TECHNIQUES DE SEQUENÇAGE DE L’ADN

Le séquençage d’un ADN consiste à identifier les différentes bases qui constituent
les chaînes de cet ADN. Deux techniques sont généralement utilisées :
- technique de SANGER
- technique chimique de MAXAM et GILBERT

I - TECHNIQUE DE SANGER

1 - Principe
Cette technique enzymatique dite encore séquençage au didesoxyribonucléotide
triphosphate (ddNTP) est la plus utilisée actuellement pour effectuer le
séquençage d’un fragment d’ADN.
C’est une technique basée sur la copie d’un fragment d’ADN monocaténaire que
l’on désire séquencer par l’ADN polymérase. On utilise des ddNTP pour assurer
l’incorporation.
En effet le ddNTP est un analogue du dNTP mas ne possède pas de OH en 3, du
désoxyribose. Ainsi, il s’incorpore normalement dans une chaîne nucléotidique
en cours de synthèse. Mais cette incorporation du ddNTP par l’ADN polymérase
bloque l’allongement de la molécule d’ADN en cours de synthèse.
Rappelons que l’allongement d’une chaîne polynucleotidique par un ADN
polymérase nécessité en effet un groupement – OH en 3 du ribose disponible

2- Synthèse des ddNTP

-Les différentes formes des nucléotides.

Exemple de synthèse du Didésoxyadénosine triphosphate ddATP

 3- Réactions de Séquençage
a- Réactions enzymatiques de synthèse du brin complémentaire
Les réactions s’effectuent en traitant de manière parallèle 4 tubes contenant
chacun :

- le brin d’ADN obtenu après fusion ;

- les 4 types de desoxyribonucléotides (dNTP) ;
- l’amorce universelle ; Mg2+
- la DNA polymérase qui est généralement la taq polymérase ou Pfu Polymérase.

Chacun des tubes contient en outre un type de ddNTP en quantité bien définie
proportionnellement aux desoxyribonucléotides associés. Le travail se fait
toujours dans des conditions dénaturantes.

NOTE si on change le sens du fragment, on aura pluto 2 AU LIEU DE 3

* Procédé pratiques
Soit l’ADN bicentenaire suivant dont on désire déterminer la séquence :

5 GGT CAT CCA TGG ATT CGA 3

3 CCA GTA GGT ACC TAA GCT 5
- Séparons préalablement les 2 brins de cet ADN par fusion et considérons le brin
orienté 3 - - - - - - -5

- Réalisons une hybridation avec l’amorce de séquençage suivant :

GGT CAT CC orienté 5 - - - - - - -3

5 GGT CAT CC- 3

3 CCA GTA GGT ACC TAA GCT- 5

- Laissons agir dans les 4 tubes : une réaction de séquençage démarre entre les
dNTP (dATP, ddTTP, dCTP, dGTP ), les ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP,
ddGTP ) et la Taq polymerase.
Les 4 tubes sont identifies en A, T, G, C comme l’indique le tableau suivant :

TUBE A T C G
Taq poly + + + +
dNTP + + + +
ddNTP ddATP ddTTP ddCTP ddGTP

* Description des réactions

Considérons le cas du tube A.
Quand l’ADN polymérase en action arrive en face d’un T situé sur le brin de
l’ADN matrice qu’elle est entrain de copier, elle doit incorporer A sur le brin
complémentaire en voie de synthèse. Elle a alors le choix entre :
- incorporer le d’AMP et donc la réaction de polymérisation se poursuit ;
- incorporer le ddAMP et la réaction s’arrête.

En effet, si la Taq polymérase incorpore de l’AMP, la réaction de synthèse se

poursuit jusqu’au prochain A approprié et de nouveau, le choix s’offre entre
dAMP et ddAMP.

Ainsi, les molécules obtenues dans chaque tube sont très nombreuses. On a toute
une famille de fragments de DNA synthétisés avec des tailles différentes selon
que dNTP ou ddNTP a été au hasard incorporé. Mais dans tous les cas toutes les
molécules se termineront obligatoirement par un ddNMP.

Dans l’exemple choisi, il y aura dans le tube A, des fragments stoppés en face du
premier « T » situé sur le brin à séquencer et formés donc de 9 nucléotides ;
d’autres stoppés en face du 2nd « T » et ayant donc 13 nucléotides et d’autres
encore devant le 3eme « T » avec 18 nucléotides.
En appliquant le même raisonnement sur chacun des 3 autres tubes, on obtient
finalement pour chacun des 4 tubes, les résultats suivant :

TUBE A
5 – GGT CAT CCA 3’ ( 9 nucléotides)
5 – GGT CAT CCA TGGA 3’ (13 nucléotides)
5 –GGT CAT CCA TGG ATT GGA 3’ (18 nucleotides)

TUBE T
5 – GGT CAT CCAT 3’
5 – GGT CAT CCA TGGAT 3’
5 – GGT CAT CCA TGG ATT 3’

TUBE C
5 – GGT CAT CCA TGG ATTC 3’

TUBE G
5 – GGT CAT CCATG 3’
5 – GGT CAT CCAT TGG 3’
5 – GGT CAT CCATGG ATT CG 3’

2 - Séparation sur gel et autoradiographie

* Marquage
On voit finalement qu’avec cette technique, si l’amorce ajoutée est marquée en
5’P par un P radioactif 32P, dans chaque tube, on aura différents fragments qui
présenteront tous un marquage en 5’ - P.
Dans le tube A on aura un brin 3’ - 5’ et l amorce.

Exo. Représenter par un schéma

Ainsi, on verra les 3 espèces suivantes qui se terminent toutes par ddA en leur
extrémité 3’- OH.

Exo. Représenter par un schéma

Le même raisonnement s’applique aux autres tubes T , C , et G et montre les

différentes espèces ou fragments avec un marquage radioactif en 5’ – P.
* Electrophorèse
Après les réactions de séquençage, on dépose sur 4 pistes électrophorétiques
séparés, les produits contenus dans les tubes A , T , C et G. Les fragments
nucléotidiques sont alors séparés selon leur taille par électrophorèse. Les plus
petits migrent plus loin. La distance de migration par rapport à leur position
initiale varie selon la taille des fragments.

* Autoradiographie et révélation
A la fin de l’électrophorèse, le gel est séché, un film est appliqué sur ce gel ;
et une révélation est effectuée après plusieurs heures de contact.
Chaque petit trait vu sur le film correspond à un fragment nucléotidique radioactif
terminé par un ddNTP.
Si par exemple dans la piste 1 on repère 3 trais successifs en .9, 13 et 18, cela veut
dire qu’il y a un « A » en position 9, 13 et18 dans le brin synthétisé. Le même
raisonnement s‘applique aux 3 autres tubes.

Exo. Représenter par un schéma

La lecture de ce gel se fait de bas en haut c’est à dire des fragments de petite taille
aux fragments de grande taille. Cette lecture nous donne comme résultat de
Séquençage :

5’ - ATGGATTCGA - 3’

Connaissant la séquence du brin complémentaire qui vient d’être synthétisé, il est

maintenant facile d’en déduire la séquence du brin matrice, soit :

3’ –TACCTTGCT – 5’

Soulignons que de nos jours, la radioactivité étant connue pour sa pollution et sa

toxicité, le marquage se fait de plus en plus grâce à la fluorescence.
Considérons un autre fragment de DNA à séquencer. Interpréter le schéma
suivant :
La détermination de l'enchaînement des nucléotides dans un fragment d'ADN
simple brin par la méthode de Sanger comporte deux étapes, lesquels ?

- Séquençage automatique : marquage des produits d'extension

Dans le séquençage automatique, des marqueurs fluorescents sont utilisés, un
marqueur différent pour chaque ddNTP (bleu, rouge, vert, orange...etc.). La
polymérisation se fait dans un seul tube contenant le mélange réactionnel et les
quatre ddNTPs. La séparation est faite selon la figure suivante.
•Pour connaître la séquence des DNA, on fait synthétiser un brin du DNA par
une enzyme spécifique.
• L’enzyme commence son travail à partir de l’extrémité 3’ d’une sonde
hybridée qui sert d’amorce. Elle ajoute des nucléotides complémentaires de ceux
du brin de DNA qu’elle copie.
• On lui donne pour substrats des désoxynucléosides triphosphates normaux
mélangés avec des didésoxynucléotides dont la fonction alcool secondaire en 3’
est réduite ce qui empêche la synthèse de se poursuivre au delà.
• Les didésoxynucléotides incorporés en dernier sont marqués spécifiquement
par des molécules fluorescentes (vert pour didésoxyA, bleu pour didésoxyC,
jaune pour didésoxyG et rouge pour didésoxyT)
• On sépare ensuite les fragments synthétisés dans un champ électrique
(électrophorèse : les DNA sont des anions, ils vont donc vers le pôle +), en
fonction de leur longueur (les plus petits vont plus vite).
• On lit ensuite les taches successives, identifiées par leur couleur, ce qui révèle
la séquence des fragments synthétisés.

II - TECHNIQUE CHIMIQUE DE MAXAM ET GILBERT

Elle est peu utilisée actuellement pour des raisons de pollution. L’ADN à
séquencer est tout d’abord marqué en 5’ avec du 32P puis clivé après A, C, G ou
T par divers réactifs chimiques.

Exemples :
 - Le diméthylsulfate : pour G et A par chauffage ; en jouant sur les conditions
opératoires, on peut favoriser le clivage en A ou en G.
- L’hydrazine clive au niveau de C et T, le clivage s’effectue au niveau des
2 bases ; mais suivant les conditions, l’un des deux clivages est grandement
privilégié.

Après ces clivages, les différents fragments obtenus sont séparés par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
L’examen de l’autoradiographie correspondante permet de connaître les
séquences du brin analysé.
 TECHNIQUE DE SOUTHERN ET TECHNIQUES PARALLELES

I - TECHNIQUES DE SOUTHERN
1 - Définition principe
Cette technique dite encore « Transfert selon southern » consiste à détecter
spécifiquement des fragments d’ADN (gène) sur filtre par leur hybridation à des
séquences complémentaires. C’est une technique initialement décrite en 1976 par
E .M Southern.

2 - Réalisation pratique
En pratique on précède par un certain nombre d’étapes successives qui sont :
- extraction de l’ADN ;
- digestion de l’ADN ;
- séparation des fragments ;
- transfert des fragments ;
- fixation des fragments ;
- lavage et révélation des bondes d’ADN.

a - Extraction de l’ADN génomique

Cette extraction s’effectue à partir des leucocytes circulants obtenus en général à
partir du sang total.

b - Digestion par des enzymes de restriction

L’ADN génomique est digéré par des enzymes de restriction différentes. Ainsi
plusieurs tubes de digestion sont préparés :

tube 1: ER1 + ADN

tube 2 : ER2 + ADN
tube 3 : ER 3 + ADN ....... (ER: enzyme de restriction)

Il est aussi possible de réaliser les digestions par 2 enzymes de restriction dans un
même un tube.
Dans ces conditions, on obtient un grand nombre de fragments, mais seuls
quelques-uns correspondent à une partie ou à la totalité du gène étudié ou
recherché.

c - Séparation des fragments obtenus

Elle se fait par électrophorèse sur un gel d’agarose. Après cette séparation
électrophorétique, des fragments d’ADN bicentenaires obtenus par digestion
enzymatique, on réalise une dénaturation de ces fragments par traitement alcalin
du gel d’électrophorèse. Ce traitement transforme les fragments d’ADN double
brins en fragments simple brins.
d - Transfert des fragments monocaténaires
Les fragments monobrins obtenus précédemment sont par la suite transférés du
gel d’agarose à un support souple comme par exemple une feuille de nylon. Ce
traitement s’effectue par simple capillarité.
e - Fixation des fragments
Les fragments monocaténaires sont fixés sur le support et hybridés dans les
conditions optimales.
En effet, les fragments monocaténaires transférés sur le support solide souple, sont
mis en présence d’une sonde qui va s’hybrider dans des conditions physico –
chimiques bien définies : on parle de condition optimale de stringence. La sonde
s’apparie alors avec le fragment d’ADN monocaténaire selon les règles
habituelles de complémentarité. Cette sonde est manquée avec un radioisotope
soit en son extrémité 5’P, soit à l’intérieur de la chaîne polynucléotidique.
f - Lavage et révélation
Après fixation et hybridation, le support solide subit plusieurs lavage afin
d’éliminer entre autre l’excès de produits radioactifs non fixé. Ce support est
ensuite mis en contact avec un film photographique pendant plusieurs heures ou
plusieurs jours. Le film sera ensuite révélé. Il pourra ainsi être décelé une ou
plusieurs bandes radioactives qui correspondent aux fragments de DNA
monocaténaire reconnus par la sonde. En effet ces bandes d’ADN monocaténaire
hybridées avec la sonde radioactive, sont visibles sous forme de bandes noires sur
un film blanc. La position de ces bandes par rapport à des témoins de poids
moléculaires, permet de déterminer la taille de ces fragments.

- Montage
3 - Les Applications de la Technique de Southern
Les applications sont très nombreuses. On peut citer entre autre :
*Etablissement d’une carte de restriction
Les enzymes de restriction coupent l’ADN aux niveaux des séquences
parfaitement connues. Il est ainsi possible d’établir une véritable carte de sites
de restriction d’un gène donné par la technique de Southern. Cette carte est dite
carte de restriction. Elle favorise la maîtrise et l’utilisation de l’ADN à des fins
médicales, agronomique etc…
*Mise en évidence des délétions
Si l’on dispose des sondes spécifiques de gène à explorer, la technique de
Southern permet de mettre en évidence des délétions dans le gène. L’étendu de
la délétion peut être estimée par la détermination de la taille des fragments
d’ADN.
*Comparaison des ADN de différents individus
Cette comparaison se fait avec la mise en évidence des polymorphismes de
restriction grâce à la technique de Southern.
En présence de mutations ponctuelles au niveau des sites de restriction, des
variations dans la taille de certains fragments seront observées et ceci par
exemple à l’intérieur d’une même population. Cette petite différence entre des
individus de la même population est qualifiée de polymorphisme de taille de
fragment. En anglais on parle de Restriction Fragment Lengh polymorphisme.
D’où le nom de technique RFLP.

4. AUTRES TECHNIQUES PARALLELES

a. TECHNIQUE DE NORTHERN
Southern étant le nom du chercheur ayant mis point la technique de Southern qui
permet de séparer les fragments d’ADN, il a été appelé Northern par analogie, la
technique consistant à séparer les fragments d’ARN.
b. TECHNIQUE RFLP
Cette technique de polymorphisme de longueurs de restriction, est une
technique qui permet de comparer les ADN de différents individus et de
rechercher si des mutations ponctuelles faisant apparaître ou disparaître des sites
de restriction se sont produites ou non.
*Principe
Deux ADN de séquences identiques traités par des enzymes de restriction
similaires donneront des fragments identiques. Les Southern-blots (tâche)
obtenus avec fragments de DNA seront donc identiques. Au contraire, si un site
de restriction a disparu à la suite d’une mutation ponctuelle, les fragments
n’auront plus des tailles identiques. Ce qui sera visible sur les autoradiogammes.
Il en est de même si un nouveau site de restriction est apparu suite à une
mutation. Cette technique est souvent utilisée dans l’étude de la drépanocytose.
c-TECHNIQUE DES DOTS
Cette technique des dots, c’est dires des tâches, est assez simple car pas de
digestion par les enzymes de restriction.
En pratique, un échantillon est déposé sur un filtre en nylon. Puis comme la
technique de Southern, on procède successivement à la dénaturation, à
l’hybridation, au lavage et l’autoradiographie. Ce qui permet d’observer les
tâches représentant les fragments. Cette technique est souvent utilisée dans
l’étude des hépatites.
 APPLICATION DES TECHNIQUES BIOLOGIQUES

Introduction
Les applications des techniques de la biologie moléculaires sont, de nos jours, très
nombreuses. Elles sont utilisées dans plusieurs domaines de la vie modernes. On
peut citer entre autres la police judiciaire et frontalière, les industries
électroniques, les industries pharmaceutiques, la médecine et les laboratoires de
recherches.

I - IDENTIFICATION DES DNA NORMAUX : empreintes génétiques

A- GENERALITES
Les empreintes génétiques ont été décrites par JEFFREYS en Angleterre en 1985
et sont utilisés depuis 1987. Elles permettent d’identifier un individu par son ADN
et ceci dans des cas aussi divers : crimes, violes, recherche de paternité, avec
pratiquement aucun risque d’erreurs.

B - ECHANTILLON UTILISE
Le prélèvement contenant le DNA à identifier est selon les cas, une goutte de sang,
du sperme, les fragments de cheveux etc.… ; en fait, toute cellule nucléé.

C – TECHNIQUES UTILISEES
Deux techniques sont très utilisées : la RFLP et le PCR

1 - Utilisation de la RFLP
a – Polymorphisme de restriction
a1 - Définition et principe
Un locus est l’emplacement occupé par un gène (ou segment de DNA) sur un
chromosome.
Un allèle est une des diverses séquences nucléotidiques polymorphiques qui
peuvent occuper un même locus.
Les séquences codantes de notre DNA sont généralement très semblables d’un
sujet à l’autre. Alors qu’au contraire, les séquences non codantes ont subi d’assez
grandes variations au cours de l’évolution. Dans cette partie non codantes, se
trouvent des séquences appelées minisatellites ou VNTR (Variable Number of
Temdem Repeat). Il s’agit de la répétition d’une même séquence nucléotidique.
Le nombre de répétition de cette séquence est variable d’un individu à un autre et
se transmet héréditairement.

a2 - Données pratiques
Considérons les individus 1 et 2, un locus L et une séquence S.
 • Individu 1 qui a :
- dans un locus L, hérité de son père une séquence S répétée 3 fois.
- dans ce même locus, mais hérité de sa mère, la même séquence S mais répétée
un nombre de fois différent, par exemple 8 fois.

• Individu 2 qui a :
- dans ce même locus L, hérité de son père cette même séquence S mais répétée 7
fois.
- dans ce même locus, mais hérité de sa mère, cette même séquence répétée 5 fois

Dans les 2 cas, il s’agit d’un même locus mais qui prend des formes différentes
selon le nombre de répétitions de séquences. On dit qu’il y a un polymorphisme
de répétition. Il s’agit là d’un type de polymorphisme autre que le polymorphisme
dû à un changement de bases.

a3 - Détermination du nombre de répétition

- Fragmentation de DNA par les enzymes de restriction.
Pour déterminer le nombre de répétition par RFLP, le DNA est tout d’abord extrait
à partir du noyau des cellules présentes dans l’échantillon biologique prélevé.
Quand il s’agit par exemple d’un échantillon de sang, le DNA est extrait des
leucocytes.
Les enzymes de restriction utilisées doivent reconnaître un site de restriction situé
non pas à l’intérieur du groupe des séquences répétées, mais juste à côté. La
longueur des fragments obtenus sera alors fonction du nombre de répétition de la
séquence S dans le locus.

a4 - Transfert des fragments selon SOUTHERN

Après clivage du DNA par les enzymes de restriction, un transfert est effectué.

a5 - Hybridation
Deux types de sondes peuvent être utilisés : uniloculaire et multiloculaire.

a6 - Hybridation avec sonde uniloculaire

Une sonde uniloculaire reconnaît une séquence unique du locus, situé juste à côté
du groupe de séquences répétées. Le résultat est présenté dans le schéma suivant :

Fig. voir bibliographie

 • Les Applications

Cas de viol
Dans un prélèvement obtenu par écouvillon vaginal, deux populations de cellules
coexistent : les spermatozoïdes du violeur et les cellules vaginales de la victime.
Après avoir effectué une lyse cellulaire différentielle, il est possible d’obtenir
l’empreinte génétique de la victime avec le DNA des cellules vaginales et celle
de l’agresseur avec le DNA des spermatozoïdes. On compare avec les empreintes
des suspects.
Exo :Exemple de résultats dans le tableau suivant.

Dans cet exemple, les suspects 1 et 2 peuvent être innocentés. Répresenter.

- Cas de crime

Considérons la figure suivante obtenue après électrophorèse de sang d’une

victime et du sang de 5 suspects.
Exo : Faire une figure représentant les empreintes génétiques RFLP avec une
sonde uniloculaire dans le cas de crime. On observe que le sang recueilli sur le
lieu du crime n’appartient pas à la victime, mais à l’agresseur. Les suspects 1, 2,
3, 5 peuvent être innocentes.
Reprenons l’exemple précédent concernant les 2 individus 1 et 2.
- La RFLP de l’individu 1 relèvera avec une sonde uniloculaire 2 fragments
de taille différente, donc 2 bandes sur l’image radiographique.
- Il existe une certaine probabilité pour que les deux allèles de l’individu 2
soient différents de celle de l’individu 1
- la comparaison des deux empreintes génétique à 2 bandes est donc très
simple.
Mais il arrive que la sonde reconnaisse un locus ayant des zones répétitives de
même taille chez 2 individus. Pour augmenter le pouvoir discriminant, il suffit
d’utiliser plusieurs sondes uniloculaires. Plus on augmente le nombre de sondes
et donc le nombre de locus étudiés, plus on augmente la probabilité de trouver une
différence.
On peut ainsi déshybrider puis réhybrider la membrane plusieurs fois avec
différentes sondes. La nouvelle sonde reconnaîtra chaque fois une séquence
unique de locus différent.
Ainsi avec 4 sondes par exemples, la probabilité de retrouver la même empreinte
génétique dans une population est de 10-6 à 10-15.

NB : cas homozygote.
Dans l’exemple ici choisi (individu 1 et 2), il s’agit de sujet hétérozygotes ayant
hérité de leur père un allèle différent de celui de leur mère. Bien évidemment,
lorsqu’il s’agit d’un sujet ayant hérité du même allèle pour son père et sa mère
(homozygote), on aura une seule bande et non 2 bandes détectées.

 Nomenclature de locus
Un locus est défini par un groupe de lettres et de chiffres.
Exemple D2 S44
Par convention D signifie DNA, le numéro suivant désigne le chromosome, la
lettre suivante est S s’il s’agit d’une séquence unique puis un numéro de catégorie
de sonde termine l’ensemble. La sonde qui explore le locus D2 S44 a pour cible
une séquence unique et pour catégorie 44. c‘est une sonde uniloculaire située sur
le chromosome 2 du DNA.
• Interprétation de profil
Crime : l’identification consiste à comparer les empreintes génétiques de la
victime, celle des suspects et celle obtenue à partir de tache de sang recueilli sur
le lieu du crime.
Viol : un suspect peut être innocenté si l’empreinte génétique obtenue avec son
sang est différente de celle donnée par les spermatozoïdes recueillis chez la
victime.
Les spermatozoïdes donnent deux bandes car bien que le DNA de spermatozoïdes
ne comprenne qu’un chromosome. Il s’agit d’une population mixte constituée de
spermatozoïdes de type X et de spermatozoïdes de type Y.

Recherche de paternité
On est amené à comparer les empreintes de la mère, de l’enfant et du père
présumé. On ne s’intéresse pas à la bande de l’enfant correspondant à l’allèle
hérité de sa mère, mais à la 2eme bande, celle héritée de son père. On cherche à
situer cette 2ème bande chez le ou les pères présumés.
Exo Représenter un exemple de figure dans lequel, on voit nettement que l’allèle
inférieur de l’enfant a été transmis par la mère. Pour l’allèle supérieur, les pères
présumés 2 et 3 peuvent être exclus. Le père présumé 1 pourrait être le père
biologique. Ce travail peut être poursuivit par d’autres sondes pour analyser
l’enfant et le père 1.
Mère enfant pères présumes

1 2 3
Recherche de maternité
Elle peut être effectuée lors d’une substitution d’enfant ou d’un vol d’enfant (voir
recherche de paternité).
Identification d’individus
Cette recherche permet d’identifier un cadavre lors d’une catastrophe de train ou
d’avion…, en comparant les empruntes génétique du mort avec celles d’un
ascendant ou d’un descendant présumé. On peut aussi prendre des échantillons de
cheveux du défunt.

a8- Hybridation avec une sonde multiloculaire

Une séquence répétitive peut être située sur plusieurs locus. Cette séquence
présente quelques variations d’un locus à l’autre. Il s’agit en fait d’une famille de
séquences comportant un motif central commun. Ce qui permet dans les
conditions d’hybridation pas trop stringente, de les révéler avec la même sonde.

Une sonde multiloculaire reconnaît en effet le cœur d’une séquence répétitive,

donnée. Elle reconnaît donc tous les locus où se trouve cette séquence même
lorsque ces locus sont situés sur plusieurs chromosomes. Chez un même individu,
une sonde peut ainsi s’hybrider avec par exemple 4 locus en une seule hybridation.
On obtiendra finalement sur le film autoradiographique, une succession de bandes
dont le nombre et la localisation sont spécifiques d’un individu. Plus on étudie les
bandes, plus on augmente la probabilité de trouver une différence entre 2
individus. Il suffit en général de retenir que 20 à 30 bandes pour cette étude.
Exo : Représenter une figure des empruntes génétiques (EG) avec une sonde
multiloculaire dans le cas d’une identification de 2 individus ; tel que 2 séquences
a et n ont la même taille.
Comme elles sont reconnues par la même sonde, elles forment donc une bande au
même niveau. Quant aux autres bandes, la migration s’effectue en des niveaux
différents. Les individus 1et 2 peuvent être considérés comme différents.

La probabilité P pour que 2 sujets qui ne sont pas de vrais jumeaux ait par hasard
la même empreinte génétique, est infime et diminue avec le nombre de bandes
étudiées. Elle est également P = 1/4n avec n le nombre total de bandes communes
entre 2 profils. Ainsi, les calculs théoriques indiquent qu’il aurait une chance sur
68 milliards de rencontrer 2 individus ayant 18 bandes communes à la même
position. La réalité pratique est cependant différente et la probabilité de trouver 2
individus ayant ces 18 mêmes bandes est en faite plus élevé.

Comme avec les sondes uniloculaires, l’interprétation se fait par comparaison de

2 profils. Mais l’interprétation du film est plus délicate dans le cas des sondes
multiloculaires puisqu’il y’a d’avantage de bandes.

Recherche de paternité
Sur le film autoradiographique, on examine chaque allèle de l’enfant. Selon le
même principe que précédemment, on s’intéresse aux allèles de l’enfant que l’on
ne retrouve pas chez la mère. Si on les retrouve chez le père présumés, celui ci
est bien le père biologique de l’enfant.

Représenter les Empreintes génétiques FRLP avec une sonde multiloculaire dans
le cas de la recherche de paternité.

Mère Enfant père présumé

1 2
Le père présumé 2 peut être exclu. Pour simplifier le travail, seul le schéma d’un
segment du film a été représenté. L’examen de la concordance des bandes permet
de conclure que le père 1 est le père biologique.

2 - La PCR et empreintes génétiques

La PCR appliquée à la détermination des empruntes génétique a été introduite
récemment. Elle est utilisée dans les cas où il y a peu de DNA à identifier ou bien
lorsque le DNA est partiellement dégradé.
La séquence que l’on choisit d’amplifier est sélectionnée en raison de son
polymorphisme qu’il s’agisse d’un polymorphisme de répétition ou de séquence.
Au lieu de couper la région sélectionnée par un enzyme de restriction on l’amplifie
par PCR grâce à des amorces qui encadrent cette région.

Si la technique PCR présente le grand avantage de permettre des déterminations

sur de faibles quantités de DNA, il faut se rappeler que cette technique nécessite
des précautions afin d’éviter l’amplification des DNA contaminant.

a – Polymorphisme de répétition
Les amorces de PCR utilisées sont donc des séquences uniques situées de part et
d’autre du minisatellite.
Après amplification de la région souhaitée, les fragments de DNA obtenus seront
séparés par électrophorèse selon leur taille.
Comme la quantité du DNA à analyser est plus importante, on peut éviter les
techniques recourant à un transfert suivi d’hybridation avec des sondes
radioactives. Les fragments de DNA sont donc directement visualisés grâce au
BET et au rayons U. V.