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1292–1305  Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  Vol.  30,  n°  6 ©  2002  Oxford  University  Press

ENQUÊTE  ET  RÉSUMÉ

PCR  en  temps  réel  en  virologie
Ian  M.  Mackay1,2,3,*,  Katherine  E.  Arden4  et  Andreas  Nitsche5
1Clinical  Virology  Research  Unit,  Sir  Albert  Sakzewski  Virus  Research  Centre,  Royal  Children's  Hospital,  Brisbane,
Australie,  2Department  of  Paediatrics  and  3Clinical  Medical  Virology  Centre,  University  of  Queensland,  Queensland,
Australie,  4Membrane  Transport  Laboratory,  Division  of  Cancer  and  Cell  Biology,  Queensland  Institute  of  Medical
Research,  Queensland,  Australie  et  5TIB  MOLBIOL,  Tempelhofer  Weg  11–12,  D­10829  Berlin,  Allemagne

Reçu  le  31  octobre  2001 ;  Révisé  le  2  janvier  2002 ;  Accepté  le  14  janvier  2002

ABSTRAIT chacun  s'hybridant  à  un  brin  d'une  cible  d'ADN  double  brin  (ADNdb),  la  
paire  couvrant  une  région  qui  sera  reproduite  de  manière  exponentielle.  
L'utilisation  de  la  réaction  en  chaîne  par  polymérase  (PCR)  dans  le  
L'amorce  hybridée  agit  comme  un  substrat  pour  une  ADN  polymérase  (le  
diagnostic  moléculaire  s'est  développée  au  point  où  elle  est  maintenant  
plus  souvent  dérivée  de  la  bactérie  thermophile  Thermus  aquaticus  et  
acceptée  comme  l'étalon­or  pour  la  détection  d'acides  nucléiques   appelée  Taq),  qui  crée  un  brin  complémentaire  par  addition  séquentielle  
d'origines  diverses  et  elle  est  devenue  un  outil  essentiel  dans  le   de  désoxynucléotides.  Le  processus  peut  être  résumé  en  trois  étapes :  
laboratoire  de  recherche.  La  PCR  en  temps  réel  a  engendré  une  plus   (i)  séparation  de  l'ADNdb  à  des  températures  > 90 °C,  (ii)  recuit  de  
large  acceptation  de  la  PCR  en  raison  de  sa  rapidité,  de  sa  sensibilité,   l'amorce  à  50­75 °C  et  (iii)  extension  optimale  à  72­78 °C  (Fig.  1A) .  Le  
de  sa  reproductibilité  améliorées  et  du  risque  réduit  de  contamination  par   taux  de  changement  de  température  ou  le  taux  de  rampe,  la  durée  de  
transfert.  Il  existe  actuellement  cinq  principales  chimies  utilisées  pour  la   l'incubation  à  chaque  température  et  le  nombre  de  fois  que  chaque  
détection  du  produit  PCR  pendant  la  PCR  en  temps  réel.  Ce  sont  les   ensemble  de  températures  (ou  cycle)  est  répété  sont  contrôlés  par  un  
fluorophores  de  liaison  à  l'ADN,  l'  endonucléase  5  ' ,  les  oligosondes   thermocycleur  programmable.  Les  technologies  actuelles  ont  
adjacentes  linéaires  et  en  épingle  à  cheveux  et  les  amplicons  auto­ considérablement  raccourci  les  temps  de  rampe  en  utilisant  des  blocs  
chauffants  à  commande  électronique  ou  des  flux  d'air  chauffés  par  
fluorescents,  qui  sont  décrits  en  détail.  Nous  discutons  également  des  
ventilateur  pour  modérer  la  température  de  réaction.  Par  conséquent,  la  
facteurs  qui  ont  limité  le  développement  de  la  PCR  multiple  en  temps  
PCR  remplace  une  partie  de  la  culture  cellulaire  de  référence,  de  
réel  ainsi  que  du  rôle  de  la  PCR  en  temps  réel  dans  la  quantification  des  
l'antigénémie  et  des  tests  sérologiques  (3).  Des  combinaisons  existantes  
acides  nucléiques.  Le  matériel  d'amplification  et  les  chimies  de  détection   de  PCR  et  de  tests  de  détection  (appelées  ici  « PCR  conventionnelle »)  
fluorigène  ont  évolué  rapidement  à  mesure  que  la  compréhension  de  la   ont  été  utilisées  pour  obtenir  des  données  quantitatives  avec  des  résultats  
PCR  en  temps  réel  s'est  développée  et  cette  revue  vise  à  mettre  à  jour   prometteurs.  Cependant,  ces  approches  ont  souffert  des  étapes  de  
le  scientifique  sur  l'état  actuel  de  la  technique.  Nous  décrivons  le   manipulation  post­PCR  laborieuses  nécessaires  pour  évaluer  l'amplicon  
contexte,  les  avantages  et  les  limites  de  la  PCR  en  temps  réel  et  nous   (4).
passons  en  revue  la  littérature  telle  qu'elle  s'applique  à  la  détection  de  
virus  dans  le  laboratoire  de  routine  et  de  recherche  afin  de  nous   La  détection  traditionnelle  de  l'ADN  amplifié  repose  sur  l'électrophorèse  
concentrer  sur  l'un  des  nombreux  domaines  dans  lesquels  l'application   des  acides  nucléiques  en  présence  de  bromure  d'éthidium  et  l'analyse  
de  la  PCR  en  temps  réel  a  ont  fourni  des  avantages  méthodologiques   visuelle  ou  densitométrique  des  bandes  résultantes  après  irradiation  par  
significatifs  et  amélioré  les  résultats  pour  les  patients.  Cependant,  la   la  lumière  ultraviolette  (5).  La  détection  d'amplicon  par  transfert  de  
Southern  par  hybridation  avec  une  sonde  oligonucléotidique  marquée  
technologie  discutée  a  été  appliquée  à  d'autres  domaines  de  la  
prend  également  du  temps  et  nécessite  plusieurs  étapes  de  manipulation  
microbiologie  ainsi  qu'à  des  études  sur  l'expression  des  gènes  et  les  
du  produit  de  PCR,  ce  qui  risque  encore  une  propagation  de  l'amplicon  
maladies  génétiques.
dans  tout  le  laboratoire  (6).  Alternativement,  la  PCR­ELISA  peut  être  
utilisée  pour  capturer  l'amplicon  sur  une  phase  solide  en  utilisant  des  
amorces  marquées  à  la  biotine  ou  à  la  digoxigénine,  des  sondes  
oligonucléotidiques  (oligosondes)  ou  directement  après  l'incorporation  de  
la  digoxigénine  dans  l'amplicon  (7–12).  Une  fois  capturé,  l'amplicon  peut  
être  détecté  à  l'aide  d'une  molécule  rapporteur  d'avidine  ou  d'anti­
digoxigénine  marquée  par  une  enzyme  similaire  à  un  format  ELISA  
ARRIÈRE­PLAN
standard.
La  réaction  en  chaîne  par  polymérase  (PCR)  (1,2)  a  été  utilisée  comme   La  possibilité  que,  contrairement  aux  tests  conventionnels,  la  détection  
nouvel  étalon­or  pour  détecter  une  grande  variété  de  modèles  dans  une   de  l'amplicon  puisse  être  visualisée  au  fur  et  à  mesure  que  l'amplification  
gamme  de  spécialités  scientifiques,  y  compris  la  virologie.  Le  procédé   progressait  était  la  bienvenue  (13).  Cette  approche  a  permis  de  mieux  
utilise  une  paire  d'oligonucléotides  synthétiques  ou  d'amorces, comprendre  la  cinétique  de  la  réaction

*À  qui  la  correspondance  doit  être  adressée  à :  CVRU,  SASVRC,  Royal  Children's  Hospital,  Herston  Road,  Herston,  Queensland  4029,  Australie.
Tél :  +61  3636  8716 ;  Télécopie :  +61  3636  1401 ;  Courriel :  i.mackay@mailbox.uq.edu.au
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Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  Vol.  30,  n°  6  1293

avantages  par  rapport  aux  oligosondes  radiogéniques  qui  comprennent  un  
évitement  des  émissions  radioactives,  une  facilité  d'élimination  et  une  durée  de  
conservation  prolongée  (18).
La  vitesse  accrue  de  la  PCR  en  temps  réel  est  en  grande  partie  due  à  la  
réduction  des  temps  de  cycle,  à  la  suppression  des  procédures  de  détection  post­
PCR  et  à  l'utilisation  de  marqueurs  fluorogènes  et  de  méthodes  sensibles  de  
détection  de  leurs  émissions  (19,20).  La  réduction  de  la  taille  des  amplicons  
généralement  recommandée  par  les  créateurs  de  tests  commerciaux  en  temps  
réel  peut  également  jouer  un  rôle  dans  cette  vitesse,  mais  nous  avons  montré  que  
la  diminution  de  la  taille  du  produit  n'améliore  pas  nécessairement  l'efficacité  de  la  
PCR  (21).
Les  inconvénients  de  l'utilisation  de  la  PCR  en  temps  réel  par  rapport  à  la  PCR  
conventionnelle  comprennent  l'incapacité  de  surveiller  la  taille  de  l'amplicon  sans  
ouvrir  le  système,  l'incompatibilité  de  certaines  plates­formes  avec  certaines  
chimies  fluorogènes  et  les  capacités  de  multiplexage  relativement  restreintes  des  
applications  actuelles.  En  outre,  les  frais  de  démarrage  de  la  PCR  en  temps  réel  
peuvent  être  prohibitifs  lorsqu'ils  sont  utilisés  dans  des  laboratoires  à  faible  débit.  
Ces  défauts  sont  principalement  dus  aux  limitations  du  matériel  du  système  ou  
aux  colorants  fluorogènes  disponibles  ou  «  fluorophores  »,  qui  seront  tous  deux  
discutés  plus  en  détail.

Étant  donné  que  la  plupart  des  chimies  de  PCR  en  temps  réel  populaires  
dépendent  de  l'hybridation  d'une  oligosonde  à  sa  séquence  complémentaire  sur  
l'un  des  brins  de  l'amplicon,  l'utilisation  d'une  plus  grande  partie  de  l'amorce  qui  
crée  ce  brin  est  bénéfique  pour  la  génération  d'un  signal  fluorescent  (22).

La  PCR  asymétrique,  comme  cela  est  connu,  s'est  avérée  produire  une  
fluorescence  améliorée  à  partir  d'une  PCR  d'oligosonde  en  épingle  à  cheveux  (23)  
et  nous  l'avons  trouvée  directement  applicable  à  d'autres  tests  d'hybridation  
d'oligosondes.
Les  oligosondes  fluorogènes  les  plus  couramment  utilisées  reposent  sur  le  
transfert  d'énergie  de  résonance  de  fluorescence  (FRET;  Fig.  2)  entre  des  
Figure  1.  Amplification  cinétique.  (A)  Un  tracé  idéalisé  de  la  température  en  fonction  du   marqueurs  fluorogènes  ou  entre  un  fluorophore  et  un  extincteur  non  fluorescent  
temps  au  cours  d'un  seul  cycle  de  PCR  composé  des  étapes  de  dénaturation  (D),   (NFQ)  sombre  ou  «trou  noir»,  qui  disperse  l'énergie  sous  forme  de  chaleur  plutôt  
d'hybridation  d'amorce  et  de  sonde  (A)  et  d'extension  d'amorce  (E).  Aux  plages  de   que  fluorescence.  Le  FRET  est  un  processus  spectroscopique  par  lequel  l'énergie  
températures  optimales  indiquées,  l'ADNdb  est  dénaturé  (TD),  les  oligosondes  s'hybrident  
est  transmise  entre  des  molécules  séparées  de  10  à  100  Å  qui  ont  des  spectres  
(TM­PROBE)  et  enfin  les  amorces  s'hybrident  en  tant  que  précurseur  de  leur  extension  
(TM­PRIMER).  La  température  réelle,  représentée  par  une  ligne  en  pointillés,  peut   d'émission   et  d'absorption  qui  se  chevauchent  (24,25).  Förster  a  principalement  
dépasser  la  température  souhaitée  à  des  degrés  divers,  en  fonction  de  la  qualité  du  thermocycleur  développé  
utilisé. la  théorie  derrière  ce  processus :  le  mécanisme  est  une  interaction  
(B)  La  courbe  d'amplification  idéale  d'une  PCR  en  temps  réel  (gras),  lorsqu'elle  est  tracée   dipôle  induite  non  radiative  (26).  L'efficacité  du  transfert  d'énergie  est  proportionnelle  
en  tant  qu'intensité  de  fluorescence  par  rapport  au  nombre  de  cycles,  est  une  courbe  de  
à  la  sixième  puissance  inverse  de  la  distance  (R)  entre  les  fluorophores  donneur  
croissance  sigmoïde  typique.  L'amplification  précoce  ne  peut  pas  être  visualisée  car  le  
signal  de  détection  est  indiscernable  du  bruit  de  fond.  Cependant,  lorsqu'un  nombre  
et  accepteur  (1/R6)  (27,28).
suffisant  d'amplicons  est  présent,  la  progression  exponentielle  du  test  peut  être  surveillée  
lorsque  le  taux  d'amplification  entre  dans  une  phase  log­linéaire  (LP).  Dans  des  conditions  
idéales,  la  quantité  d'amplicon  augmente  à  un  taux  d'environ  un  log10  tous  les  trois   La  manipulation  post­amplification  de  l'amplicon  n'est  pas  nécessaire  pour  la  
cycles.  Au  fur  et  à  mesure  que  les  amorces  et  l'enzyme  deviennent  limitantes  et  que  les  
PCR  en  temps  réel,  c'est  pourquoi  ces  tests  sont  décrits  comme  des  systèmes  «  
produits  inhibiteurs  de  la  PCR  s'accumulent,  la  réaction  ralentit,  entrant  dans  une  phase  
de  transition  (TP),  atteignant  finalement  la  phase  de  plateau  (PP)  où  il  y  a  peu  ou  pas   fermés  »  ou  homogènes.  Les  avantages  des  systèmes  homogènes  comprennent  
d'augmentation  supplémentaire  du  rendement  du  produit.  Le  point  auquel  la  fluorescence   une  rotation  réduite  des  résultats,  la  minimisation  du  potentiel  de  contamination  
passe  de  niveaux  insignifiants  à  clairement  détectable  est  appelé  cycle  de  seuil  (CT ;   par  transfert  et  la  capacité  d'examiner  de  près  les  performances  du  test  (29).  De  
indiqué  par  une  flèche),  et  cette  valeur  est  utilisée  dans  le  calcul  de  la  quantité  de  matrice  
plus,  la  PCR  en  temps  réel  s'est  avérée  rentable  lorsqu'elle  est  mise  en  œuvre  
pendant  la  PCR  quantitative  en  temps  réel.  Sont  également  présentées  des  courbes  
dans  un  laboratoire  à  haut  débit  (30),  en  particulier  lorsqu'elle  remplace  les  
représentant  un  titrage  optimal  de  la  matrice  (gris),  consistant  en  des  concentrations  de  
matrice  de  départ  supérieures  et  inférieures,  qui  produisent  des  valeurs  CT  inférieures   approches  conventionnelles  de  détection  de  virus  basées  sur  la  culture.
ou  supérieures,  respectivement.  Les  données  pour  la  construction  d'une  courbe  standard  
sont  tirées  du  LP,  ce  qui  permet  ensuite  de  déterminer  la  concentration  d'échantillons  inconnus.

Dans  la  suite  de  cet  article,  la  théorie  de  la  PCR  en  temps  réel  sera  passée  en  
et  c'est  le  fondement  de  la  PCR  cinétique  ou  "en  temps  réel" (Fig.  1B) revue  et  son  utilisation  rapidement  croissante  dans  les  domaines  de  la  virologie  
(6,14–17).  La  PCR  en  temps  réel  a  déjà  fait  ses  preuves  dans  les  laboratoires  du   humaine  sera  utilisée  à  titre  d'illustration.
monde  entier,  en  s'appuyant  sur  l'énorme  quantité  de  données  générées  par  les  
tests  PCR  conventionnels.
DÉTECTION  D'AMPLICONS
Le  suivi  de  l'accumulation  d'amplicon  en  temps  réel  a  été  rendu  possible  par  le  
marquage  d'amorces,  de  sondes  ou  d'amplicon  avec  des  molécules  fluorogènes.   Dans  la  section  suivante,  nous  nous  concentrerons  sur  les  processus  de  détection  
Cette  chimie  a  clairement qui  discriminent  la  PCR  en  temps  réel  de  la  PCR  conventionnelle.
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1294  Nucleic  Acids  Research,  2002,  Vol.  30,  n°  6

nécessite  moins  de  connaissances  spécialisées  que  la  conception  d'oligosondes  
fluorogènes,  est  moins  coûteuse  et  ne  souffre  pas  lorsque  la  séquence  matrice  
varie,  ce  qui  peut  annuler  l'hybridation  d'une  oligosonde  (36).  La  formation  d'amorce­
dimère  (37)  est  courante  et,  avec  la  formation  de  produits  spécifiques,  est  fortement  
associée  à  l'entrée  de  la  PCR  dans  la  phase  plateau  (Fig.  1B)  (38,39).  L'association  
d'un  fluorophore  de  liaison  à  l'ADN  avec  un  amorce­dimère  ou  d'autres  produits  
d'amplification  non  spécifiques  peut  confondre  l'interprétation  des  résultats.  L'ajout  
d'une  courte  incubation  à  température  plus  élevée  après  l'étape  d'extension  au  
cours  de  laquelle  les  données  de  fluorescence  sont  acquises  minimise  la  contribution  
de  ces  produits  au  signal  de  fluorescence  (40).  Le  problème  de  l'amorce­dimère  
peut  également  être  résolu  à  l'aide  d'un  logiciel  capable  d'analyser  la  courbe  de  
fusion  fluorescente.  Cette  méthode  utilise  la  température  à  laquelle  l'amplicon  
d'ADNdb  est  dénaturé  (TD ;  Fig.  1A).  L'amorce­dimère  plus  courte  peut  être  
distinguée  par  son  TD  réduit  par  rapport  à  l'amplicon  de  pleine  longueur.  L'analyse  
des  courbes  de  fusion  de  l'amplicon  en  présence  de  SYBR  green  1  a  démontré  que  
la  sensibilité  pratique  des  fluorophores  de  liaison  à  l'ADN  est  limitée  par  une  
amplification  non  spécifique  à  de  faibles  concentrations  initiales  de  matrice.

Les  fluorophores  de  liaison  à  l'ADN  augmentent  également  le  TD  et  élargissent  
la  transition  de  fusion,  nécessitant  un  changement  de  séquence  substantiel  pour  
produire  un  décalage  du  TD.  Les  oligosondes  sont  capables  de  discriminer  les  
mutations  ponctuelles  en  utilisant  la  température  à  laquelle  50  %  des  duplex  
oligosonde­cible  se  séparent  (41).  Cette  température  est  appelée  température  de  
Figure  2.  Mécanismes  fluorogènes.  Lorsqu'un  rapporteur  (R)  et  un  extincteur  (Q,  
ouvert)  d'une  sonde  de  nucléase  5′  sont  à  proximité  immédiate  comme  dans  (A),   fusion  (TM)  et  dépend  de  la  concentration  de  l'ADNdb,  de  sa  longueur,  de  la  
l'extincteur  "détourne"  les  émissions  qui  ont  résulté  de  l'excitation  du  rapporteur  par  la   séquence  nucléotidique  et  de  la  composition  du  solvant,  et  est  souvent  confondue  
source  lumineuse  de  l'instrument.  Le  quencher  émet  alors  cette  énergie  (flèches   avec  TD  (Fig.  1A)  (42).
pleines).  Lorsque  les  fluorophores  sont  séparés  au­delà  d'une  certaine  distance,  
comme  cela  se  produit  lors  de  l'hydrolyse  comme  illustré  en  (B),  l'extincteur  n'exerce  
plus  aucune  influence  et  le  rapporteur  émet  à  une  longueur  d'onde  distinctive  (flèches   Oligosondes  linéaires
en  pointillés)  qui  est  enregistrée  par  l'instrument.  Dans  le  processus  inverse  tel  
qu'illustré  en  (C)  utilisant  des  oligosondes  adjacentes,  les  fluorophores  commencent   L'utilisation  d'une  paire  de  sondes  oligo  d'hybridation  fluorogènes  adjacentes  a  été  
sous  forme  d'entités  séparées.  Un  signal  de  l'accepteur  (A)  ne  peut  être  généré  que   décrite  pour  la  première  fois  à  la  fin  des  années  1980  (43,44)  et,  maintenant  
lorsque  le  donneur  (D)  se  trouve  à  proximité,  comme  illustré  en  (D).  Cela  se  produit  à  
connues  sous  le  nom  de  « HybProbes »,  elles  sont  devenues  la  méthode  de  choix  
la  suite  de  l'hybridation  adjacente  des  oligosondes  à  l'amplicon  cible.  En  (E)  une  autre  
forme  d'extinction  est  montrée,  provoquée  par  le  contact  intime  de  marqueurs  attachés   pour  le  LightCycler™  (Roche  Molecular  Biochemicals,  Allemagne ),  un  fluorimètre  
à  des  oligosondes  en  épingle  à  cheveux  (molecular  beacon,  sunrise  ou  scorpion).  Le   et  thermocycleur  microvolume  à  base  capillaire  avec  contrôle  rapide  de  la  
fluorophore  (F)  et  un  NFQ  (Q,  fermé)  interagissent  plus  par  collision  que  FRET,   température  (20,  45).  L'oligosonde  en  amont  est  marquée  avec  un  fluorophore  
perturbant  la  structure  électronique  de  l'autre  et  transmettant  directement  l'énergie  
donneur  3  '(FITC)  et  la  sonde  en  aval  est  généralement  marquée  avec  un  fluorophore  
d'excitation  qui  est  dissipée  sous  forme  de  chaleur  (flèches  en  pointillés).  Lorsque  les  
étiquettes  sont  séparées  par  rupture  de  l'épingle  à  cheveux,  comme  c'est  le  cas  en   accepteur  LightCycler  Red  640  ou  Red  705  à  l'extrémité  5  'de  sorte  que  lorsque  les  
(F),  le  fluorophore  est  libre  de  fluo  resce  (flèches  en  pointillés). deux  oligosondes  sont  hybridées,  les  deux  fluorophores  sont  situés  à  moins  de  10  
nt  l'une  de  l'autre,  attirant  parfois  le  nom  de  sondes  «  embrassantes  » (Figs  2C,  D  
et  3C).  Les  capillaires  composites  en  plastique  et  en  verre  sont  optiquement  clairs  
Tests  PCR.  Il  existe  cinq  grandes  chimies  actuellement  utilisées,  et  elles  peuvent   et  agissent  comme  des  cuvettes  pour  l'analyse  de  fluorescence,  tout  en  facilitant  un  
être  classées  en  méthodes  spécifiques  ou  non  spécifiques  à  la  séquence  d'amplicon   transfert  de  chaleur  rapide.  Les  capillaires  sont  mis  en  rotation  devant  une  diode  
de  détection  par  PCR  en  temps  réel  (31).  Chacune  des  chimies  a  une  nomenclature   électroluminescente  bleue  et  la  fluorescence  est  surveillée  par  trois  diodes  de  
associée  pour  décrire  les  marqueurs  fluorescents ;  cependant,  pour  une  discussion   photodétection  avec  différents  filtres  de  longueur  d'onde.

générale,  le  fluorophore  continuera  à  être  utilisé  pour  décrire  ces  fragments.

La  température  est  variée  en  chauffant  et  en  refroidissant  rapidement  l'air  à  l'aide  
Bien  que  cette  revue  se  concentre  sur  l'utilisation  de  ces  chimies  dans  des  
d'un  élément  chauffant  et  d'un  ventilateur  qui  produisent  des  vitesses  de  rampe  de  
applications  en  temps  réel,  elles  peuvent  également  être  utilisées  comme  étiquette  
20°C/s,  prolongeant  la  survie  de  la  polymérase  (46).  De  plus,  étant  donné  que  les  
pour  la  détection  d'amplicon  de  point  final.
oligosondes  ne  sont  pas  significativement  hydrolysées  lors  de  l'amplification  (47)  et  

Fluorophores  se  liant  à  l'ADN  La  base   que  le  LightCycler  est  capable  de  surveiller  les  changements  d'émission  de  
fluorescence  lors  de  la  dénaturation  des  oligosondes  adjacentes  à  partir  de  leur  
des  méthodes  de  détection  non  spécifiques  de  séquence  est  la  molécule  fluorogène   amplicon,  ce  système  peut  effectuer  un  génotypage  à  tube  unique.  Cette  capacité,  
se  liant  à  l'ADN.  Ce  groupe  comprend  les  approches  les  plus  anciennes  et  les  plus   qui  utilise  l'analyse  de  la  courbe  de  fusion  fluorescente,  fournit  des  informations  
simples  de  la  PCR  en  temps  réel. importantes  sur  la  séquence  à  laquelle  les  oligosondes  se  lient.  La  ou  les  mutations  
Le  bromure  d'éthidium  (32),  le  YO­PRO­1  (33,34)  et  le  SYBR®  green  1  (35)   sous  une  ou  les  deux  oligosondes  peuvent  être  déterminées  par  la  diminution  de  la  
émettent  tous  une  fluorescence  lorsqu'ils  sont  associés  à  l'ADNdb  qui  est  exposé  à   fusion
une  longueur  d'onde  de  lumière  appropriée.  Cette  approche
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Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  Vol.  30,  n°  6  1295

Figure  3.  Chimie  oligosonde.  (A)  Oligosondes  5'  Nuclease.  Au  fur  et  à  mesure  que  l'ADN  polymérase  (pol)  progresse  le  long  du  brin  concerné,  elle  déplace  puis  hydrolyse  
l'oligosonde  via  son  activité  endonucléase  5'→3' .  Une  fois  que  le  rapporteur  (R)  est  soustrait  à  l'influence  extinctrice  de  l'extincteur  (Q,  ouvert),  il  est  capable  de  libérer  de  
l'énergie  d'excitation  à  une  longueur  d'onde  contrôlée  par  l'instrument  et  différente  des  émissions  de  l'extincteur.  L'encart  montre  les  molécules  NFQ  et  MGB  qui  composent  
les  oligosondes  de  nucléase  MGB  améliorées.  (B)  Oligosondes  en  épingle  à  cheveux.  L'hybridation  de  l'oligosonde  à  la  cible  sépare  suffisamment  le  fluorophore  (F)  et  
l'extincteur  non  fluorescent  (Q,  fermé)  pour  permettre  l'émission  du  fluorophore  excité,  qui  est  surveillé.  L'encart  montre  une  oligosonde  en  épingle  à  cheveux  à  décalage  de  
longueur  d'onde  incorporant  une  molécule  de  récolteuse.  (C)  Oligosondes  adjacentes.  L'hybridation  adjacente  entraîne  un  signal  FRET  dû  à  l'interaction  entre  les  fluorophores  
donneur  (D)  et  accepteur  (A).  Ce  système  bimoléculaire  acquiert  ses  données  à  partir  des  émissions  de  l'accepteur  d'une  manière  opposée  à  la  fonction  de  la  chimie  des  
oligosondes  de  nucléase.  (D)  Amorces  Sunrise.  Le  brin  opposé  est  dupliqué  afin  que  la  structure  en  épingle  à  cheveux  de  l'amorce  puisse  être  perturbée.  Cela  sépare  les  
marqueurs,  éliminant  l'extinction  d'une  manière  similaire  à  l'oligosonde  en  épingle  à  cheveux.  (E)  Amorces  Scorpion.  L'amorce  ne  nécessite  pas  d'extension  du  brin  
complémentaire ;  en  fait,  il  bloque  l'extension  pour  garantir  que  l'épingle  à  cheveux  dans  la  sonde  n'est  interrompue  que  par  une  hybridation  spécifique  avec  une  séquence  
complémentaire  conçue  pour  se  produire  en  aval  de  son  propre  brin  naissant.  L'encart  montre  un  scorpion  duplex  qui  échange  la  structure  tige­boucle  contre  un  élément  
d'amorce  marqué  en  extrémité  avec  le  fluorophore  et  un  oligonucléotide  complémentaire  séparé  marqué  avec  un  extincteur  à  l'  extrémité  5  ' .

température  qu'ils  subissent  en  raison  de  la  déstabilisation  du  duplex   la  détection  d'agents  pathogènes  viraux  apparentés.  Malgré  le  fait  que  
oligosonde/cible  (Fig.  4).  Cela  a  permis  des  améliorations  significatives   l'hybridation  n'atteint  pas  l'équilibre  en  utilisant  ces  vitesses  de  rampe,  les  
de  la  vitesse  de  diagnostic  des  maladies  génétiques  ainsi  qu'un  nombre   valeurs  apparentes  de  TM  sont  à  la  fois  reproductibles  et  caractéristiques  
croissant  d'approches  PCR  multiplex  pour d'un  duplex  sonde/cible  donné  (48).  Cependant,
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1296  Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  vol.  30,  n°  6

une  partie  de  l'oligosonde  est  consommée  par  l'activité  de  l'endonucléase  
liée  à  la  séquence  (50,  51).  Les  trois  chimies  d'oligosondes  (SYBR  Green  I,  
nucléase  et  oligosondes  adjacentes)  semblent  capables  de  détecter  le  
produit  amplifié  avec  approximativement  la  même  sensibilité  (20).

Des  combinaisons  des  approches  ci­dessus  apparaissent  maintenant  à  
mesure  que  de  plus  en  plus  d'utilisateurs  de  l'instrumentation  se  familiarisent  
avec  les  concepts  derrière  la  PCR  en  temps  réel  et  contribuent  à  la  littérature.
Si  une  oligosonde  linéaire  spécifique  à  la  séquence  et  marquée  par  un  
fluorophore  est  ajoutée  à  un  mélange  SYBR  green  1,  actuellement  appelé  le  
système  Bi­probe,  FRET  se  produira  et  une  couche  supplémentaire  de  
spécificité  peut  être  obtenue  (44,  52,  53).  Un  test  utilisant  une  oligosonde  
marquée  BODIPY®FL  a  été  adapté  pour  fonctionner  dans  le  LightCycler  en  
utilisant  une  séquence  cible  de  β­globine  (54).  La  sonde  a  été  conçue  pour  
que  le  fluorophore  soit  situé  sur  une  cytosine  terminale  et  soit  désactivé  par  
proximité  avec  une  guanine  complémentaire.
Le  test  a  démontré  que  l'extinction  varie  linéairement  avec  la  concentration  
de  matrice  sur  une  plage  de  concentration  définie.  Le  fluorophore  FITC  
couramment  utilisé  est  intrinsèquement  désactivé  par  des  nucléotides  de  
désoxyguanosine.  Le  niveau  d'extinction  peut  être  augmenté  si  plus  de  
guanines  sont  présentes  ou  si  une  seule  guanine  est  située  dans  la  première  
position  en  porte­à­faux,  1  nt  au­delà  de  l'extrémité  de  la  sonde  marquée  au  
fluorophore.  Cette  approche  de  détection  d'amplicon  est  plus  facile  à  
concevoir  que  les  oligosondes  fluorogènes,  plus  simple  à  synthétiser  et  à  
utiliser  dans  la  PCR  en  temps  réel  et  ne  nécessite  pas  d'ADN  polymérase  à  
activité  nucléase  (55).

La  sonde  lumineuse  est  un  acide  nucléique  peptidique  auquel  est  attaché  
le  fluorophore  cyanine  asymétrique  thiazole  orange  (56).  Lorsqu'il  est  hybridé  
avec  une  cible  d'acide  nucléique,  soit  sous  forme  de  duplex  soit  de  triplex,  
selon  la  séquence  de  l'oligosonde,  le  fluorophore  devient  fortement  
fluorescent.  Ces  sondes  n'interfèrent  pas  avec  la  PCR,  ne  nécessitent  pas  
de  changement  de  conformation,  sont  sensibles  aux  mésappariements  d'un  
seul  nucléotide  permettant  une  analyse  de  fusion  par  fluorescence,  et  comme  
un  seul  reporter  est  utilisé,  une  mesure  directe  de  la  fluorescence  peut  être  
effectuée  au  lieu  de  la  mesure  d'un  changement  en  fluorescence  entre  deux  

Figure  4.  Analyse  de  la  courbe  de  fusion  fluorescente.  À  la  fin  d'une  PCR  en  temps  réel   fluorophores  (56,57).  Cependant,  une  fluorescence  non  spécifique  a  été  
utilisant  une  paire  d'oligosondes  adjacentes,  la  réaction  peut  être  refroidie  à  une   signalée  au  cours  des  cycles  ultérieurs  utilisant  ces  sondes  (58).
température  inférieure  à  la  TM  attendue  des  oligosondes,  puis  chauffée  au­dessus  de  
85 °C  à  une  fraction  de  degré  par  seconde  (B).  Pendant  le  chauffage,  les  émissions  de  
l'accepteur  peuvent  être  acquises  en  permanence  (C).  Le  logiciel  calcule  la  dérivée   Oligosondes  5′  Nuclease
négative  de  la  fluorescence  au  fil  du  temps,  produisant  des  pics  clairs  qui  indiquent  le  
TM  de  la  transition  de  fusion  oligosonde­cible  (D).  Lorsqu'une  ou  plusieurs  mutations   À  la  fin  des  années  1980,  les  dosages  homogènes  étaient  rares,  mais  les  
sont  présentes  sous  une  ou  les  deux  oligosondes  (A),  cette  TM  est  décalée  et  ce   progrès  rapides  de  l'instrumentation  thermocycleuse  et  de  la  chimie  de  la  
décalage  peut  être  utilisé  de  manière  diagnostique  pour  discriminer  les  polymorphismes  
manipulation  des  acides  nucléiques  ont  depuis  rendu  ces  dosages  monnaie  
de  nucléotide  unique  dans  la  matrice.  Idéalement,  l'une  des  oligosondes,  l'ancre,  est  
conçue  pour  se  lier  à  une  région  de  séquence  stable,  tandis  que  l'autre,  le  capteur,   courante.  Le  succès  de  ces  tests  tourne  autour  d'un  changement  de  signal  
couvrira  le  décalage.  Les  mésappariements  près  du  centre  de  la  sonde  et  flanqués  de   d'une  manière  rapide  et  mesurable  lors  de  l'hybridation  d'une  sonde  à  sa  
paires  G:C  sont  plus  déstabilisants  que  les  mésappariements  près  des  extrémités  de  l'oligosonde   flanquées  
cible   (59).  Edn  
e  
uptilisant  
aires  A:T.
un  excès,  le  temps  requis  pour  l'hybridation  d'une  
sonde  oligo  à  sa  cible,  en  particulier  lorsque  la  quantité  de  cette  cible  a  été  
augmentée  par  PCR  ou  un  autre  processus  d'amplification,  est  
les  capillaires  sont  fragiles  et  nécessitent  une  certaine  expérience  pour  être  
considérablement  réduit  (41,  59).
manipulés  (49).
Lors  de  la  comparaison  des  signaux  des  différentes  chimies,  la  destruction  
En  1991,  Holland  et  al.  (6)  ont  décrit  une  technique  qui  devait  constituer  
des  oligosondes  de  nucléase  se  poursuit  malgré  un  plateau  dans   la  base  d'une  PCR  homogène  utilisant  des  oligosondes  fluorogènes.  
l'accumulation  de  produit  alors  que  la  fluorescence  SYBR  green  1  dans  le   L'amplicon  a  été  détecté  en  surveillant  l'effet  de  l'activité  de  l'endonucléase  
contrôle  sans  matrice  augmente  généralement  de  manière  non  spécifique   5  '→  3'  de  l'ADN  polymérase  Taq  sur  des  duplex  oligosonde/ADN  cible  
au  cours  des  cycles  ultérieurs.  La  fluorescence  de  l'oligosonde  adjacente   spécifiques.  Les  produits  radiomarqués  ont  été  examinés  par  chromatographie  
commence  à  diminuer  à  mesure  que  le  taux  de  collision  entre  le  nombre   sur  couche  mince  et  la  présence  ou  l'absence  d'hydrolyse  a  été  utilisée  
croissant  de  brins  d'amplicon  complémentaires  augmente,  favorisant  la   comme  indicateur  de  la  formation  de  duplex.  Ces  oligosondes  contenaient  
formation  d'ADNdb  par  rapport  à  l'hybridation  de  l'oligosonde  à  son  brin   un  fragment  phosphate  3′,  qui  bloquait  leur  extension  par  la
d'ADN  cible.  De  plus,  il  est  possible  que
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Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  Vol.  30,  n°  6  1297

polymérase,  mais  autrement  n'a  eu  aucun  effet  sur  le  rendement  de  l'amplicon. par  l'amplicon  qui  s'accumule  dépasse  10  écarts­types  de  la  fluorescence  moyenne  
de  base,  en  utilisant  les  données  prises  des  cycles  3  à  15  (Fig.  1B)  (64).  Le  CT  est  
Les  critères  souhaitables  pour  un  marqueur  oligosonde  sont  (i)  la  fixation  facile   proportionnel  au  nombre  de  copies  cibles  présentes  dans  l'échantillon  (17).
du  marqueur  à  l'ADN,  (ii)  la  détectabilité  à  de  faibles  concentrations,  (iii)  la  
détectabilité  à  l'aide  d'instruments  simples,  (iv)  la  production  d'un  signal  altéré  lors   Une  amélioration  récente  de  l'oligosonde  de  nucléase  a  abouti  aux  oligosondes  
d'une  hybridation  spécifique,  (v)  la  sécurité  biologique,  (vi)  la  stabilité  à  des   de  liaison  au  sillon  mineur  (MGB)  (Fig.  3A,  encadré).  Cette  chimie  remplace  le  
températures  élevées  et  (vii)  une  absence  d'interférence  avec  l'activité  de  la   quencher  TAMRA  standard  par  un  NFQ  et  incorpore  une  molécule  qui  stabilise  le  
polymérase  (6,18). duplex  oligosonde­cible  en  se  repliant  dans  le  petit  sillon  de  l'ADNdb  (65).  Cela  
permet  l'utilisation  d'oligosondes  très  courtes  (14  nt),  idéales  pour  détecter  les  
Une  approche  innovante  a  utilisé  la  PCR  de  translation  de  coupure  en   polymorphismes  mononucléotidiques  (SNP).  Une  utilisation  connexe  des  séquences  
combinaison  avec  des  oligosondes  marquées  à  double  fluorophore  (14). d'oligonucléotides  à  double  marquage  a  été  de  fournir  la  partie  génératrice  de  
Dans  le  premier  test  véritablement  homogène  de  ce  type,  un  fluorophore  a  été   signal  du  système  DzyNA  –  PCR  (66).
ajouté  à  l'extrémité  5  'et  un  au  milieu  d'une  sonde  oligonucléotidique  spécifique  à  la  
séquence.  Lorsqu'il  se  trouve  à  une  telle  proximité,  le  fluorophore  rapporteur  5  '(6­
carboxy­fluoroscéine)  a  transféré  l'énergie  d'excitation  induite  par  laser  par  FRET   Ici,  le  rapporteur  et  l'extincteur  sont  séparés  après  clivage  de  la  sonde  par  un  
au  fluorophore  extincteur  3' (6­carboxy­tétraméthyl­rhodamine;  TAMRA),  ce  qui  a   DNAzyme,  qui  est  créé  pendant  la  PCR  en  tant  que  complément  d'une  séquence  
réduit  la  durée  de  vie  du  l'état  excité  du  journaliste  en  prenant  son  énergie   DNAzyme  antisens  incluse  dans  la  queue  5  'de  l'une  des  amorces.  Lors  du  clivage,  
excédentaire  et  en  l'émettant  comme  un  signal  fluorescent  qui  lui  est  propre  (Fig.   le  substrat  à  double  marquage  libère  les  fluorophores  et  génère  un  signal  de  
2A  et  B).  TAMRA  a  émis  la  nouvelle  énergie  à  une  longueur  d'onde  qui  a  été   manière  analogue  à  la  sonde  5'  nucléase.
surveillée  mais  non  utilisée  dans  la  présentation  des  données.  Cependant,  lorsque  
l'oligosonde  s'est  hybridée  à  sa  matrice,  les  fluorophores  ont  été  libérés  en  raison  
de  l'hydrolyse  du  composant  oligosonde  du  duplex  sonde/cible.  Une  fois  les   Oligosondes  en  épingle  à  
marqueurs  séparés,  les  émissions  du  rapporteur  n'étaient  plus  désactivées  et  
cheveux  Les  balises  moléculaires  ont  été  les  premières  oligosondes  en  épingle  à  
l'instrument  surveillait  la  fluorescence  résultante.  Ces  oligosondes  ont  été  appelées  
cheveux  et  sont  une  variante  de  l'oligosonde  de  nucléase  à  double  marquage  (Fig.  3B).
oligosondes  5′  nucléase,  hydrolyse  ou  TaqMan®  (Fig.  3A).
Les  marqueurs  fluorogènes  de  l'oligosonde  en  épingle  à  cheveux  sont  appelés  
fluorophore  et  extincteur,  et  ils  sont  positionnés  aux  extrémités  de  l'oligosonde.  Les  
étiquettes  sont  maintenues  à  proximité  par  des  régions  de  tige  distales  d'appariement  
de  bases  homologues  délibérément  conçues  pour  créer  une  structure  en  épingle  à  
Les  oligosondes  de  nucléase  ont  des  exigences  de  conception  qui  s'appliquent  
cheveux  qui  entraîne  une  trempe  soit  par  FRET,  soit  par  un  transfert  d'énergie  
aux  autres  chimies  d'oligosondes  linéaires,  y  compris  (i)  une  longueur  de  20  à  40  
direct  par  un  mécanisme  de  collision  en  raison  de  la  proximité  intime  des  étiquettes  
nt,  (ii)  une  teneur  en  GC  de  40  à  60  %,  (iii)  aucune  course  d'un  seul  nucléotide,  en  
(Fig.  2E  et  F)  (67).
particulier  G,  (iv)  pas  de  motifs  de  séquence  répétés,  (v)  une  absence  d'hybridation  
En  présence  d'une  séquence  complémentaire,  conçue  pour  apparaître  dans  les  
ou  de  chevauchement  avec  les  amorces  sens  ou  antisens  et  (vi)  une  TM  supérieure  
limites  des  sites  de  liaison  de  l'amorce,  la  sonde  oligo  s'hybridera,  passant  à  une  
d'au  moins  5°C  à  celle  des  amorces,  pour  s'assurer  que  l'oligosonde  s'est  liée  à  la  
configuration  ouverte.  Le  fluorophore  est  maintenant  spatialement  retiré  de  
matrice  avant  que  l'extension  des  amorces  puisse  se  produire  (60).
l'influence  de  l'extincteur  et  les  émissions  fluorescentes  sont  surveillées  au  cours  
de  chaque  cycle  (68).  L'apparition  d'un  mésappariement  entre  une  oligosonde  en  
Cependant,  cette  technologie  a  nécessité  le  développement  d'une  plate­forme  
épingle  à  cheveux  et  sa  cible  a  un  effet  déstabilisant  plus  important  sur  le  duplex  
pour  exciter  et  détecter  la  fluorescence  ainsi  que  pour  effectuer  des  cycles  
que  l'introduction  d'un  mésappariement  équivalent  entre  la  cible  et  une  oligosonde  
thermiques.  Un  dispositif  à  couplage  de  charge  avait  été  décrit  en  1992  pour  la  
linéaire.  En  effet,  la  structure  en  épingle  à  cheveux  fournit  une  conformation  
quantification  des  produits  conventionnels  de  transcription  inverse  (RT)–PCR  (61).  
alternative  très  stable.  Par  conséquent,  les  oligosondes  en  épingle  à  cheveux  se  
En  1993,  cette  approche  a  été  associée  à  un  thermocycleur,  ce  qui  a  donné  
sont  révélées  plus  spécifiques  que  les  oligosondes  linéaires  les  plus  courantes,  ce  
naissance  à  la  première  plate­forme  d'excitation  et  de  détection  de  fluorescence  
par  PCR  en  temps  réel  (29).  À  ce  jour,  le  système  de  détection  de  séquence  ABI   qui  en  fait  des  candidats  idéaux  pour  la  détection  des  SNP  (67).  Le  quencher,  le  4­

Prism®  7700  (Perkin  Elmer  Corporation/Applied  Biosystems,  États­Unis)  a  été  le   (4'­diméthylamino­phénylazo)­benzène  (DABCYL),  diffère  de  celui  décrit  pour  les  

principal  instrument  utilisé  pour  les  oligosondes  5'  nucléase.  Les  fluctuations  de   oligosondes  de  nucléase  car  il  s'agit  d'un  NFQ.

fluorescence  non  liées  à  la  PCR  ont  été  normalisées  à  l'aide  d'un  fluorophore  de  
référence  interne  non  participant  ou  «  passif  » (6  ­carboxy­N,N,N′,N′­
tétraméthylrhodamine ;  ROX).  Les  valeurs  corrigées,  obtenues  à  partir  d'un  rapport  
de  l'intensité  d'émission  du  signal  reporter  et  ROX,  sont  appelées  RQ+.  Pour  mieux   La  sonde  en  épingle  à  cheveux  à  décalage  de  longueur  d'onde  est  une  
contrôler  les  fluctuations  d'amplification,  la  fluorescence  d'une  réaction  de  contrôle   amélioration  récente  de  cette  chimie  qui  utilise  un  deuxième  fluorophore  de  récolte.  
«  sans  matrice  » (RQ–)  est  soustraite  de  RQ+ ,  ce  qui  donne  la  valeur  ∆RQ  qui   Le  moissonneur  transmet  l'énergie  d'excitation  acquise  à  partir  d'une  source  de  
indique  l'amplitude  du  signal  généré  pour  la  PCR  donnée  (62). lumière  bleue  et  la  libère  sous  forme  d'énergie  fluorescente  dans  les  longueurs  
d'onde  du  rouge  lointain.  L'énergie  peut  ensuite  être  utilisée  par  un  fluorophore  «  
émetteur  »  réceptif  qui  produit  de  la  lumière  à  des  longueurs  d'onde  caractéristiques  
(Fig.  3B,  encadré).  Cela  offre  la  possibilité  d'améliorer  l'analyse  PCR  et  SNP  
Le  nombre  de  cycles  fractionnaires  auquel  le  signal  de  fluorescence  en  temps   multiplex  en  temps  réel  (Fig.  4),  en  utilisant  les  instruments  actuellement  disponibles  
réel  reflète  la  progression  de  la  réaction  au­dessus  du  bruit  de  fond  a  été  utilisé   (69).
comme  indicateur  d'une  amplification  cible  réussie  (63).  Ce  cycle  seuil  (CT)  est   Étant  donné  que  la  fonction  de  ces  oligosondes  dépend  de  l'hybridation  correcte  de  
défini  comme  le  cycle  PCR  dans  lequel  le  gain  de  fluorescence  généré la  tige,  une  conception  précise  est  cruciale  pour  leur  fonction  (47).
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1298  Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  vol.  30,  n°  6

Amplicon  auto­fluorescent   plage  dynamique  prédéterminée  pour  les  composants  d'amplification  et  
de  détection  (79).
L'amplicon  auto­amorçant  est  similaire  dans  son  concept  à  l'oligosonde  
Bien  qu'une  comparaison  des  courbes  standard  absolues,  des  courbes  
en  épingle  à  cheveux,  sauf  que  le  marqueur  s'incorpore  de  manière  
standard  relatives  et  des  valeurs  CT  produise  des  valeurs  finales  
irréversible  dans  le  produit  PCR  (Fig.  3D  et  E).  Deux  approches  ont  été  
similaires  (80),  la  croyance  générale  demeure  qu'un  contrôle  interne  en  
décrites :  les  amorces  sunrise  (désormais  appelées  commercialement  
combinaison  avec  des  répliques  de  chaque  échantillon  est  essentiel  pour  
amorces  en  épingle  à  cheveux  Amplifluor™)  et  les  amorces  scorpion  (31,  
une  quantification  fiable  par  PCR  (38,39).  Malheureusement,  un  logiciel  
70).  L'amorce  sunrise  est  constituée  d'un  fluorophore  5'  et  d'un  DABCYL  
de  PCR  en  temps  réel  capable  de  calculer  la  concentration  d'un  inconnu  
NFQ.  Les  étiquettes  sont  séparées  par  des  séquences  complémentaires  
en  comparant  les  signaux  générés  par  une  cible  amplifiée  et  le  contrôle  
qui  créent  une  tige  lorsque  l'amorce  Sunrise  est  fermée.  À  l'extrémité  3'  
interne  commence  seulement  à  émerger.  Nous  espérons  que  ce  problème  
se  trouve  une  séquence  d'amorce  spécifique  à  la  cible.  La  séquence  de  
sera  résolu  dans  les  prochaines  versions  commerciales  (81).  Par  
l'amorce  sunrise  est  destinée  à  être  dupliquée  par  le  brin  complémentaire  
conséquent,  la  meilleure  approche  suivante  pour  la  quantification  par  
naissant  et,  de  cette  manière,  la  tige  est  déstabilisée,  les  deux  fluorophores  
PCR  est  l'utilisation  d'une  courbe  standard  externe.  Cette  approche  
sont  séparés  d'environ  20  nt  (70  Å)  et  le  fluorophore  est  libre  d'émettre  
repose  sur  le  titrage  d'un  modèle  amplifié  de  manière  identique,  dans  une  
son  énergie  d'excitation  pour  le  suivi  (70).  Ce  système  pourrait  souffrir  
matrice  d'échantillon  connexe,  dans  le  même  cycle  expérimental.
d'une  fluorescence  non  spécifique  due  à  la  duplication  de  la  séquence  de  
Alors  que  la  courbe  standard  externe  est  l'approche  la  plus  couramment  
l'amorce  sunrise  lors  de  la  formation  de  l'amorce­dimère.
décrite,  elle  souffre  de  variations  inter­tubes  incontrôlées  et  non  
surveillées.  En  raison  de  cette  omission,  de  telles  expériences  doivent  
L'amorce  du  scorpion  est  presque  identique  dans  sa  conception,  à  
être  qualifiées  de  semi­quantitatives.  Malgré  cette  approche  sous­
l'exception  d'une  molécule  d'hexéthylène  glycol  adjacente  qui  bloque  la  
optimale,  les  données  de  fluorescence  sont  généralement  collectées  à  
duplication  de  la  partie  de  signalisation  du  scorpion.  En  plus  de  la  
partir  de  cycles  de  PCR  qui  couvrent  la  partie  d'amplification  linéaire  de  
différence  de  structure,  la  fonction  des  amorces  scorpion  diffère  
la  réaction  où  le  signal  fluorescent  et  l'ADN  accumulé  sont  proportionnels.  
légèrement  en  ce  que  la  région  5'  de  l'oligonucléotide  est  conçue  pour  
Étant  donné  que  les  émissions  des  produits  chimiques  fluorescents  
s'hybrider  à  une  région  complémentaire  au  sein  de  l'amplicon.  Cette  
dépendent  de  la  température,  les  données  ne  sont  généralement  acquises  
hybridation  force  les  marqueurs  à  s'écarter,  perturbant  l'épingle  à  cheveux  
qu'une  seule  fois  par  cycle  à  la  même  température  afin  de  surveiller  le  
et  permettant  l'émission  de  la  même  manière  que  les  sondes  en  épingle  à  cheveux  (31).
rendement  en  amplicons  (45).  Le  CT  de  l'échantillon  à  une  valeur  de  
fluorescence  spécifique  peut  ensuite  être  comparé  à  des  données  
QUANTIFICATION  VIRALE similaires  collectées  à  partir  d'une  série  de  normes  par  le  calcul  d'une  
courbe  standard.  La  détermination  du  CT  dépend  de  la  sensibilité  et  de  
La  majorité  des  tests  PCR  de  diagnostic  signalés  à  ce  jour  ont  été  utilisés   la  capacité  de  l'instrument  à  distinguer  la  fluorescence  spécifique  du  bruit  
dans  un  format  qualitatif  ou  « oui/non ».  Le  développement  de  la  PCR  en   de  fond,  la  concentration  et  la  nature  du  composant  générateur  de  
temps  réel  a  fait  passer  la  véritable  quantification  des  acides  nucléiques   fluorescence  et  la  quantité  de  matrice  initialement  présente.
cibles  du  laboratoire  de  recherche  pure  au  laboratoire  de  diagnostic.
La  PCR  en  temps  réel  offre  des  améliorations  significatives  à  la  
La  détermination  de  la  quantité  de  matrice  par  PCR  peut  être  réalisée   quantification  de  la  charge  virale  en  raison  de  son  énorme  plage  
de  deux  manières :  en  tant  que  quantification  relative  et  en  tant  que   dynamique  qui  peut  accueillir  au  moins  huit  log10  copies  de  matrice  
quantification  absolue.  La  quantification  relative  décrit  les  changements   d'acide  nucléique  (33,  52,  77,  82–89).  Ceci  est  rendu  possible  parce  que  
dans  la  quantité  d'une  séquence  cible  par  rapport  à  son  niveau  dans  une   les  données  sont  choisies  à  partir  de  la  phase  linéaire  (LP;  Fig.  1B)  
matrice  associée.  La  quantification  absolue  indique  le  nombre  exact  de   d'amplification  où  les  conditions  sont  optimales,  plutôt  que  le  point  final  
cibles  d'acide  nucléique  présentes  dans  l'échantillon  par  rapport  à  une   où  la  quantité  finale  d'amplicon  présente  peut  avoir  été  affectée  par  des  
unité  spécifique  (71).  Généralement,  la  quantification  relative  fournit  des   inhibiteurs,  réaction  mal  optimisée  conditions  ou  saturation  par  des  sous­
informations  suffisantes  et  est  plus  simple  à  développer.  Cependant,  lors   produits  PCR  inhibiteurs  et  amplicon  double  brin.  Le  résultat  de  la  prise  
du  suivi  de  la  progression  d'une  infection,  la  quantification  absolue  est   de  données  du  point  final  est  qu'il  peut  ne  pas  y  avoir  de  relation  entre  la  
utile  pour  exprimer  les  résultats  dans  des  unités  communes  aux   matrice  initiale  et  les  concentrations  finales  d'amplicon.
scientifiques  et  aux  cliniciens  et  sur  différentes  plateformes.  La  
quantification  absolue  peut  également  être  nécessaire  lorsqu'il  y  a  un   La  PCR  en  temps  réel  est  également  une  alternative  intéressante  à  la  
manque  d'échantillons  séquentiels  pour  démontrer  les  changements  dans   PCR  conventionnelle  pour  l'étude  de  la  charge  virale  en  raison  de  sa  
les  niveaux  de  virus,  aucun  réactif  de  référence  standardisé  de  manière   faible  variabilité  inter  et  intra­essai  (77,87,90)  et  de  sa  sensibilité  
appropriée  ou  lorsque  la  charge  virale  est  utilisée  pour  différencier  les  virus  actifs  
des  virus.
analytique   équivalente  ou  supérieure  par  rapport  à  la  culture  virale  
infection  persistante. traditionnelle ,  ou  PCR  conventionnelle  à  un  tour  et  nichée  (77,85,91–96).  
Une  approche  très  précise  de  la  quantification  absolue  par  PCR   La  PCR  en  temps  réel  a  été  signalée  comme  étant  au  moins  aussi  
consiste  à  utiliser  la  co­amplification  compétitive  d'un  acide  nucléique  de   sensible  que  le  Southern  blot  (92).  Cependant,  ces  rapports  pourraient  
contrôle  interne  de  concentration  connue  et  d'un  acide  nucléique  cible  de   être  surestimés  en  raison  du  choix  de  cibles  plus  petites,  qui  s'amplifient  
type  sauvage  de  concentration  inconnue,  le  premier  étant  conçu  ou  choisi   plus  efficacement,  ou  en  raison  de  l'utilisation  d'amorces  différentes  ou  
pour  amplifier  avec  une  efficacité  égale  à  ce  dernier  (72­76).  Cependant,   améliorées  pour  les  tests  en  temps  réel,  car  l'utilisation  de  logiciels  pour  
alors  que  la  PCR  compétitive  conventionnelle  est  relativement  peu   concevoir  des  amorces  et  des  oligosondes  optimisées  est  plus
coûteuse,  la  PCR  en  temps  réel  est  beaucoup  plus  pratique,  fiable  et   commun.
mieux  adaptée  à  une  prise  de  décision  rapide  dans  une  situation  clinique   Lorsque  cette  sensibilité  accrue  et  cette  large  gamme  dynamique  sont  
(77,78).  En  effet,  la  PCR  conventionnelle,  quantitative  et  compétitive   combinées,  il  est  possible  de  quantifier  la  matrice  à  partir  d'échantillons  
(qcPCR)  nécessite  un  développement  et  une  optimisation  importants  pour   contenant  une  large  gamme  de  concentrations,  comme  c'est  souvent  le  
garantir  des  performances  reproductibles  et  une cas  dans  les  échantillons  de  patients.  Cela  évite  d'avoir  à  diluer  le
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Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  vol.  30,  n°  6  1299

amplicon  avant  la  détection  conventionnelle  ou  la  répétition  du  test  à  l'aide   longueur  d'onde  produit  des  émissions  lumineuses  à  partir  d'un  fluorophore  
d'un  échantillon  dilué  car  le  premier  résultat  de  test  se  situe  en  dehors  des   convenablement  sélectionné,  cela  limite  le  nombre  de  fluorophores  qui  
limites  du  test.  Ce  sont  des  problèmes  rencontrés  lors  de  l'utilisation  de   peuvent  être  inclus  (69).  Les  récentes  améliorations  apportées  à  la  
certains  kits  de  test  qcPCR  conventionnels,  qui  ne  peuvent  pas  englober   conception  des  amorces  en  épingle  à  cheveux,  des  oligosondes  en  épingle  
des  charges  virales  élevées  tout  en  maintenant  une  sensibilité  appropriée   à  cheveux  et  des  nucléases  ainsi  que  de  nouvelles  combinaisons  de  
(52,  97–99).  La  flexibilité  de  la  PCR  en  temps  réel  est  également  démontrée   fluorophores,  comme  dans  les  systèmes  de  sonde  bi­sonde  et  lumineuse,  
par  sa  capacité  à  détecter  une  cible  en  présence  d'un  vaste  excès  d'une   ont  promis  la  capacité  de  discriminer  un  nombre  croissant  de  cibles.
autre  cible  dans  des  dosages  duplexés  (84). La  découverte  et  l'application  des  extincteurs  non  fluorescents  ont  libéré  
La  charge  virale  est  également  un  indicateur  utile  de  l'étendue  de   certaines  longueurs  d'onde  qui  étaient  auparavant  occupées  par  les  
l'infection  active,  des  interactions  virus­hôte  et  de  la  réponse  au  traitement   émissions  des  premiers  extincteurs  eux­mêmes.  Cette  percée  a  permis  
antiviral,  qui  peuvent  tous  jouer  un  rôle  dans  le  schéma  thérapeutique   l'inclusion  d'un  plus  grand  nombre  d'oligosondes  spectralement  discernables  
choisi  (100,101).  La  PCR  quantitative  conventionnelle  a  déjà  prouvé  les   par  réaction,  et  a  souligné  la  nécessité  d'un  extincteur  unique  non  
avantages  de  l'application  de  l'amplification  des  acides  nucléiques  à  la   fluorescent,  qui  peut  éteindre  une  large  gamme  de  longueurs  d'onde  
surveillance  de  la  charge  virale  en  tant  que  marqueur  utile  de  la  progression   d'émission  (par  exemple  400–600  nm).  Les  premiers  systèmes  de  PCR  en  
de  la  maladie  et  en  tant  que  composante  des  études  sur  l'efficacité  des   temps  réel  contenaient  des  filtres  optimisés  pour  minimiser  le  
composés  antiviraux  (74,  100,  102­104).  Il  a  été  démontré  que  la  gravité   chevauchement  des  spectres  d'émission  des  fluorophores.  Malgré  cela,  le  
de  certaines  maladies  est  corrélée  à  la  charge  virale,  ce  qui  rend  la   nombre  de  fluorophores  pouvant  être  combinés  et  clairement  distingués  
quantification  par  PCR  en  temps  réel  utile  pour  étudier  non  seulement  la   était  limité  par  rapport  aux  capacités  discriminatoires  de  la  PCR  multiplex  
présence  d'un  virus,  mais  aussi  le  rôle  de  la  réactivation  ou  de  la   conventionnelle.  Les  plates­formes  de  PCR  en  temps  réel  plus  récentes  
persistance  virale  dans  la  progression  de  la  maladie  (78,82,91,105–  112).
ont  incorporé  soit  plusieurs  diodes  électroluminescentes  pour  couvrir  tout  
Un  exemple  des  avantages  que  la  PCR  en  temps  réel  a  apportés  à  la   le  spectre  visible,  soit  une  source  de  lumière  au  tungstène,  qui  émet  de  la  
détection  quantitative  du  cytomégalovirus  humain  (CMV)  est  observé  chez  
lumière  sur  une  large  gamme  de  longueurs  d'onde.  Lorsque  ces  plates­
les  patients  immunodéprimés  après  une  greffe  d'organe  solide  ou  de  
formes  intègrent  des  filtres  optiques  de  haute  qualité,  il  est  possible  
moelle  osseuse.
d'appliquer  n'importe  quelle  chimie  de  détection  PCR  en  temps  réel  actuelle  
Bien  que  la  détection  qualitative  de  l'ADN  du  CMV  par  PCR  ait  été  utilisée  
sur  une  seule  machine.  Néanmoins,  ces  améliorations  ne  permettent  
comme  indicateur  du  succès  de  la  thérapie  antivirale,  les  dosages  
généralement  qu'un  multiplexage  d'oligosondes  à  quatre  couleurs,  dont  
quantitatifs  sont  préférés  afin  de  surveiller  les  réponses  thérapeutiques  du  
une  couleur  est  idéalement  réservée  à  un  contrôle  interne  pour  surveiller  
patient.  De  plus,  puisqu'il  a  été  postulé  que  la  surveillance  de  la  réplication  
l'inhibition  et  peut­être  même  agir  comme  un  compétiteur  co­amplifié.  
virale  au  fil  du  temps  est  un  indicateur  plus  fiable  d'une  maladie  virale  en  
Certaines  conceptions  de  PCR  en  temps  réel  ont  utilisé  des  changements  
développement  que  la  détermination  des  quantités  virales  absolues  à  un  
de  nucléotides  simples  ou  multiples  entre  des  matrices  similaires  pour  
moment  donné,  plusieurs  tests  quantitatifs  ont  été  établis  et  évalués  pour  
permettre  leur  différenciation  par  TM  (Fig.  4),  évitant  ainsi  le  besoin  de  
augmenter  la  précision  du  diagnostic.  Les  tests  compétitifs  quantitatifs  
plusieurs  fluorophores  (49,  91,  118­122).
basés  sur  l'analyse  du  point  final  ont  affiché  des  limites  de  détection  de  5  
×  101  équivalents  génomiques  (ge)  par  test  et  une  plage  dynamique  de  5  
Cette  approche  a  été  utilisée  beaucoup  plus  couramment  dans  la  
×  101–5  ×  104  ge/test  (113).  Les  essais  basés  sur  l'hybridation  couvraient  
détection  des  maladies  génétiques  humaines  où  jusqu'à  27  substitutions  
approximativement  la  même  gamme  dynamique  de  quatre  ordres  de  
de  nucléotides  possibles  ont  été  détectées  en  utilisant  seulement  un  ou  
grandeur  avec  des  limites  de  détection  de  20  ge/essai  (114,115).
deux  fluorophores  (48,  123­128).

Bien  que  ces  tests  possèdent  des  plages  dynamiques  qui  peuvent  être   À  ce  jour,  il  n'y  a  eu  qu'une  poignée  de  tests  de  PCR  en  temps  réel  
suffisantes  pour  la  plupart  des  applications  cliniques,  ils  affichent  une  forte   véritablement  multiplexés  décrits  dans  la  littérature  et  peu  d'entre  eux  ont  
variabilité  inter­  et  intra­essai,  jusqu'à  40  %  (115). été  appliqués  au  diagnostic  des  maladies  infectieuses.
En  revanche,  l'un  des  premiers  tests  PCR  en  temps  réel  publiés  pour  la   Certaines  de  ces  approches  ne  peuvent  pas,  techniquement,  être  
détection  de  l'ADN  du  CMV  pouvait  être  effectué  en  moins  de  90 min,   considérées  comme  des  dosages  homogènes  en  temps  réel  car  elles  
s'étendait  sur  une  plage  dynamique  de  six  à  sept  ordres  de  grandeur  avec   nécessitent  l'interruption  de  la  procédure  pour  transférer  la  matrice,  leur  
une  limite  de  détection  d'au  moins  10 ge/test  et  une  variabilité  inter­essai   fluorescence  est  détectée  par  analyse  du  point  final  ou  les  dosages  ne  
et  intra­essai  de  <  10  %  et  <  5  %,  respectivement,  en  utilisant  des   sont  pas  effectués  dans  le  même  tube.  L'un  des  meilleurs  protocoles  de  
échantillons  de  plasma  provenant  de  patients  ayant  subi  une  greffe  de   PCR  virale  multiplex  en  temps  réel  peut  discriminer  entre  quatre  séquences  
moelle  osseuse  (116). cibles  rétrovirales  (129),  cependant,  la  PCR  multiplex  conventionnelle  
utilisant  la  détection  du  point  final  peut  facilement  discriminer  plus  de  cinq  
séquences  amplifiées  différentes,  indiquant  une  plus  grande  flexibilité  par  
PCR  MULTIPLEX  EN  TEMPS  RÉEL
rapport  avec  PCR  en  temps  réel  (130–133).
Le  multiplexage  (utilisant  plusieurs  amorces  pour  permettre  l'amplification   Malgré  ces  limitations,  un  certain  nombre  de  tests  ont  été  appliqués  à  la  
de  plusieurs  matrices  dans  une  seule  réaction)  est  une  application  utile  de   détection  de  plusieurs  génomes  viraux  à  la  fois,  y  compris  l'utilisation  d'un  
la  PCR  conventionnelle  (117).  Cependant,  son  transfert  vers  la  PCR  en   marqueur  non  spécifique,  SYBR  green  1  pour  détecter  les  virus  de  l'herpès  
temps  réel  a  confondu  sa  terminologie  traditionnelle.  Le  terme  PCR   simplex  (HSV),  le  virus  varicelle­zona  (VZV)  ou  le  CMV ,  dans  des  tubes  
multiplex  en  temps  réel  est  plus  couramment  utilisé  pour  décrire  l'utilisation   séparés  (134)  ou,  par  adaptation  d'une  PCR  multiplex  classique,  pour  
de  plusieurs  oligosondes  fluorogènes  pour  la  discrimination  de  plusieurs   identifier  le  HSV­1  et  le  HSV­2,  le  VZV  et  les  entérovirus  dans  un  même  
amplicons.  Le  transfert  de  cette  technique  s'est  avéré  problématique  en   capillaire  en  appliquant  une  analyse  de  la  courbe  de  fusion  fluorescente  
raison  du  nombre  limité  de  fluorophores  disponibles  (14)  et  de  l'utilisation   (121).  Une  autre  RT­PCR  oligosonde  de  nucléase  multiplexée  à  tube  
courante  d'une  source  de  lumière  énergisante  monochromatique.  Bien  que   unique  était  capable  de  détecter  simultanément  la  grippe  A  et  B  dans  les  
l'excitation  par  un  seul échantillons  respiratoires  du  patient
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1300  Nucleic  Acids  Research,  2002,  Vol.  30,  n°  6

avec  une  sensibilité  améliorée  par  rapport  à  la  culture  conventionnelle  ou   111,112,144,167,171),  orthomyxovirus  (95),  parvovirus  (88),  papovavirus  
shell­viral  (95). (122,143,145),  paramyxovirus  (94),  picornavirus  (85,86),  rétrovirus  
Les  développements  futurs  de  nouvelles  chimies  telles  que  les  étiquettes   (90,93,156,196,197)  et  virus  TT  (137).  La  surveillance  de  la  charge  virale  
de  transfert  d'énergie  de  fluorescence  combinatoire  (135)  et  les   par  PCR  en  temps  réel  s'est  également  révélée  bénéfique  pour  l'étude  des  
améliorations  apportées  à  la  conception  d'instruments  et  de  logiciels  en   patients  après  une  greffe  d'organe  (21,  83,  107,  198­201).
temps  réel  amélioreront  considérablement  l'avenir  de  la  PCR  multiplex  en  temps  réel.
Cette  technologie  est  maintenant  devenue  un  outil  essentiel  dans  
l'évaluation  approfondie  des  vecteurs  viraux  de  thérapie  génique  avant  leur  
APPLICATIONS  A  LA  VIROLOGIE
utilisation  dans  les  essais  cliniques.  Les  oligosondes  de  nucléase  ont  été  le  
La  PCR  en  temps  réel  a  été  extrêmement  utile  pour  étudier  les  agents   plus  souvent  signalées  pour  ces  études,  qui  évaluent  la  biodistribution,  la  
viraux  des  maladies  infectieuses  et  aider  à  clarifier  les  processus  litigieux   fonction  et  la  pureté  de  ces  préparations  médicamenteuses  (164,  197,  202–
des  maladies  infectieuses.  La  plupart  des  tests  présentés  dans  la  littérature   205).
permettent  une  fréquence  accrue  de  détection  des  virus  par  rapport  aux   De  plus,  l'étude  des  virus  émergents  a  été  complétée  par  l'utilisation  de  
techniques  conventionnelles,  ce  qui  rend  la  mise  en  œuvre  de  la  PCR  en   la  PCR  en  temps  réel  comme  outil  pour  démontrer  les  liens  entre  les  
temps  réel  attractive  pour  de  nombreux  domaines  de  la  virologie. séquences  virales  uniques  et  les  signes  et  symptômes  cliniques  des  patients  
(94,  96,  150,  160,  206,  207).
Bien  sûr,  la  PCR  en  temps  réel  s'est  avérée  de  plus  en  plus  utile  pour  les   La  vitesse  et  la  flexibilité  de  la  PCR  en  temps  réel  se  sont  également  
études  virologiques  générales,  bien  que  de  plus  en  plus,  ces  applications   révélées  utiles  aux  intérêts  commerciaux  pour  le  dépistage  de  la  
soient  difficiles  à  examiner  en  raison  de  la  nature  de  leur  utilisation  en  tant   contamination  microbienne  de  préparations  de  réactifs  à  grande  échelle  
qu'outil  plutôt  qu'au  centre  de  l'étude  publiée.  De  telles  études  ont  étudié  le   produites  à  partir  de  systèmes  d'expression  eucaryotes  (208,209).
rôle  des  virus  dans  une  gamme  de  maladies  en  confirmant  simplement  la  
présence  ou  l'absence  du  virus  (136,  137)  ou,  à  l'avenir,  en  surveillant  les  
CONCLUSIONS  ET  RÉSUMÉ
niveaux  d'activité  génique  spécifique  (138)  résultant  de  la  croissance  sous  
des  conditions  manipulées.  conditions.  L'entrée  ou  la  réplication  virale   Les  progrès  dans  le  développement  des  fluorophores,  des  chimies  de  
altérée,  causée  par  la  modification  des  tissus  cibles,  peut  également  être   marquage  des  nucléotides  et  les  nouvelles  applications  de  l'hybridation  
suivie  à  l'aide  de  la  PCR  en  temps  réel,  tout  comme  les  liens  entre  la   d'oligosondes  ont  fourni  à  la  technologie  PCR  en  temps  réel  une  base  
réplication  du  virus  et  l'expression  des  gènes  cellulaires  (139­141). suffisamment  large  pour  garantir  son  acceptation.  Récemment,  une  
instrumentation  est  apparue  qui  est  capable  de  temps  de  cycle  
La  PCR  en  temps  réel  a  amélioré  la  vitesse  et  la  portée  de  la  mesure   incroyablement  courts  combinés  à  la  capacité  de  détecter  et  de  différencier  
des  différences  de  souche  virale  et  de  titre  chez  les  patients  présentant   plusieurs  amplicons.  Les  nouveaux  instruments  sont  également  suffisamment  
différents  syndromes  dus  à  des  variétés  du  même  virus  (106). flexibles  pour  permettre  l'utilisation  de  l'une  des  chimies  décrites  dans  cette  
De  plus,  la  vitesse  et  la  portée  des  études  épidémiologiques  ont  été   revue,  faisant  de  l'amplification  d'acide  nucléique  en  temps  réel  une  
améliorées  grâce  à  l'utilisation  de  la  PCR  en  temps  réel,  car  elle  peut   proposition  de  plus  en  plus  attrayante  et  viable  pour  le  laboratoire  de  
mesurer  de  manière  fiable  la  quantité  de  deux  cibles  d'acide  nucléique  dans   diagnostic  de  routine.  Dans  de  nombreux  cas,  ces  laboratoires  effectuent  
une  seule  réaction  (91,  142).  De  nouvelles  chimies  ont  permis  une  meilleure   une  culture  tissulaire  pour  isoler  le  virus  et  des  méthodes  sérologiques  pour  
discrimination  de  plusieurs  génotypes  viraux  dans  un  seul  récipient  de   confirmer  l'identité  de  l'isolat,  ce  qui  peut  prendre  un  temps  considérable  et  
réaction  (143)  et  ont  fourni  une  alternative  aux  méthodes  de  détection  de   cliniquement  pertinent.
virus  basées  sur  des  tests  de  morbidité  et  de  mortalité. La  familiarité  qui  conduit  à  une  utilisation  de  routine  confortable  d'une  
technologie  est  maintenant  apparente  dans  l'inclusion  des  chimies  
L'utilisation  de  la  PCR  en  temps  réel  a  permis  de  mieux  comprendre  le(s)   oligosondes  fluorogènes  dans  de  nombreux  laboratoires.  Selon  la  littérature,  
rôle(s)  de  certains  composés  sur  l'inhibition  de  la  PCR  ainsi  que  de  mettre   le  format  le  plus  largement  utilisé  est  l'oligosonde  5'  endonucléase  bien  que  
en  lumière  l'efficacité  de  différentes  méthodes  d'extraction  d'acide  nucléique,   cela  soit  probablement  dû  à  sa  maturité  commerciale.  Les  chimies  
à  partir  d'une  gamme  variée  de  types  d'échantillons  (144–146).  Cette   d'oligosondes  développées  plus  récemment  ont  été  utilisées  dans  un  certain  
capacité  à  utiliser  un  modèle  à  partir  d'une  gamme  de  types  d'échantillons   nombre  d'applications  innovantes  et  il  ressort  du  rythme  et  du  contenu  des  
répond  à  une  exigence  pour  un  système  de  détection  idéal,  qui  est  la   publications  liées  à  la  PCR  en  temps  réel  qu'elles  sont  de  plus  en  plus  
capacité  d'appliquer  une  technologie  unique  dans  de  nombreux  domaines.   largement  acceptées.
Cette  flexibilité  est  mise  en  évidence  par  la  détection  d'acides  nucléiques   Les  développements  récents  de  la  PCR  multiplex  en  temps  réel  ont  
viraux  dérivés,  de  différentes  manières,  de  végétaux  (147­149),  d'animaux   suggéré  un  avenir  dans  lequel  l'identification,  le  génotypage  et  la  
(86,89,94,150­152),  de  boues  urbaines  (85,153),  de  culture  tissulaire   quantification  faciles  des  cibles  virales  dans  des  réactions  simples  et  rapides  
(23,77,96,154  –160),  divers  tissus  solides  (108,118,161–166),  liquide   seront  monnaie  courante.  Bien  sûr,  cette  technologie  n'est  en  aucun  cas  
céphalo­rachidien  (49,167,168),  cellules  mononucléaires  du  sang   limitée  à  la  virologie,  car  des  réalisations  importantes  sont  apparues  dans  le  
périphérique  (82,93,105,112,169–171),  plasma  (81,88,90,172–176),  sérum   domaine  de  la  détection  des  mutations,  appliquant  tous  les  avantages  
(30,33,36,  87,97,99,109,177–181),  écouvillons  (182,183),  salive  (106)  et   décrits  ci­dessus  pour  améliorer  la  détection  des  maladies  génétiques  et,  le  
urine  (78,122,184,185). cas  échéant,  permettre  de  quantifier  l'étendue  de  ces  mutations.  
En  outre,  les  affections  chroniques  telles  que  le  sarcome  (186­189),  le   changements  génétiques.
carcinome  (92,  111),  la  néoplasie  intraépithéliale  cervicale  (190­192)  et  les   La  technologie  des  micro­  et  macro­réseaux  jouera  sûrement  un  rôle  
troubles  lymphoprolifératifs  (193,  194)  peuvent  être  relativement  facilement   chimérique  dans  la  PCR  en  temps  réel  de  la  recherche  future,  mais  pour  
étudiées  pour  rechercher  des  liens  directs  ou  indirects  avec  une  infection   l'instant,  il  existe  un  potentiel  important  pour  les  intérêts  de  routine,  de  
virale.  Ces  études  ont  ciblé  des  virus  qui  incluent  les  flavivirus   recherche  et  commerciaux  de  reconcevoir  les  systèmes  existants  pour  une  
(33,36,96,109,195),  les  hepadnaviridae  (52,97),  les  virus  de  l'herpès   plus  grande  sophistication,  flexibilité  et  capacité  à  générer  des  données  
(21,77,78,82–84,91,92,98,105,106,108, quantitatives  de  haute  qualité.  Le  développement  de  tests  capables
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Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  vol.  30,  n°  6  1301

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REMERCIEMENTS LightCycler™ :  un  fluorimètre  multiéchantillon  à  microvolume  avec  contrôle  rapide  de  la  
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travail.  Il  s'agit  de  la  publication  numéro  139  du  Centre  de  recherche  sur   Microbiol.,  38,  2734–2737.
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Un  test  de  réaction  en  chaîne  par  polymérase  à  fluorescence  homogène  pour  identifier  
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1302  Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  Vol.  30,  n°  6

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Ward,  LR,  Woodward,  MJ,  Davies,  RH,  Liebana,  E.  et  Threlfall,EJ
(2001)  Utilisation  d'un  test  de  mutation  LightCycler  gyrA  pour  l'identification  rapide  des   78.  Tanaka,  N.,  Kimura,  H.,  Iida,  K.,  Saito,  Y.,  Tsuge,  I.,  Yoshimi,  A.,

mutations  conférant  une  sensibilité  réduite  à  la  ciprofloxacine  dans  les  isolats  multirésistants   Matsuyama,  T.  et  Morishima,  T.  (2000)  Analyse  quantitative  de  la  charge  de  

de  Salmonella  enterica  sérotype  typhimurium  DT104. cytomégalovirus  à  l'aide  d'un  test  PCR  en  temps  réel.  J.  Med.  Virol.,  60,  455–462.
J.Clin.  Microbiol.,  39,  1443–1448.
54.  Kurata,  S.,  Kanagawa,  T.,  Yamada,  K.,  Torimura,  M.,  Yokomaku,  T.,  Kamagata,  Y.  et   79.  Ferré,F.  (1992)  PCR  quantitative  ou  semi­quantitative :  réalité  versus
Kurane,  R.  (2001)  Détection  quantitative  basée  sur  l'extinction  de  la  fluorescence   mythe.  Méthodes  PCR  Appl.,  2,  1–9.
d'ADN/ARN  spécifique  à  l'aide  d'une  sonde  ou  d'une  amorce  marquée  BODIPY®FL.   80.  Johnson,  MR,  Wang,  K.,  Smith,  JB,  Heslin,  MJ  et  Diasio,  RB  (2000)
Nucleic  Acids  Res.,  29,  e34. Quantification  de  l'expression  de  la  dihydropyrimidine  déshydrogénase  par  réaction  en  chaîne  
55.  Crockett,  AO  et  Wittwer,  CT  (2001)  Fluorescein­labelled de  polymérase  de  transcription  inverse  en  temps  réel.  Anal.  Biochem.,  278,  175–184.
oligonucléotides  pour  la  PCR  en  temps  réel :  utilisation  de  l'extinction  inhérente  des  
nucléotides  de  désoxyguanosine.  Anal.  Biochem.,  290,  89–97. 81.  Kleiber,  J.,  Walter,  T.,  Haberhausen,  G.,  Tsang,  S.,  Babiel,  R.  et
56.  Svanvik,  N.,  Westman,  G.,  Wang,  D.  et  Kubista,M.  (2001)  Lumière Rosenstraus,  M.  (2000)  Caractéristiques  de  performance  d'un  test  TaqMan  RT–PCR  
sondes :  acide  nucléique  peptidique  conjugué  au  thiazole  orange  pour  la  détection  de  l'acide   quantitatif  et  homogène  pour  l'ARN  du  VHC.  J.  Mol.  Diagn.,  2,  158–166.
nucléique  cible  en  solution  homogène.  Anal.  Biochem.,  281,  26–35.
57.  Isacsson,  J.,  Cao,  H.,  Ohlsson,  L.,  Nordgren,  S.,  Svanvik,  N.,  Westman,  G.,  Kubista,  M.,   82.  Kimura,  H.,  Morita,  M.,  Yabuta,  Y.,  Kuzushima,  K.,  Kato,  K.,  Kojima,  S.,  Matsuyama,  T.  et  
Sjöback,  R.  et  Sehlstedt,  U.  (2000)  Détection  rapide  et  spécifique  des  produits  PCR  à  l'aide   Morishima,  T.  (1999)  Analyse  quantitative  de  la  charge  virale  d'Epstein  –  Barr  à  l'aide  d'un  
de  sondes  lumineuses.  Mol.  Cellule.  Sondes,  14,  321–328. test  PCR  en  temps  réel.
J.Clin.  Microbiol.,  37,  132–136.
58.  Svanvik,  N.,  Sehlstedt,  U.,  Sjöback,  R.  et  Kubista,M.  (2000)  Détection  de  produits  PCR  en   83.  Najioullah,  F.,  Thouvenot,  D.  et  Lina,  B.  (2001)  Développement  d'une  procédure  de  
temps  réel  à  l'aide  de  sondes  lumineuses.  Anal.  Biochem.,  287,  179–182. PCR  en  temps  réel  incluant  un  contrôle  interne  pour  la  mesure  de  la  charge  virale  
HCMV.  J.  Virol.  Méthodes,  92,  55–64.
59.  Morrison,  LE,  Halder,  TC  et  Stols,  LM  (1989)  Phase  de  solution 84.  Ryncarz,  AJ,  Goddard,  J.,  Wald,  A.,  Huang,  M.­L.,  Roizman,  B.  et
détection  de  polynucléotides  en  utilisant  des  marqueurs  fluorescents  interactifs  et  une   Corey,  L.  (1999)  Développement  d'un  test  quantitatif  à  haut  débit  pour  détecter  l'ADN  du  
hybridation  compétitive.  Anal.  Biochem.,  183,  231–244. virus  de  l'herpès  simplex  dans  des  échantillons  cliniques.  J.Clin.
60.  Landt,O.  (2001)  Dans  Meuer,  S.,  Wittwer,  C.  et  Nakagawara,  K.  (éd.), Microbiol.,  37,  1941–1947.
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35–41. Nicolas,J.­C.,  Billaudel,S.  et  Ferré,V.  (2000)  Quantification  de  l'ARN  d'entérovirus  
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d'imagerie  CCD  non  radioactifs.  Nucleic  Acids  Res.,  20,  4939. Biotechniques,  29,  88–93.
86.  Alexandersen,  S.,  Oleksiewicz,  MB  et  Donaldson,  AI  (2001)  La  pathogenèse  précoce  de  la  
62.  Gelmini,  S.,  Orlando,  C.,  Sestini,  R.,  Vona,  G.,  Pinzani,  P.,  Ruocco,  L.  et  Pazzagli,  M.  (1997)   fièvre  aphteuse  chez  les  porcs  infectés  par  contact :  une  étude  quantitative  sur  l'évolution  
Dosage  homogène  basé  sur  la  réaction  en  chaîne  par  polymérase  quantitative  avec  des   temporelle  à  l'aide  de  TaqMan  RT­PCR.  J.  Gen.  Virol.,  82,  747–755.
sondes  fluorogènes  pour  mesurer  l'amplification  de  l'oncogène  c­cerB­2 .  Clin.  Chem.,  43,  
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cible  d'ADN  sur  la  quantification  PCR  en  temps  réel.  Clin.  Chem.,  46,  1738–1743. de  l'hépatite  B  par  PCR  de  détection  en  temps  réel.  J.Clin.  Microbiol.,  37,  2899–2903.

64.  Jung,  R.,  Soondrum,  K.  et  Neumaier,  M.  (2000)  PCR  quantitative. 88.  Gruber,  F.,  Falkner,  FG,  Dorner,  F.  et  Hammerle,  T.  (2001)  Quantification  de  l'ADN  viral  par  
Clin.  Chim.  Laboratoire.  Méd.,  38,  833–836. PCR  en  temps  réel  appliquant  l'amplification  duplex,  la  normalisation  interne  et  la  détection  
65.  Kutyavin,  IV,  Afonina,  IA,  Mills,  A.,  Gorn,  VV,  Lukhtanov,  EA, de  fluorescence  bicolore.  Appl.  Environ.
Belousov,  ES,  Singer,  MJ,  Walburger,  DK,  Lokhov,  SG,  Gall,  AA  et  al. Microbiol.,  67,  2837–2839.
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Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  Vol.  30,  n°  6  1303

89.  Moody,A.,  Vendeurs,S.  et  Bumstead,N.  (2000)  Mesure  des  maladies  infectieuses Système  d'amplification  automatisé  TaqMan.  J.Clin.  Microbiol.,  37,  2543–2547.
ARN  du  virus  de  la  bursite  dans  le  sang  par  RT­PCR  quantitative  multiplex  en  temps  
réel.  J.  Virol.  Méthodes,  85,  55–64. 110.  Chang,  L.­J.,  Urlacher,  V.,  Iwakuma,  T.,  Cui,  Y.  et  Zucali,  J.  (1999)
90.  Schutten,  M.,  van  den  Hoogen,  B.,  van  der  Ende,  ME,  Gruters,  RA,  Osterhaus,  ADME   Analyses  d'efficacité  et  d'innocuité  d'un  système  de  vecteur  dérivé  du  virus  de  
et  Niesters,  HGM  (2000)  Développement  d'une  RT–PCR  quantitative  en  temps  réel   l'immunodéficience  humaine  recombinant  de  type  1.  Gène  Ther.,  6,  715–728.
pour  la  détection  du  VIH­  2  ARN  dans  le  plasma.  J.  Virol.  Méthodes,  88,  81–87. 111.Lo,YMD,  Chan,LYS,  Lo,K.­W.,  Leung,S.­F.,  Zhang,J.,  Chan,ATC,  Lee,JCK,  Hjelm,NM,  
Johnson,PJ  et  Huang,DP  (1999)
91.  Kearns,  AM,  Turner,  AJL,  Taylor,  CE,  George,  PW,  Freeman,  R.  et  Gennery,  AR  (2001)   Analyse  quantitative  de  l'ADN  du  virus  Epstein  –  Barr  acellulaire  dans  le  plasma  de  
PCR  quantitative  basée  sur  LightCycler  pour  la  détection  rapide  de  l'ADN  de  l'herpèsvirus   patients  atteints  d'un  carcinome  du  nasopharynx.  Cancer  Res.,  59,  1188–1191.
humain  6  dans  le  matériel  clinique.  J.Clin.  Microbiol.,  39,  3020–3021. 112.Hawrami,K.  et  Breur,  J.  (1999)  Développement  d'un  test  de  réaction  en  chaîne  par  
polymérase  flurogénique  (TaqMan)  pour  la  détection  et  la  quantification  du  virus  varicelle­
92.  Capone,  RB,  Pai,  SI,  Koch,  WM  et  Gillison,  ML  (2001)  Détection  et  quantification  de  l'ADN   zona.  J.  Virol.  Méthodes,  79,  33–40.
du  papillomavirus  humain  (VPH)  dans  le  sérum  de  patients  atteints  de  carcinome   113.Roberts,  TC,  Brennan,  DC,  Buller,  RS,  Gaudreault­Keener,  M.,  Schnitzler,  MA,  
épidermoïde  de  la  tête  et  du  cou  associé  au  VPH. Sternhell,  KE,  Garlock,  KA,  Singer,  GG  et  Storch,  GA  (1998)  Réaction  en  chaîne  
Clin.  Cancer  Res.,  6,  4171–4175. par  polymérase  quantitative  pour  prédire  l'occurrence  d'une  infection  symptomatique  à  
93.  Leutenegger,  CM,  Klein,  D.,  Hofmann­Lehmann,  R.,  Mislin,  C., cytomégalovirus  et  évaluer  la  réponse  au  traitement  par  le  ganciclovir  chez  les  receveurs  
Hummel,  U.,  Boni,  J.,  Boretti,  F.,  Guenzburg,  WH  et  Lutz,  H.  (1999) de  greffe  rénale.  J.  Infecter.  Dis.,  178,  626–636.
Quantification  rapide  du  provirus  du  virus  de  l'immunodéficience  féline  par  réaction  en  
chaîne  par  polymérase  à  l'aide  du  système  de  détection  en  temps  réel  fluorogène  TaqMan. 114.  Rollag,  H.,  Sagedal,  S.,  Holter,  E.,  Degre,  M.,  Ariansen,  S.  et  Nordal,KP
J.  Virol.  Méthodes,  78,  105–116. (1998)  Diagnostic  de  l'infection  à  cytomégalovirus  chez  les  greffés  rénaux  par  un  
94.  Smith,  Illinois,  Halpin,  K.,  Warrilow,  D.  et  Smith,  GA  (2001)  Développement  d'un  test  RT­ test  de  capture  hybride  ARN­ADN  quantitatif  pour  l'ADN  du  cytomégalovirus  dans  
PCR  fluorogène  (TaqMan)  pour  la  détection  du  virus  Hendra.  J.  Virol.  Méthodes,  98,  33–40. les  leucocytes.  EUR.  J.Clin.  Microbiol.  Infecter.  Dis.,  17,  124–127.

95.  van  Elden,  LJR,  Nijhuis,  M.,  Schipper,  P.,  Schuurman,  R.  et 115.Boivin,  G.,  Handfield,  J.,  Murray,  G.,  Toma,  E.,  Lalonde,  R.,  Lazar,  JG  et  Bergeron,  MG  
van  Loon,  AM  (2001)  Détection  simultanée  des  virus  grippaux  A  et  B  par  PCR  quantitative   (1997)  Quantification  de  l'ADN  du  cytomégalovirus  (CMV)  dans  les  leucocytes  du  virus  de  
en  temps  réel.  J.Clin.  Microbiol.,  39,  196–200. l'immunodéficience  humaine  ­sujets  infectés  avec  et  sans  maladie  à  CMV  en  utilisant  la  
96.  Lanciotti,  RS,  Kerst,  AJ,  Nasci,  RS,  Godsey,  MS,  Mitchell,  CJ, PCR  et  le  système  de  détection  de  signal  SHARP.  J.Clin.  Microbiol.,  35,  525–526.
Savage,  HM,  Komar,  N.,  Panella,  NA,  Allen,  BC,  Volpe,  KE  et  al.
(2000)  Détection  rapide  du  virus  du  Nil  occidental  à  partir  d'échantillons  cliniques  humains,   116.  Nitsche,  A.,  Steuer,  N.,  Schmidt,  CA,  Landt,  O.  et  Siegert,  W.  (1999)
de  moustiques  prélevés  sur  le  terrain  et  d'échantillons  aviaires  par  un  test  TaqMan  reverse   Différents  formats  de  PCR  en  temps  réel  comparés  pour  la  détection  quantitative  de  l'ADN  
transcriptase–PCR.  J.Clin.  Microbiol.,  38,  4066–4071. du  cytomégalovirus  humain.  Clin.  Chem.,  45,  1932–1937.
97.  Weinberger,  KM,  Wiedenmann,  E.,  Böhm,  S.  et  Jilg,  W.  (2000)  Détection  sensible  et  précise   117.  Chamberlain,  JS,  Gibbs,  RA,  Ranier,  JE,  Nguyen,  PN  et  Caskey,  CT
de  l'ADN  du  virus  de  l'hépatite  B  à  l'aide  d'un  système  de  détection  de  fluorescence   (1988)  Criblage  par  délétion  du  locis  de  la  dystrophie  musculaire  de  Duchenne  via  une  
cinétique  (TaqMan  PCR).  J.  Virol.  Méthodes,  85,  75–82. amplification  multiplexe  de  l'ADN.  Nucleic  Acids  Res.,  16,  11141–11156.
98.  Schaade,  L.,  Kockelkorn,  P.,  Ritter,  K.  et  Kleines,  M.  (2000)  Détection  de  l'ADN  du   118.  Espy,  MJ,  Uhl,  JR,  Mitchell,  PS,  Thorvilson,  JN,  Svien,  KA,
cytomégalovirus  dans  des  échantillons  humains  par  PCR  LightCycler. Wold,  AD  et  Smith,  TF  (2000)  Diagnostic  des  infections  par  le  virus  de  l'herpès  
J.Clin.  Microbiol.,  38,  4006–4009. simplex  dans  le  laboratoire  clinique  par  LightCycler  PCR.  J.Clin.
99.  Kawai,  S.,  Yokosuka,  O.,  Kanda,  T.,  Imazeki,  F.,  Maru,  Y.  et  Saisho,  H. Microbiol.,  38,  795–799.
(1999)  Quantification  du  virus  de  l'hépatite  C  par  PCR  TaqMan :  comparaison  avec  le  test   119.Espy,MJ,  Ross,TK,  Teo,R.,  Svien,KA,  Wold,AD,  Uhl,JR  et
de  surveillance  de  l'amplicor  du  VHC.  J.  Med.  Virol.,  58,  121–126. Smith,  TF  (2000)  Évaluation  de  la  PCR  lightcycler  pour  la  mise  en  œuvre  du  diagnostic  
100.Clementi,M.  (2000)  Analyse  moléculaire  quantitative  de  l'expression  et  de  la  réplication  du   en  laboratoire  des  infections  par  le  virus  de  l'herpès  simplex.  J.Clin.  Microbiol.,  38,  3116–
virus.  J.Clin.  Microbiol.,  38,  2030–2036. 3118.
101.Limaye,AP,  Jérôme,KR,  Kuhr,CS,  Ferrenberg,J.,  Huang,M.­L., 120.Loparev,VN,  McCaustland,K.,  Holloway,BP,  Krause,PR,  Takayama,M.  et  
Davis,  CL,  Corey,  L.  et  Marsh,  CL  (2000)  Quantification  de  la  charge  virale  BK  dans  le   Schmid,  DS  (2000)  Génotypage  rapide  du  vaccin  contre  le  virus  varicelle­
sérum  pour  le  diagnostic  de  la  néphropathie  associée  au  virus  BK  chez  les  greffés   zona  et  des  souches  de  type  sauvage  avec  des  sondes  d'hybridation  
rénaux.  J.  Infecter.  Dis.,  183,  1669–1672. marquées  au  fluorophore.  J.Clin.  Microbiol.,  38,  4315–4319.
102.  Holodniy,  M.,  Katzenstein,  D.,  Sengupta,  S.,  Wang,  AM,  Casipit,  C.,
Schwartz,  DH,  Konrad,  M.,  Groves,  E.  et  Merigan,  TC  (1991)  Détection  et  quantification  de   121.Read,  SJ,  Mitchell,  JL  et  Fink,  CG  (2001)  PCR  multiplex  LightCycler  pour  le  diagnostic  en  
l'ARN  du  virus  de  l'immunodéficience  humaine  dans  le  sérum  du  patient  en  utilisant  la   laboratoire  des  infections  virales  courantes  du  système  nerveux  central.  J.Clin.  Microbiol.,  
réaction  en  chaîne  par  polymérase.  J.  Infecter.  Dis.,  163,  862–866. 39,  3056–3059.
122.Whiley,DM,  Mackay,IM  et  Sloots,TP  (2001)  Détection  et
103.  Kaneko,  S.,  Murakami,  S.,  Unoura,  M.  et  Kobayashi,  K.  (1992) différenciation  des  polyomavirus  humains  JC  et  BK  par  PCR  LightCycler.
Quantification  de  l'ARN  du  virus  de  l'hépatite  C  par  réaction  en  chaîne  par  polymérase   J.Clin.  Microbiol.,  39,  4357–4361.
compétitive.  J.  Med.  Virol.,  37,  278–282. 123.  Schütz,  E.,  von  Ashen,  N.  et  Oellerich,  M.  (2000)  Génotypage  de  huit  mutations  de  la  
104.  Menzo,  S.,  Bagnarelli,  P.,  Giacca,  M.,  Manzin,  A.,  Varaldo,  PE  et  Clementi,  M.   thiopurine  méthyltransférase :  multiplexage  tricolore,  ancre  « bicolore/partagée »  et  
(1992)  Quantification  absolue  de  la  virémie  dans  l'infection  par  le  virus  de   essais  de  sonde  d'hybridation  d'extinction  de  la  fluorescence  basés  sur  la  conception  
l'immunodéficience  humaine  par  transcription  inverse  compétitive  et  réaction  en  chaîne   thermodynamique  de  la  sonde  la  plus  proche  voisine.
par  polymérase.  J.Clin.  Microbiol.,  30,  1752–1757. Clin.  Chem.,  46,  1728–1737.
105.  Ohyashiki,  JK,  Suzuki,  A.,  Aritaki,  K.,  Nagate,  A.,  Shoji,  N.,  Ohyashiki,  K.,  Ojima,  T.,  Abe,   124.Lay,MJ  et  Wittwer,CT  (1997)  Génotypage  par  fluorescence  en  temps  réel  du  facteur  V  
K.  et  Yamamoto,  K.  (2000)  Utilisation  de  la  PCR  en  temps  réel  pour  surveiller  la  réactivation   Leiden  pendant  la  PCR  à  cycle  rapide.  Clin.  Chem.,  43,  2262­2267.
de  l'herpèsvirus  humain  6  après  une  allogreffe  de  moelle  osseuse.  Int.  J.  Mol.  Méd. ,  6,   125.Herrmann,  MG,  Dobrowolski,  SF  et  Wittwer,  CT  (2000)  Génotypage  rapide  de  la  β­
427–432. globine  par  multiplexage  de  la  température  de  fusion  et  de  la  couleur  de  la  sonde.  
106.Furuta,Y.,  Ohtani,F.,  Sawa,H.,  Fukuda,S.  et  Inuyama,  Y.  (2001) Clin.  Chem.,  46,  425–429.
Quantification  de  l'ADN  du  virus  varicelle­zona  chez  les  patients  atteints  du  syndrome  de   126.  Lee,  LG,  Livak,  KJ,  Mullah,  B.,  Graham,  RJ,  Vinayak,  RS  et
Ramsay  Hunt  et  de  zona  sine  herpete.  J.Clin.  Microbiol.,  39,  2856–2859. Woudenberg,TM  (1999)  Détection  homogène  à  sept  couleurs  de  six  produits  de  PCR.  
107.Limaye,AP,  Huang,M.­L.,  Leisenring,W.,  Stensland,L.,  Corey,L.  et Biotechniques,  27,  342–349.
Boeck,  M.  (2001)  Charge  d'ADN  du  cytomégalovirus  (CMV)  dans  le  plasma  pour  le   127.  Bernard,  PS  et  Wittwer,  CT  (2000)  Amplification  homogène  et  détection  de  variants  par  
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108.Lallemand,F.,  Desire,N.,  Rozenbaum,W.,  Nicolas,J.­C.  et  Maréchal,  V. 128.  Elenitoba,  KSJ,  Bohling,  SD,  Wittwer,  CT  et  King,  TC  (2001)
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du  virus  de  la  dengue  après  une  infection  primaire  ou  secondaire  par  la  dengue  en  utilisant  le Multiplex  detection  of  four  pathogenic
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1304  Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  vol.  30,  n°  6

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céphalo­rachidien  de  patients  infectés  par  le  virus  de  l'immunodéficience  humaine   Transcription  inverse  fluorogénique  à  tube  unique­réaction  en  chaîne  par  polymérase  
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Virologie,  282,  65–76.
non  diluée  de  patients  après  une  greffe  de  moelle  osseuse.  J.Clin.  Microbiol.,  38,  3689–
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Recherche  sur  les  acides  nucléiques,  2002,  Vol.  30,  n°  6  1305

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Analyse  quantitative  du  virus  d'Epstein  –  Barr  (EBV)  sans  cellule  circulant dans  la  leucémie  aiguë  lymphoblastique  commune.
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Comparaison  de  la  PCR  Light­Cycler,  du  dosage  immunoenzymatique  et  de  la  
progénitrices  hématopoïétiques  transduites  par  voie  rétrovirale  à  l'aide  d'une  PCR  au  
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l'ADN  du  cytomégalovirus  humain  dans  les  urines  de  nouveau­nés  et  de  nourrissons  au   203.Hackett,  NR,  El  Sawy,  T.,  Lee,  LY,  Silva,  I.,  O'Leary,  J.,  Rosengart,  TK  et  Crystal,  RG  (2000)  

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et  O'Leary,J.  (1997)  HHV8  et  le  sarcome  de  Kaposi :  une  étude  de  cohorte  temporelle.   Détermination  quantitative  du  nombre  de  particules  de  vecteurs  lentiviraux  par  PCR  
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Lucas,  SB,  McGee,  JO  et  O'Leary,  JJ  (1998)  Identification  du  HHV8  au  début  du  sarcome   d'acides  nucléiques  pour  la  détection  rapide  de  l'encéphalite  du  Nil  occidental  et  de  
de  Kaposi :  implications  pour  la  pathogenèse  du  sarcome  de  Kaposi.  J.Clin.  Pathol.,  51,   Saint­Louis.  J.Clin.  Microbiol.,  39,  4506–4513.
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M.,  Sweeney,  M.,  Kenny,  C  et  coll.  (2000)  Localisation  du  HHV­8  dans  la  lymphadénopathie   différencier  les  sous­types  de  virus  Ebola  Zaïre  et  Soudan.
liée  au  SIDA.  J.Clin.  Pathol.,  53,  43–47. J.Clin.  Microbiol.,  39,  4125–4130.

189.O'Leary,  J.,  Kennedy,  M.,  Howells,  D.,  Silva,  I.,  Uhlmann,  V.,  Luttich,  K.,  Biddolph,  S.,   208.Brorson,  K.,  Swann,  PG,  Lizzio,  E.,  Maudru,  T.,  Peden,  K.  et  Stein,  KE
Lucas,  S.,  Russell,  J.,  Bermingham ,N.  et  coll.  (2000)  Localisation  cellulaire  du  HHV­8   (2001)  Utilisation  d'un  test  quantitatif  de  transcriptase  inverse  améliorée  par  un  produit  pour  
dans  la  maladie  de  Castleman :  existe­t­il  un  lien  avec  la  vascularisation  ganglionnaire ?   surveiller  les  niveaux  de  rétrovirus  dans  la  culture  cellulaire  mAb  et  le  traitement  en  aval.  
J.Clin.  Pathol.,  53,  69–76. Biotechnol.  Prog.,  17,  188–196.  209.de  Wit,C.,  Fautz,C.  et  Xu,Y.  (2000)  PCR  quantitative  
190.Josefsson,A.,  Livak,K.  et  Gyllensten,  U.  (1999)  Détection  et  quantification  du   en  temps  réel  pour  la  formation  de  particules  de  type  rétrovirus  dans  la  culture  de  cellules  CHO.  
papillomavirus  humain  en  utilisant  le  test  d'  exonucléase  fluorescente  5  ' .   Produits  biologiques,  28,  137–148.
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