Corrigé TD3

Exo 1.

La séquence amplifiée est indiquée en gras. Les zone de fixation des amorces sont
sous-titrées.

La taille du segment amplifié sans les amorces est de 288-118+1=171 bases.

La taille du segment amplifié avec les amorces est de 171+(21´ 2) = 213bases.

2. si on souhaite l’amplification de ce segment allant de 118 à 288 compris, on doit

encadrer ce segment avec une amorce droite et une gauche selon le schéma suivant.

L’amorce droite est complémentaire à la séquence du brin connu de 289 à 309 inclus.

-brin connu 5’ TCCAACTGTCCTCACGCTGAC3’

-séquence complémentaire 3’AGGTTGACAGGAGTGCGACTG5’
- écriture conventionnelle 5’ GT………………………………. A3’

L’amorce gauche (la même chose)

 3. critères de choix des amorces
-taille de 20 à 30 nucléotides
-50 % du contenu CG et Tm proche
- absence de répétition d’un même nucléotide
- absence de complémentarité de séquences entre les amorces ( formation de
dimèred’amorce).
Exercice 5 : Séquençage
-faible risque de formation de structures secondaires

4. lesdisposez
Vous Tm des deuxd’unamorces sont: à séquencer (matrice), d’une amorce, d’ADN polymérase
brin d’ADN
tronquée*, des quatre
- amorce droite Tm= 66°C 2’-désoxyribonucléotides (dXTP) et d’un jeu des différents 2’,3’-
didésoxyribo-nucléotides
- amorces gauche Tm= (ddXTP).
68°C L’amorce est radiomarquée par du phosphore radioactif 32P.
L’ADN matriciel à séquencer ACGTAATCGC---- comporte, à son extrémité 3’, une séquence
supplémentaire
Les deux Tm sont(représentée
proches. ici
Lespar un sondes
deux segment de compatibles.
sont droite en pointillé)
Mes ces surdeux
laquelle
sondesl’amorce va
s’hybrider, créant ainsi le site
risquent de former des dimères. d’initiation de l’ADN polymérase.
La solution est de raccourcir les deux amorces d’un A ou d’un AC afin d’atténuer la
*l’enzyme est constituée de plusieurs domaines dont l’un est responsable de la destruction " programmée " de
formation
l’amorce des élimination
; après dimères. de ce domaine, la fraction restante, désignée " fragment de Klenow ", conserve
l’activité ADN polymérase.
Exo 2.
1 — Résumez brièvement le principe de la méthode en indiquant le rôle du
didésoxyribonucléotide.
L’originalité du ddXTP (fluorescent ou radioactif) dans la méthode utilisée (Méthode
L’originalité du qu’il
de Sanger) est ddXTP (fluorescent
stoppe ou radioactif)
la progression dans la (absence
de la synthèse méthode utilisée (Méthode de Sanger)
du groupement
est qu’il
OH). stoppe la progression de la synthèse (absence du groupement OH)
.

Désoxyribonucléotide Didésoxyribonucléotide
triphosphate triphosphate
(dXTP) (ddXTP)

Rappel de la méthode :

1 — la réplication (ou duplication) de l’ADN nécessite la présence d’un brin modèle

(matrice), d’une amorce complémentaire d’un fragment d’ADN qui jouxte la région à
séquencer, des 4 nucléotides dXTP, d’ADN polymérase.
2 — la synthèse du brin complémentaire se faisant dans la direction 5’P vers 3’OH, le
brin matriciel a l’orientation inverse ; l’amorce se lie du côté 3’ de l’ADN matriciel ;
 l’ADN polymérase parcourt ce brin dans sa direction 3’-5’ pour allonger l’amorce
dansdela
Rappel la direction
méthode : correcte 5’-3’.
1 — la réplication (ou duplication) de l’ADN nécessite la présence d’un brin modèle (matrice),
d’une amorce complémentaire d’un fragment d’ADN qui jouxte la région à séquencer, des 4
3 — lorsque l’ADN polymérase identifie A sur le brin modèle, elle place T sur le brin
nucléotides dXTP, d’ADN polymérase.
2 —enlacours dedusynthèse
synthèse (de mêmesepour
brin complémentaire C et
faisant G).la direction 5’P vers 3’OH, le brin
dans
matriciel a l’orientation inverse ; l’amorce se lie du côté 3’ de l’ADN matriciel ; l’ADN
polymérase
Quand parcourt
des ddXTPce brinsont
dansutilisés
sa direction
: 3’-5’ pour allonger l’amorce dans la direction
correcte 5’-3’.
3 —L’enzyme
lorsque l’ADNplace soit 1identifie
polymérase dXTP Aetsurl’élongation
le brin modèle,de l’amorce
elle place T surselepoursuit, soit
brin en cours de 1 ddXTP et
la synthèse
synthèse (de mêmes’arrête. On obtient au final une série d’oligonucléotides de taille variable,
pour C et G).
tous terminés par ddX (X = A, G, C, T selon le milieu). Le résultat de l’électrophorèse
Quand des ddXTP sont utilisés :
des 4place
L’enzyme milieux
soit 1donne
dXTP etdirectement
l’élongation delal’amorce
séquence de l’ADN
se poursuit, soit 1 complémentaire
ddXTP et la synthèseà
la séquence
recherchée.
s’arrête. On obtient au final une série d’oligonucléotides de taille variable, tous terminés par
ddX (X = A, G, C, T selon le milieu). Le résultat de l’électrophorèse des 4 milieux donne
directement la séquence de l’ADN complémentaire à la séquence recherchée.

2 — Compléter le tableau en indiquant la composition des différents milieux réactionnels et, pour
chaque milieu, le type et la taille des fragments néosynthétisés.

3 — Sur le gel ci-dessous, représenter la taille des fragments néosynthétisés dans chaque milieu
réactionnel (utiliser l’échelle de taille représentée à gauche du schéma)
4 — Reporter, à droite, la séquence du brin synthétisé puis la séquence recherchée, en indiquant
le sens de lecture des séquences établies.
 4.

Exercice 6 : Séquençage
Un petit fragment d’ADN a été séquencé selon la méthode d’interruption des chaînes (méthode
de Sanger). Une fois la réaction de séquence terminée, la taille des fragments obtenus est
déterminée par une chromatographie. Le séquenceur automatique pourvu d’une source laser ou
infra-rouge qui excite les fluorochromes portés par les ddNTP, détecte la fluorescence sortant des
colonnes de chromatographie, repérant ainsi les fragments d'ADN et leur taille précise. Le
résultat est présenté sous forme de courbes présentant la fluorescence détectée, et l'interprétation
qui en faite en terme de nucléotidesDonner la séquence de l’ADN (la flèche sur le dessin indique
le sens de migration)