Chapitre 17

Principaux Techniques
de Biologie Moléculaire
- Les méthodes permettant d’étudier l’ADN des malades
(Extraction, purification, conservation)
- L’activité de quelques enzymes qui permettent l’étude des acides
nucléiques
- Les facteurs qui permettent l’hybridation de deux brins d’acides
nucléiques.
- Technique d’hybridation avec une sonde (Southern ou Northern
blots, puces à DNA)
- Le mécanisme de l’amplification de l’ADN par PCR
- Le mécanisme d’un séquençage d’acide nucléique.
 Historique

Ø Au XXème siècle, suite à l’élaboration des lois de la génétique, de la

découverte des chromosomes et de l’identification de l’ADN comme
support de l’information génétique, est apparue la Biologie Moléculaire.

Ø La biologie moléculaire est une discipline scientifique dont l’objet est la

compréhension des mécanismes de fonctionnement de la cellule au
niveau moléculaire.

Ø La biologie moléculaire consiste à étudier la structure des gènes portant

l’information génétique, leur expression et le contrôle de leur expression.

Ø Donc, la biologie moléculaire est l’ensemble des techniques qui

consistent à travailler essentiellement avec des molécules d’ADN, et
d’ARNm.
 1- Extraction et purification de l’ADN

Ø Les techniques d’étude de l’ADN sont devenues si performantes qu’il

est actuellement courant d’isoler le segment d’ADN correspondant à
n’importe quel gène spécifique.
Les trois domaines du monde
vivant
 1- Extraction et purification de l’ADN

Ø L’extraction de l’ADN est une technique qui permet d’extraire ou d’isoler

l’ADN de cellules ou de tissus.

Ø L’ADN extrait pourra faire objet d’une digestion, hybridation (Southern

blot), séquençage, PCR, clonage…..

Ø Il existe différents protocoles d’extraction d’ADN avec un même principe:

Ø Lyse des cellules

Ø Elimination des protéines

Ø Elimination des autres acides nucléiques (ARN…)

Ø Concentration de l’ADN par précipitation à l’alcool

1- Extraction et purification de l’ADN
 1- Extraction et purification de l’ADN

Ø En deux étapes:

Ø Extraction: digestion des tissus et lyse des cellules.

Ø Purification: séparation de l’ADN des autres constituants

cellulaires.
1- Extraction et purification de l’ADN

L’ADN précipite en un nuage cotonneux

blanchâtre = La méduse
 2- Extraction et purification de l’ARN

Ø L’extraction de l’ARN est une technique qui permet d’extraire ou d’isoler

l’ARN de cellules ou de tissus.

Ø L’ARN extrait pourra faire objet d’une hybridation (Northern blot),

banques d’ADNc, RT-PCR…..

Ø Il existe différents protocoles d’extraction de l’ARN avec un même

principe:

Ø Lyse cellulaire mécanique (congélation, billes de céramique

ou détergents) OU lyse cellulaire enzymatique (lysozyme ou
lyticase).

Ø Protection des ARN de l’action des ARNases.

Attention Pyrocarbonate d’éthyle ou diéthyl

pyrocarbonate
 Inhibition des ARNases au cours de l’extraction des ARNs

• Le pyrocarbonate d’éthyle ou diéthyl pyrocarbonate, DEPC, est un

composé organique utilisé pour sa capacité à réagir spécifiquement
avec les acides aminés histidine et, dans une moindre mesure,
tyrosine des protéines.

Utilisation en Extraction des ARN

Ø Cette particularité permet d’utiliser cette molécule pour inactiver les

RNAses. Ces protéines sont en effet très résistantes aux agents
dénaturants. La réaction avec le DEPC modifie les histidines du site
actif de ces enzymes.

Ø L’inactivation des RNAses est recommandée au cours des

expériences mettant en jeu les ARNs afin d’éviter leur dégradation.

Ø Au laboratoire, la vaisselle et l’eau utilisées pour faire les diverses

solutions en contact avec les ARNs sont aussi traitées avec le
DEPC.
2- Extraction et purification de l’ARN
2- Extraction et purification de l’ARN
 Synthèse de l’ADNc

Ø La manipulation et l’étude des ARN est difficile à cause de leur grande

sensibilité aux ribonucléases qui les détruisent.

Ø Il est nécessaire de recopier la séquence en ADN pour qu’elle soit plus

stable et qu’on puisse l’amplifier en fonction des besoins.
 3- Dosage des acides nucléiques

Ø Les spectres d’absorption des acides nucléiques présentent une bande

d’absorption maximale autour de 260 nm.
 3- Dosage des acides nucléiques
Ø L’absorbance à 260 nm peut être mesurée pour estimer la concentration
des acides nucléiques.

Ø Cette estimation est indispensable après extraction de l’ADN ou l’ARN à

partir des cellules.

Ø Pour des déterminations approximatives de la concentration des acides

nucléiques purs, on peut assumer qu’une solution aqueuse contenant 50
µg/ml d’ADN double brin ou 25 µg/ml d’ADN simple brin ou 40 µg/ml
d’ARN donne une valeur de A260nm = 1.
 3- Dosage des acides nucléiques

Ø L’absorbance à la longueur d’onde caractéristique de 280 nm (i.e

A280nm) est communément utilisée pour estimer la concentration
totale de protéines dans un échantillon.

Ø Les protéines sont des interférents. Il est donc indispensable de

mesurer également l’absorption à 280 nm.

Ø Pour des échantillons d’ADN pur, A260nm/A280nm=1.8.

Un rapport < 1.8 indique la présence de protéines, tandis qu’un

rapport > 1.8 indique la présence d’ARN.
4- Outils enzymatiques pour étudier l’ADN
 4-1- Couper
4-1-1- Les enzymes de restriction

Ø Les enzymes de restriction sont capables de reconnaître spécifiquement

une courte séquence d’ADN, de 4 à 8 pb, et de cliver l’ADN au site
reconnu.

Ø Elles permettent de fragmenter l’ADN en segments de taille réduite.

Ø Les enzymes de restriction sont des enzymes bactériennes participant à

un mécanisme de défense des bactéries vis-à-vis des virus. Donc, la
présence de ces enzymes dans les bactéries restreint l’infectiosité des
bactériophages.
Exp: Eco RI = Escherichia coli type R souche I
 4-1-1- Les enzymes de restriction

Ø Ces enzymes bactériennes reconnaissent des séquences spécifiques sur

l’ADN de 4 à 8 pb (sites de restrictions), et clivent l’ADN sur les deux
brins au niveau de ces sites.

Ø Elles coupent l’ADN à l’intérieur au niveau des ponts phosphodiesters.

Ces enzymes, naturellement présentes chez les bactéries, sont devenues des outils
important en Biologie Moléculaire.
 4-1-1- Les enzymes de restriction

Ø La plupart des sites sont des séquences inversées répétées

(palindromes) : la lecture des deux brins complémentaires dans des sens
opposés donne la même séquence.

Ø On observe deux types de coupures par les enzymes de restriction:

ü Coupures franches donnant des extrémités franches ou bouts

francs: la coupure au milieu du palindrome.

ü Coupures cohésives donnant des extrémités adhésives ou

bouts collants: coupure de part et d’autre du centre de
symétrie.
4-1-1- Les enzymes de restriction
 Polymorphisme de restriction

Ø Variations individuelles d’une séquence de l’ADN révélée par des

modifications de la longueur des fragments de restriction.

Ø A l’électrophorèse, il y a polymorphisme de longueur des fragments de

restriction = RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
 Les fragments de restriction

Ø Fragment de restriction est le produit de digestion de l’acide

désoxyribonucléique par une endonucléase spécifique d’une séquence
de nucléotides.
Polymorphisme de restriction
Polymorphisme de restriction
 4-1-2- Les endonucléases

Ø DNAse I: ADN double ou simple brin.

Ø Nucléase S1: ADN simple brin
Ø RNAse A (ARN), H (Hybrides ARN/ADN)

4-1-3- Les exonucléases

Ø 5’ à 3’ ou 3’ à 5’
 4-2- Synthèse et copie
Les ADN et ARN polymérases

Ø Activité des polymérases : 5’ à 3’

Ø ADN polymérases:
- produit: ADN
- matrice: ADN simple brin + amorce ARN ou ADN

Ø ARN polymérases:
- produit: ARN
- matrice: ADN simple brin

Ø ADN polymérases ARN dépendante (transcriptase réverse, inverse)

- produit: ADN
- matrice: ARN + amorce
 4-3- Coller
Les ligases

Ø Les ligases catalysent la formation d’une liaison phosphodiester entre un

5’ phosphate et un 3’ –OH de 2 brins adjacents.
 5- Marquage des acides nucléiques

Ø Une sonde est un marqueur qu’on introduit dans un milieu biologique

pour que ses propriétés vis-à-vis des constituants de ce milieu soient
révélées par l’émission d’un signal détectable par les instruments de
mesure.

Ø Les oligonucléotides sont employés comme sondes parce qu’ils peuvent

s’hybrider spécifiquement avec une séquence d’un acide nucléique dans
un milieu biologique. Lorsqu’elles sont marquées (atomes radioactifs,
biotine, fluorochromes) leur présence dans le milieu peut être suivie.
 5- Marquage des acides nucléiques
Ø Séquence d’ADN monocaténaire, marqué, complémentaire du gène
recherché, son rôle est la détection de gènes, notamment en diagnostic
génétique.

Ø Le principe consiste à détecter la présence d’une mutation ponctuelle en

réalisant l’hybridation moléculaire entre la séquence à tester et la sonde
de l’allèle muté. L’utilisation d’une sonde spécifique de l’allèle normal est
nécessaire pour réaliser un témoin négatif.
 6- Séparation de fragments d’ADN

Ø C’est une technique de biologie moléculaire qui permet de séparer des

molécules en fonction de leur taille et de leur charge en utilisant un courant
électrique.

Ø Dans les conditions de neutralité, les acides nucléiques ont leurs groupements
phosphates ionisés et deviennent des polyanions, et dans ce cas les molécules
d’ADN sous l’effet d’un champ électrique ils vont migrer vers l’anode (+).
 6 - Électrophorèse sur gel

Ø Pour la séparation des acides nucléiques on peut utiliser les gels de

polyacrylamides et gels d’agarose, mais le premier possède un diamètre des
pores inférieur de celui d’agarose et sert ainsi qu’à la séparation des petits
fragments d’ADN.

Simulation de la taille des pores

Structure d’un pore du gel en fonction de la concentration du gel

Concentration d’agarose
le gel d'agarose

L’agar-agar

Agar-agar est un mot d'origine Malaise qui désigne en extrême-orient la

gelée obtenue à partir de diverses algues rouges

gélidium
gracilaria

Une découverte accidentelle

Au XVIIème siècle par un cuisinier Japonais. Une industrie dont le Japon
conserva seul la maîtrise jusqu'à la 2ème guerre mondiale.
La concentration d’agarose

Brin d’ADN de tailles différentes

CATHODE -

Migration

ANODE +
 Brin d’ADN de tailles différentes

CATHODE -

Migration

ANODE +

Faible concentration en agarose

Meilleure séparation des brins de grandes tailles

 Brin d’ADN de tailles différentes

CATHODE -

Migration

ANODE +

Forte concentration en agarose

Meilleure séparation des brins de petites tailles

Correspondance tailles des brins d’ADN/ concentration d’agarose

% d’agarose Éventail de taille d’ADN

(bp)

0,75 10000-15000

1 500-10000

1,25 300-5000

1,5 200-4000

2 100-2500

2,5 50-1000
 L’électrophorèse des acides nucléiques

Eléments nécessaires:

Un support Gel d’agarose ou polyacrylamide

Tampon d’électrophorèse

Marqueur de poids moléculaire

Tampon de charge

colorants
 Montage d’électrophoèse

support le plus utilisé: gel d’agarose

Les tailles de fragments qu'il est possible de séparer sont comprises entre 0,5 et 20 kb.

Les gels sont coulés à l'horizontale dans des appareils transparents aux UV
de manière à pouvoir suivre périodiquement la migration.

La migration est horizontale

Vocabulaire:

Cuve d’électrophorèse

Dépôt d’échantillon dans les

Puits du gel
L’importance du tampon d’électrophorèse

Composition du tampon (pH 7,5-8)

La mobilité électrophorétique
Résistance ionique du tampon

En absence d’ions la conductance est nulle L’ADN ne migre pas

Conductance élevée Migration rapide

Résistance ionique élevée
Augmentation de la température

Exemples: Tris Borate EDTA (TBE)

Tris Acetate EDTA (TAE)
Tris Phosphate EDTA (TPE)
 Le tampon de charge

Tampon de charge : bleu de bromophénol et/ou xylène cyanol - glycérol - tampon

d’électrophorèse.

Augmentation de la densité de l’échantillon évite que l’ADN sorte du puit

Ajout de couleur à l ’échantillon simplifiant le dépôt.

Les 2 colorants permettent de suivre la migration des fragments d'ADN :

La migration du Xylène cyanol est "comparable" à celle d'un fragment d'ADN de 4000 pb
La migration du bleu de bromophénol est "comparable" à celle d'un fragment d'ADN de 300 pb

Xylène cyanol

bleu de bromophénol
Le marqueur de poids moléculaire

La distance de migration d’un fragment d’ADN dépend de:

Du temps
La tension
Du gel
Des concentrations de tampon
De la cuve utilisée
De nombreux facteurs plus ou poins contrôlés

Mauvaise reproductibilité

Nécessité des marqueurs à chaque expérience

tailles connues
mêmes conditions de migrations que l’échantillon

Détermination des tailles des fragments dans l’échantillon

Indépendante des conditions expérimentales

Indicateur de reproductibilité de l’expérience

Le gel d’agarose n’est pas résolutif pour de petits fragments d’ADN (Inférieurs à 100
pb)
6- Séparation de fragments d’ADN
 Un gel d'agarose avant éclairage sous
ultraviolets

Le gel est exposé à des

rayonnements ultraviolets, le
BET colore l'ADN en une
couleur rouge-orangée

Photographie
du gel Puits :
1. Echelle de marqueur de poids
moléculaire (1kbplus) 2. vide, 3. Un
produit de PCR d'une taille
légèrement supérieure à 500 paires
de bases 4. Fragment d'environ
4.5kb d'un Plasmide digéré par une
enzyme de restriction
44
 7 – Visualisation de l’ADN

Ø Utilisation de molécules fluorescentes:

Le bromure d'éthidium se lie à l'ADN bicaténaire par

intercalation.
Ø Il existe des méthodes de coloration de l'ADN qui ne nécessitent pas l'emploi
d'UV ni de BET :

- le bleu de méthylène
- l'azure A
- le bleu de toluidine
Limite: moins sensibles

- La coloration au bleu de Nile semble une méthode à la fois sensible et non

dangereuse.

Limite:
La durée de coloration estimée à 15 h !!!

Gels après coloration par le bleu de Nile

 Application : détermination de la taille exacte de fragments d’ADN

Ø La détermination de la taille d'un fragment se fait par rapport à la migration d'un

marqueur approprié contenant des fragments de tailles connues.

Ø La comparaison visuelle de la fluorescence d'un échantillon avec celle d'une

quantité d'ADN connue (le marqueur de taille) permet d'estimer la quantité
d'acides nucléiques déposée.
Détermination des distances Tracé de la droite :
de migration log (taille) = f(distance de migration)

Permet de déterminer la taille en paires de base d'un

fragment d'ADN inconnu
Les applications de l’électrophorèse des acides nucléiques

Ø Estimation du poids moléculaire de fragments d’ADN

après une digestion par des enzymes de restriction.

Ø Analyse d’ADN ou d’ARN après une amplification par

PCR.

Ø Séparation de fragments d’ADN digérés avant Southern

blot ou d’ARN dans le cas de Northern blot.
 7 – Hybridation moléculaire

Ø Hybridation: association de 2 séquences d’acides nucléiques sous

forme simple brin sur la base de leur complémentarité.
 7 – Hybridation moléculaire

Ø Sonde: séquence d’ADN complémentaire de la séquence cible.

Ø Facteurs ayant une influence sur l’hybridation:

- la température optimale d’hybridation est en général inférieure au
Tm de la sonde.
- la taille des fragments ou des sondes
- la force ionique: l’hybridation est accélérée en forte concentration
saline
- la nature des hybrides ADN ou ARN

Ø Types de sondes:
- sonde génomique: fragment obtenu par coupure de l’ADN
génomique
- sonde ADNc: sonde ADN obtenue par transcription réverse d’un
ARNm (=séquence codante)
- sonde oligonucléotides: ADN(ou ARN) simple brin de 18 à 50
nucléotides synthétisé chimiquement.
 7 – Hybridation sur support
7-1- Southern blot (ADN)

Ø Cette technique a été initialement décrite par Edward M. Southern en

1975. Elle porte également le nom d’hybridation moléculaire sur filtre.

Ø Elle consiste à détecter spécifiquement des fragments d’ADN

transférés sur filtre pour leur hybridation à une sonde complémentaire
(des séquences complémentaires marquées par radioisotope).

Ø Le filtre utilisé est la membrane de nitrocellulose ou de nylon.

Ø La membrane de nylon est très utilisée car elle est plus résistante, elle
lie les acides nucléique de façon covalente et sa capacité de charge
est plus élevée. Donc les membranes de nylon sont mieux adaptées
pour le transfert des acides nucléiques.
 7-2- Norther blot (ARN)

Ø Pour l’acide nucléique ARN le principe d’électrophorèse est identique a

celui de l’ADN et le transfert sur un filtre s’appelle Northernblot.

7-3- Western blot (Protéines)

 8- Technique d’amplification par PCR

PCR: Polymerse Chain Reaction

(Amplification enzymatique en chaîne par ADN polymérase thermostable)

Ø Technique décrite en 1985 par Kary MULLIS et collaborateurs (Nobel

prize in 1993).

Ø Permet d’amplifier des séquences d’ADN de manière spécifique et

d’augmenter de manière considérable la quantité d’ADN dont on
dispose initialement.

Ø Elle nécessite de connaître la séquence des régions qui délimitent

l’ADN à amplifier.
8- Technique d’amplification par PCR
 Amplification à partir d’une petite quantité
d’ADN par une série de cycles se déroulant
en trois étapes:

Ø Dénaturation: l’ADN à amplifier est

dénaturé à la chaleur, les deux brins se
séparent et servent de matrice.

Ø Hybridation des amorces: on baisse la

température pour permettre à l’amorce de
s’hybrider spécifiquement aux extrémités
de la séquence cible à amplifier.

Ø Elongation ou polymérisation à ~ 70°C: à

cette température optimale de l’activité de
l’enzyme Taq polymérase, l’amorce est
allongée par complémentarité au bri
matrice, ce qui produit deux nouvelles
molécules d’ADN.
8- Technique d’amplification par PCR
Ø Variantes de la PCR classiques: PCR Conventionnelle, PCR multiplexe

- PCR Conventionnelle: on utilise un seul couple d’amorces pour

amplifier une cible d’ADN unique.

- PCR multiplexe: on utilise un set de plusieurs couples d’amorces pour

amplifier simultanément plusieurs cibles d’ADN en une seule réaction de
PCR.

Ø PCR e temps réel où l’amplification est mesurée à chaque cycle grâce à

un marqueur fluorescent qui s’incorpore dans le double brin formé.

Ø Amplification à partir d’ARN: RT-PCR

RT PCR
ARNm ADNc
 9- Technique de séquençage

Ø Le séquençage de l’ADN a été inventé dans la deuxième moitié des

années 1970.

Ø Le séquençage de l’ADN, consiste à déterminer l’ordre d’enchaînement

des nucléotides d’un fragment d’ADN donné.

Ø Deux méthodes ont été développées indépendamment : l’une par

l’équipe de Walter Gilbert, (Maxam and Gilbert 1977) aux États-Unis, et
l’autre par celle de Frederick Sanger (Sanger, Nicklen et al. 1977) en
Grande-Bretagne.

Ø Pour cette découverte, Gilbert et Sanger ont été récompensés par le

prix Nobel de chimie en 1980.
 9- Technique de séquençage

Les deux principales méthodes de séquençage de l'ADN sont :

q La méthode chimique de Maxam et Gilbert dans laquelle l'ADN dont

on a marqué l'extrémité est soumis à des réactions de clivage
spécifiques de bases avant d'être soumis à une électrophorèse.

q La méthode enzymatique de Sanger (prix Nobel de chimie en 1980)

qui repose sur l'utilisation de nucléotides particuliers appelés
didésoxynucléosides triphosphates, qui bloquent la synthèse d'ADN
après leur incorporation.
 9- Technique de séquençage

Ø Le début du 21 siècle est marqué par l’avènement de la nouvelle

génération des techniques de séquençage, découlant des avancées
technologiques dans plusieurs domaines.

Ø Ces innovations technologiques visent à réduire le coût et le temps

nécessaire pour le séquençage du génome complet.

Ø C’est une technique qui permet de déterminer la séquence d’ADN en

réalisant une série de réplication.

Ø De ce fait la technique nécessite:

- 4 synthèses du brin complémentaire

- des amorces d’où les synthèses débutent
- ADN polymérase: catalyse la synthèse
- Nucléosides triphosphates: dATP, dCTP, dGTP et dTTP.
- Didésoxyribonucléoside triphosphate marqué (radioactivité): dd
ATP, dd CTP, dd GTP et dd TTP.
 Les Didésoxyribonucléoside triphosphate

- Matrice ADN
- Amorce de séquençage
- ADN polymérase
- dNTP & ddNTP (didéoxyNTP)

dATP ddATP

Les Didésoxyribonucléoside triphosphate ne possèdent pas de

groupement OH en 2’. Ils bloquent donc la synthèse lorsqu’ils sont
incorporés au brin: Inhibiteurs de la réplication (ADN polymérase).
 9- Technique de séquençage

Ø La détermination d’une séquence d’ADN est utile aussi bien pour les
recherches visant à savoir comment vivent les organismes que pour
des sujets appliqués.

Ø Elle représente le niveau de résolution le plus élevé pour rechercher la

présence de mutations ponctuelles dans un gène.

Ø En médecine, elle peut être utilisée pour identifier, diagnostiquer et

potentiellement trouver des traitements à des maladies génétiques.

Ø Grâce aux outils de la biologie moléculaire, la médecine a connu une

avancée importante dans le domaine du diagnostic et de la thérapie des
maladies génétiques, on cite:

• Diagnostic génétique (pré symptomatique, prénatal, …)

• Thérapie génique (correction d’un gène au niveau des cellules
souches)
• Synthèse des molécules thérapeutiques
 10- Bioinformatique
Ø Clonage « in silico »
Ø Analyse et traitement des séquences
Ø Annotation des génomes
Ø Analyse génétique
Ø Banques de données

- séquences d’ADN, ARN, protéines

- http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/
- http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/
- http://us.expasy.org/sprot

- génétiques:
- OMIM maladies génétiques: http://www.ncbi.nih.gov/Omim/
- HMDB mutations: http://www.uwcm.ac.uk
- info-biogène: http://www.infobiogen.fr

- bibliographiques: http://www.ncbi.nih.gov/PubMed/
 Fin de Cours

MERCI POUR VOTRE

ATTENTION

Pr. Chahboune Rajaa

Spécialité: Microbiologie et Biologie moléculaire

Année universitaire 2022/2023