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Introduction

I. Dfinition
Le footprinting est une mthode utilisant l'interaction des protines avec
l'ADN. Elle permet de dsigner les sites de liaison des
facteurs protiques au niveau de l'ADN. Ces facteurs peuvent tre :
des complexes hormones -rcepteurs se liant leur
lments de rponse
des facteurs de transcription se liant des enhancers ou
des silencers des gnes eucaryotes ( squence cis-
rgulatrices et facteurs trans rgulateurs)

De par cette interaction le complexe protgera une squence


nuclotidique de la digestion par l'endonuclase de type DNase I en la
masquant.

II. Historique

En 1978, David Galas et Albert Schmitz ont dvelopp la technique de


l'empreinte gntique pour tudier la spcificit de liaison de la protine
lac rpresseur. Il s'agissait l'origine d'une modification de la technique de
squenage chimique de Maxam-Gilbert

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III. Principe
Dans cette technique, nuclases comme DNAse I est utilis qui
dgrade molcule d'ADN. Nuclases ne peut pas dgrader l' ADN si elle est
limite par une protine. Ainsi , cette rgion est protge contre la
dgradation par les nuclases.Cette rgion d'ADN protge est appele
l'empreinte.
IV. Protocole
Diffrentes possibilits existent pour raliser un footprint. Ici, nous
ntudierons que le footprint in vitro la DNase I.

Figure 1 : protocole de DNA footprinting

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La molcule que l'on va suivre est le fragment dADN marqu une
seule extrmit. Il existe diffrentes possibilits pour faire ce marquage
unilatral mais, gnralement, ce marquage est ralis par PCR en
utilisant un oligonuclotide marqu en 5. Le fragment est incub en
prsence dextrait nuclaire (ou dune protine purifie) puis soumis une
digestion mnage par la DNase I.
Un tmoin est ralis en incubant le fragment sans E.N. avec la DNase
I. Lanalyse est effectue sur gel de polyacrylamide en conditions
dnaturantes (gel de squence) et le profil obtenu permet de dterminer
les rgions qui ont t protges de laction de la DNaseI par lextrait
nuclaire ou la protine purifie. Si les fragments utiliss sont reconnus
par plusieurs facteurs on pourra mettre en vidence des Footprint
multiples. Pour dterminer les positions exactes des squences protges,
une raction de squenage (type Maxam and Gilbert) est ralise et
dpose en parallle sur le gel.

squenage (MAXAM & GILBERT )


Cette mthode est base sur une dgradation chimique de l'ADN et utilise
les ractivits diffrentes des quatre bases A, T, G et C, pour raliser des
coupures slectives . En reconstituant l'ordre des coupures, on peut
remonter la squence des nuclotides de l'ADN correspondant.
V. Application
L' ADN est souvent utilis footprinting pour
tude la rgulation d'une expression de gene
pour tudier sur la rgulation transcriptionelle des bactrie
localiser le site de liaison pour les protines qui rgulent la
transcription . Par exemple, un chercheur peut souponner qu'une
protine particulire se lie un fragment d'ADN particulier et inhibe
la transcription. Aprs avoir effectu une exprience d'ADN de l'
empreinte, le chercheur connatre l'emplacement de la squence
exacte de l' ADN li par cette protine. Si cette squence correspond
la squence d'un promoteur l'exprience ADN peut aider

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expliquer footprinting comment cette protine se liant l' ADN
remplit sa fonction.

ADN modifi expriences peuvent galement tre empreinte


effectuer pour dtecter o les protines se lient l'ADN dans une
cellule vivante. Dans ces expriences, les cellules sont cultives
dans des conditions o la protine d'intrt serait prvu de se lier
l'ADN. Les cellules sont ensuite traites avec un produit chimique qui
provoque les protines lies l'ADN pour devenir fixe de manire
permanent protine-ADN obtenus sont ensuite purifis partir de la
cellule et les squences d'ADN sont identifies.

tant donn que l'ADN est utilis pour footprinting identifier les
squences spcifiques de l'ADN o une protine se lie, la technique
est susceptible d'tre d'une utilit continue dans la recherche
gntique. Par exemple, l'ADN est susceptible d'empreinte tre
fortement utilis pour caractriser la fonction des protines
identifies dans le projet du gnome humain et d'autres projets du
gnome, ce qui en fait un lment important de la bote outils d'un
gnticien molculaire.

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Conclusion

Cette tude approfondie des techniques de gnie-gntique nous a permis


de comprendre les dessous du thme d'actualit que reprsente le
squenage gntique. Nous avons prsent le technique et leur principe ,
protocol et ces application

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