Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene (USTHB)

Faculté des Sciences Biologiques (FSB)

Département BCM

Licence L3, spécialité: Biotechnologie et santé

Module: Biologie moléculaire et génie génétique

TD3
HYBRIDATION MOLECULAIRE

Enseignants :
Dr N. Behairi
Dr S. Louahchi
Dr M. Messaoud khelifi
Dr N. Rebbah
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 Plan
Introduction
I- Sondes nucléotidiques
I-1. Caractéristiques des sondes
I-2. Marquage des sondes moléculaires
I-2-1. Marquage chaud ou radioactif
I-2-2. Marquage froid
II- Techniques classiques d’hybridation moléculaire
II-1. Southern Blot
II-2. Northern Blot
II-3. Hybridation in situ (HIS)
II-3-1. Hybridation in situ sur colonies bactériennes
II-3-2. Hybridation in situ sur chromosomes métaphasiques
III-Techniques modernes d’hybridation moléculaire
III-1. Hybridation in situ en florescence (FISH)
III-2. Hybridation génomique comparative sur puces: CGH array
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 Introduction

L'hybridation moléculaire désigne

l'association entre deux acides nucléiques
simples brins de séquences marquée
complémentaires, et qui conduit à la
formation d'un double brin (duplex). Cette
association est fondée sur la
complémentarité des bases azotées.

L'hybridation est à la base de nombreuses

techniques de biologie moléculaire. Elle
implique:
• La sonde: le brin dont on connaît au
moins une partie de la séquence, et
qui est marqué par une molécule
pouvant générer un signal.
• La cible: Le brin que l'on souhaite
caractériser.
Principe général de l’hybridation moléculaire
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 Sondes nucléotidiques
Une sonde nucléotidique est un segment de nucléotides qui permet de
rechercher de manière spécifique un fragment d'acide nucléique que l'on
désire étudier.

I-1- Caractéristiques des sondes

 Une séquence d'ADN ou d'ARN, obligatoirement monobrin.

 La taille est très variable: oligonucléotide de 20-30 nucléotides, ou à
l'opposé, de plusieurs centaines de nucléotides.
 Complémentaire et antiparallèle au fragment recherché.
 Facilement repérable grâce à un marquage radioactif (marquage chaud),
enzymatique ou fluorescent (marquage froid).
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 Sondes nucléotidiques
I-2- Marquage des sondes moléculaires
I-2-1- Marquage chaud ou radioactif

Le principe est d’introduire des nucléotides marqués à la radioactivité dans la sonde

moléculaire, ce qui la rend ainsi radioactive. Le radio-isotope le plus utilisé est le
Phosphore 32 (P32), il est incorporé dans la sonde enzymatiquement au moyen d’un
ou plusieurs molécules d’ATP marquées (en position α ou γ).

On distingue plusieurs méthodes de marquage chaud selon:

• La localisation du marquage (interne ou externe),
• La nature de la séquence marquée (simple ou double brin).
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 Sondes nucléotidiques

A- Marquage externe
La sonde est marquée au niveau des extrémités 5‘ ou 3‘.

1- Marquage en 3‘ de l’ADN
L’enzyme utilisée est la transférase terminale. Elle catalyse l’ajout des nucléotides
marqués (α- P32) sur l’extrémité 3‘ sans la présence d’un brin matrice. Cette enzyme
préfère les molécules d’ADN avec des extrémités 3‘ sortantes, mais elle est capable
de catalyser l’addition de nucléotides sur l’ADN à bouts francs dans des conditions
précises.

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 Sondes nucléotidiques
2- Marquage en 3‘ de l’ADN: Fill-in

 Si les extrémités 5‘ sont sortantes

L’addition des nucléotides marqués (α- P32) sur les extrémités 3‘ est catalysée par le
fragments de Klenow , éliminant ainsi le décalage des deux brins.

 Si les extrémités 3‘ sont sortantes

Le fragment de Klenow excise à travers son activité exonucléase les nucléotides sur les
extrémités 3‘ sortantes, conduisant ainsi à un petit décalage (environ 4 à 5 nucléotides)
entre les deux brins. Ensuite, ce décalage sera comblé avec des nucléotides marqués (α-
P32) grâce à l’activité polymérase de l’enzyme.

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 Sondes nucléotidiques
3- Marquage en 5‘ de l’ADN et l’ARN
L’enzyme utilisée est la T4 Polynucléotide kinase. C’est une kinase qui catalyse le transfert
du phosphate terminal (γ- P32) de l’ATP sur les extrémités 5’ terminales d’une molécule
d’ADN ou d’ARN. Toutefois, Il faut préalablement procéder à une déphosphorylation des
extrémités 5‘ avec une phosphatase alcaline.

Marquage de l’ARN en 5‘:

Il faut d’abord détruire la

coiffe sur l’extrémité 5‘ de
l’ARN avec une
pyrophosphatase, avant de
faire agir la phosphatase
alcaline et la T4
polynucléotide kinase.

+ ADP

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 Sondes nucléotidiques
B- Marquage interne
La radioactivité est incorporée à l’intérieur de la sonde.
1- Marquage de l’ADN: Amorçage au hasard (Multi-random Labelling)
L’ADN bicaténaire est dénaturé par chauffage, puis refroidi brutalement pour
empêcher la réassociation des deux brins. Chacun de ces derniers est hybridé au
hasard avec de petites amorces (hexanucléotides), qui permettront au fragment de
Klenow de synthétiser les deux brins complémentaires en utilisant des nucléotides
marqués. Les brins d’ADN néo-synthétisés seront ainsi marqués.

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 Sondes nucléotidiques
2- Marquage de l’ARN: transcription in vitro

L’ADNc est cloné dans un vecteur possédant des promoteurs reconnus par l’ARN
polymérase. Le vecteur est linéarisé avant la transcription en utilisant des enzymes de
restriction. Le marquage s’effectue au cours de la polymérisation en utilisant des
nucléotides marqués (α- P 32). Selon le promoteur utilisé (P1 ou P2), on peut avoir des
sondes sens ou anti-sens.

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 Sondes nucléotidiques
I-2-2- Marquage froid

Les sondes froides représentent une alternative à l’utilisation de la radioactivité. En

effet, cette dernière présente de nombreux inconvénients :
 La nécessité de se protéger contre le rayonnement émis, un maniement des
sondes inconfortable,
 La décroissance rapide du P32, d'où le besoin de marquer les sondes
fréquemment.

Dans ce type de marquage, les nucléotides portant le marqueur sont incorporés

directement au cours de la synthèse de la sonde. Le radical libre des nucléotides
est substitué par un marqueur attaché au bout d’une chaine carbonée (Spacer).

L’utilisation des sondes froides a également permis :

 L’amélioration de la sensibilité et de la flexibilité des méthodes de détection,
 L’utilisation combinée de plusieurs marquages différents en une seule
expérience d’hybridation.

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 Sondes nucléotidiques
Il existe deux types de méthodes de marquage froid selon la méthode de révélation:
directe et indirecte.

A- Méthode directe
Dans ce type de marquage, la molécule détectable (rapporteur) est liée directement à
la sonde d’acide nucléique. Il s’agit de Fluorochromes (fluorophores), capables
d’émettre de la fluorescence après excitation par de l’énergie lumineuse.
Exp: La Fluorescéine directement couplée au nucléotide.

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 Sondes nucléotidiques
B- Méthode indirecte
Dans ce cas, le marqueur est lié à la sonde, mais sa révélation se fait indirectement
grâce à une molécule présentant un système rapporteur.
Deux molécules sont très utilisées: la digoxigénine (DIG) et la biotine.

 La digoxigénine (DIG)
La DIG est un stéroïde présent dans les plantes. Les sondes marquées par la DIG
peuvent être détectées à haute affinité par des anticorps anti-DIG conjugués à une
enzyme rapporteur (la phosphatase alcaline ou la peroxydase), ou à un
fluorochrome.

 La biotine
La biotine est utilisée de la même manière que la digoxigénine, et peut être détectée
par des anticorps anti-biotine. La Streptavidine (ou l’Avidine) est cependant plus
fréquemment utilisée en raison de sa forte capacité de liaison à la biotine.

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 Sondes nucléotidiques

Méthodes de détection des sondes marquées par la DIG et la biotine

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 Sondes nucléotidiques

Marquages multiples

En utilisant différentes combinaisons de sondes marquées à la digoxigénine, à la

biotine ou aux fluorochromes, de multiples hybridations simultanées peuvent être
réalisées, permettant d’identifier plusieurs régions différentes dans l’ADN.

En effet, la disponibilité de plusieurs marqueurs fluorescents différents couplés à

des anticorps a permis d’améliorer la réalisation de ces procédures, par exemple :

 Fluorescéine (fluorophore vert)

 FITC (Fluorescéine isothiocyanate, jaune)
 TRITC (Tétraméthylrhodamine isothiocyanate, rouge)
 AMCA (Amino-methylcoumarine acétate, bleu)

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 Techniques classiques d’hybridation moléculaire
1. Southern Blot
C'est une technique d'hybridation de l'ADN mise au point en 1975 par le
biochimiste Edwrad Southern. La technique consiste en le transfert d'ADN ou
«Southern blot».
Elle permet de détecter spécifiquement des fragments d'ADN dans un génome,
par leur hybridation à des sondes marquées par un radio-isotope.

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Les différentes étapes du Southern blot
 Techniques classiques d’hybridation moléculaire
2. Northern Blot

C’est une transposition de la technique de Southern Blot à l’ARN. Elle consiste à

séparer par électrophorèse les ARNs en gel d’agarose dénaturant. Les étapes de la
technique sont les mêmes que pour le Southern Blot.

La présence d’un agent dénaturant (Ex: Formaldéhyde) lors de l’électrophorèse

permet d’abolir la structure secondaire des ARNs, afin de ne pas affecter la mobilité
des molécules et ne pas gêner l’hybridation.

Cette technique permet la détection et l’analyse des ARNm (repérer un type de

molécule d'ARNm, étudier son abondance relative, déterminer sa taille, détecter les
intermédiaires de maturation et les différentes formes d'épissage de l'ARN).

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 Techniques classiques d’hybridation moléculaire

Les différentes étapes du Northern blot

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 Techniques classiques d’hybridation moléculaire
3. Hybridation in situ (HIS)

L‘hybridation in situ (HIS) est un outil incomparable pour étudier l'expression

des gènes. L’HIS est très proche, dans son principe des techniques de Southern
et de Northern Blot, et repose, comme elles, sur l'hybridation d'une sonde
d'acide nucléique (ADN ou ARN) marquée, avec une séquence complémentaire
d'acides nucléiques que l'on désire identifier et localiser.

L’HIS permet de mettre en évidence et de localiser, dans des cellules ou des

coupes tissulaires les séquences d’intèret.

Les techniques de Southern et Northern Blot se font sur des broyats de tissus,
alors que l'HIS s'effectue sur une coupe histologique de tissus, apportant ainsi
des informations précises sur la localisation des acides nucléiques étudiés.

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 Techniques classiques d’hybridation moléculaire
3-1- Hybridation in situ sur colonies bactériennes

Cette technique permet de détecter parmi un grand nombre de bactéries, celles qui
contiennent le fragment d'ADN recherché (criblage de banque).

Principe de l’hybridation in situ sur colonies bactériennes

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 Techniques classiques d’hybridation moléculaire
3-2- Hybridation in situ sur chromosome métaphasique
C’est une technique qui a pour but de déterminer sur quel chromosome et dans quelle
région se trouve le gène d’intèret.

Lymphocytes circulants ou lignée lymphoblastoide

Préparation des chromosomes en métaphase

+ sonde marquée au tritium 3H
Hybridation directement sur les préparations cytogénétiques
fixées sur lame

Exposition plusieurs jours à semaines

Observation sous microscope

(les signaux positifs apparaissent sous forme de grains noirs
disposés sur les chromosomes)

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Différentes étapes de l’HIS sur chromosomes métaphasiques
 Techniques modernes d’hybridation moléculaire
1. Hybridation in situ en florescence (FISH)
La FISH est une technique qui permet de repérer la présence d’anomalies
chromosomiques liées à certaines pathologies. Elle permet la détection, sur une
préparation cytogénétique, d’un hybride entre sonde marquée et sa séquence
chromosomiques complémentaire.

Différents types de sondes existent dont le choix dépend de l’application pratique et

des objectifs diagnostiques.

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Les différents types de sondes de la FISH
 Techniques modernes d’hybridation moléculaire
• Sondes centromériques
Elles marquent les centromères des chromosomes, permettant ainsi de les
compter et détecter les anomalies liées aux nombres de chromosomes.

Caryotype de la Trisomie 21.

Syndrome de Down
Chromosome 21 supplémentaire

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 Techniques modernes d’hybridation moléculaire
• Sondes de peinture
Elles marquent la totalité d’un chromosome donné permettant ainsi de préciser
des remaniements chromosomiques complexes.

Sondes de peintures: détection de translocation réciproque

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 Techniques modernes d’hybridation moléculaire
• Sondes locus-spécifiques
Elles permettent la détection des anomalies chromosomiques invisibles au
caryotype standard, telles que les microdélétions ou les microduplications
chromosomiques.

Le locus q11.2 des deux

chromosomes 22 est rendu
visible au moyen d'une sonde
spécifique (rouge). Une 2ème
sonde de contrôle marque la
région q11.13.

Sur ce caryotype, il manque la

région q11.2, sur l'un des
chromosomes 22, ce qui est en
faveur d'une microdélétion.

Utilisation des sondes locus spécifiques pour le

diagnostic du syndrome de CATCH 22 ou syndrome
de microdélétion du chromosome 22q11 25
 Techniques modernes d’hybridation moléculaire
2. Hybridation génomique comparative sur puces (CGH array)

Les puces à ADN permettent d’étudier le transcriptome, c’est-à-dire

l’expression des séquences codantes des gènes transcrits en ARNm. C’est une
image fonctionnelle du génome, puisque les biopuces ou puces à ADN ne
vont révéler que les séquences codantes du génome effectivement
exprimées.

Le principe de la technique consiste à cohybrider la même quantité d’ADN

d’un patient et d’un témoin, marqué chacun par un fluorochrome différent,
sur une lame de verre sur laquelle sont déposées des séquences d’ADN
(sondes), dont la séquence et la position sur le génome sont connues.

Après hybridation, les signaux générés par les deux fluorochromes sont
numérisés, et un rapport de leur intensités (quantité d’ADN du patient/ADN
témoin) est établi au niveau de chaque fragment d’ADN fixé.

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 Techniques modernes d’hybridation moléculaire

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Principe de la technique des puces à ADN