PLAN

1. Introduction
2. Définition et réactif
3. Avantages
4. Principe
5. Description de la technique
6. Conclusion
 1. Introduction
De façon générale la partie de la médecine qui touche directement l’ADN et les gènes est
considéré comme très délicat et indispensable. C’est la raison pour laquelle la compréhension
de séquençage est primordiale. C’est donc après des années de recherche que le scientifique tel
qu’Allan Maxan, Walter Gilbert et Frédérick Sanger on peut à la fin des années 1973 développer
des techniques de séquençage. en 1977, Frédéric Sanger conçu le séquençage enzymatique et
cette méthode qui lui a valu un prix Nobel un est resté plus utile pendant 40 ans. On distingue
donc plusieurs séquençages : chimique, enzymatique et au débit
2. Définition et réactif
Le séquençage de l’ADN est une méthode qui permet de déterminer l’ordre d’agencement des
nucléotides dans un bain ADN. La lecture du résultat permet d'étudier l'information génétique
compte tenu dans le brun séquencé. Le séquençage est dit enzymatique parce que l’on utilise
l’ADN polymérase pour construire un brin d’ADN complémentaire. Pour réaliser le séquençage
enzymatique nous aurions besoin de de :
 Brun simple Matrix
 Amorce
 ADN polymérase
 Désoxyde nucléotide
 Adénine
 Thymine
 Guanine
 Cytosine

3. Avantage
La technique de Sanger et tu ne méthode de synthèse partiel basé sur l'arrêt de la synthèse par
l'incorporation de désoxydé nucléosides. Cette technique également sur croître équation de
polymérisation parallèle dans 4 tubes différent et du simple précède la réplication de l’AND.
La méthode de Sanger a permis aux scientifiques de séquencer l’AND de nombreux organisme,
allants de aux humains. À l'aide des fluorochrome et d'un ordinateur, il est possible de
séquencer l’ADN d’une personne en quelques jours. Le séquençage de l’AND est important
dans plusieurs domaines :
 La médecine
 La biotechnologie
 La criminologie
 4. Principe

D’abord, on extrait un fragment d’ADN de l’échantillon. Ensuite, on chauffe ce fragment. Ainsi,

on force l’ADN à se dérouler. Les deux brins de la double hélice se séparent en brins individuels.

La prochaine étape consiste à abaisser la température et à ajouter une amorce d’ADN. Celle-ci
est une courte séquence d’ADN à un seul brin. L’amorce d’ADN s’attache au brin d’ADN qu’on
tente de séquencer. Elle indique le début du séquencement, un peu comme une ligne de départ.

Par la suite, on augmente légèrement la température. Puis, on ajoute des nucléotides libres et une
enzyme appelée ADN polymérase. Les nucléotides libres contiennent l’une des quatre bases
suivantes : cytosine, thymine, adénine ou guanine. En commençant par la séquence d’amorce,
l’ADN polymérase construit un brin d’ADN complémentaire (ou inverse). Elle le fait en ajoutant
un nucléotide à la fois.

Quatre réactions de séquençage différentes doivent se produire, une pour chacun des quatre types
de nucléotides. Pour obtenir ces réactions, il faut ajouter au mélange des versions chimiquement
modifiées de chacun des nucléotides. Ces versions indiquent la terminaison d’une chaîne.
Chacun de ces nucléotides spéciaux est étiqueté avec un colorant différent. Ainsi, les
scientifiques peuvent les voir lorsqu’ils les exposent aux rayons UV.

Lorsque l’ADN polymérase atteint un nucléotide de terminaison de chaîne, elle arrête la

séquence d’ADN qu’elle était en train de construire. L’ADN polymérase ajoute les nucléotides
modifiés de façon aléatoire. De nombreuses séquences d’ADN de différentes longueurs sont
donc produites.

Ensuite, les segments d’ADN subissent l’électrophorèse en gel. Celle-ci permet de séparer les
fragments d’ADN de différentes longueurs. Pour ce faire, on doit ajouter les fragments d’ADN à
un excipient de gel, puis y faire passer un courant électrique. Cela fait en sorte que les segments
s’alignent dans le gel en fonction de leur taille. Les petits fragments se déplacent davantage que
les gros. Lorsque les fragments ont fini de se déplacer, on examine le gel à l’aide d’un appareil
de radiographie ou d’une lumière UV. Ainsi, chaque segment devient visible.

On peut « lire » le gel en regardant les bandes foncées dans chaque colonne. Il y a une colonne
pour chaque type de nucléotide (G, C, A, T). En examinant la séquence des bandes, on peut
déterminer la séquence des nucléotides.
Fig 1 : À gauche : radiographie qui montre les colonnes et les bandes pour les quatre nucléotides.
À droite : les bandes et la manière dont on peut les utiliser pour déterminer l’ordre des
nucléotides.
Pour déterminer la séquence, on éclaire le tube avec un laser. Lorsque la lumière traverse chaque
bande de couleur, un détecteur inscrit un pic sur un graphique. Ces pics correspondent aux bases
nucléotidiques. À l’aide des fluorochromes, les scientifiques peuvent automatiser le séquençage
de l’ADN. Cela accélère le processus.
Fig 2 : Séquençage de l’ADN à l’aide d’électrophorèse capillaire en gel

5. Description de la technique
Cette méthode est utilisée classiquement pour effectuer un petit séquençage ponctuel. Pour le
séquençage d’un génome entier, on utilise plutôt le séquençage nouveau génération. Le principe
de cette méthode consiste à initier la polymérisation de l’ADN à l'aide d'un petit oligonucléotide
(amorce) complémentaire à une partie du fragment d’AND à séquencer. L’élongation de
l’amorce est réalisée par le fragment de Klenow (une AND polymérase I dépourvue d’activité
exonucléase 5’→3’) et maintenue par des AND polymérases thermostables, celles qui sont
utilisées pour la PCR. Les quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sont
ajoutés, ainsi qu’une faible concentration de l’un des quatre didésoxyribonucléotides (ddATP,
ddCTP, ddGTP ou ddTTP)5.
Ces didésoxyribonucléotides agissent comme des « poisons » terminateurs de chaîne : une fois
incorporés dans le nouveau brin synthétisé, ils empêchent la poursuite de l’élongation car ils ne
possèdent pas d’extrémité 3’-OH (seulement un hydrogène à la place du groupement hydroxyle).
Cette terminaison se fait spécifiquement au niveau des nucléotides correspondant au
didésoxyribonucléotide incorporé dans la réaction. Pour le séquençage complet d’un même
fragment d’ADN, on répète cette réaction quatre fois en parallèle, avec les quatre
didésoxyribonucléotides différents.
Par exemple, dans la réaction où on a ajouté du ddGTP, la synthèse s’arrête au niveau des G. Le
mélange réactionnel contenant, à la fois du dGTP et un peu de ddGTP, la terminaison se fait de
manière statistique suivant que l’ADN polymérase utilise l’un ou l’autre de ces nucléotides. Il en
résulte un mélange de fragments d’ADN de tailles croissantes, qui se terminent tous au niveau
d’un des G dans la séquence. Ces fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur un gel de
polyacrylamide6, ce qui permet ainsi de repérer la position des G dans la séquence.
La détection des fragments ainsi synthétisés se fait en incorporant un traceur dans l’ADN
synthétisé. Initialement ce traceur était radioactif ; aujourd’hui, on utilise des traceurs
fluorescents, attachés soit à l’oligonucléotide, soit au didésoxyribonucléotide.

6. Conclusion
La demande n’a jamais été aussi grande pour les technologies révolutionnaires qui offrent des
informations rapides, précises et peu coûteuses sur le génome. Ainsi, de par les progrès
techniques apportés ces dernières années, le séquençage est devenu plus rapide et plus efficace.
Depuis les années 1970, et l’avènement du séquençage enzymatique par la méthode de Sanger,
de nombreux verrous techniques ont été levés menant au séquençage haut débit. Dans cet article,
nous présenterons ces évolutions qui ont permis à la fois une augmentation considérable du
volume de données, une réduction du temps nécessaire à l’exécution d’un séquençage, ainsi que
la diminution du coût de ces séquençages. Nous aborderons aussi le large éventail d’applications
pour les technologies de séquençage, en plus de fournir des lignes directrices pour la sélection de
plateformes répondant à des questions biologiques d’intérêt.Enfin, nous discuterons des
conséquences d’une telle révolution. Demain, grâce au décryptage du génome, il sera peut être
possible de faire un diagnostic personnalisé de chaque individu et de mettre ainsi en place des
traitements adaptés, ultra personnalisés. Connaitre les maladies dont on aura à souffrir dans
l’avenir est-il bénéfique ou représente un fardeau?