MINISTERE DE LA SANTE DE LAPOPULATIION ET DE LA REFORME HOSPITALIERE

DIRECTION DE LA FORMATION

FORMATION MEDICALE CONTINUE

FORMATION SUR LES TECHNIQUES DE PRELEVEMENTS ET

INTERPRETATION DES TESTS DE DEPISTAGE DE LA COVID 19

Département de virologie, IPA Sidi-Fredj

07, 08 et 12 juillet 2021
 INTRODUCTION

• Le 31 décembre 2019, l’OMS a été alertée par plusieurs cas de

pneumonie dans la ville de Wuhan, la province de Hubei dans un
marché d’animaux vivants.
• Le virus fut identifié le 9 janvier 2020, il ne correspond à aucun
virus connu.
• Inquiétude!!! Nouveau virus => nouvelle infection chez
l’Homme ???
 INTRODUCTION
• La connaissance des tests de diagnostic du SARS-CoV-2 est encore en évolution et il est
important de bien comprendre la nature, l’indication des tests et l’interprétation de leurs
résultats.

• Jusqu’à présent, le test de référence le plus couramment utilisé et le plus fiable pour le dg
virologique de cette infection reste la RT-PCR, réalisée à partir de prélèvements naso-
pharyngés ou d’autres échantillons des voies respiratoires.

• Cependant, d’autres tests d’ordre sérologiques sont actuellement utilisés et constituent

un complément utile à la détection de l’ARN du SARS-CoV2.
 Classification
 Ordre : Nidovirales

 Famille : Coronaviridae

 Sous famille : Coronavirinae et Torovirinae.

 Genre: Alpha-coronavirus, Beta-coronavirus, Gamma-coronavirus et

delta-coronavirus.

Les coronavirus humains sont retrouvés dans 2 genres: Alpha-coronavirus, Beta-

coronavirus

SARS-CoV2 2019 ACE2 Bats, pingolin ?

Classification

111 ET
1 et 2
2
 STRUCTURE du SARS CoV 2
Famille: Coronaviridae grossièrement sphérique qui tire leurs nom de l’aspect en couronne en
microscopie électronique.

Virus enveloppé à ARN + de 80 à 200 nm de diamètre

Protéinés S: surface (couronne)
Protéines M et E: matrice de l’enveloppe
Protéines N: nucléocapsides étroitement liées à l’ARN génomique.

Le coronavirus SARS-CoV-2 vu au microscope électronique Scripps

 Diagnostic virologique: Tests utilisés
Tests
molécul
:
s
n
io
at
c
ifi
pl
m
A
s
e
tr
u
A
Tests
aires
antigén
fl
u
o
e
hi
p
a
r
g
o
at
m
o
r
h
Tests
iques  Technique immuno-enzymatique (ELISA)

sérologi  Chimi et électroluminescence (CMIA, ECLIA)

 Tests rapides : chromatographie

ques
 FIABILITE DU DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE

Dépend:

 QUALITE DU PRELEVEMENT :
- MOMENT: Période d’incubation du virus
- MODALITES DE REALISATION
- TRANSPORT

 FIABILITE DU TEST BIOLOGIQUE (sensibilité, spécificité)

 QUALITE DES TESTS VIROLOGIQUES

• Aucun test n’est parfait : limites

→ Les critères de qualité d’un test

• La fiabilité: exactitude (sensibilité, spécificité)

• La reproductibilité: précision: même résultat en répétant le test

• La rapidité: utile dans la prise en charge précoce du patient

Interprétation des méthodes diagnostiques en
fonction du stade de l’infection

10
10
 CONTAMINATION MALADIE

Asymptomatiques
Symptômes Bénins Graves Séquelles……..
0 7 15 21 28

Contagiosité
0 4 7 15 21 28

PCR
... .....…
.. ... ...
...... .... .... ...... .. ..
....... ...
0 4 7 15 21 28

Sérologie (Ac)
..
.. …
………
… … … …… … ……..
0 4 7 15 21 28

Contagiosité
 2 à 4 jours avant les symptômes
 Les asymptomatiques peuvent être contagieux
 Diminue après 1 semaine de symptômes et 14
jours après la contamination
5/10/2020
PCR
 Une PCR + ne signifie pas forcément contagiosité
 Tenir compte de la clinique, de l’existence ou non de symptômes
et de la date estimée de contamination
 Si PCR + chez asymptomatique, sans date de contact identifiée, le
considérer en début de maladie (sauf si sérologie positive)
11
 Evolution des marqueurs biologiques

2 à 14 jours
IgM puis IgG
Diagnostic tardif
Diagnostic précoce

5,6 jours
Les tests moléculaires

La RT-PCR
 RT- qPCR: Principe

• Recherche directe qualitative du génome viral par réaction de transcription

inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne.

• Echantillons: Prélèvements respiratoires+++

 Techniques RT-PCR
De nombreuses techniques de RT-PCR sont actuellement
disponibles ciblant 1, 2 ou 3 gènes viraux
(il est recommandé d’utiliser une trousse ciblant au moins 2 gènes viraux)
parmi :
le gène de l’enveloppe (E)
le gène de la nucléocapside (N)
le gène de la ARN polymérase ARN-dépendante virale (RdRp, RNA-
dependent RNA polymerase)
le gène de la protéine de spicule (S, spike)
l’ORF1 (open reading frame 1).
 RT-PCR
Etape 1: extraction de l’ARN

« Extraction manuelle sur colonnes /billes »

« Automate
d’extraction » « Bloc d’extraction pour automate »
 RT-PCR : Etape 2
1. Rétrotranscription de l’ARN en ADN complémentaire (RT-
PCR)
2. Amplification et quantification en temps réel (PCR en temps
réel: q-PCR)
Polymérisation en chaine
 Détection de l’ARN
Etape 2: Amplification et quantification
PCR classique PCR en temps réel
Qualitative  Qualitative/quantitative.
Mêmes étapes que la PCR classique +
03 étapes:  Utilisation de sondes oligonucléotidiques (Taqman):
 Dénaturation: séparation des 02 brins (95°C)

Hybridation des amorces (courts fragments d’ADN) sur les

brins d’ADN (50°-70°C)  Le quencher lié au fluorophore: pas d’émission de
fluorescence.
 Elongation/ Taq polymérase: synthèse du brin d’ADN à Le quencher séparé du fluorophore/ la Taq polymérase:
partir de l’amorce grâce aux olignucléotides présents dans le émission de fluorescence:
milieu de réaction. Mesure de la fluorescence (ADN) en fin d’élongation à
 Les amplicons sont transférés sur gel → chaque cycle → en temps réel (augmentation de la
migration par électrophorèse → bandes : fluorescence proportionnelle à la quantité d’ADN)
L’ADN est détecté en fin de réaction
PCR en temps réel
 Interprétation des résultats
• Notion de CT= Cycle Threshold: nombre de cycles d’amplification de l’ARN requis pour la
production d’un signal fluorescent/ mesure relative de la concentration de la cible
amplifiée lors de la réaction PCR (courbe exponnentielle).
Résultat positif- Ct=17
Résultat positif Ct=25
Résultat négatif
 Interprétation des résultats
 La détection ARN viral est mesurée par le CT

 CT< 40 : reporté positif: suivre recommandations kits.

 Résultat dépend fortement des variations de la quantité de virus présents dans les
prélèvements:
 positif dès j1 , Pic 1ère – 3ème semaine;

site de prélèvement: passage du virus vers les VRI.

degré de multiplication et de clearance du virus: formes sévères˃ formes

modérées
autres facteurs: sexe masculin, HTA, CTC, ventilation…: élimination virale
 RT-PCR: avantages
• Spécificité élevée: Gènes cibles = gènes spécifiques du SARS CoV-2

• Sensibilité 60-80% 40-50% entre j15-j39

• Diagnostic précoce: (Phase aigüe)

 contrôle de la propagation par les patients contagieux (isolement)
 décision thérapeutique rapide.
•Rapidité: 3-6h selon le degré d’automatisation ?
•Amplification et analyse simultanées: ↓faux (+), ↓ contaminations
 RT-PCR: limites
Limites techniques Faux négatifs (30%)

- Personnel/manipulateur qualifié. - Présence d’inhibiteurs de la PCR.

-Structure L2: PSM II - Qualité du prélèvement: site/ préleveur.

(extraction manuelle).
-Etapes pré-analytiques: transport/ stockage
-Coût élevé
- Délai : début des symptômes / réalisation du test.
- Prélèvements contraignants.
→Variations de la charge virale
 Autres tests moléculaires

Amplification isotherme médiée en

boucle
« LAMP »
RT-LAMP: Loop Mediated Isothermal amplification
Principe
 RT-LAMP: Loop Mediated Isothermal amplification
Avantages
Limites
• Rapidité • Validation par autorités de santé/ pas
assez de recul
• Facilité d’exécution
• Absence de données
• Pas de matériel sophistiqué (bain
• marie,,,,,,) • Interprétation objective des résultats

• Prix réduit/PCR
Les tests rapides antigéniques

TDR- Ag
 LE POINT SUR LES TESTS ANTIGENIQUES

• Basés sur réaction antigène-anticorps. Plusieurs type:

 tests rapides « strip »

« bandelette / cassette / savonnette»

 Tests rapides avec lecteur automatique

 Tests haut débit sur automate

 Caractéristiques

• Des tests un peu moins sensibles/ RT-PCR mais beaucoup plus rapides

• Prélèvement nasopharyngé

• Résultats rapides en moins de 30 mn

• Stockage prêt à l’emploi et à T° ambiante

• Aucun équipement ou réactifs supplémentaire nécessaire

 Tests antigéniques

 Détection de la protéine N ou S.
 Appelés: Point of care (POC).
 Prélèvement: nasopharyngé ou nasal (PSM type II).
 Doit présenter (selon OMS/HAS):
Sensibilité ≥ 80%
Spécificité ≥ 97%.
 Recommandations d’utilisation (OMS)
Quand utiliser: diagnostic
• Cas suspects dans des institutions ou des
communautés semi-fermées (PCR non
disponible);
• Clusters? (p. Ex. Écoles, maisons de soins,
lieux de travail, etc.);
• Surveillance des tendances des taux de
COVID-19 parmi les travailleurs essentiels
et le personnel de santé (exposés);
Quand ne pas utiliser:
dépistage
• Individus asymptomatiques sans notion de
contact;
• Régions/zones à faible prévalence (zéro ou
peu: risque de faux positifs);
• Défaillance des mesures de biosécurité, de
systèmes de prévention des infections
(prélèvements++).

• Détection des cas positifs dans les

institutions sanitaires et les différentes
communautés avec large transmission;
 Tests antigéniques
Avantages Limites
Rapidité Qualitatifs
Simplicité Limites= PCR ( CV, prélèvement,......)
Désengorgement des laboratoires. Prélèvement nasopharyngé→ PSM II.
Diagnostic précoce. En cours de validation
Coût faible

Selon HAS (25/9/2020): la perte de sensibilité est

compensée par l’impact sur les délais.
Test rapide antigénique: Procédure
CT N=18 CT N=21 CT N=27
CT N=24 CT N=25 CT N=33 DDS=
Asymptomatique
4j
CT
Les tests sérologiques
 Les tests sérologiques

Tests sérologiques

Tests unitaires Tests en série (automate)

TDR
(technique ELISA
de diagnostic Autotest Chimiluminescence
rapide) Electroluminescence
 Tests sérologiques

Détection des Ac produits par l’organisme contre le SARS-CoV2

• Ac anti nucléocapside (protéine N) ou Ac anti-RBD (protéine S)

• Test détecte: Ac totaux (Ig G, IgM, IgA) ou isolé IgG ou IgM

• Prélèvement: sérum ou plasma

• Place: Sérologie en appui de la PCR.

Après apparition des symptomes (7ème j), la CV diminue, Dc sérologique efficace

 Les différentes méthodes
• CHIMILUMINESCENCE: CMIA

• Electrochimiluminescence (ECLIA)
CMIA
• TESTS ELISA

• TESTS RAPIDES

ECLIA
Les tests sérologiques unitaires
 Tests sérologiques unitaires
Tests rapides
• Principe : immunochromatographie à flux latéral (FLA)

Séparation des composants d'un mélange à travers un milieu en

utilisant la force capillaire et la liaison spécifique et rapide d'un Ac à
son Ag.

• Bandelette de nitrocellulose

• Prélèvement: goutte de sang ou sérum

 Tests sérologiques unitaires
Tests rapides
Composés de quatre parties

1. Membrane d'échantillon (sample Pad): la zone sur laquelle

l'échantillon est déposé

1. Membrane de conjugués (Conjugation Pad) sur lequel des

molécules combinées avec des éléments de bio-reconnaissance

1. Membrane de réaction contenant la ligne de test et la ligne de

FLA Principe
Tests sérologiques unitaires
Tests rapides
Techniques sérologiques

Avantages et limites
Techniques sérologiques: avantages et limites

Avantages et limites
Spécifiques
Non spécifiques
Généraux
 Avantages spécifiques
Tests automatisables (ELISA/CMIA)
•Techniques de routine
•Sensibilité/Spécificité
•Etape pré analytique moins contraignante
( Ac plus stables que l’ARN).
•Niveau de biosécurité nécessaire bas.
•Coût faible/ Grand nombre de trousses
disponibles
•Données qualitatives et quantitatives.
•Dépistage de masse
•Traçabilité+
Tests unitaires
(TDR)
•Simplicité/stockage facile:
petit dispositif portable, aucun matériel
supplémentaire nécessaire
•Rapidité: 10-15 minutes.
•Prélèvement= goutte de sang
( cabinet/pharmacie)
•Dépistage de masse +/-
•Personnel de santé formé.
•Coût faible/Grande disponibilité.
 Limites spécifiques
Tests automatisables (ELISA/CMIA) Tests unitaires
(TDR)

•Prélèvement sanguin ( structure hospitalière). •Test qualitatif uniquement.

•Analyse LBM.
•Manque de recul et de validation.
•Biologiste qualifié.
•Nature de l’Ag utilisé non fournie
•Manque de recul/validation (virus émergent)
•Absence de traçabilité
•Nature de l’Ag utilisé non fournie
•Réactions croisées?
•Réactions croisées?
 Avantages généraux
Tests automatisables (ELISA/CMIA)

 Spécificité˃ 95%

 Etude de la réponse immunitaire au SARS Cov-2 de manière dynamique, qualitative et

quantitative
 Enquêtes sérologiques : déterminer le taux précis (symptomatiques/asymptomatiques)
d’infection dans une zone précise→ taux de mortalité et sérosurveillance (évolution de la
pandémie).
 Documentation des patients symptomatiques avec PCR négative.

 Dépistage et réinsertion des personnes asymptomatiques.

Guide pour les politiques de santé publique

 Limites générales
Tests automatisables (ELISA/CMIA)

Liés à la cinétique des AC

1: Limites de diagnostic: résultat négatif (patients asymptomatiques++) ne signifie pas

absence d’infection /SARS-CoV 2:
 Prélèvement trop précoce (< j 7) ou trop tardif (disparition).
 Faible taux d’anticorps/pas de production

2: Limites d’interprétation: La présence d’Ac n’est pas synonyme de:

Protection immunitaire (réinfection/réactivation non exclues → contagiosité possible);
Absence de contagiosité: risque de transmission du virus (premières phases de
détectabilité des Ac)
 POINTS ESSENTIELS
• A ce jour les données disponibles sur les tests sérologiques ne permettent
pas de conclure sur le caractère protecteur d’un résultat positif vis-à-vis d’un
nouvel épisode de COVID-19,ni sur la durée d’une éventuelle protection,

• La sérologie COVID-19 ne permet pas de savoir si vous êtes contagieux ou

non,

• Un résultat négatif n’exclut pas complétement la présence d’une infection à

SARS-CoV2 (séroconversion)

• Quelque soit le résultat du test sérologique, les mesures barrières

 Conclusion
Le laboratoire de Microbiologie clinique occupe une place très importante dans:
- le diagnostic virologique et étiologique de l’épidémie de COVID-19 causée par le SARS-
CoV-2,
- dans l’accompagnement technique des laboratoires de microbiologie autorisés.
- Il permet également de déterminer la technique à utiliser selon le contexte clinique et
épidémiologique.

Le choix des tests est primordial pour une bonne et judicieuse interprétation et pour une
PEC clinique et thérapeutique adéquate.

les tests RT-PCR sur prélèvement naso-pharyngé sont aujourd’hui considérés comme la
technique de référence pour les virus respiratoires.
 Conclusion
• Les tests sérologiques:
diagnostic tardif (rétrospectif/ de rattrapage): statut immunologique
des patients asymptomatiques.

• La recherche concernant les tests diagnostiques sont toujours en

cours.

• L’utilisation de tests adéquats ,de bonne qualité ,au moment

opportun est essentielle à l’obtention certaine de résultats précis.
stratégie de détection

des variants sars-cOv 2

à l’IPA
 Variants d’intérêt
( Variant of Concern, VOC)

Les variants du SARS-CoV2 sont sous surveillance

internationale :

• Lineage B.1.1.7 (VOC)-202012/01 (UK)

• Lineage B.1.351 (New VOC 501Y.V2), South
Africa
• Lineage B.1.1.28.1 (P1), Brazil
• Variant nigérian B.1.1.207
• Variant "californien" CAL.20C, Variant danois,,,,,
 Etape 1 : Criblage ( Screening)

RT-PCR en temps réel SARS-CoV2 avec kits de screening/

variants
 Etape 2 : Confirmation

- Séquençage du génome du SARS-CoV2

( gène de la protéine Spike)

- Technologie : Sanger sequencing (ABI 3130)

- Définition: consiste à déterminer l’ordre d’enchainement des

nucléotides pour un fragment d’ADN donné

- Procédure opératoire :
Lourde et longue ( 3-5 jours)
Nécessite des moyens humains et techniques
Formation en biologie moléculaire et bio informatique
Couteuse
 METHODE: séquençage génomique

1.Recueil du prélèvement naso-pharyngé

2.Extraction ARN

3. Amplification génique: PCR

PCR1 (consensus)→ PCR2 (niché) →purification

4. Réaction de séquence « Sanger »

5. Migration sur le séquenceur: ABI 3130

6. Analyse bio-informatique des séquences

• Correction /interprétation séquences

 Analyse bio-informatiques des séquences du génome du SARS-CoV2

- 1- Traitement des séquences brutes

- Analyse bio-informatiques des séquences du génome du SARS-CoV2

2- Identification des mutations spécifiques

(Comparaison au génome de référence du SARS-CoV2 ( 1ere souche: Wuhan 2020)
GISAID: Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data
www.gisaid.org