hôtes des coronavirus :
Les alpha-coronavirus et bêta-coronavirus infectent uniquement les mammifères et causent

généralement des maladies respiratoires chez l'homme et une gastro-entérite chez les animaux
(17), les deltacoronavirus et les gammacoronavirus infectent les oiseaux, mais certains d'entre
eux peuvent également infecter les mammifères.
Le coronavirus est à l'origine de diverses pathologies. Le virus de la bronchite infectieuse
(IBV) gamma-coronavirus est le principal responsable des infections respiratoires chez les
poulets et a un impact significatif sur l'industrie avicole (18). Le virus (MHV) Mouse
6
Hepatitis Virus peut provoquer une hépatite ou une encéphalite selon la souche virale ; il
infecte les souris (19). De nombreux coronavirus infectent les animaux. Parmi eux,
l’alphacoronavirus porcine Epidemic Diarrhea Coronavirus (PEDV) a été à l'origine d'un
grand nombre de décès de porcelets dans les élevages porcins aux États-Unis et en Asie en
2013 (20).
Les coronavirus ayant la capacité d’infecter les êtres humains sont les HCoV-229E, HCoV-
NL63 appartenant à alphacoronavirus et HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV,
MERSCoV, et le SARS-CoV-2 appartenant aux betacoronavirus (21) (Figure 2).
Trois coronavirus émergents sont hautement pathogènes le SRAS-CoV et le MERS-CoV et le
SARS-CoV-2. Ils provoquent de graves complications respiratoires humaines et les quatre
autres coronavirus humains (HCoV-NL63, HCoV-229E, HCoV-OC43 et HKU1) induisent
des maladies respiratoires légères chez les hôtes immunocompétents, bien que certains
puissent provoquer des infections graves chez les nourrissons, les jeunes enfants et les
personnes âgées (22).
Selon les données de séquence actuelles, les coronavirus humains sont d'origine animale
essentiellement la chauve-souris pour le SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-
NL63 et HCoV-229E.
La chauve-souris du genre Rhinolophus (Rhinolophidés) est l’hôte animal primaire du SARS-
CoV appartient à la famille des Vespertilionidae (Vespertilionidés). Tandis que, HCoV-OC43
et HKU1 doivent probablement provenir des rongeurs. Les animaux domestiques peuvent
jouer un rôle important en tant qu'hôtes intermédiaires activant le virus pour le transmettre
aux humains (23).
7
Figure 2 : Arbre phylogénétique des coronavirus (CoV).L'analyse phylogénétique (SplitsTree 4.0)
des isolats du SRAS-CoV-2 (39 isolats) basée sur le gène de la glycoprotéine spike (S) est illustrée.
Les isolats du SRAS-CoV-2 ont été analysés avec des CoV apparentés provenant d'anciennes
épidémies humaines et d'origine animale, notamment le MERS-CoV, le coronavirus bovin, le
coronavirus canin, les coronavirus des chauves-souris, le Bat-SL-SARS-CoV et le CoV équin.
L'analyse comprend les cinq sous-genres définis de Betacoronavirus, à savoir Sarbecovirus,
Embecovirus, Merbecovirus, Nobecovirus et Hibecovirus. Les isolats dans la zone grise sont issus de
l'épidémie actuelle de SRAS-CoV-2 dans le monde entier. Les voisins les plus proches du SARS-
CoV-2 sont le bat-SL-CoV, encerclé en jaune (23).
8
Figure 3: Origines animales des coronavirus humains (22).
9
c. Origine du SRAS-CoV-2
Le génome du SARS-CoV-2 présente, 79,6 % et près de 50 % de similitude avec les

coronavirus de type SARS-CoV et MERS-CoV, respectivement (24). Le SARS-CoV-2
présente 96 % d'homologie au niveau du génome entier avec le coronavirus de la chauve-
souris (25). Il existe sept domaines de réplication conservés dans le gène ORF1ab du SARS-
CoV-2 qui partagent une identité de séquence de 94,4 % avec le SARS-CoV. En outre, une
courte région RdRp provenant d'un coronavirus de chauve-souris appelé BatCoVRaTG13 a
démontré une identité de séquence élevée avec le SARS-CoV-2 (26). Le séquençage complet
de cet ARN a donné lieu à une concordance de séquence génomique complète de 96,2 %. La
protéine de liaison aux récepteurs spike S du SARS-CoV-2, qui présentait une grande
diversité dans d'autres CoV était identique à 93,1 % au gène S de RaTG13, à l'exception de
trois courtes insertions dans l'extrémité N-terminale et quatre changements de résidus clés sur
cinq dans le motif de liaison aux récepteurs (27). En outre, l'étude de la région codante du
génome du SRAS-CoV-2 a montré que les nucléotides et les acides aminés de cette région
présentent une ressemblance de 92,67 % et 96,92 % au niveau des nucléotides et 97,82 % et
98,67 % au niveau des acides aminés avec le génome du CoV du pangolin et de la chauve-
souris (28,29). Ces données phylogénétiques soutiennent la théorie de l'origine chauve-souris
du SRAS-CoV-2 et que le SARS-CoV-2 pourrait avoir évolué naturellement à partir du
coronavirus de chauve-souris RaTG13 (30). Cependant, des recherches supplémentaires sont
encore nécessaires pour clarifier la présence d'un hôte intermédiaire qui a favorisé la
transmission du virus, car certains éléments indiquent que le virus n'a pas été transmis de la
chauve-souris à l'homme (31).
2. Structure et génome du SARS-CoV-2

a. Structure du virus
La particule virale du SARS-CoV-2 est sphérique avec une taille moyenne de 120 nm (32), un
aspect en couronne des spicules de l’enveloppe virale en microscopie électronique d’où le
nom de Coronavirus (33). La nucléocapside est constituée de la protéine de capside (N)
complexée à l’ARN viral, est protégée par une enveloppe phospholipidique portant à sa
1
surface la glycoprotéine de surface : la protéine Spike (S), protéine d’enveloppe (E) ainsi que
la matrice (M) (34).
L'entrée des coronavirus dans les cellules hôtes est médiée par la glycoprotéine Spike
(protéine S) (35) (Figure 4).
Les glycoprotéines Spike transmembranaires forment des homotrimères qui dépassent de la
surface virale. La glycoprotéine Spike est essentielle pour l'entrée des coronavirus et constitue
donc une cible antivirale. La protéine S est composée de deux sous-unités fonctionnelles, dont
les sous-unités S1 et S2. La sous-unité S1 est constituée d’un domaine N-terminal (NTD) et
un domaine de liaison au récepteur (RBD) (Figure 5).
La fonction de la sous-unité S1 est de se lier au récepteur de la cellule hôte. S2 contient le
peptide de fusion (FP), la répétition heptadique 1 (HR1), une hélice centrale (CH), un
domaine connecteur (CD), une répétition heptadique 2 (HR2), un domaine transmembranaire
(TM) et une queue cytoplasmique (CT). La fonction de la sous-unité S2 est de fusionner les
membranes des virus et des cellules hôtes. Le site de clivage à la frontière entre les sous-
unités S1 et S2 est appelé site de clivage de la protéase S1/S2. Pour tous les coronavirus, les
protéases de l'hôte clivent la glycoprotéine au niveau du site de clivage S2', pour activer les
protéines qui sont essentielles pour fusionner les membranes des virus et des cellules hôtes
par des changements de conformation irréversibles. Les glycanes N-liés sont essentielles pour
la neutralisation des anticorps et la forme des trimères de protéines (36,37).
Dans l'ensemble, la structure de la protéine S du SARS-CoV-2 ressemble à celle de la
protéine S du SARS-CoV. Dans la conformation de préfusion, les sous-unités S1 et S2 restent
liées de manière non covalente. Différents types de coronavirus utilisent des domaines
spéciaux dans la sous-unité S1 pour reconnaître différents récepteurs d'entrée. Dans le cas du
SARS-CoV et SARS-CoV-2, pour pénétrer dans les cellules hôtes, ils reconnaissent le
récepteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) sur les cellules hôtes à
travers le domaine de liaison au récepteur (RBD) (Figure 6).
La protéine S présente deux formes de structure, dont l'état fermé et l'état ouvert.
À l'état fermé, les trois motifs de reconnaissance ne dépassent pas de l'interface formée par
trois protomères de la protéine S.
Dans l'état ouvert, le RBD est dans la conformation "up"en haut. L'état ouvert est nécessaire
pour la fusion de la protéine du SARS-CoV-2 et des membranes de la cellule hôte, facilitant
ainsi la pénétration du SARS-CoV-2 dans les cellules hôtes (36).
La Glycoprotéine S est à la base de la plupart des candidats vaccins; elle se lie aux récepteurs
membranaires des cellules hôtes via son RBD et assure une fusion virale avec les cellules
hôtes (37). Son principal récepteur est l’ACE2, bien qu'une autre voie via CD147 ait
1
également été décrite. Les glycanes attachées à la protéine S aident le virus à se fixer
initialement à la cellule hôte et agissent comme un manteau qui aide le virus à s'échapper du
système immunitaire de l'hôte. En fait, une étude a montré que les glycanes couvrent environ
40 % de la surface de la protéine de pointe. Cependant, l'ACE2-RBD s'est avéré être l'épitope
le plus grand et le plus accessible (38). Ainsi, le vaccin cible le domaine de liaison au
récepteur de la glycoprotéine Spike (essentiellement le RBD), à condition qu'il reste
accessible et stable dans le temps. Par conséquent, il est important de surveiller l'introduction
de toute mutation qui pourrait compromettre la potentielle efficacité d'un vaccin candidat.
La protéine M est la protéine virale la plus abondante présente dans la particule du virion,
donnant une forme définie à l'enveloppe virale (39), elle se lie à la nucléocapside et agit
comme un organisateur central de l'assemblage des coronavirus (40).
Les protéines M des coronavirus sont très diverses en termes de contenu en acides aminés,
mais conservent une similarité structurelle globale au sein des différents genres, elle possède
trois domaines transmembranaires, flanqués d'une courte extrémité aminé à l'extérieur du
virion et d'une longue extrémité carboxy terminale (41).
La protéine E du coronavirus est la plus petite des principales protéines structurelles (42), elle
joue un rôle dans l'assemblage, la pathogenèse et la libération du virus (43). Il s'agit d'un petit
polypeptide membranaire intégral qui agit comme une viroporine (canal ionique) (44).
L'absence de cette protéine est liée à l'altération de la virulence des coronavirus en raison de
changements dans la morphologie et le tropisme (45).
La protéine N des coronavirus est polyvalente. Parmi plusieurs fonctions, elle joue un rôle
dans la formation de complexes avec le génome viral, facilite l'interaction avec la protéine M
nécessaire lors de l'assemblage du virion, et améliore l'efficacité de la transcription du virus
(46, 47).
Elle possède trois domaines différents et extrêmement conservés, à savoir un domaine N-
terminal (NTD), un domaine de liaison à l'ARN ou une région de liaison (LKR), et un
domaine carboxyl-terminal (CTD) (48). Le NTD se lie à l'extrémité 3’ du génome viral, peut-
être par l'intermédiaire d'interactions électrostatiques, et est très divergente à la fois en
longueur et en séquence (49).
Le LKR peut interagir directement avec l'ARN in vitro et responsable de la transduction du
signal cellulaire (50, 51). Il module également la réponse antivirale de l'hôte en agissant
comme un interféron (IFN) et un antagoniste de l'ARN (52).
1
Figure 4: Structure schématisée du SARS-CoV-2 (53).
Le génome est constitué d'un brin d'ARN de polarité positive pour interagir avec la
nucléoprotéine de capside (N) pour former une nucléocapside en forme d'hélice (34).
1
Figure 5 : Le domaine RBD (receptor binding domain) est la région de la protéine spike entrant en
contact avec le récepteur cellulaire ACE2 qui sert de porte d’entrée au SARS-CoV-2 dans les cellules
qu’il infecte (54).
1
Figure 6 : (a) Structure du domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine S du SARS-CoV-2
(rubans bleu) complexé avec l'ACE2 humaine (rubans rouge). Le ruban vert indique le motif de liaison
au récepteur (RBM) dans les résidus d'acides aminés 424-494 ou 438-504.
(b) Le site actif de l'ACE2 (couleur jaune) qui interagit directement avec le RBD de la protéine S du
SARS-CoV-2. L'interaction entre la protéine S de SARS-CoV-2 et hACE2 est stabilisée par une
liaison hydrogène (lignes vertes) entre Arg439 (protéine S de SARS-CoV-2) et Glu329 (hACE2) (55).
1
b. Structure du génome
Le SARS-CoV-2 est un virus à ARN simple brin de polarité positive d’environ 30 Kb et sa

structure génomique suit les caractéristiques des gènes de coronavirus connus (56). La
polyprotéine ORF1ab couvre les deux tiers du génome viral est clivée en de nombreuses
protéines non structurales (nsp1 à nsp16). La troisième partie du génome du SRAS-CoV-2
code pour les principales protéines structurales; Gp spike (S), enveloppe (E), nucléocapside
(N), et membrane (M). En outre, six ORF, à savoir ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8 et
ORF10, n’ont pas de fonction connue (57) (Figure 7) (Tableau 1).
Nsp1 assure la médiation du traitement de l'ARN et la réplication. Nsp2 module la voie de
signalisation de la survie de la cellule hôte. Nsp3 est censé séparer la protéine traduite. Nsp4
contient le domaine transmembranaire 2 (TM2) et assure le réarrangement de la membrane.
Nsp5 participe au processus de la polyprotéine pendant la réplication. Nsp6 est un domaine
transmembranaire présumé domaine. La présence de nsp7 et nsp8 augmente de manière
significative l'association de nsp12 et de l'ARN modèle-primaire. Nsp9 fonctionne comme
une protéine de liaison à l'ARNss. Nsp10 est critique pour la méthylation de la coiffe des
ARNm viraux. Nsp12 contient l'ARN polymérase ARN dépendante (RdRp), qui est un
élément critique de la réplication/transcription des coronavirus. Nsp13 se lie à l'ATP et le
domaine de liaison au zinc de nsp13 participe au processus de réplication et de transcription.
Nsp14 est un domaine exoribonucléase de relecture. Nsp15 possède une activité
endoribonucléase dépendante du Mn (2+). Nsp16 est une 2'-Oribose méthyltransférase (58)
(Tableau 2).
1
Figure 7 : Présentation schématique de l'organisation du génome du SRAS-CoV-2, des ARNm sous-
génomiques canoniques et de la structure du virion (59).
1
Tableau 1: Caractéristiques des gènes exprimés par le SARS-CoV-2 (60).
Numéro Gènes Locus Taille (aa) Protéines
1 ORF1ab BCB15089.1/ 7096 Polyprotéine ORF1ab

BCB97900.1
1 ORF1a YP_009725295.1 4405 Polyprotéine ORF1a
2 ORF2 (S) BCA87361.1 1273 Péplomère (protéine S)
3 ORF3a BCA87362.1 275 Protéine ORF3a
4 ORF4 (E) BCA87363.1 75 Protéine d’enveloppe

(protéine E)
5 ORF5 (M) BCA87364.1 222 Protéine de membrane

(protéine M)
6 ORF6 BCA87365.1 61 Protéine ORF6
7 ORF7a BCA87366.1 121 Protéine ORF7a
8 ORF7b BCB15096.1 43 Protéine ORF7b
10 ORF9 (N) BCA87368.1 419 Phosphoprotéine de la

nucléocapside (protéine N)
1
Tableau 2: Protéines non structurales (NSP) du SARS-CoV-2 et leurs fonctions moléculaires
(58,60).
Nom de la protéine Taille

et identifiant (aa) Description Fonction proposée
Nsp1
YP_009725297.1 180 Protéine leader Induit le clivage de l'ARNm de l'hôte
Nsp2 Produit de réplicase
YP_009725298.1 essentiel pour la relecture de
638 Se lie aux Prohibitine 1 et 2
la réplication virale
Nsp3 Papaïne Libère les Nsp1, Nsp2 et Nsp3 de la
YP_009725299.1 protéinase région N-terminale des polyprotéines 1a et 1ab
1945
contenant plusieurs domaines.
Nsp4 Contient le domaine
YP_009725300.1 transmembranaire 2 (TM2) Réarrangement de la membrane
500
Nsp5 Impliqué dans le traitement de la
YP_009725301.1 Protéinase de type 3C polyprotéine virale pendant la réplication
306
Nsp6 Joue un rôle dans l'induction initiale des
YP_009725302.1 Domaine transmembranaire autophagosomes du réticulum
290
putatif endoplasmique de l'hôte
Forme un complexe avec Nsp8 (section
Nsp7 ARN polymérase suivante)
83
YP_009725303.1 ARN-dépendante et Nsp12 pour produire l'activité ARN
polymérase de Nsp8
Nsp8 ARN polymérase
YP_009725304.1 198 Multimérique réplicase Stimule Nsp12
Nsp9 Un monomarque Participe à la réplication virale agissant comme
YP_009725305.1 113 Liaison ARN viral protéine une liaison ssRNA protéine
Nsp10 Similaire à un facteur de Joue un rôle essentiel dans la coiffe des ARNm
YP_009725306.1 139 croissance viraux
Nsp11 _ _
YP_009725312.1 13
Nsp12 (Pol / RdRp) Responsable de la réplication et de la
YP_009725307.1 932 ARNpolymérase ARNdépendante transcription de l'ARN viral du génome
Nsp13
YP_009725308.1 601 Hélicase Déroule l'ARN duplex
Nsp14 Relecture du domaine
YP_009725309.1 527 Exoribonucléase Activité exoribonucléase
(ExoN / nsp14)
Nsp15 Dégrade l'ARN en (endoRNAse /
YP_009725310.1 346 EndoRNAse endoribonucléase) pour échapper à la défense
de l'hôte
Nsp16 2'-O-ribose
YP_009725311.1 298 méthyltransférase Intervient dans la méthylation
1
3. Cycle de réplication virale du SARS-CoV-2
Le cycle du virus dans la cellule hôte se répartit en trois grandes étapes : L’entrée du virus
dans la cellule hôte, suivie de la réplication du génome et ensuite la libération de nouveaux
virions. La capacité d’un virus à entrer dans une cellule hôte pour l’infecter, repose sur la
reconnaissance d’un récepteur que celle-ci exprime à sa surface. Dans le cas du SARS-CoV-2,
c’est la protéine S qui est responsable de la reconnaissance du récepteur cellulaire et elle
utilise comme récepteur l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2).
L'ACE2 est une métalloprotéinase composée de 805 acides aminés, caractérisée comme un
contre-régulateur du système rénine-angiotensine-aldostérone, responsable du clivage des
angiotensines I et II en peptides (angiotensine (1-9) et (1-7), respectivement) dont les effets
s'opposent aux actions vasoconstrictrices/pro-inflammatoires des angiotensines générées par
l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) (61,62).
Le cycle de vie du SARS-CoV-2 commence par la liaison du domaine de liaison au récepteur
(RBD) de la sous-unité S1 de la protéine spike à l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2
(ACE2) qui est exprimée à la surface des cellules épithéliales des voies respiratoires et de
l'intestin (63,64). Au contact des cellules, le virus pénètre dans les cellules hôtes par fusion
directe des membranes de la cellule hôte et l’enveloppe du virus et/ou par endocytose en
utilisant la sous-unité S2 de la protéine spike (63,65). La protéine spike est synthétisée sous la
forme d'un précurseur inactif et les clivages ultérieurs par les protéases cellulaires provoquent
des changements de conformation de la sous-unité S2, rendant la protéine spike
fonctionnellement active et prête pour la fusion membranaire ultérieure (66). Dans une entrée
par fusion directe, la protéine spike est clivée par la protéase transmembranaire sérine 2
(TMPRSS2) à proximité de l'ACE2 après la formation du complexe spike-ACE2, ce qui
déclenche la fusion membranaire avec la cellule hôte et la libération du génome viral dans les
cellules hôtes (65). D'autres protéases telles que la trypsine, la plasmine et le facteur Xa
peuvent également contribuer à ce processus (67,68). Le virus peut également pénétrer dans la
cellule hôte par un processus médié par l'endocytose. L'activation de la protéine spike semble
avoir lieu dans les endosomes par l'action de la furine et de la cathepsine B/L (CatB/L) dans
les endo-lysosomes (63,65), ce qui favorise finalement la fusion de l'enveloppe virale avec la
membrane de la cellule hôte et la libération de l'ARN viral.
L'ARN viral génomique dans le cytoplasme des cellules infectées peut être traduit en deux
polyprotéines, pp1a et pp1ab (69), qui sont traitées par deux protéases virales, la protéase de
2
type 3C (3CLpro), également connue sous le nom de protéase principale (Mpro), et la
protéase de type papaïne (PLpro), pour générer 16 protéines non structurelles (NSP) matures
(64,69). Parmi elles, la nsp12, également appelée ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp),
s'assemble avec plusieurs NSP pour former un complexe de réplication et de transcription
(RTC) ancré sur des vésicules à double membrane (DMV), responsable de la réplication et de
la transcription du génome viral (70). Les produits de l'ARN viral sont transportés vers le
cytosol par un complexe de pores moléculaires à travers la double membrane (70). Ensuite,
les protéines structurelles, notamment S, E et M (sont traduites dans le réticulum
endoplasmique (RE) et transportées vers l'appareil de Golgi pour l'assemblage des virions.
L'ARN génomique viral et la protéine structurelle N sont biosynthétisés et assemblés dans la
nucléocapside dans le cytoplasme, puis associés aux protéines structurelles virales pour
produire de nouveaux virions. Enfin, les virions sont libérés de la cellule infectée par
exocytose (71).
2
Figure 8 : Schéma montrant le cycle de vie du SARS-CoV-2 dans les cellules hôtes (72).
2
4. Variabilités génétiques du SARS-CoV-2
La variabilité génétique des virus présente un intérêt considérable sur le plan médical et
biologique, car elle a un impact important non seulement sur la prévention et le diagnostic des
maladies infectieuses, mais aussi pour les potentielles perspectives de thérapie. Les
mutations, délétions et recombinaisons sont considérées comme les origines de la variabilité
génétique du SARS-CoV-2. Les mutations sont le fondement de l'évolution et la source de la
variation génétique puisqu'elles peuvent fournir la variabilité nécessaire sur laquelle la
sélection naturelle peut agir et générer de la diversité (73). Les virus à ARN sont
particulièrement susceptibles d'avoir des taux de mutation élevé pendant la réplication du
génome et sont le plus souvent sans effets. Parfois, ces taux élevés sont corrélés à une
transmissibilité et / ou un échappement immunitaire accrue, des caractéristiques qui sont
considérées comme bénéfiques pour les virus (74).
Il est connu que dans la plupart des virus à ARN, l'ARN polymérase ARN dépendante n’a pas
d'activité correctrice, à quelques exceptions dont les coronavirus tels que le SARS-CoV-2. En
plus des mutations, la recombinaison génomique est un événement courant du processus de
réplication chez les coronavirus et peut jouer un rôle important dans la génération de la
diversité (75). La recombinaison est dirigée par la protéine non structurelle nsp14 3-5'
exoribonuclease (Nsp14-ExoN). Il a été démontré que l'inactivation génétique in vitro de
Nsp14-ExoN diminuait de manière significative la fréquence et les modèles modifiés de
recombinaison dans les cellules infectées et les virions libérés (75). Ainsi, le taux élevé de
mutations observé dans les virus à ARN, dû à l'absence ou la déficience de l'activité de
relecture conduit à une hétérogénéité génétique qui les aide à s'adapter et à surmonter les défis
environnementaux tels que le changement d'hôte, le traitement antiviral et les réponses
immunitaires, mais d'un autre côté, l'accumulation de mutations délétères excessives peut
entraîner des erreurs qui peuvent conduire à l'extinction de l'espèce virale (76,77). Ainsi,
l'environnement peut exercer une pression sélective sur les mécanismes impliqués dans
l'ajustement du taux de mutation en contrôlant le processus de réplication des organismes à
grand génome, notamment les coronavirus comme le SRAS-CoV-2 qui, parmi d'autres virus à
ARN, contiennent des génomes plus grands et présentent une activité 3′ -5′ ExoN différente
de celle des virus à génome plus court où cette activité est absente (78).
2
Les mutations les plus importantes SARS-CoV 2 ont un impact sur :
• La transmissibilité des souches
• La sévérité de la maladie
• L’efficacité des vaccins
• Le diagnostic virologique
L'impact des nouveaux variants du SARS-CoV-2 sur les performances des tests PCR n’est pas
significatif à ce jour car la plupart des tests PCR utilisés dans le monde continuent de détecter
l’infection, y compris le nouveau variant Omicron en se basant sur plusieurs cibles virales
dont les plus utilisées sont situés dans les gènes : S (Spike), E (enveloppe), N (nucléocapside)
et RdRp (ARN polymérase ARN dépendante de l’ORF1ab) (79).
Dénomination des variants du SARS-CoV-2
Il existe plusieurs dénominations en fonction des instances : GISAID, Nextstrain, Pango et

l’OMS (Lettres alphabet grec) pour nommer et suivre les lignées génétiques du SARS-CoV-2
avec une évolution et changement rapide même pour un même variant.
• Variant préoccupants (VOC) Ex: delta
• Un variant préoccupant du SARS-CoV-2 ou variant à suivre présente les changements:
 Augmentation de la transmissibilité
 Augmentation de la virulence, d'une maladie plus grave (par exemple,
augmentation des hospitalisations ou des décès)
• Variants à suivre (VOI) Ex: mu
• Variant qui présente des modifications génétiques connues pour affecter ou

susceptibles d'affecter les caractéristiques du virus, telles que la gravité de la
maladie, la transmissibilité; le diagnostic, les traitements ou l'échappement
immunitaire; ET
2
• qui cause une transmission communautaire majeure ou de multiples foyers de
COVID-19, entraînant une augmentation de la prévalence relative ainsi qu’une
augmentation du nombre de cas au fil du temps, ou d’autres conséquences
épidémiologiques exposant ainsi les personnes à des risques émergents Inquiétude
sur la santé publique mondiale.
• Variants sous surveillance (VUM)
• Variant qui présente des modifications génétiques soupçonnées d’affecter

les caractéristiques du virus, et il y a des signes qu'elle peut présenter un
risque futur, mais la preuve de l'impact phénotypique ou épidémiologique n'est
pas encore claire, donc qui devrait recevoir une surveillance renforcée et des
évaluations répétées et attendre d'autres preuves (80).
Figure 9 : Variants préoccupants (OMS Septembre 2021) (80).
Le 24 novembre 2021, un nouveau variant du SRAS-CoV-2, B.1.1.529, a été signalé à

l'Organisation mondiale de la santé (OMS), il est identifié pour la première fois au Botswana
et en Afrique du Sud.
Le 26 novembre 2021, l'OMS a nommé le B.1.1.529 Omicron et l'a classé dans la catégorie
des variants préoccupants (VOC).
2
Ce nouveau variant du coronavirus a causé l'inquiétude des scientifiques et des responsables
de la santé publique en raison d'un nombre inhabituellement élevé de mutations dont certaines
sont préoccupantes.
Les chercheurs d'Afrique du Sud ont indiqué que le variant Omicron présentait 50 mutations
et que la plupart d'entre elles (plus de 30 mutations) avaient été signalées dans la protéine
spike (protéine S) du SRAS-CoV-2, qui a été utilisée comme cible clé pour la plupart des
vaccins disponibles.
Le diagnostic du COVID-19 par les tests PCR actuellement disponibles peut être influencé car
de nombreux scientifiques ont signalé que l'un des trois gènes cibles n'est pas détecté (on
parle de négativité pour le gène S), ce qui peut donc être utilisé comme un marqueur de ce
variant. Néanmoins, tous ces résultats sont préliminaires et doivent être confirmés dans les
semaines à venir (80).
Figure 10 : distribution régionale des variants dans les nouvelles séquences (81).
2
III. Épidémiologie
1. Modes de transmission
Comprendre le mode, l'heure et le type de transmission du SARS-CoV-2 est essentiel pour le

développement des mesures efficaces de santé publique et de prévention des infections visant
à briser la chaîne de transmission.
Le SARS-CoV-2 se transmet principalement d'une personne à l'autre par contact direct,
indirect ou étroit par les gouttelettes respiratoires, la salive ou par les sécrétions respiratoires,
soit en étant inhalé, soit en se déposant sur les surfaces muqueuses, y compris les aérosols
produits lors de la toux et de la parole.
Le virus peut être transmis indirectement en touchant une surface ou un objet préalablement
contaminé par le virus, puis en se touchant le visage, les yeux ou la bouche.
A noter que la transmission par contact avec les objets contaminés est considérée comme
possible, bien qu’on n’ait pas isolé de virus cultivable en situation réelle (82).
La propagation du SARS-CoV-2 se produit principalement chez les personnes
symptomatiques, mais elle peut également se produire avant qu'elles ne présentent des
symptômes, lorsqu'elles sont en contact avec d'autres personnes pendant des périodes
prolongées.
Si une personne qui ne développe jamais de symptômes peut également transmettre le virus à
d’autres, on ne sait pas dans quelle mesure cela se produit, des recherches supplémentaires
sont nécessaires dans ce domaine.
2
Figure 11 : Risque de transmission du SARS-CoV-2 dans différentes situations. En vert : risque
faible. En orange : risque modéré. En rouge : risque fort (83).
2. Contagiosité et période d’incubation
La période d'incubation est estimée entre 1 et 14 jours, avec une médiane de 5 à 6 jours (84).
L'infectiosité culmine environ 1 jour avant l'apparition des symptômes et diminue dans les 7
jours.
Le taux de reproduction de base (Ro) de la maladie, défini comme le nombre attendu de

nouveaux cas d’une maladie directement générés par une personne infectée dans une
population où tous les individus sont sensibles à l'infection était estimé début 2020, d’après
les données de l’épidémie en Chine, à 3,28 en moyenne.
Le R0 est influencé par des facteurs biologiques tels que :
 La contagiosité après infection
2
 La voie d'infection et le mode de transmission, qui reste plus ou moins constants au
cours d'une épidémie
 La fréquence des contacts entre les individus de la population et la probabilité qu'un
contact entre un individu infectieux et un individu sensible entraîne une infection.
L'interprétation est généralement présentée comme simple ; on s'attend à ce qu'une épidémie

continue et que l’agent infectieux réussisse à infecter davantage d’hôtes si le R0 a une valeur
supérieur à 1, et à ce qu'elle diminue si le R0 est inférieur à 1.
IV. Histoire naturelle de la COVID-19
1. Physiopathologie
La pathogenèse du SRAS-CoV-2 est caractérisée par deux aspects principaux :

1) Le déséquilibre de la réponse immunitaire innée et acquise avec une sur activation critique
du système immunitaire inné conduisant à un syndrome de libération de cytokines, également
connu sous le nom de "tempête de cytokines" (85).
2) La liaison du SRAS-CoV-2 au récepteur ACE-2, un important régulateur du système
rénine-angiotensine-aldostérone et la réplication du SARS-CoV-2 avec l’effet cytopathique
qu’il engendre (63).
L'évolution sévère et l'issue potentiellement létale du SRAS-CoV-2 sont généralement
prédites par la présence d'un dérèglement des deux facteurs susmentionnés (86). Outre les
mécanismes physiopathologiques susmentionnés, il a également été démontré que le SRAS-
CoV-2 entraîne des modifications fonctionnelles et structurelles généralisées de
l'endothélium, similaires à celles de l'endothélite. Elles sont déclenchées par des cytokines
libérées par le système immunitaire inné et/ou par une infection directe des cellules
endothéliales (87,88). Ici, les petits vaisseaux semblent être particulièrement touchés, de sorte
que l'endothélite induite par COVID-19 est probablement une vasculite des petits vaisseaux
dans laquelle les gros vaisseaux ne semblent pas être touchés (89).
En plus du récepteur ACE-2, la protéase TMPRSS2 (Transmembrane Serine Protease 2) est
également nécessaire à la pénétration du virus dans la cellule. Cette protéase est
principalement exprimée sur les cellules épithéliales, par exemple dans le poumon, le rein, le
foie et l'intestin (63, 90).
Dans l'évolution délétère d'une infection à COVID-19, une évolution bi ou tripartite a été
fréquemment observée. Cette évolution peut également être assez bien décrite sur le plan
pathogénique en relation avec le système immunitaire (91), de sorte que l'on peut supposer,
2
sur la base de la corrélation temporelle, que le système immunitaire en est responsable. Après
l'infection des cellules exprimant les récepteurs de surface des enzymes de conversion de
l'angiotensine 2 (ACE-2) et TMPRSS2 par le SRAS-CoV-2, le virus se réplique activement et
est libéré de la cellule hôte (92) ce qui entraîne une fuite vasculaire, qui peut consécutivement
libérer d'autres substances (par exemple l'ATP) et ainsi influencer d'autres cellules voisines
telles que les cellules épithéliales et endothéliales et les macrophages alvéolaires. Cela
déclenche un environnement pro-inflammatoire avec la libération de cyto- et de chimiokines,
qui attirent les monocytes, les macrophages et les lymphocytes T sur le site de l'infection,
déclenchant ainsi une nouvelle inflammation et mettant en marche une boucle de rétroaction
pro-inflammatoire dans le sens d'un cercle vicieux. Dans les 5 à 6 jours suivant l'apparition
des symptômes, la charge virale du SRAS-CoV-2 atteint son maximum (93).
Dans le cas d'une réponse immunitaire adaptée, le système immunitaire inné, composé de
macrophages résidents, de cellules dendritiques, de granulocytes et de cellules NK, constitue
la première défense (94). Ces cellules présentatrices d'antigènes (CPA) présentent l'antigène à
leur surface par l'intermédiaire des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité
(CMH) et entraînent ainsi l'activation ultérieure des cellules B et T (virales) spécifiques de
l'agent pathogène avec la formation d'anticorps spécifiques de l'antigène. Chez les individus
immunocompétents, les cellules infectées par le virus peuvent être éliminées par les cellules T
cytotoxiques avant que celui-ci ne se propage davantage. En outre, les anticorps neutralisants
anti-Spike, les macrophages alvéolaires et les cellules apoptotiques entraînent la clairance du
virus et ne causent que des dommages mineurs aux poumons, ce qui conduit à un
rétablissement complet après le premier pic au jour 5-8, comme on le constate chez la
majorité des personnes infectées par le SRAS-CoV-2.
Dans le cas d'une réponse immunitaire déficiente (comme celle observée dans
l'immunosénescence) (95) ou d'une surinfection bactérienne, la boucle de rétroaction pro-
inflammatoire peut conduire à une accumulation pulmonaire supplémentaire de cellules
immunitaires, entraînant une surproduction de cytokines pro-inflammatoires avec
hyperinflammation (96). Cette hyperinflammation peut endommager le tissu pulmonaire et
ainsi entraîner une fibrose pulmonaire, comme décrit ci-dessous. La généralisation de ce qu'on
appelle l'orage de cytokines entraîne une atteinte systémique de plusieurs organes (97). Par
conséquent, la gravité de la maladie n'est pas seulement déterminée par l'infection virale avec
atteinte des voies respiratoires, mais aussi par la réponse immunitaire généralisée de l'hôte.
Outre le système immunitaire, le système rénine-angiotensine-aldostérone joue également un
rôle déterminant, comme nous l'avons déjà décrit plus haut. Cela conduit à un cercle vicieux
de production d'angiotensine II (Ang II), qui a également un effet pro-inflammatoire (98), et à
3
la régulation négative du récepteur ACE2 (122), qui affecte principalement l'endothélium
artériel et veineux. Une infection directe de l'endothélium vasculaire a également été décrite
(99), ce qui réduit la densité des récepteurs ACE2. Cela crée un environnement proadhésif
pour l'agrégation et la migration des macrophages, des leucocytes et des lymphocytes. Cela
entraîne à son tour la libération d'une variété de cytokines ainsi que de facteurs de
coagulation.
Les différentes cibles de la réponse immunitaire humorale et cellulaire anti-SARS-CoV-2 sont
résumée dans la figure 12.
Figure 12 : Schéma résumant les cibles virales de l’immunité humorale et cellulaire dirigée
contre le SARS-CoV-2 (101).
3
2. Manifestations cliniques :
L’infection par le SARS-CoV-2 semble progresser en trois phases : La phase d’incubation est
suivie d’une phase symptomatique qui apparaît dans un délai médian de 5 jours après le
contage et concerne 70 % des patients infectés.
Une phase d’aggravation dont le délai médian d'apparition du syndrome de détresse
respiratoire aiguë (SDRA) à partir de l'apparition de la maladie ou des symptômes chez 3,4%
des patients est de 8 jours. Le taux de mortalité lié au SDRA est autour de 50% (102) (Figure
9).
Les caractéristiques cliniques des patients atteints de la COVID-19 allaient de
l'asymptomatique dans les cas légers au syndrome de détresse respiratoire aiguë et au décès
dans les cas graves. Les symptômes les plus courants du COVID-19 sont les suivants : signes
classiques d’infection respiratoire : fièvre et toux accompagnées de myalgies, céphalées,
maux de gorge, congestion nasale, nausées, vomissements, diarrhées, agueusie ou anosmie
(103,104). Les comorbidités fréquemment signalées pour la COVID-19 sont l'hypertension,
l'obésité, le diabète et les maladies cardiovasculaires (105). Les facteurs de risque de mortalité
étaient l'âge (≥ 60 ans), le sexe masculin, les antécédents de tabagisme, l'hypertension, le
diabète, les maladies cardiaques et les maladies rénales chroniques (106).
La COVID-19 affecte principalement le système respiratoire, car le virus SRAS-CoV-2
pénètre et se réplique dans la muqueuse épithéliale des voies respiratoires supérieures. La
maladie peut entraîner des lésions myocardiques et des complications arythmiques (129,130),
des complications neurologiques, telles que des myalgies, des maux de tête, vertiges, troubles
de la conscience, hémorragie intracrânienne, l'hypogeusie et l'hyposmie (107,108), et même
des accidents vasculaires cérébraux (109,110).
Des symptômes digestifs et des lésions hépatiques (111), hypercoagulabilité et complications
thrombotiques (112) ont également été signalés. Les patients critiques pourraient rapidement
évoluer vers un SDRA, une acidose métabolique difficile à corriger, un choc septique, un
dysfonctionnement de la coagulation et une défaillance fonctionnelle de plusieurs organes.
Les complications graves comprenaient le SDRA, l'ARNémie (charge virale détectable dans
le sérum du SRAS-CoV-2), la défaillance de plusieurs organes et l'insuffisance cardiaque
aigue. Environ 26,1 % des patients ont été admis en soins intensifs en raison de complications
causées par COVID-19 (113).
3
Figure 13 : Facteurs de sévérité et présentation clinique de l’infection à SARS-CoV-2.
SDRA : syndrome de détresse respiratoire aiguë. IQR : intervalle interquartile ; FDR : facteur de
risque ; HTA : hypertension artérielle ; LDH : lactate déshydrogénase ; CK : créatine kinase ; ASAT :
aspartateamino transférase ; ALAT : alanine amino transférase ; TP : temps de prothrombine ; PNN :
polynucléaires neutrophiles ; Q-Sofa : score de Quick SOFA (Sepsis-related OrganFailure
Assessment) (114).
Figure 14 : Formes de gravité de la maladie (115).
3
V. Diagnostic virologique du SARS-CoV-2
1. cinétique des marqueurs virologiques du SARS-CoV-2
La détection du SARS-CoV-2 par RT-PCR est une méthode de référence pour diagnostiquer
la COVID-19 en phase aiguë dans les 2 premières semaines après l'apparition des symptômes
cliniques. Chez la plupart des personnes présentant une infection symptomatique, l'ARN viral
dans l'écouvillon nasopharyngé devient détectable 2 jours avant le premier jour des
symptômes et atteint son pic dans la semaine suivant l'apparition des symptômes.
La cinétique de production des anticorps anti SARS-CoV-2 est intéressante par la détection
des IgG et IgM.
Les IgM se positivent en moyenne 7 jours après l’infection (2 jours en moyenne après le
début des symptômes) et les IgG 15 jours après le début de l’infection. La présence
d'anticorps IgG anti-SARS CoV-2 permet un diagnostic rétrospectif de l'infection par le
SARS-CoV-2 dans les 2 à 3 premières semaines après l'apparition des symptômes cliniques.
La présence d'anticorps de type IgM anti-SARS-CoV-2 est un marqueur d'infections récentes,
ils sont détectés dans les 4 premières semaines après le début de l'infection, et les taux
d'anticorps peuvent varier au cours de cette période (116).
La cinétique de la réponse humorale varie en fonction de nombreux facteurs. Dans les formes
sévères de COVID-19, les titres élevés sont généralement atteints rapidement (Figure 15).
Dans la phase aiguë de COVID-19, les anticorps sériques peuvent être détectés par une
technologie de dosage immunologique automatisé ou des tests immunochromatographiques
rapides (117).
Lors de l'infection par le SRAS-CoV-2, une réponse immunitaire neutralisante anti-Spike a
été détectée, mais elle semble s'affaiblir 2 à 3 mois après l'infection, notamment chez les
personnes présentant des formes asymptomatiques ou pauci-symptomatiques (118).
3
Figure 15: Cinétique et variation estimée dans le temps des tests de diagnostic pour la détection de
l'infection par le SRAS-CoV-2 par rapport à l'apparition des symptômes (119).
Les intervalles de temps et les taux de détection virale estimés sont basés sur des données provenant
de plusieurs rapports publiés. En raison de la variabilité des valeurs entre les études. Les intervalles de
temps estimés doivent être considérés comme des approximations et la probabilité de détection de
l'infection par le SARS-CoV-2 est présentée de manière qualitative.
a : La détection ne se produit que si les patients sont suivis de manière proactive dès le moment de
l'exposition. b :Plus de chances d'obtenir un résultat négatif qu'un résultat positif par PCR d'un
écouvillon nasopharyngé.
3
2. Prélèvements
La détection de l’ARN viral par RT-PCR est réalisée sur des échantillons par écouvillonnage
naso-pharyngés dont les performances seraient meilleures que sur prélèvements par
écouvillonnage oropharyngés (Figure16). Les prélèvements salivaires sont moins
désagréables particulièrement pour les patients ayant des difficultés pour les prélèvements
nasopharangés (chez les jeunes enfants, chez des personnes présentant des troubles
psychiatriques…) (120). Les performances du test salivaire sont en revanche trop
insuffisantes pour envisager son utilisation chez les personnes asymptomatiques (trois cas
positifs sur cinq non détectés).
Les prélèvements profonds ne peuvent être réalisés qu’en cas d’hospitalisation tels que les
expectorations, lavages broncho-alvéolaires. Une élimination virale a été démontrée dans les
selles mais la relation entre la positivité dans les selles et le risque de contamination n’a pas
été établi.
Figure 16 : Coupe sagittale des voies aériennes supérieures illustrant les modalités de réalisation
d’un prélèvement rhino-pharyngé avec un écouvillon (7).
3
L'échantillon doit tenir compte de la dynamique d’excrétion virale. Elle atteint sa valeur
maximale pendant les trois premiers jours après l'apparition des symptômes. Alors qu’elle va
diminuer lorsque la réponse immunitaire (IgM puis IgG) apparaît (Figure 17). Après la
première semaine, nous avons observé une meilleure détection sur les échantillons profonds.
Figure 17 : Diagnostic biologique de l’infection à Sars-CoV-2 : stratégies et interprétation des

résultats (7).
3
3. Techniques de diagnostic et interprétation
3.1. Diagnostic direct
3.1.1. RT- PCR en temps réel :
Le diagnostic moléculaire confronte trois défis majeurs qui sont la détection de petites
quantités d’ARN viral pour réduire le nombre de faux négatifs, la différenciation de signal
positif parmi différents pathogènes pour diminuer le nombre de faux positifs et d’avoir un
débit important, afin de tester rapidement un grand nombre de patients avec la meilleure
fiabilité. Pour cette raison et compte tenu de la physiopathologie de l’infection à SARS-CoV-
2, la PCR en temps réel après transcription inverse (RT-PCR) est le test de référence pour le
diagnostic précoce chez les patients suspectés d’infection par le SARS-CoV-2 sur des
prélèvements par écouvillonnage nasopharyngés ou d'autres échantillons des voies
respiratoires supérieures, y compris l'écouvillon de gorge ou, plus récemment, la salive.
La RT-PCR utilise la transcriptase inverse pour retrotranscrire les molécules d'ARN en
molécules d'ADNc (complémentaire). Ensuite l'ADNc fonctionne comme une séquence
modèle pour la réaction PCR (121).
Le diagnostic était possible en ciblant le gène spike (S) du virus pour différencier entre le
SARS-CoV-2 et le Sars-CoV-1, mais avec une sensibilité limitée. La sensibilité a été encore
améliorée lors de l’intégration d’autres gènes viraux spécifiques ; l’enveloppe (E), la
nucléocapside (N), l'ARN dépendant de l'ARN polymérase (RdRp) et ORF1(122). Une
comparaison entre tous les gènes ciblés a révélé que les meilleurs résultats ont été obtenus
avec les gènes RdRp, et les recommandations de l’Organisation mondiale de la santé (OMS)
préconisent l’utilisation des gènes RdRp, E, N et S dans différentes combinaisons (PCR
multiplexe SARS-CoV-2).
La retrotranscription et l’amplification sont réalisées à l’aide d’un kit de qRT-PCR en une
étape utilisant un tube de réaction unique pour l’étape de reverse transcription et l’étape
d’amplification, elle minimise les résultats faussement positifs et permet un gain de temps.
Il existe différents kits pour le diagnostic moléculaire du SARS-CoV-2 ; semi- automatisé,

automatisé ou POC (test unitaire avec extraction, amplification et détection dans une seule
cartouche ou cassette). Ce sont des tests essentiellement qualitatifs avec une idée indirecte sur
la charge virale à partir du Ct.
La grande majorité est des trousses de qRT-PCR nécessitant une extraction d’acides
nucléiques préalables et adaptables sur de nombreux thermocycleurs. Il y’ a également les
3
tests PCR Syndromique et multiplexes permettant la détection de plusieurs cibles virales et
bactériennes en même temps.
Parallèlement à la RT-PCR, un test reposant sur une approche moléculaire de type RT-LAMP
(amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse) ciblant le gène RdRp a
également été validé par la Food and Drug Administration (FDA) aux États-Unis permettant
d’obtenir des premiers résultats en cinq minutes en cas de positivité et un résultat final en 13
minutes pour les négatifs (ID NOW™ Covid-19). Au-delà de cette validation de la FDA,
plusieurs évaluations ont mis en évidence une sensibilité insuffisante de l’ordre de 70 % pour
recommander ce test en dépistage.
Le Ct est le nombre de cycles d’amplification nécessaires pour produire un signal fluorescent,

les valeurs de Ct les plus faibles représentent des charges d'ARN viral plus élevées. Une
valeur de Ct inférieure à 40 est signalée comme étant PCR positive pour la plupart des kits
(119). Cette valeur est généralement diminuée au cours de la troisième semaine d'infection et
peut ne pas être détectée plus tard, les valeurs de Ct des patients extrêmement malades qui ont
été hospitalisés sont plus faibles que celles des patients présentant des symptômes légers et
peuvent rester positives après 3 semaines de maladie (123). La positivité de la PCR diminue
plus lentement dans les expectorations et peut être positive alors que l'écouvillon
nasopharyngé est négatif. Cependant, un résultat PCR " positif " reflète uniquement la
détection de l'ARN viral et n'indique pas nécessairement la présence d'un virus viable.
Dans certains cas, l'ARN viral a été détecté par la RT-PCR même au-delà de la sixième
semaine après le premier test positif.
Le test RT-PCR de COVID-19 peut donner des résultats positifs un jour avant le début des
symptômes, mais dans la plupart des cas, les patients n'ont pas été identifiés avant l'apparition
des symptômes en raison d'une faible charge virale (124).
Dans une étude portant sur 205 patients présentant une infection confirmée par COVID-19, la
positivité de la RT-PCR était la plus élevée dans les échantillons de lavage broncho-alvéolaire
(93 %), suivis de l'expectoration (72 %), l'écouvillon nasal (63 %) et l'écouvillon pharyngé
(32 %) (121). Les résultats faussement négatifs sont principalement en raison d'un moment
inapproprié pour le prélèvement des échantillons par rapport à l'apparition de la maladie et à
des déficiences dans la technique d'échantillonnage, en particulier pour les écouvillons
nasopharyngés.
3
La spécificité de la plupart des tests RT-PCR est de 100% car la conception de l'amorce est
spécifique à la séquence génomique du SRAS-CoV-2. Des résultats faux positifs peuvent être
dus à des erreurs techniques et à la contamination des réactifs.
Deux tests de RT-PCR en temps réel en été mis en comparaison dans cette étude le premier
kit MAScIR SARS-CoV-2 M kit 2.0 conçus et fabriqué au Maroc pour la détection du SARS-
CoV-2 et développé par la société MOLDIAG créée par la Fondation MAScIR, Il s’agit d’un
test en triplex qualitatif d’amplification in vitro basé sur la (RT-qPCR) et dont les cibles sont
deux gènes viraux du SARS-CoV-2 ; RdRp et S et un contrôle interne d’origine humaine
tandis que le deuxième kit permet la détection de trois cibles virales (RdRp, N et E) et d’un
contrôle cellulaire il s’agit du kit de référence GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit.
3.1.2. Tests Antigéniques
Les tests de diagnostic rapide (TDR) détectent la présence d'antigènes viraux du SRAS-CoV-
2 dans un échantillon oropharyngé ou nasopharyngé ou dans un échantillon de salive d'une
personne infectée. Le principe repose en général sur l’immunochromatographie avec une
lecture qui peut être soit manuelle soit automatisée. Lorsque l'antigène cible est présent en
concentration suffisante, il se lie aux anticorps spécifiques (le plus souvent anti-N) enduits sur
une membrane de nitrocellulose dans la cassette de test et produit un signal visuellement
détectable. Si les tests basés sur la PCR restent la référence, les tests rapides de détection de
l'antigène du SRAS-CoV-2 fournissent des résultats en 10 à 15 minutes, sont souvent utilisés
comme substitut pour détecter le SARS-CoV-2 chez les personnes symptomatiques dans les 5
jours suivant le début de la symptomatologie vu que sa sensibilité est généralement inférieure
à celle de la RT-PCR (125).
Les tests antigéniques rapides peuvent détecter la présence du SRAS-CoV-2 (y compris les
virus variants) ; ils peuvent contribuer à réduire la transmission grâce à une détection précoce
des cas hautement infectieux, permettant de commencer rapidement la recherche des contacts.
La rapidité et la commodité des tests antigènes COVID-19 ont conduit à l'autodiagnostic dans
les écoles, les bureaux et les universités compte tenu de la plus grande accessibilité des TDR
et de la généralisation de l'autotest à domicile, il y a eu des résultats faussement positifs.
Lorsque ces faux positifs sont ensuite testés par PCR, ils s'avèrent être de vrais négatifs (126).
La figure 18 ci-dessous montre les résultats du test antigénique ; l'expression du résultat est t
binaire : positif/négatif.
4
Figure 18: Résultat d’un test rapide antigénique pour le dépistage du SARS-CoV-2 ( positif et négatif)
(130,131)
3.2. Diagnostic indirect

3.2.1. Sérologie
L'infection par le COVID-19 peut également être détectée indirectement comme diagnostic de
rattrapage, en détectant la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par le SARS-CoV-2. Le
diagnostic sérologique est également un outil important pour étudier la séroprévalence de la
maladie COVID-19 dans la communauté et pour identifier les individus qui sont
« immunisés » (anti-Spike neutralisants) et potentiellement "protégés" contre l'infection (119).
De nombreux tests automatisables destinés à la détection des anticorps IgG et IgM dirigés
contre la protéine de la nucléocapside du SARS-CoV-2 (marqueurs de contact avec le SARS-
CoV-2) ou des anti-Spike (corrélés à la séroneutralisation) dans le sérum et le plasma ont été
développés et mis sur le marché (de type Enzyme-Linked Immunosorbent Assay [ELISA] ou
Chemiluminescent Microparticule Immunoassays [CMIA], par exemple) ou
immunochromatographique TDR.
Les taux les plus élevés des IgM et des IgG sont observés au cours de la deuxième et de la
troisième semaine de la maladie. Ils commencent à se positiver dès le quatrième jour après
l'apparition des symptômes. Les IgM commencent ensuite à diminuer à la cinquième semaine
et disparaissent presque à la septième semaine, tandis que les IgG persistent au-delà de la
septième semaine (127). Dans une étude portant sur 140 patients, la sensibilité combinée de la
PCR et de la sérologie des IgM dirigées contre les l'antigène de la nucléocapside (NC) était de
98,6 % contre 51,9 % pour un seul test PCR. Au cours des 5,5 premiers jours, le taux de
positivité de la PCR quantitative était plus élevé que celui des IgM, tandis que l'IgM avait un
4
taux de positivité plus élevé après le jour 5,5 de la maladie (128). En général, la majorité des
anticorps sont produits contre la protéine la plus abondante du virus, à savoir la NC, par
conséquent, les tests qui détectent les anticorps contre la NC seraient les plus sensibles.
Cependant, la protéine RBD-S (receptor-binding S (RBD-S) est la protéine d'attachement à
l'hôte, et les anticorps contre le RBD-S seraient plus spécifiques et devraient être
neutralisants, par conséquent, l'utilisation de l'un ou des deux antigènes pour la détection les
IgG et les IgM se traduirait par une sensibilité élevée (129). Les anticorps peuvent toutefois
présenter une réactivité croisée avec le SARS-CoV et peut-être d'autres coronavirus.
3.2.2. Interprétation des résultats

Le tableau ci-dessous résume les principaux profils clinico-virologique des situations
diagnostic du SARS-CoV-2.
Symptômes RT-PCR IgM IgG Interprétation

+ + _ _ Infection aigue
_ + + + Infection aigue
_ + +/_ _/+ Infection aigue
+ _ + + Infection récente
+ _ +/_ + Infection tardive
_ _ _ + Infection ancienne ou
vaccination
_ _ _ _ Absence d’infection
Tableau 3 : Interprétation clinique des résultats des tests diagnostiques (7).
4
V. Aspect préventif et thérapeutique
1. Mesures barrières :
À l'instar des autres maladies infectieuses émergentes, aucune intervention pharmacologique
n'etait disponible au début de l'épidémie de COVID-19 en décembre 2019. En l'absence de
vaccins et d'antiviraux, seule la mise en œuvre stricte de mesures de santé publique à
l'ancienne peut contrôler efficacement le développement de l'épidémie (132). Par rapport au
SARS, le taux de mortalité du COVID-19 est plus faible, mais il a un nombre de reproduction
plus important et une plage de transmission plus large. (133).
Lors de l'épidémie de COVID-19, la plupart des pays ont pris des mesures de prévention et de
contrôle complètes, strictes et rapides, comprenant l'isolement, la quarantaine, l'hébergement
sur place, le port du masque, le respect des mesures de distanciation physique, l’hygiène des
mains, le nettoyage et la désinfection des surfaces (selon les règles applicables) et l’isolement
des personnes symptomatiques, etc. Plus important encore, ils ont adopté des mesures de
"restrictions de mobilité extrêmement strictes". Contrairement aux restrictions de voyage et
aux contrôles aux frontières dans les pays étrangers, les mesures mises en œuvre comprennent
des restrictions de la mobilité entre les provinces, les villes de niveau préfecture, les régions
de niveau comté, les villes et les villages, ce qui est sans précédent. Seules quelques villes
ayant connu de graves épidémies étaient verrouillées. L'adoption de restrictions strictes en
matière de mobilité, qui signifie que les habitants des villes et des campagnes sont limités
dans leur vie et que toutes les activités productives sont perturbées, a un coût social et
économique énorme.
Pour empêcher la propagation de la COVID-19, les mesures barrières sont les suivantes :
 Maintenir une distanciation physique d’au moins 1 mètre.

 Porter un masque
o Nettoyer les mains avant de le mettre, ainsi qu'avant et après l'avoir enlevé, et
après l'avoir touché à tout moment.
 Se laver les mains fréquemment (+ de 10 secondes)
 Désinfecter les mais avec les solutions hydro-alcooliques
 Toussez ou éternuez dans le coude.
 S’isoler si vous présentez des symptômes.
4
2. Vaccins anti-SARS-CoV-2 :
De multiples stratégies, nouvelles et traditionnelles, ont été adoptées dans le cadre du

développement des vaccins anti-COVID-19, leur efficacité et leur puissance dépendent de la
sélection des antigènes, du système d'administration, de la formulation, des adjuvants et des
voies d'immunisation (aérosol, intramusculaire et sous-cutanée) (134). Jusqu'au 2 avril 2021,
le nombre de vaccins contre la COVID-19 en cours de tests précliniques et cliniques était de
184
Depuis l'apparition de la maladie, les technologies qui ont été introduites pour la vaccination
contre le COVID-19 comprennent l'ARNm, l'ADN recombinant (protéine S), vecteur viral
(Spike ou S1 inséré dans un vecteur adénovirus modifié ou dans des vecteurs de la vaccine),
les sous-unités (Spike, S1, RDB, nucléocapside), particules de type viral (VLP) (RDB, S ou
co-expression de S1, M, et E produite dans un baculovirus) et les vaccins
protéiques/peptidiques (Figure 19). (137,138).
Les vaccins les plus utilisés sont les suivants : les vaccins inactivés, les vaccins à ARNm, les
vaccins vecteurs viraux non réplicatifs.
Bien que les vaccins à base d'acide nucléique puissent être produits rapidement, ce nouveau
type de vaccin nécessite des conditions de transport et de stockage relativement strictes pour
garantir la stabilité du vaccin. En revanche, la méthode de préparation des vaccins inactivés
est bien établie et fiable, mais les vaccins qui en résultent procurent une immunité
relativement faible. L'utilisation de la technologie de la protéine recombinante est mature et
considérée comme plus sûre que les autres vaccins, avec une faible possibilité de provoquer
des réactions indésirables, mais la réponse immunitaire peut aussi être insuffisamment forte
pour contrôler le virus.
Dans les technologies à base de fragments viraux, les études se sont principalement
concentrées sur la protéine S. De plus, des formulations basées sur les nanotechnologies ont
été introduites dans les développements actuels de vaccins contre le SARS-CoV-2 afin
d'augmenter l'absorption de l'antigène par les cellules présentatrices d'antigène (CPA) (135).
Presque toutes les plateformes et les technologies sont intégrées sur la base d'anciens vaccins
contre le SRAS, le MERS, des coronavirus animaux, de la grippe et du virus Ebola.
En outre, un avantage par rapport aux technologies traditionnelles, en sous-unités, l'ARNm et
les vaccins peptidiques, la bioinformatique et les méthodes ont permis d'accélérer
considérablement le développement du vaccin COVID-19 (136).
4
A titre de comparaison, les nouveaux vaccins permettent de gagner du temps et ne nécessitent
pas l'isolement et la culture du virus (problèmes d'accessibilité et de faisabilité), ni
l'exposition directe au virus vivant (problèmes de sécurité) (139,140).
4
Figure 19 : Types de vaccins anti-COVID-19 (141).
4
3. Traitement
La pandémie qui s'est déclenchée dans les premiers mois de 2020 dans le monde entier a
déclenché une ruée sans précédent vers des centaines d'essais cliniques évaluant à la fois des
médicaments approuvés ou homologués et des agents expérimentaux (142).
Tous ces essais cliniques sont basés sur le cycle de vie viral, de l'attachement et de l'entrée
dans la cellule hôte, la traduction, la réplication et la libération, et les dommages ultérieurs
résultant de l'affaiblissement du système immunitaire (143).
Il y a donc de multiples cibles à considérer pour une intervention thérapeutique potentielle.
La COVID-19 est plus qu'une infection pulmonaire car l'imagerie et les examens
pathologiques montrent que le syndrome est un processus thrombo-inflammatoire qui affecte
initialement la perfusion pulmonaire, mais qui touche ensuite tous les organes du corps
humain(144).
Le développement de nouveaux médicaments antiviraux prend beaucoup de temps, pour
accélérer le processus, la réaffectation de médicaments existants peut être une stratégie
efficace pour le développement de médicaments (145). Cela a conduit à la recherche de
nouvelles molécules antivirales et, plus important encore, de nouvelles cibles pour le
développement thérapeutique (146,147).
Formes bénignes: Traitement symptomatique
Hospitalisation pour les formes sévères et graves :
• Oxygénothérapie
• Anticoagulation
• Corticothérapie
• Immunomodulateurs: Ex anti-IL6
• Prévention des surinfections bactériennes
• Mesures de réanimation en fonction de la sévérité
Les immunothérapies telles que les sérums convalescents ou d'autres agents sont également
considérés comme une option de traitement.
4
Figure 20 : Protocole national thérapeutique COVID-19 (148).
En Octobre/Novembre 2021 ; deux type de traitement anti-viraux ont été développé contre le
SARS-CoV-2 et ont une ATU (autorisation d'utilisation d'urgence à la FDA)
• Merck; molnupiravir
• analogue ribonucléosidique, qui inhibe la réplication du SARS-CoV-2
• devrait être indiqué dans le COVID-19 léger à modéré chez les adultes à risque de
faire un COVID-19 sévère ou d'être hospitalisé.
• Réduit le risque d'hospitalisation ou de décès d'environ 50 % (données fabricants)
• Pfizer; Paxlovid,
• Inhibiteur de la protéase virale
• Efficace à 89 %, par rapport à un placebo pour prévenir les formes graves de
COVID-19 chez les personnes à haut risque (données fabricants)
4
Deuxième partie :
COMPARAISON ENTRE LE NOUVEAU KIT MAScIR SARS-
CoV-2 M 0.2 ET LE KIT DE REFERENCE GeneFinderTM COVID-
19 Plus RealAmp Kit
4
I. Matériels et Méthode
1. Echantillons :
Cette étude a été réalisée au Laboratoire Central de Virologie de l'Hôpital des Spécialisés de
Rabat sur des échantillons prélevés par écouvillonnage nasopharyngés ou par écouvillonnage
oropharyngés déchargés dans un milieu de transport virologique, pour la détection qualitative
du Génome du SRAS-COV-2 par RT-PCR, elle a portée sur 61 échantillons dont 38 étaient
des échantillons fortement positifs, 14 étaient faiblement positifs et 9 étaient négatifs.
Les échantillons traités dans cette études sont des échantillons stockés et conservés à une
température de -80°C. Leur stabilité est vérifiée par les résultats de leurs contrôles internes
(ARN cellulaire), avec une valeur de Ct inférieure à 35 conformes aux recommandations du
fournisseur.
2. Extraction des acides nucléiques
Au Laboratoire Central de Virologie l’extraction des acides nucléiques du SARS-CoV-2 est
effectuée d’une façon semi-automatisée en utilisant des plaques ou des strips d’extraction à
l’aide des extracteurs BIOEr, Big-Fish, MolArray et Maxwell Promega en fonction de la
disponibilité des réactifs correspondants. Pour cette étude, nous avons effectuée l’extraction
sur l’extracteur BIOER uniquement pour avoir un rendement homogène de l’extraction.
 Extracteur BIOER
C’est un automate d’extraction des acides nucléiques par billes magnétiques pour extraire et
purifier l'acide nucléique. Il présente les caractéristiques suivantes : petit volume, poids léger,
faible bruit, enceinte de travail entièrement fermée ; système d'exploitation en temps réel
intégré, chambre de travail transparente facilitant l'observation du travail, grand panneau LCD
facile à utiliser. Il dispose de fonctions puissantes telles que la protection de la porte ouverte,
la protection de la position ultra-limite et l'alarme. Il est plus sûr et plus fiable pour
l'utilisation. Il peut être utilisé pour extraire l'ADN et l'ARN du sang total, des cellules, des
tissus, etc., ce qui permet d'économiser du temps et de la main-d'œuvre (149).
Les étapes pour extraire les acides nucléiques sur BIOER sont les suivantes :
1. Allumer le PSM et attendre la stabilité du flux laminaire.
2. Désinfecter la surface de travail avec DNAsap et RNAaway et l’alcool 70°.
3. Déposer la plaque d’extraction, qui est prête à l’emploi à température ambiante.
4. Vortexer les tubes de prélèvement à faible vitesse (toujours à l’intérieur du PSM).
5. Mélanger et tapoter la plaque par une agitation douce pour mettre les microparticules
en suspension.
5
6. Déposer 10µL de la Protéinase K dans les colonnes 1 et 7.
7. Ajouter 300 µL du prélèvement respiratoire (le dépôt des échantillons se fait selon
l’ordre de la fiche de traçabilité de la manipulation).
A l’extérieur du PSM
8. Allumer l’extracteur BIOER.
9. Insérer 2 strips de protection par plaque dans leurs supports (au-dessus de la plaque).
(1 plaque 16 échantillons, 2 plaques 32 échantillons en même temps).
10. Placer la plaque (Il y a quatre blocs chauffants placés sur chaque plaque avec un
bloc de limite de chaque côté pour aider au positionnement, et une plaque à ressort de
chaque côté pour aider à fixer la plaque 96 puits profonds. S’assurer que la plaque est
placée uniformément avant de commencer).
11. Fermer le couvercle.
12. Lancer le RUN (Figure 21) :
 Cliquer sur RUN.
 Sélectionner le fichier « BioMed-Bioer ».
 Cliquer sur « SAVE/RUN ».
 Cliquer sur RUN.
Un message de vérification du dépôt du strip s’affiche : cliquer sur RUN.
 Durée d’extraction : 35min.
5
Figure 21 : Extracteur BIOER, unité COVID-19 LCV
Les différents extracteurs utilisés au Laboratoire Central de Virologie
Figure 22 : Extracteur Big-Fish, unité COVID-19 LCV
5
Figure 23 : Extracteur MolArray, unité COVID-19 LCV
Figure 24 : Extracteur Maxwell Promega, unité COVID-19 LCV
5
3. Amplification des acides nucléiques :
a. Procédure analytique du Kit MAScIR SARS-CoV-2 M kit 2.0
Le kit MAScIR SARS-CoV-2 M kit 2.0 est un test triplex qualitatif d’amplification in vitro
pour la détection d’acides nucléiques du SARS-CoV- 2 dans des écouvillons nasopharyngés
et oropharyngés, des liquides broncho-alvéolaires (LBA) et des aspirations bronchiques, basé
sur la réaction en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-qPCR) et dont les cibles sont
deux gènes viraux du SARS-CoV-2 , RdRp et S et un contrôle interne (IC) ARN d’origine
humaine. Le kit possède deux réactifs Mix 1 et Mix 2, un contrôle positif et un contrôle
négatif. Les trois cibles sont traitées dans le même puit réactionnel, pour chaque mélange
réactionnel en combinant les différents composants (pour plusieurs échantillons, préparer un
mélange du Mix 1+ Mix 2 suffisant pour l’ensemble des échantillons à analyser). On dépose
2.5 µL du Mix 1 qui est un Mix enzymatique (Cocktail enzymatique, dNTP et Tampon
réactionnel), 1 µL du Mix 2 qui est un Mix des amorces et Sondes (S (Cy5), RdRp (FAM) et
IC (VIC)) (Tableau 4) et 6.5 µL d’extrait viral des échantillons des patients (éluât), on obtient
un volume total de 10 µL par puits (Tableau 5). Un contrôle positif et un contrôle négatif sont
utilisés dans chaque série d’échantillons.
Tableau 4: Fluorophores et gène correspondants du Kit MAScIR SARS-CoV-2 M kit 2.0
Cible (ARN) Fluorophore
RdRp FAM
S Cy5
IC VIC
Tableau 5: Composition / Volume par réaction d’amplification du Kit MAScIR SARS-CoV-2 M kit
2.0
Composition Volume par réaction
Mix 1 (cap rouge) 2.5 µL
Mix 2 (cap vert) 1 µL
ARNm extrait 6.5 µL
Volume Total (éluats, CP, CN) 10.0 µL
5
Sur la même microplaque PCR, préparer un contrôle positif et un contrôle négatif.
Sceller la plaque à 96 puits avec le film adhésif, centrifuger la plaque avant de lancer le Run
d’amplification sur le thermocycleur.
A partir des mêmes éluats, l’amplification a été réalisée sur trois thermocycleur : ABI 7500
Applied Biosystem, QuantStudio™ 5 Applied Biosystem et Exicycler™ 96 Bioneer. Le
programme d’amplification était comme suit : une étape de transcription inverse à 50°C
pendant 5 minutes puis une étape d’activation à 95°C pendant 20 secondes suivies d’une
succession de 40 cycles de dénaturation-hybridation (la dénaturation se fait à 95°C pendant 3
secondes et l’hybridation/ Elongation à 60°C pendant 30 secondes). La durée totale de la
PCR sur le QS5 est de 55 min.
L’acquisition des résultats doit être effectuée à la fin de l’étape d’élongation.
Pour le seuil (threshold) les thermocycleurs 7500 FAST et QuantStudio 5 , les valeurs de seuil
doivent être fixées à 0.1 pour tous les gènes.
b. Procédure analytique du Kit de réference GeneFinderTM

COVID-19 Plus RealAmp Kit:
Le kit GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit est un test d’amplification in vitro conçu
pour détecter qualitativement le génome du SARS-CoV-2 basé sur la réaction RT-Qpcr et
permet la détection de trois cibles virales (RdRp, N et E) et d’un contrôle cellulaire (CI). Le
kit possède un Mix1 (mélange réactionnel), Mix 2 probe (mélange de sondes et d’amorces
pour l'amplification et la détection de chaque cible), un contrôle négatif et un contrôle positif,
le Mix (contient du Tris-HCl, MgCl2 et dNTPs) tandis que le probe (RdRp (FAM), N (JOE
ou VIC), E (Texas Red) et IC (Cy5)) (Tableau 6). Avant de lancer la PCR, tous les
composants doivent être décongelés, mélangés doucement et centrifugés brièvement pour
recueillir la solution au fond. Pour chaque mélange réactionnel on combine les différent
composants (pour plusieurs échantillons, préparer un mélange du Mix + Probe suffisant pour
l’ensemble des échantillons à analyser, plus un supplément pour éviter les erreurs de
pipetage), mélanger 10 µl du Mix1 et 5 µl du Mix 2 Probe pour préparer le Master Mix
(mélange réactionnel) pour chaque réaction (voir ci-dessous). Après avoir bien mélangé,
placer 15µl du Master Mix dans une plaque de 96 puits. Ajouter 5µl d'échantillon d'ARN
extrait (éluât) dans la plaque à 96 puits, on obtient un volume total de 20 µL par puits
(Tableau 7), puis mélanger tous les composants en pipetant. Procéder de la même manière
avec les autres échantillons d'ARN, le contrôle positif et le contrôle négatif. Sceller la plaque
5
à 96 puits avec le film adhésif, centrifuger la plaque avant de lancer le Run d’amplification
sur le thermocycleur.
L’amplification, réalisée sur les trois thermocycleurs susmentionné, comprends les étapes
suivantes : une étape de transcription inverse à 50°C pendant 20 minutes puis une étape
d’activation à 95°C pendant 5 minutes suivies d’une succession de 45 cycles de dénaturation-
hybridation (la dénaturation se fait à 95°C pendant 15 secondes et l’hybridation à 60°C
pendant 60 secondes). La durée totale de la PCR sur le thermocycleur QS5 est de 2 heures.
Tableau 6: Fluorophores et gène correspondants du Kit GeneFinderTM COVID-19 Plus RealAmp

Kit
Cible (ARN) Fluorophore
RdRp FAM
N JOE / VIC
E Texas Red
CI Cy5
Tableau 7: Composition / Volume par réaction du Kit GeneFinderTM COVID-19 Plus RealAmp Kit
Composition Volume par réaction
Mix 1 (Mélange réactionnel) 10 µL
Mix 2 Probe (Mélange de sondes) 5 µL
ARNm extrait ou CP ou CN 5 µL
Volume Total 20.0 µL
Sur la même microplaque PCR, préparer un contrôle positif et un contrôle négatif
5
Thermocycleur QuantStudio 5 Applied BiosystemsTM
L’Appleid BiosystemsTM QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument avec le VERSANT

kPCR MiPLX AD Software est un système d’amplification et de détection à cyclage
thermique avec des réactifs fluorescents de réaction de polymérisation en chaîne (PCR), qui
réalise la détection quantitative des séquences d’acides nucléiques (cibles) et la détection
qualitative des cibles (analyses en point final).
Il permet de surveiller en temps réel l’hybridation des sondes-amorces fluorescentes
spécifiques à la cible, et de fournir des résultats de diagnostic in vitro pour les analyses
d’ADN et d’ARN (150) (Figure 25).
Figure 25: L’amplificateur QuantStudio 5™ 5 Applied Biosystems unité COVID-19 LCV
5
Interprétation des résultats de la RT-PCR SARS-CoV-2 au LCV :
Pour la PCR la validation de la série consiste à valider les contrôles négatif et positif. Pour le
contrôle négatif, toutes les cibles doivent être négatives tandis que pour le contrôle positif,
toutes les cibles doivent être positives (Figure 13,14). Pour le kit MAScIR SARS-CoV-2 M
kit 2.0, Les valeurs du Ct du CP recommandés sont : de 22±2 pour le RdRp, 19±2 pour le S et
24±2 pour le CI tandis que pour le kit GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit : ≤22 pour le
RdRp, ≤22 pour le N, ≤22 pour le E et ≤21 pour le CI.
Puis on procède à la validation du contrôle interne (CI) de chaque patient. Le CI permet de
contrôler l’absence d’hibition au cours de l’extraction et/ou l’amplification et la « qualité » du
prélèvement, il doit être positif avec un Ct < à 35 pour le kit MaScIR.
Après la validation des contrôles, on passe à la lecture des résultats des patients. Si la valeur
Ct des deux cibles est inférieure à 30 selon les recommandations de la SFM, l'échantillon est
considéré comme positif, et si la valeur Ct est comprise entre 31 et 36, il est considéré comme
un échantillon faiblement positif. Un échantillon avec une valeur du Ct ≥37 est négatif.
Le résultat s'exprime qualitativement : positif/négatif. La valeur Ct (le nombre de cycles PCR

dans lesquels le signal est détecté en PCR, ce qui permet d'évaluer la charge virale de
l'échantillon à tester) n'est généralement pas indiquée dans le rapport de résultat biologique.
La PCR négative n'élimine pas l'infection par le SRAS-CoV-2, elle peut rester positive
pendant des semaines voire des mois, il s'agit de débris d'ARN du virus, le patient n'est plus
contagieux.
5
Figure 26: Résultat négatif toutes les cibles (CI, S, RdRp) sont négatives.
Figure 27: Résultat positif toutes les cibles (CI, S, RdRp) sont positives (Kit MaScIR
SARS-CoV-2).
5
RdRp (Ct) S (Ct) IC (Ct) Statut COVID-19
1 ≤ 37 ≤ 37 ≤ 35 Positif
2 ≤ 37 IND ≤ 35 Positif
3 IND ≤ 37 ≤ 35 Positif
4 IND IND ≤ 35 Négatif
5 ≤ 37 ≤ 37 IND Non valide (Re-tester)
6 IND IND IND Non valide (Re-tester)
Tableau 8 : Interprétation des résultats Kit MaScIR SARS-CoV-2).; IND : indéterminé
III. Résultats
1. Performance analytique :
a. Etude de la répétabilité et de la reproductibilité : (précision) :
La répétabilité et la reproductibilité sont des moyens de mesurer la précision, notamment dans
les domaines de la chimie et de l'ingénierie. En général, les scientifiques réalisent la même
expérience plusieurs fois afin de confirmer leurs résultats. Ces résultats peuvent présenter des
variations. Dans le contexte d'une expérience, la répétabilité mesure la variation des mesures
prises par un seul instrument ou une seule personne dans les mêmes conditions et la répétition
sur une courte période de temps. Le coefficient de répétabilité est une mesure de la précision,
qui désigne la différence absolue entre une paire de résultats de tests répétés.
La reproductibilité, quant à elle, fait référence au degré de concordance entre les résultats
d'expériences menées par différentes personnes, à différents endroits, avec différents
instruments. En d'autres termes, elle mesure notre capacité à reproduire les résultats des
autres. (151).
L’étude de la répétabilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 a été réalisée sur trois
prélèvements de concentrations différentes (concentration élevée, moyenne et basse). Chaque
échantillon a été repassé à cinq reprises le même jour, dans la même série, les mêmes
conditions du travail, avec les mêmes opérateurs, la même procédure et le même lot de
6
réactifs. Le CV recommandé par le fournisseur était un CV <5% de la valeur Ct. (Tableau
12).
Le test de reproductibilité a été étudié sur des contrôles positifs. En effet, les résultats des CP
du même lot, passés dans chaque série et sur plusieurs jours, ont été recueillis dans un tableau
Excel puis transformées en une courbe de levey jennigns. (Tableau 13) (Figure 23).
Tableau 9: Résultats du test de répétabilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0.
Concentration Cible Nombre de Moyenne Ecart type CV% Conclusion
de valeurs(N) du Ct
l’échantillon
Concentration RdRp 14.52 0.39 2.69 Conforme
élevée
S 16.02 0.87 5.44 Limite
5
CI 21.94 0.33 1.49 Conforme
moyenne
S 28.69 0.50 1.76 Conforme
5
CI 25.15 0.45 1.77 Conforme
faible
S 34.63 1.06 3.06 Conforme
5
CI 24.19 0.90 3.73 Conforme
6
Tableau 10: Résultats du test de reproductibilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0.
Thermocycleurs échantillons Nombre Moyenne Ecart CV% Conclusion
de valeurs(N) du Ct type
RdRp 19.56 1.11 5.67 conforme
CP S 26 20.64 1.09 5.27 Conforme

QS5
CI 21.95 1.18 5.39 Conforme
RdRp 21.62 0.75 3.46 conforme
CP S 13 21.04 0.87 4.11 conforme

EXICYCLER
CI 21.05 0.98 4.67 conforme
Reproductibilité RdRp 20.25 1.40 6.90 Limite
globale (QS5 + CP 39
S 20.78 1.03 4.93 conforme
EXICYCLER) CI 21.65 1.19 5.49 conforme
6
A
Figure 28 : Graphe Levey-Jenning (à gauche) et répartition des valeurs autour de la moyenne (à

droite) des résultats de la reproductibilité (A : Cible RdRp, thermocycleur QS5 / B : Cible S,
thermocycleur QS5 / C : Cible CI, thermocycleur QS5).
6
b. Résultat du test de spécificité :
• La spécificité mesure la capacité d'un test à générer correctement un résultat négatif

pour les personnes qui ne sont pas atteintes de la maladie testée (également appelé
taux de "vrais négatifs"). La spécificité est la mesure dans laquelle les négatifs réels
sont bien classés comme tels (les faux positifs sont donc peu nombreux).
• La spécificité d'un test est exprimée comme la probabilité (en pourcentage) qu'un test
renvoie un résultat négatif si le patient n'est pas atteint de la maladie.
• Pour l'estimer, il faut calculer la proportion de vrais négatifs dans les cas sains.
Mathématiquement, cela peut être énoncé comme suit :
• Sp = VN/VN + FP
• Une spécificité égale à 1 (100%) signifie que le test est négatif chez 100 % des
patients indemnes de la maladie
• Les tests spécifiques positifs permettent de confirmer une hypothèse diagnostique.
(Exemple: un test d'une spécificité de 90% renverra correctement un résultat négatif pour 90
% des personnes qui n'ont pas la maladie, mais renverra un résultat positif - un faux positif -
pour 10 % des personnes qui n'ont pas la maladie et auraient dû être testées négativement)
(152).
Pour évaluer la spécificité et mesurer la capacité du nouveau kit MAScIR triplex à générer
correctement un résultat positif, 18 échantillons positifs pour un virus respiratoire ont été
testés (Grippe A, Grippe B, VRS, …:) et dont le diagnostic a été fait par PCR sur GenXpert
ou FilmArray. Tous ces échantillons ont été non réactifs pour le SARS-COV-2. (Tableau 14).
6
Tableau 11 : Résultats du test de spécificité analytique du nouveau kit MAScIR SARS-CoV-2 M
2.0.
Résultat PCR SARS-COV-2

Date Echantillon Résultat PCR Xpert MAScIR triplexe (QS5)
1912313397 Grippe B
1802263748 Grippe A
1912162283 Grippe B
SARS-COV-2 négatif
22/12/2020 1911250014 VRS
1912234666 VRS
1912042566 VRS
1912314278 VRS
1912162258 VRS
Résultat PCR SARS-COV-2
Date Echantillon Résultat FilmArray BIOFIRE MAScIR triplexe (QS5)
01/01/2021 2101010012 Parainfluenza virus 3
12/01/2021 2101121486 Corona 229E

26/01/2021 2101260084 OC43
26/01/2021 2101263803 Rhinovirus/Enterovirus

SARS-COV-2 négatif
Adenovirus
15/02/2021 2102154282 Parainfluenza virus 4
21/02/2021 2102210221 Oc43
Parainfluenza virus 4
Rhinovirus/Enterovirus
20/03/2021 2103203593
Parainfluenza virus 3
6
c. Résultat du test de sensibilité
• La sensibilité mesure la fréquence à laquelle un test génère correctement un résultat

positif pour les personnes atteintes de la maladie testée (également appelée taux de
"vrais positifs"). La sensibilité d'un test de diagnostic mesure la capacité à bien
identifier les patients atteints de la maladie.
• Elle est exprimée comme la probabilité (en pourcentage) qu'un échantillon soit positif
si le patient est atteint de la maladie.
• L'équation suivante est utilisée pour calculer la sensibilité d'un test :
• Se = VP/VP + FN
• Un test sensible négatif permet au médecin d’exclure la maladie.
Un test très sensible détectera presque toutes les personnes atteintes de la maladie et ne
générera pas de résultats faussement négatifs. (Exemple : un test dont la sensibilité est de 90
% renverra correctement un résultat positif pour 90 % des personnes atteintes de la maladie,
mais renverra un résultat négatif - un faux négatif - pour 10 % des personnes atteintes de la
maladie et qui auraient dû être testées positives) (152).
Pour évaluer la sensibilité analytique du Kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0, des dilutions en
série (du 1/10 au 1/108) ont été réalisées sur un contrôle positif dont le Ct RdRp : 16, Ct S :
18, Ct CI : 17) par un diluant contenant de l’ARN de transfert à une concentration de 10
ng/µL.
6
Figure 29: Résultat du test de sensibilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 (Cible S: en vert,
Cible RdRp: en bleu, CI : en rouge).
Figure 30 : Résultat du test de sensibilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 du gène S.
6
Figure 31: Résultat du test de sensibilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 du gène RdRp.
Figure 32 : Résultat du test de sensibilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 du CI.
6
La limite inférieure de détection obtenue, définie comme étant la plus grande valeur du Ct
détectable, était un Ct de 37 pour le RdRp et de 38 pour le S.
d. Exactitude / comparaison inter-laboratoire :
Une comparaison inter-laboratoire ou EEQ (évaluation externe de la qualité) consiste à tester

les mêmes échantillons par différents laboratoires et à comparer les résultats.
En pratique, cela consiste à :
 Envoyer à un nombre suffisant de laboratoires une série d'échantillons aussi similaires

que possible ;
 Faire réaliser une série de tests par tous les laboratoires participants ;
 Déterminer une valeur de référence à trouver pour les résultats des tests ;
 Evaluer la différence entre les résultats de chaque laboratoire et la valeur de
référence ;
 Et conclure à un niveau de confiance dans le résultat du test.
Les résultats lui sont transmis de manière confidentielle. C'est à lui seul de déterminer si une
action corrective interne doit être mise en œuvre (153).
Une évaluation externe de la qualité de notre nouveau kit MAScIR a été réalisée dans le
cadre d’un programme international d’évaluation externe de la qualité des laboratoires. Dans
cette session, 5 échantillons d’EEQ ARN SARS-CoV-2 ont été traités par les deux
extracteurs (Maxwell et BigFish) et amplifiés par le même thermocycleur le QS5. Les
résultats des EEQ étaient parfaitement concordants avec nos résultats. Cependant la
comparaison des Ct et le calcul de l’exactitude de la mesure n’est pas possible vue que les
résultats qui nous ont été transmis ne précisent pas les valeurs des Ct des cibles.
6
WHO-SC WHO-SC WHO-SC WHO-SC WHO-SC
20-01 20-01 20-01 20-01 20-01
RA VR RA VR RA VR RA VR RA VR
Gène S D 27,00 D 21,00 ND ND ND ND D 31,00
Gène RdRp D 26,00 D 20,00 ND ND ND ND D 30,00
Interprétation P P P P N N N N P P
Tableau 12 : Résultats de l’évaluation externe de la qualité (EEQ) du kit MAScIR SARS-CoV-2 M

2.0. RA: Résultat attendu, NR: Notre résultat, N: Négatif, P: Positif, D: Détecté, ND: Non détecté.
Résultats de la comparaison entre le Kit MAScIR SARS-CoV-2 M et le Kit

de référence kit Genefinder :
La comparaison entre le kit GeneFinder et le nouveau Kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 a été
réalisée sur 61 prélèvements dont 38 étaient des échantillons fortement positifs, 14 étaient
faiblement positifs et 9 étaient négatifs (Tableau 16). L’extraction de ces prélèvements a été
effectuée sur le même extracteur (BIOER), tandis que l’amplification des ARN extraits a été
faite sur trois thermocycleurs (QS5, ABI, Exicycler).
7
Tableau 13: Comparaison entre le Kit MAScIR SARS-CoV-2 M et le Kit de référence kit
Genefinder ; P: résultat positif (Ct des cibles inférieur à 30), PF: résultat positif faible (valeur du Ct
des cibles entre 31 et 36), N: résultat négatif (Ct des cibles supérieur à 37).
GeneFinderTM
MAScIR SARS-COV-2 kit 2.0 COVID-19 Plus
Echantillon RealAmp (Référence)
Gène Gène
Extracteur Thermocycleur IC Interprétation Résultat
RdRp S
QS5 24 24 26
1 BIOER ABI 25 24 30 P P
Exicycler 24 24 26
QS5 22 23 24
Exicycler 23 23 24
QS5 35 34 25 PF
3 BIOER ABI 25 33 28 PF
P
Exicycler 31 30 24
QS5 36,5 32 27
4 BIOER ABI 32 31 PF P
Exicycler ±35 32 27
QS5 36 34 25
5 BIOER ABI 35 33 27 PF P
Exicycler 34 24
QS5 33 32 25
6 BIOER ABI 33 32 27 PF PF
Exicycler 32 32 25
QS5 33 33 26
7 BIOER PF PF
ABI 32 31 27
7
Exicycler f32 25
QS5 30 30 26
8 BIOER ABI 31 30 28 P PF
Exicycler f31 30 25
QS5 23 24 25
Exicycler 23 23 24
QS5 15 16 21
Exicycler 15 15 20
QS5 20 20 24
Exicycler 20 20 22
QS5 23 24 22
Exicycler 24 23 21
QS5 16 16 23
13 Bioer ABI 17 16 26 P P
Exicycler 16 16 22
QS5 22 22 23
Exicycler 22 22 22
QS5 - - 27
15 BIOER ABI - - 30 N N
Exicycler - - 26
QS5 - - 24
Exicycler - - 23
QS5 - - 26
17 BIOER N N
ABI - - 28
7
Exicycler - - 25
QS5 - - 25
Exicycler - - 24
QS5 - - 25
Exicycler - - 23
QS5 - - 27
Exicycler - - 25
QS5 - - 26
Exicycler - - 25
QS5 - - 24
Exicycler - - 23
QS5 16 16 24
Exicycler 15 15 22
QS5 28 28 25
Exicycler 28 28 25
QS5 30 29 24
Exicycler 30 29 23
QS5 26 27 23
Exicycler 28 27 21
QS5 13 13 24
27 Bioer P P
ABI 13 13 26
7
Exicycler 13 12 21
QS5 18 19 26
Exicycler 18 17 23
QS5 19 19 23
Exicycler 19 19 21
QS5 30 30 24
Exicycler 31 30 23
QS5 17 18 26
Exicycler 17 17 23
QS5 24 19 24
Exicycler 19 19 23
QS5 17 17 24
Exicycler 23 17 23
QS5 23 24 25
Exicycler 23 24 24
QS5 33 33 23
Exicycler f33 22
QS5 30 26 24
Exicycler 26 26 24
QS5 31 32 23
37 BIOER P P
ABI 32 30 25
7
Exicycler - 31 23 PF
QS5 14 15 23
Exicycler 14 14 22
QS5 18 18 22
Exicycler 18 18 21
QS5 31 31 22
Exicycler ±32 30 21
QS5 34 33 28
41 Bioer ABI 36 33 30 PF PF
Exicycler - f34 27
QS5 34,9 33 25
42 Bioer ABI 34 33 27 PF PF
Exicycler f33 f33 24
QS5 33,6 32 24
Exicycler 32 31 23
QS5 27 23 24
Exicycler 23 23 23
QS5 - 36,9 26
45 BIOER ABI - 37 28 N N
Exicycler - - 25
QS5 15 16 24
46 BIOER P P
ABI 16 15 27
QS5 28 28 25
47 BIOER P P
ABI 28 27 27
48 BIOER QS5 29 29 24 P PF
7
ABI 30 29 25
QS5 27 27 23
49 BIOER P P
ABI 27 26 23
QS5 13 13 24
50 BIOER P P
ABI 13 12 25
QS5 18 19 26
51 BIOER P P
ABI 19 18 28
QS5 19 19 24
52 BIOER P P
ABI 20 19 25
QS5 30 30 24
53 BIOER P P
ABI 31 29 26
QS5 18 18 26
54 BIOER P P
ABI 18 17 28
QS5 24 19 24
55 BIOER P P
ABI 23 18 25
QS5 17 17 23
56 BIOER P P
ABI 17 16 24
7
GeneFinderTM COVID-19
MAScIR SARS-COV-2 kit 2.0
Plus RealAmp (Référence)
Thermocycleur
Résultats Nb d'échantillons Résultats Nb d'échantillons
P 36
P 38
PF 2
ABI 7500 Applied
P 8
Biosystems PF 14
PF 6
N 9 N 9
P 32
P 34
PF 2
QuantStudio™ 5 Applied
P 7
Biosystem PF 13
PF 6
N 9 N 9
P 21
P 24
PF 3
Exicycler™ 96 Bioneer P 7
PF 12
PF 5
N 9 N 9
Tableau 14 : Comparaison qualitative des résultats des deux kits de RT-PCR SARS-COV-2. P :
résultat positif (Ct des cibles inférieur à 30), PF : résultat positif faible (valeur du Ct des cibles entre
31 et 36), N : résultat négatif (Ct des cibles supérieur à 37).
7
A
Figure 33: Résultat de l’application de la méthode de Bland et Altman sur la cible RdRp
(A Résultats sur QS5 et B résultats sur ABI 7500).
Les résultats qualitatifs de cette comparaison étaient globalement concordants. Aucune
discordance ayant un impact clinique n’a été détectée.
7
IV. Discussion :
Jusqu’à la fin novembre 2021, la pandémie liée au SRAS-CoV-2 a été responsable de

200 millions cas infectés par le virus dans le monde dont 5,1 millions des cas sont décédés.
Cette pandémie a marqué le monde de diverses manières et la réponse à la demande de tests a

été de développer plusieurs tests pour le diagnostic direct de la COVID-19. En effet, de
nombreux kits PCR ont été développés depuis l’autorisation en urgence d’utilisation du test
de diagnostic du SARS-CoV-2 dont la liste est disponible dans le
monde sur https://www.finddx.org/covid 19/pipeline/?section =molecular-assays#diag_tab.
Dans ce contexte, la Fondation Marocaine pour l’innovation et la recherche Scientifiques
Avancées (The Moroccan Foundation for Advanced Science Innovation and Research
(MAScIR)) a pu développer un kit, 100% marocain, de détection qualitative de l’ARN du
virus SARS-CoV-2, basé sur la technologie RT-qPCR.
L'algorithme de test a été particulièrement problématique car les personnes porteuses du virus
peuvent être asymptomatiques ou symptomatiques, présentant des symptômes légers à
graves. Le fait de ne pas savoir qui peut être porteur du virus en raison de l'absence de
symptômes a rendu nécessaire le dépistage du SRAS-CoV-2 chez les personnes à risque,
qu'elles soient symptomatiques ou asymptomatiques.
La précision du diagnostic du SARS-CoV-2 est essentielle pour identifier et prendre en charge

les personnes atteintes de la COVID-19. La norme de soins actuelle pour le diagnostic d'une
infection à SARS-CoV-2 est la détection de l'ARN viral à partir d'échantillons respiratoires
par une réaction en chaîne par polymérase avec transcription inverse en temps réel (rRT-
PCR).
Quels tests utiliser ? Le diagnostic était possible en ciblant le gène spike (S) du virus pour
différencier entre le Sars-CoV-2 et le Sars-CoV-1 avec une bonne spécificité, mais une
sensibilité limitée. L’intégration d’autres gènes viraux spécifiques tels que les gènes ARN
polymérase ARN dépendante (RdRp), nucléocapside (N) et enveloppe (E) a encore améliorée
la sensibilité. Des études antérieures ont mis au point un kit de RT-PCR en une seule étape
pour la détection de l'ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) et des gènes E et N. Le test
du gène RdRp a démontré la plus grande sensibilité, et les recommandations de l’Organisation
mondiale de la santé (OMS) préconisent l’utilisation des différentes combinaisons des gènes
RdRp, E, N et S (154).
7
En France, le Centre national de référence (CNR) des virus respiratoires dont la grippe a
fourni un protocole pour les laboratoires de virologie dérivés du test recommandé par l’OMS
décrit par Corman et al. Sur la base des premières séquences du SRAS-CoV-2 mises à
disposition dans la base de données GISAID le 11 janvier 2020, des amorces et des sondes
IP2 et IP4 ont été conçues pour cibler le gène RdRp s'étendant des (nt 12621-12727 et 14010-
14116; positions selon SARS-CoV, NC_004718).
L'objectif de cette étude était d'évaluer et de comparer la performance diagnostique du

nouveau kit MAScIR triplex SARS-CoV-2 M qui est un test, 100% marocain, d'amplification
et de détection qualitative de l’ARN du virus SARS-COV-2 basé sur la technologie RT-qPCR
et développé par la Fondation Marocaine pour l’Innovation et la Recherche Scientifiques
Avancées ciblant les gènes S, RdRp et CI du SRAS-CoV-2 avec le kit de référence
GeneFinder ciblant les gènes E, N, RdRp et le CI utilisé au LCV depuis le début de la
pandémie.
Dans cette étude, nous avons examiné les performances analytiques du kit MAScIR qui
comptent parmi les tests qui présentent une durée d’amplification plus courte par rapport au
kit de référence. En ce qui concerne les performances analytiques, la sensibilité analytique du
test MAScIR SARS-CoV-2 a été mesurée en utilisant des dilutions d’un ARN synthétique
contenant toutes les séquences des gènes cibles, le kit a été soumis pour évaluation dans des
centres biologiques et virologiques de référence, au niveau national et international,
notamment le Laboratoire de Recherche et d’Analyses Médicales de la Gendarmerie Royale
ainsi que celui de l’Institut Pasteur de Paris (version 1.0), qui ont montré que la sensibilité est
de 100 %, et la limite de détection déterminée par le fournisseur est de l'ordre de 10
copies/réaction (Manuel du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0). Dans notre étude, des
dilutions en série (du 1/10 au 1/108) ont été réalisées sur un contrôle positif dont le Ct RdRp :
16, Ct S : 18, Ct CI : 17 par un diluant contenant de l’ARN de transfert à une concentration de
10 ng/µL. La limite inférieure de détection obtenue, définie comme étant la plus grande valeur
du Ct détectable, était un Ct de 37 pour le RdRp et de 38 pour le S, les résultats avec Ct ≥37
sont considérés comme négatifs.
En se basant sur les données du fournisseur du kit MaScIR, la répétabilité du test MAScIR
SARS-CoV-2 a été déterminée sur 3 pools d'échantillons de patients positifs (3 niveaux de
concentrations différents: élevé, moyen et bas) et un pool d'échantillons de patients négatifs
avec un nombre de passage de 10 fois. La répétabilité a été conforme aux objectifs
analytiques fixés (CV<5%). La reproductibilité du test MAScIR SARS-CoV-2 a été évaluée
durant 5 jours sur 2 pools d’échantillons de patients positifs avec 2 niveaux de concentrations
8
différents, élevé et moyen. Les résultats obtenus démontrant une excellente reproductibilité du
kit sur une période de 5 jours.
Dans notre étude la répétabilité du kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2.0 a été réalisée sur trois
prélèvements, repassés à cinq reprises dans la même série, de concentrations différentes
(concentration élevée, moyenne et basse) tandis que le test de reproductibilité a été étudiée sur
le contrôle positif du même lot, passés dans chaque série et sur plusieurs jours. Les résultats
du test de la répétabilité et du test de la reproductibilité sont cohérents avec les résultats du
fournisseur. Les valeurs du CV étaient généralement supérieures aux résultats du fournisseur,
mais toujours inférieure à la valeur du CV recommandée.
Des études antérieures ont montré que la spécificité analytique du kit MAScIR SARS-CoV-2
a été déterminée par des analyses in silico utilisant l’outil BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool). Les régions de similitude ont été recherchées sur toutes les amorces et les
sondes de ce test en analysant la totalité de la base de données de la collection de nucléotides
du National Center for Biotechnology Information (NCBI) et de la base des données des
génomes des virus grippaux (GISAID : Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data).
L’analyse in silico démontre qu’une amplification de séquences non-cible pouvant
éventuellement entraîner une réactivité croisée ou potentiellement une interférence avec la
détection du SARS-CoV-2 est quasiment nulle avec une spécificité à 100%. Dans notre étude
18 échantillons positifs pour un virus respiratoire ont été testés (Grippe A, Grippe B, VRS,
…:) et dont le diagnostic a été fait par PCR Xpert ou FilmArray. Le pourcentage était à 100%
indiquant ainsi une excellente spécificité de notre nouveau kit. Tous les échantillons qui ont
été positifs pour un ou plusieurs virus respiratoires, y compris les virus appartenant à la
famille des coronaviridae, ont été négatifs pour le SARS-CoV-2 par le nouveau kit MAScIR.
Quant à l’évaluation externe de la qualité de notre nouveau kit MAScIR elle a été réalisée sur
5 échantillons d’EEQ ARN SARS-CoV-2 qui ont été traités par les deux extracteurs (Maxwell
et BigFish) et amplifiés par le même thermocycleur le QS5. Les résultats des EEQ étaient
parfaitement concordants avec nos résultats. Cependant la comparaison des Ct et le calcul de
l’exactitude de la mesure n’est pas possible vue que les résultats qui nous ont été transmis ne
précisent pas les valeurs des Ct des cibles.
Concernant les performances cliniques, la comparaison a été réalisée sur 61 prélèvements, les
échantillons traités dans cette études sont des échantillons prélevés par écouvillonnages
nasopharyngés ou par écouvillonnages oropharyngés stockés et conservés à une température
de -80°C lors de leur 2ème passage par le nouveau kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2. Leur
stabilité est vérifiée par les résultats de leurs contrôles internes (ARN cellulaire), avec une
valeur de Ct inférieure à 35 conformes aux recommandations du fournisseur.
8
Les échantillons ont été traités sur l’extracteur Bioer et amplifiés par les trois thermocycleurs
ABI 7500 Applied Biosystem, QuantStudio™ 5 Applied Biosystem et Exicycler™ 96
Bioneer. Les résultats du nouveau kit MAScIR avec ceux du kit de référence GeneFinder
étaient conformes. Tous les prélèvements négatifs (9 prélèvements) testés par le kit de
référence GeneFinder, sont rendus négatifs (Ct des cibles supérieur à 37), lors de leur 2 ème
passage par le nouveau kit MAScIR SARS-CoV-2 M 2, et tous les prélèvements positifs sont
rendus positifs (Ct des cibles inférieur à 30) . Cependant, Parmi les prélèvements fortement
positifs, 2/38 ont eu un résultat faiblement positif (valeur du Ct des cibles entre 31 et 36) lors
de leur deuxième passage par le nouveau kit sur les trois thermocycleurs et 8/14 prélèvements
faiblement positifs ont eu un résultat fortement positif. Quant à les échantillons traités par le
kit de référence GeneFinder et amplifiés sur le thermocycleur ABI 7500 Applied Biosystem
38 échantillons ont eu un résultat positif et 14 échantillons faiblement positif tandis que 9 ont
eu un résultat négatif, sur le même thermocycleur mais en utilisant le nouveau kit MAScIR
nous avons obtenu parmi les prélèvements fortement positifs, 2/38 ont eu un résultat
faiblement positif et parmi les prélèvements faiblement positif, 8/14 ont eu un résultat
fortement positif, tandis que tous les échantillons négatifs (9 échantillons) sont rendus
négatifs. Concernant les échantillons amplifiés sur le thermocycleur QuantStudio™ 5
Applied Biosystem et traités par le kit GeneFinder 34 échantillons ont eu un résultat positif et
13 échantillons faiblement positif tandis que 9 ont eu un résultat négatif, sur le même
thermocycleur mais en utilisant le nouveau kit MAScIR nous avons obtenu parmi les
prélèvements fortement positifs, 2/34 ont eu un résultat faiblement positif et parmi les
prélèvements faiblement positif, 7/13 ont eu un résultat fortement positif, tandis que tous les
échantillons négatifs (9 échantillons) sont rendus négatifs. Quant à les échantillons amplifiés
sur le thermocycleur Exicycler™ 96 Bioneer et amplifiés par le kit de référence 24
échantillons ont eu un résultat positif et 12 échantillons faiblement positif tandis que 9 ont eu
un résultat négatif, sur le même thermocycleur mais en utilisant le nouveau kit MAScIR nous
avons obtenu parmi les prélèvements fortement positifs, 3/24 ont eu un résultat faiblement
positif et parmi les prélèvements faiblement positif, 7/12 ont eu un résultat fortement positif,
tandis que tous les échantillons négatifs (9 échantillons) sont rendus négatifs. En analysant les
trois thermocycleurs aucune discordance ayant un impact clinique n’a été détectée et le
thermocycleur QuantStudio™ 5 Applied Biosystem présente des résultats plus proche à ceux
de la méthode de référence ainsi qu’un délai d’exécution plus court (55 min pour le kit
MAScIR et 2h pour le kit GeneFinder) par rapport aux autres thermocycleurs.
8
Nous notons également que les échantillons ont subi une congélation/décongélation entre le
premier passage par le kit de référence GeneFinder et le deuxième passage par le kit MAScIR
ce qui peut donner une influence sur les résultats.
Cette étude montre que la sensibilité du kit MAScIR est excellente puisque tous les
échantillons positifs selon la méthode de référence ont été également identifiés comme
positifs par ce nouveau kit.
Le kit MAScIR présente les avantages suivants : un délai d'exécution plus court d’une heure
(au lieu de deux heures), une réduction de la durée de la manipulation et une réduction du
temps de travail.
La décision de choisir un test plutôt qu'un autre dans ce contexte, il convient d'évaluer
l'équilibre entre les avantages en matière de la disponibilité des instruments ou des réactifs, et
les inconvénients d'une sensibilité potentiellement réduite. Il faut notamment tenir compte de
la population de patients sous-jacente testée, ainsi que les conséquences de santé publique des
cas de COVID-19 manqués.
En conclusion, les tests d'amplification de l'acide nucléique du SRAS-CoV-2 inclus dans cette
étude ont démontré une performance similaire lorsqu'ils étaient utilisés pour tester les
échantillons nasopharyngés ou oropharyngés prélevés sur des personnes faisant l'objet d'une
investigation pour le COVID-19.
8
V. Conclusion
L’infection à SARS-CoV-2 constitue un problème de santé publique à l’échelle mondiale.

Malgré des mesures prises, la pandémie semble ne pas être sous contrôle et demeure
problématique aussi bien sur le plan sanitaire que sur le plan économique. Depuis le début de
la pandémie, les laboratoires de microbiologie clinique ont développés de nombreux kits PCR
pour la détection du SARS-COV-2. Dans ce contexte, la Fondation MAScIR, a développé le
premier kit PCR qualitatif conçu et fabriqué au Maroc pour la détection du SARS-CoV-2.
Notre étude a permis de comparer les performances de ce nouveau kit MAScIR SARS-CoV-2
avec le kit de référence GeneFinder, cette comparaison a été réalisée par l'équipe du
Laboratoire Central de Virologie de rabat. Les résultats des paramètres de recherche
répondent aux recommandations du fournisseur et sont cohérents avec les résultats de la
technologie de référence. Il présente certains avantages : prix, fabrication et disponibilité, et
une durée d’amplification plus courte par rapport au kit de référence GenFinder.
8
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coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR Euro Surveill., 25 (2020), p. 2000045

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ROYAUME DU MAROC

Université Mohammed V - Rabat Faculté de Médecine et de Pharmacie RABAT

Année 2021 N°: MM0072021

Mémoire de fin d’études

MASTER DE «BIOTECHNOLOGIE MEDICALE»

Author: ANZI HASNA

Keywords: SARS-CoV-2, RT-PCR, MAScIR SARS-CoV-2 M 0.2, GeneFinderTM

SARS-CoV-2 infection is a worldwide public health problem, and understanding and

Titre : COMPARAISON ENTRE LE NOUVEAU KIT MAScIR SARS-CoV-2 M 0.2

Auteur : ANZI HASNA

Mots clés: SARS-CoV-2, RT-PCR, MAScIR SARS-CoV-2 M 0.2, GeneFinderTM

L’infection à SARS-CoV-2 constitue un problème de santé publique à l’échelle mondiale. La

Les résultats qualitatifs de cette comparaison étaient globalement concordants. Aucune

‫‪ GENeFinderTM COVID-19 Plus RealAmp Kit‬المرجعية‬

‫الكاتب ‪ :‬عنزي حسناء‬

‫‪GENeFinderTM COVID-19 Plus RealAmp Kit‬‬

‫‪ qPCR‬التي تسمح باكتشاف ‪ RNA‬فيروس ‪. -SARS-COV 2‬‬

‫‪ QuantStudio ™ 5 Applied Biosystems ،Biosystems‬و ‪).Exicycler ™ 96 Bioneer‬‬

‫تقدير حساسية وخصوصية مجموعة ‪ M SARS-CoV-2 MAScIR 2.0‬بنسبة ‪ ، ٪ 611‬باستخدام اختبار‬

1 PREMIERE PARTIE : GENERALITES CONCERNANT LE SARS-COV-2 3

II. Rappels virologiques.....................................................................................................5

2. Structure et génome du SARS-CoV-2....................................................................10

3. Cycle de réplication virale du SARS-CoV-2..........................................................20

IV. Histoire naturelle de la COVID-19…........................................................................29

1. Cinétique des marqueurs...................................................................................34

CoV-2 M 0.2 ET LE KIT DE REFERENCE GeneFinderTM COVID-19 Plus RealAmp Kit

2. Extraction des acides nucléiques...........................................................................50

3. Amplification des acides nucléiques......................................................................54

2. Résultats de la comparaison entre le nouveau kit MAScIR SARS-CoV-2 M 0.2 et

ACE2 : Enzyme de conversion de l'angiotensine 2

Tableau 1 : Caractéristiques des gènes exprimés par le SARS-CoV-2...................................18

II. Rappels virologiques

La classification des Coronavirus comme le rapporte le Comité International de Taxonomie

b. Réservoirs primaires et hôtes des coronavirus :

Les alpha-coronavirus et bêta-coronavirus infectent uniquement les mammifères et causent

Le génome du SARS-CoV-2 présente, 79,6 % et près de 50 % de similitude avec les

2. Structure et génome du SARS-CoV-2

Le SARS-CoV-2 est un virus à ARN simple brin de polarité positive d’environ 30 Kb et sa

Numéro Gènes Locus Taille (aa) Protéines

1 ORF1ab BCB15089.1/ 7096 Polyprotéine ORF1ab

1 ORF1a YP_009725295.1 4405 Polyprotéine ORF1a

2 ORF2 (S) BCA87361.1 1273 Péplomère (protéine S)

3 ORF3a BCA87362.1 275 Protéine ORF3a

4 ORF4 (E) BCA87363.1 75 Protéine d’enveloppe

5 ORF5 (M) BCA87364.1 222 Protéine de membrane

6 ORF6 BCA87365.1 61 Protéine ORF6

7 ORF7a BCA87366.1 121 Protéine ORF7a

8 ORF7b BCB15096.1 43 Protéine ORF7b

9 ORF8 BCA87367.1 121 Protéine ORF8

10 ORF9 (N) BCA87368.1 419 Phosphoprotéine de la

11 ORF10 BCA87369.1 38 Protéine ORF10

Nom de la protéine Taille

• La transmissibilité des souches

• L’efficacité des vaccins

Dénomination des variants du SARS-CoV-2

Il existe plusieurs dénominations en fonction des instances : GISAID, Nextstrain, Pango et

• Variant préoccupants (VOC) Ex: delta

• Un variant préoccupant du SARS-CoV-2 ou variant à suivre présente les changements:

• Variants à suivre (VOI) Ex: mu

• Variant qui présente des modifications génétiques connues pour affecter ou

• Variants sous surveillance (VUM)

• Variant qui présente des modifications génétiques soupçonnées d’affecter

Figure 9 : Variants préoccupants (OMS Septembre 2021) (80).