Cours Outils Momeculaires PCR Et QPCR

Ou#l moléculaire
PCR et qPCR
Tharaniya TAMBOSCO SRIKANTHASAMY

Ecologie microbienne
tharaniya.srikanthasamy@iutsf.org
Objec&fs du Cours
Plan du Cours
Introduction II. Principes fondamentaux de la qPCR
A. Définitions de la PCR et de la qPCR
B. Brève histoire et évolution des deux A. Les composants de base
techniques 1. ADN matrice
C. Objectifs spécifiques de chaque méthode 2. Amorces
3. Sondes spécifiques
I. Principes fondamentaux de la PCR
B. Les étapes de la qPCR
A. Les étapes de base de la PCR 1. DénaturaLon, hybridaLon, extension
1. Dénaturation 2. DétecLon en temps réel
2. Hybridation des amorces
3. Extension C. Différences entre la qPCR et la PCR
tradiLonnelle
B. Amplification exponentielle
C. Détection des produits de PCR
D. Applications classiques de la PCR

Plan du Cours
III. Applica*ons spécifiques de la qPCR VII. Analyse des résultats
A. PCR : Gel d'agarose et visualisaLon des
A. QuanLficaLon de l'expression génique bandes
B. DétecLon de mutaLons B. qPCR : Courbes en temps réel, courbes de
C. Analyse de la variabilité généLque fusion C. Comparaison des avantages
D. Comparaison des applicaLons avec la PCR analyLques
classique
VIII. Limita*ons et défis techniques
A. Inhibiteurs de PCR
IV. Protocole expérimental B. ContaminaLons
A. PréparaLon des échanLllons pour la PCR et C. Variabilité inter-assay et inter-prélèvement
la qPCR
B. Choix des amorces et des sondes IX. Applica*ons pra*ques et études de cas
C. Mise en place des réacLons A. Exemples de recherches ou diagnosLcs
D. ProgrammaLon des thermocycleurs uLlisant l'une ou l'autre méthode
B. Cas réels de conversion de la PCR à la qPCR
X. Futur des techniques d'amplifica*on

d'acides nucléiques
A. Tendances émergentes
B. Nouvelles technologies
Introduc&on
Biologie Moléculaire Moderne et l'Importance des Techniques d'Amplifica*on de l'ADN
La biologie moléculaire moderne consLtue un domaine de recherche et d'applicaLon essenLel

=> exploraLon des mécanismes fondamentaux au niveau moléculaire.
Techniques d'amplificaLon de l'ADN

=> offrant des ouLls puissants pour explorer, comprendre et manipuler l'informa*on
géné*que.
=> ouverture de nouvelles méthodes pour la compréhension des processus

Impact sur différent domaines :
- la recherche médicale
- l’agriculture en passant
- la criminalisLque.
Introduction
Réplication de l'ADN : Fondement de la Vie
•Au cœur de la biologie moléculaire se trouve le processus de réplication de l'ADN, une étape
cruciale pour la transmission de l'information génétique d'une génération à l'autre.
•Les techniques d'amplification de l'ADN permettent de recréer artificiellement ce processus en

laboratoire, offrant aux chercheurs la possibilité d'analyser, de caractériser et de manipuler
spécifiquement des séquences d'ADN.
Introduc&on
Iden*fica*on de Gènes et d'Organismes
•Les techniques d'amplificaLon de l'ADN, en parLculier la PCR (Polymerase Chain ReacLon), ont
révoluLonné la manière dont nous idenLfions et étudions les gènes spécifiques.
•Ces méthodes ont également permis l'idenLficaLon rapide d'organismes, que ce soit pour des
applicaLons médicales, environnementales ou de recherche fondamentale.
A. Défini)ons de la PCR et de la qPCR
PCR (Polymerase Chain Reac*on) : La PCR, ou réacLon de polymérisaLon en chaîne, est une
technique de biologie moléculaire permeànt d'amplifier de manière exponenLelle des
séquences spécifiques d'ADN.
qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) : La qPCR, ou PCR quantitative en temps réel,
est une évolution de la PCR qui permet non seulement d'amplifier l'ADN, mais aussi de
quantifier précisément la quantité initiale de l'ADN dans un échantillon
B. Brève histoire et évolu)on des deux techniques
1. PCR : Les Débuts Pionniers
•1983 : Le biochimiste Kary Mullis invente la PCR, une technique qui permet d'amplifier de
manière exponentielle des segments spécifiques d'ADN.
•1985 : La première publication de Mullis détaille la PCR comme une méthode révolutionnaire,
offrant un moyen rapide et puissant de cloner et d'étudier des fragments d'ADN.
2. Expansion de la PCR dans la Recherche et la Médecine
•Années 1990 : La PCR devient un outil incontournable en recherche génétique, facilitant

l'amplification spécifique de gènes et la détection de mutations.
•1993 : Kary Mullis reçoit le prix Nobel de chimie pour l'invention de la PCR, soulignant son
impact monumental dans la biologie moléculaire.
B. Brève histoire et évolu)on des deux techniques
Brève Histoire et Évolu*on des Techniques de PCR et qPCR
3. Transi*on vers la qPCR : La Quête de la Quan*fica*on en Temps Réel
•Années 1990-2000 : Les scienLfiques cherchent à améliorer la PCR en ajoutant des capacités de
quanLficaLon en temps réel.
•1996 : La qPCR, également appelée PCR en temps réel, est introduite. Elle permet non
seulement d'amplifier l'ADN, mais aussi de mesurer la quanLté accumulée à chaque cycle
d'amplificaLon.
4. Avènement de la Technologie de la qPCR
•Début des années 2000 : Les progrès technologiques permeènt le développement de sondes
fluorescentes et de détecteurs en temps réel, ouvrant la voie à une mesure plus précise de
l'amplificaLon.
•Améliora*on de la sensibilité et de la spécificité : La qPCR devient un ouLl essenLel pour la

quanLficaLon absolue et relaLve de l'ADN, la détecLon de pathogènes, et l'analyse de
l'expression génique.
B. Brève histoire et évolution des deux techniques
Brève Histoire et Évolu*on des Techniques de PCR et qPCR
5. Évolu*on Con*nue et Émergence de Nouvelles Variantes
•Années 2010-2020 : Des variantes de la qPCR conLnuent d'émerger, offrant des amélioraLons
en termes de sensibilité, de rapidité et de coût.
•Technologies associées : Des variantes telles que la digital PCR et la qPCR mulLplexe
élargissent les possibilités d'analyse.
6. Applica*ons Diversifiées et Intégra*on dans la Recherche Appliquée
•Actuellement : La PCR et la qPCR sont largement intégrées dans de nombreux domaines de

recherche, de la médecine personnalisée à la surveillance environnementale, et jouent un rôle
clé dans le diagnosLc précoce de maladies et la compréhension des processus biologiques
complexes.
C. Objec)fs spécifiques de chaque méthode
Objectifs spécifiques de la PCR :
1.Amplification exponentielle.
2.Clonage d'ADN.
3.Détection de mutations.
4.Séquençage d'ADN.
5.Études de l'expression génique.
C. Objec)fs spécifiques de chaque méthode
Objec*fs spécifiques de la PCR : Objec*fs spécifiques de la qPCR :
1.AmplificaLon exponenLelle. 1.QuanLficaLon en temps réel.

2.Clonage d'ADN. 2.Analyse de l'expression génique.
3.DétecLon de mutaLons. 3.DétecLon précise des produits amplifiés.
4.Séquençage d'ADN. 4.Calcul de l'efficacité de la PCR.
5.Études de l'expression génique. 5.Études de la cinéLque d'amplificaLon.
I. Principes Fondamentaux de la PCR
La PCR, ou réacLon de polymérisaLon en chaîne, repose sur plusieurs principes clés qui
permeènt l'amplificaLon sélecLve de segments spécifiques d'ADN.
A. Les étapes de base de la PCR
1.Dénatura*on
2.Hybrida*on des amorces
3.Extension
Amorce
Liaison
hydrogène
Température d’hybridation (Th)
Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
Amorce Th = Tm-5°C
Liaison
hydrogène
Liaison
hydrogène
Liaison
hydrogène
La PCR, ou réacLon de polymérisaLon en chaîne, repose sur plusieurs principes clés qui
permeènt l'amplificaLon sélecLve de segments spécifiques d'ADN.
A. Les étapes de base de la PCR
1.Dénatura*on :
1. Chauffage de l'échanLllon à une température élevée (environ 94-98°C).
2. La double hélice d'ADN est dénaturée, séparant les brins complémentaires et produisant
deux brins simples.
2.Hybrida*on des amorces :
1. Refroidissement à une température permeànt aux amorces spécifiques de se lier
(hybrider) aux régions complémentaires sur chaque brin simple.
2. Les amorces définissent la séquence d'ADN à amplifier.
3.Extension :
1. Chauffage à une température opLmale pour l'acLvité de l'ADN polymérase (environ
72°C).
2. L'ADN polymérase synthéLse un nouveau brin complémentaire à parLr des amorces,
étendant ainsi la séquence d'ADN.
B. Amplifica*on Exponen*elle :
•RépéLLon cyclique des étapes de dénaturaLon, hybridaLon et extension.

•Chaque cycle double le nombre de copies de l'ADN cible.
•L'amplificaLon est exponenLelle, générant rapidement une quanLté importante d'ADN
spécifique. Nombre amplicon = 2n , avec n = nombre de cycle
C. Détec*on des Produits de PCR :
•Après plusieurs cycles, les produits d'amplificaLon sont généralement visualisés par
électrophorèse sur gel d'agarose.
•La longueur des fragments obtenus correspond à la séquence d'ADN cible.
MigraLon sur gel d’agarose
Marqueur de taille
poids moléculaire
D. Applications Classiques de la PCR :
•Clonage d'ADN : Amplification de fragments spécifiques pour la création de clones génétiques.

D. Applica*ons Classiques de la PCR :
•Détec*on de Muta*ons : IdenLficaLon de variaLons généLques.
-
Wild Mutant 1 Mutant 2
Type
+
•Détec*on de Muta*ons : IdenLficaLon de variaLons généLques.
Wild Mutant 1 Mutant 2

Type
ADN
Wild Type
Mutant 1
Mutant 2
• Diagnos*c Médical : DétecLon d'agents pathogènes,

idenLficaLon de maladies généLques, etc.
•Séquençage d'ADN : PréparaLon d'échanLllons pour des

analyses de séquençage.
•Études de l'Expression Génique : Analyse des niveaux

d'expression de gènes spécifiques.
II. Principes Fondamentaux de la qPCR
A. Les Composants de Base
1.ADN Matrice :
• L'échanLllon contenant l'ADN à amplifier. Peut être de l'ADN génomique, de l'ADN

complémentaire (ADNc) ou de l'ARN.
2.Amorces :
• Courts fragments d'ADN complémentaires à des séquences spécifiques de l'ADN cible.
ULlisées pour délimiter la région à amplifier.
3.Sondes Spécifiques :
• Molécules marquées avec un fluorophore.
B. Les Étapes de la qPCR
1.Dénaturation, Hybridation, Extension :
1. Les étapes de dénaturation, hybridation des amorces et extension se déroulent de

manière similaire à la PCR traditionnelle.
2. La dénaturation sépare les brins d'ADN, les amorces s'hybrident aux séquences
spécifiques, et l'ADN polymérase synthétise un nouveau brin complémentaire.
2.Détection en Temps Réel :
1. Une fluorescence est mesurée à chaque cycle d'amplification en temps réel. Cette
fluorescence provient de l'émission par les sondes spécifiques lorsque la PCR progresse.
2. La mesure de la fluorescence à chaque cycle permet de suivre l'amplification en temps

réel et de quantifier la quantité initiale d'ADN.
C. Différences entre la qPCR et la PCR Traditionnelle
•Quantification en Temps Réel : La qPCR permet une mesure précise et en temps réel de
l'amplification, fournissant des données quantitatives sur la quantité initiale d'ADN.
•Utilisation de Sondes : La qPCR utilise des sondes spécifiques, tandis que la PCR traditionnelle
se base généralement sur l'interprétation de la fluorescence de colorants intercalants.
•Détection plus Sensible : La qPCR est souvent plus sensible et permet la détection
d'amplification à des stades plus précoces de la réaction.
•Applications Quantitatives : La qPCR est particulièrement adaptée à des applications

nécessitant une mesure précise des niveaux d'expression génique, de la charge virale, etc.
La chimie de détecLon de séquences
• SYBRGreen
Processus par étapes
Lorsque le colorant SYBR Green I est ajouté à un échanLllon, il se lie immédiatement à tous les
ADN double brin présents dans l’échanLllon.
1. Au cours de la PCR, l’ADN polymérase Applied Biosystems™ AmpliTaq Gold™ amplifie la

séquence cible, générant les produits de PCR ou “amplicons”.
2. Le colorant SYBR Green I se lie ensuite à chaque nouvelle copie d’ADN double brin.
3. Au fur et à mesure que la PCR progresse, d’autres amplicons sont créés. Le colorant SYBR
Green I se liant à tous les ADN double brin, l’intensité de fluorescence augmente
proporLonnellement à la quanLté de produits de PCR générés.
• SYBRGreen
La chimie de détection de séquences
La chimie de détection de séquences
• SYBRGreen
Avantages du colorant SYBR Green I
•Il peut être uLlisé pour suivre l’amplificaLon de n’importe quelle séquence d’ADN double brin.
•Aucune sonde n’est requise, ce qui réduit la configuraLon du dosage et les coûts d’exploitaLon.
Inconvénient du colorant SYBR Green I
peut générer de faux signaux posi*fs ;

=> se lie à n’importe quel ADN double brin, il peut aussi se lier à des séquences d’ADN double
brin non spécifiques.
• Taqman
Développement de la chimie TaqMan
Les systèmes en temps réel pour PCR ont été améliorés par l’introducLon de sondes marquées
par fluorescence qui uLlisent l’ac*vité des nucléases 5’ de l’ADN polymérase Taq.
=> une méthode en temps réel pour détecter uniquement des produits d’amplificaLon
spécifiques.
Le développement de sondes fluorogéniques a également permis d’éliminer le traitement post-

PCR pour l’analyse de la dégradaLon de la sonde
• Taqman
FoncLonnement de la chimie de détecLon de séquences TaqMan
La chimie TaqMan uLlise une sonde fluorogénique pour perme`re la détecLon d’un produit de
PCR spécifique au fur et à mesure qu’il s’accumule au cours de la PCR.
• Taqman
1.Une sonde d’oligonucléoLdes :

- colorant fluorescent rapporteur au niveau
de l’extrémité 5’ et
- colorant absorbeur (Quencher) au niveau
de l’extrémité 3’.
Tant que la sonde est intacte, la proximité du

colorant absorbeur réduit fortement la
fluorescence émise par le colorant
rapporteur lors du transfert d’énergie par
résonance de fluorescence (FRET) dans
l’espace.
• Taqman
• Taqman
2. Si la séquence cible est présente, la sonde s’hybride en aval de l’un des sites d’amorce et est
clivée par l’acLvité des nucléases 5’ de l’ADN polymérase Taq au fur et à mesure que ceè
amorce est étendue.
3. Ce clivage de la sonde :
1. sépare le colorant rapporteur du colorant absorbeur, augmentant ainsi le signal du
colorant rapporteur.
2. provoque le retrait de la sonde du brin cible, permeànt à l’extension des amorces de
conLnuer jusqu’à la fin du brin matrice. Ainsi, l’inclusion de la sonde n’inhibe pas le
processus global de PCR.
4. Les molécules du colorant rapporteur supplémentaires sont clivées de leurs sondes

respecLves avec chaque cycle, ce qui entraîne une augmentaLon de l’intensité de la
fluorescence proporLonnelle à la quanLté d’amplicons produite.
• Taqman
Avantages de la chimie TaqMan
•L’hybridation spécifique entre la sonde et la cible est nécessaire pour générer un signal
fluorescent
•Les sondes peuvent être marquées avec des colorants rapporteurs différents et faciles à
distinguer, ce qui permet l’amplification de deux séquences distinctes dans un tube de réaction
•Plus besoin de traitement post-PCR, ce qui réduit les coûts de main-d’œuvre et de matériel
nécessaires aux dosages
Inconvénient de la chimie TaqMan
Le principal inconvénient de la chimie TaqMan est que la synthèse des différentes sondes est
requise pour des séquences différentes.
III. Applications Spécifiques de la qPCR
A. Quan*fica*on de l'Expression Génique :
•Objec*f : Mesurer précisément les niveaux d'ARN messager (ARNm) pour évaluer l'acLvité
génique.
•Applica*on : Études de régulaLon génique, recherche en biologie du développement,

évaluaLon de l'impact de médicaments ou de condiLons expérimentales sur l'expression
génique.
III. Applica&ons Spécifiques de la qPCR
B. Détec*on de Muta*ons :
•Objec*f : IdenLfier des variaLons spécifiques dans les séquences d'ADN.
•Applica*on : DiagnosLc de maladies généLques, détecLon de mutaLons liées au cancer,

évaluaLon de la suscepLbilité généLque aux maladies.
C. Analyse de la Variabilité Géné*que :
•Objec*f : Étudier la diversité généLque au sein d'une populaLon.
•Applica*on : Analyse des polymorphismes généLques, évaluaLon de la variabilité généLque

dans des populaLons naturelles ou des études de lien généLque.
D. Comparaison des Applications avec la PCR Classique :
•Objectif : Identifier les domaines où la qPCR apporte des avantages par rapport à la PCR
traditionnelle.
•Application : Évaluation comparative des performances dans des contextes spécifiques tels que
la sensibilité, la quantification précise, la rapidité, et la capacité à détecter des changements
subtiles.
IV. Protocole expérimental
A. Prépara*on des échan*llons pour la PCR et la qPCR
1) ExtracLon de l'ADN/ARN :
•Extraire l'ADN ou l'ARN total des échanLllons biologiques selon une méthode appropriée
(extracLon au phénol/chloroforme, kits d'extracLon, etc.).
•Vérifier la qualité et la concentraLon de l'ADN/ARN extrait à l'aide de méthodes comme la

spectrophotométrie ou l'électrophorèse sur gel.
2) Synthèse de l'ADNc (pour qPCR) :
•Si l'analyse concerne l'ARN, effectuer la synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc) à l'aide
d'une enzyme transcriptase inverse (RT).
•Contrôler la qualité de l'ADNc synthéLsé.

B. Choix des amorces et des sondes
1) ConcepLon des amorces :
•Concevoir des amorces spécifiques au gène d'intérêt en uLlisant des ouLls de concepLon
d'amorces en ligne.
•S'assurer que les amorces ont une température de fusion similaire et une spécificité élevée.
2) Choix de la sonde (pour qPCR) :
•Si la qPCR est uLlisée, choisir une sonde fluorescente spécifique au gène cible.
•S'assurer que la sonde a une température de fusion compaLble avec les amorces.
C. Mise en place des réacLons
1) PréparaLon des réacLfs :
•Préparer un mélange réacLonnel contenant l'ADN/ARN, les amorces, les sondes (pour qPCR), la
polymérase, les nucléoLdes, et d'autres réacLfs nécessaires.
•ULliser des réacLfs exempts de contaminants et d'enzymes inhibitrices.
2) DistribuLon des réacLons :
•RéparLr les réacLfs dans des tubes ou plaques de PCR appropriés.
•Prévoir des témoins négaLfs et posiLfs, ainsi que des témoins de réacLon sans ADN (blancs).
D. Programma*on des thermocycleurs
1) Paramètres de la PCR
•Définir les paramètres de la PCR, notamment la température d'iniLaLon, la température

d'extension, le nombre de cycles, etc.
•Configurer le thermocycleur pour effectuer une PCR classique ou une qPCR en foncLon des
besoins.
2) ProgrammaLon de la qPCR (si applicable) :
•Si vous uLlisez la qPCR, définir les paramètres spécifiques à la sonde fluorescente, comme la
température de détecLon, le nombre de cycles, etc.
3) Contrôle de qualité :
•Vérifier la qualité des réacLons en uLlisant des contrôles internes, des courbes de fusion, et en
incluant des témoins connus.
E. Analyse des résultats
1) QuanLficaLon absolue:
•Analyser les courbes de fluorescence

pour déterminer la quanLté d'ADN
amplifié.
2) QuanLficaLon relaLve (pour qPCR) :
•ULliser des méthodes telles que la

méthode ΔΔCt pour quanLfier
relaLvement l'expression génique.
•Analyser les courbes de fluorescence

pour déterminer la quanLté d'ADN
amplifié.
•Analyser les courbes de fluorescence pour déterminer la quanLté d'ADN amplifié.

On place le seuil (ligne verte)

dans cette
phase exponentielle.
Ct se mesure là où la courbe
PCR croise le seuil.
Ct est un cycle PCR donné. Elle

est prise dans là où la pente est
linéaire.
Ici, Ct = 16

Ici,
Ct (ech1) = 21
Ct (ech2) = 30
Plus le Ct est petit plus l’échantillons

est concentré en ADN
Ici,
Ct (ech1) = 21
Ct (ech2) = 30
Plus le Ct est petit plus l’échantillons

est concentré en ADN
•La quanLficaLon absolue permet de déterminer la quanLté ou le nombre de copies d’un

ADN dans un échanLllon à l’aide d’un ADN étalon dont la quanLté ou le nombre de copie
sont connus..
Avec une gamme on peut quanLfier la quanLté iniLal de copie présent dans l’échanLllons
Traiter les données : faire une courbe de type

Ct = a Log (nbr copies) + b,
a) Calculer les log des nombres de copies

b) Tracer la courbe
c) Déterminer l’équaLon de la droite
d) Calculer l’efficacité de la qPCR avec la
formule suivante : E = 10(-pente) -1
e) Calculer le nombre de copie présent dans
chaque échanLllon à l’aide de l’équaLon de
la droite
3) QuanLficaLon relaLve:
La quanLficaLon relaLve est souvent uLlisée pour comparer le niveau d’expression d’un gène-
cible dans deux condiLons expérimentales (ex. échanLllon traité et contrôle).
Contrôle endogène
Le contrôle endogène est le gène qui ne varie pas entre les échanLllons testés.
Par exemple : GAPDH, ACTB, TBP, HPRT, PPIA, YWHAZ
Delta Ct = Ct gène – Ct contrôle endogène

•ULliser des méthodes telles que la méthode ΔΔCt pour quanLfier relaLvement l'expression
génique. Pour cela on uLlise un Calibrateur.
calibrateur
C’est l’échanLllon « non traité » ou « temps zéro ». Le RQ du calibrateur donne 1

car il ne varie pas par rapport à lui-même.
Delta Delta Ct = ∆Ct échanLllon1 – ∆Ct calibrateur
DéterminaLon de la variaLon du nombre de copie du gène-cible : Facteur de variation = 2-

ΔΔCt.
Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène
DRn Contrôle endogène
Gène cible
DCt = 22 – 16 = 6
Ct=16 Ct=22 Cycle Si 2 x plus de matrice ?

Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène
DRn Contrôle endogène
Gène cible
DCt = 22 – 16 = 6
Ct=16 Ct=22 Cycle Si 2 x plus de matrice ?

DRn
Contrôle endogène
Gène cible
DCt = 21 – 15 = 6
Ct=16 Ct=22 Cycle
Ct=15 Ct=21
Quantification relative
• pas besoin de courbe de standard

• calcul des résultats pas comparaisons des Ct
• nécessité de définir :
- un gène cible servant de contrôle endogène,
- un gène cible servant de standard.
ü le contrôle endogène :
- donne une image de la quan9té de matrice apportée (ADN ou ADNc),
- est présent en quan9té constante dans tous les échan9llons,
- normalise :
- les biais d’extrac9on et de contamina9ons par des inhibiteurs (ADN)
- les varia9ons d’éfficacité de transcrip9on inverse
t=0 t=2 t=4 t=7 t=14 t=21
-t0 ajout d’atrazine à des mésocosmes de sol,

-t0 sera uLlisé comme valeur standard
Comparaison de Ct
t0 Gène cible
DRn
t2
DRn
Contrôle endogène
Ct=14 Ct=32 Cycle Ct=16 Ct=26 Cycle

t4
DRn t7
DRn
Ct=15 Ct=31 Cycle

Ct=12 Ct=22 Cycle
IV. Protocole expérimental Comparaison de Ct
Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène

Gène cible
Ct gène cible – Ct contrôle endogène = DCt
Contrôle endogène
Etape 2: normalisaLon par rapport au standard
DCt échanAllon - DCt standard = DDCt
Etape 3: déterminaLon de la variaLon du nombre de copie du gène cible
2-DDCt
FML 13-12-04
Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène à T0

Gène cible
Ct gène cible à t0 – Ct contrôle endogène à t0 = DCt t0
Contrôle endogène
FML 13-12-04
Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène à T0

Gène cible
Contrôle endogène
Etape 2: normalisaLon par rapport au standard
DCt échanAllon - DCt standard = DDCt
DCt t2 - DCt t0 = DDCt
FML 13-12-04
Etape 3: déterminaLon de la variaLon du nombre de copie du gène cible
2-DDCt
De plus, une normalisaLon du niveau d’expression du gène-cible étudié est nécessaire. Un ou

plusieurs gènes ubiquistes, dont les expressions sont constantes dans les condiLons
expérimentales, sont uLlisés comme gène de référence pour normaliser, éliminant les
fluctuaLons. La méthode la plus uLlisée est le calcul de ΔΔCt. Voici un exemple de calcul de
ΔΔCt :
1 : Comparaison entre deux condiLons expérimentales (condiLon expérimentale « exp » et

condiLon de contrôle « ctl ») :
Ct gène-cible (exp) – Ct gène-cible (ctl) = ΔCt gène-cible
Ct gène-réf (exp) – Ct gène-réf (ctl) = ΔCt gène-réf
2 : NormalisaLon par rapport au gène de référence

ΔCt gène-cible - ΔCt gène-réf = ΔΔCt gène-cible
3 : Détermination de la variation du nombre de copie du gène-cible : Facteur de

variation = 2-ΔΔCt. Donc si le ΔΔCt = -2, la variation du niveau d’expression du gène-
cible dans les conditions expérimentales versus les conditions contrôles est de 4 fois.

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C. Détection des produits de PCR

D. Applications classiques de la PCR

X. Futur des techniques d'ampliﬁca*on

Biologie Moléculaire Moderne et l'Importance des Techniques d'Ampliﬁca*on de l'ADN

La biologie moléculaire moderne consLtue un domaine de recherche et d'applicaLon essenLel

Techniques d'ampliﬁcaLon de l'ADN

=> ouverture de nouvelles méthodes pour la compréhension des processus

Biologie Moléculaire Moderne et l'Importance des Techniques d'Ampliﬁca*on de l'ADN

Réplication de l'ADN : Fondement de la Vie

•Les techniques d'amplification de l'ADN permettent de recréer artificiellement ce processus en

Biologie Moléculaire Moderne et l'Importance des Techniques d'Ampliﬁca*on de l'ADN

Iden*ﬁca*on de Gènes et d'Organismes

1. PCR : Les Débuts Pionniers

2. Expansion de la PCR dans la Recherche et la Médecine

•Années 1990 : La PCR devient un outil incontournable en recherche génétique, facilitant

Brève Histoire et Évolu*on des Techniques de PCR et qPCR

3. Transi*on vers la qPCR : La Quête de la Quan*ﬁca*on en Temps Réel

4. Avènement de la Technologie de la qPCR

•Améliora*on de la sensibilité et de la spéciﬁcité : La qPCR devient un ouLl essenLel pour la

Brève Histoire et Évolu*on des Techniques de PCR et qPCR

5. Évolu*on Con*nue et Émergence de Nouvelles Variantes

6. Applica*ons Diversiﬁées et Intégra*on dans la Recherche Appliquée

•Actuellement : La PCR et la qPCR sont largement intégrées dans de nombreux domaines de

Objectifs spécifiques de la PCR :

Objec*fs spéciﬁques de la PCR : Objec*fs spéciﬁques de la qPCR :

1.AmpliﬁcaLon exponenLelle. 1.QuanLﬁcaLon en temps réel.

A. Les étapes de base de la PCR

Température d’hybridation (Th)

A. Les étapes de base de la PCR

•RépéLLon cyclique des étapes de dénaturaLon, hybridaLon et extension.

C. Détec*on des Produits de PCR :

•Clonage d'ADN : Amplification de fragments spécifiques pour la création de clones génétiques.

•Détec*on de Muta*ons : IdenLﬁcaLon de variaLons généLques.

•Détec*on de Muta*ons : IdenLﬁcaLon de variaLons généLques.

Wild Mutant 1 Mutant 2

• Diagnos*c Médical : DétecLon d'agents pathogènes,

•Séquençage d'ADN : PréparaLon d'échanLllons pour des

•Études de l'Expression Génique : Analyse des niveaux

• L'échanLllon contenant l'ADN à ampliﬁer. Peut être de l'ADN génomique, de l'ADN

1.Dénaturation, Hybridation, Extension :

1. Les étapes de dénaturation, hybridation des amorces et extension se déroulent de

2.Détection en Temps Réel :

2. La mesure de la fluorescence à chaque cycle permet de suivre l'amplification en temps

•Applications Quantitatives : La qPCR est particulièrement adaptée à des applications

Processus par étapes

1. Au cours de la PCR, l’ADN polymérase Applied Biosystems™ AmpliTaq Gold™ ampliﬁe la

Avantages du colorant SYBR Green I

Inconvénient du colorant SYBR Green I

peut générer de faux signaux posi*fs ;

Développement de la chimie TaqMan

Le développement de sondes ﬂuorogéniques a également permis d’éliminer le traitement post-

FoncLonnement de la chimie de détecLon de séquences TaqMan

Processus par étapes

1.Une sonde d’oligonucléoLdes :

Tant que la sonde est intacte, la proximité du

Processus par étapes

4. Les molécules du colorant rapporteur supplémentaires sont clivées de leurs sondes

Avantages de la chimie TaqMan

Inconvénient de la chimie TaqMan

•Applica*on : Études de régulaLon génique, recherche en biologie du développement,

•Objec*f : IdenLﬁer des variaLons spéciﬁques dans les séquences d'ADN.

Idenﬁcaon de Gènes et d'Organismes

3. Transion vers la qPCR : La Quête de la Quanﬁca*on en Temps Réel

5. Évoluon Connue et Émergence de Nouvelles Variantes

6. Applicaons Diversiﬁées et Intégraon dans la Recherche Appliquée

Objecfs spéciﬁques de la PCR : Objecfs spéciﬁques de la qPCR :

•Détecon de Mutaons : IdenLﬁcaLon de variaLons généLques.

•Détecon de Mutaons : IdenLﬁcaLon de variaLons généLques.

A. Préparaon des échanllons pour la PCR et la qPCR