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Biologie médicale
[90­60­0020]

Amplification par déplacement de brin (SDA)

Isabelle Vassias : Ingénieur
CNRS ESA 7060, Centre universitaire des Saint­Pères, 45, rue des Saints­Pères, 75006 Paris  France

Résumé
La technique SDA (pour strand displacement amplification ou amplification par déplacement de brin)
est  une  méthode  isotherme  qui  permet  d'amplifier  de  l'ADN.  Elle  utilise  deux  enzymes
thermorésistantes  :  une  enzyme  de  restriction  BsoBI  ou  BsrI  et  une  ADN  polymérase  dépourvue
d'activité  exonucléasique  (exo­).  Grâce  à  deux  couples  d'amorce  contenant  notamment  le  site  de
coupure pour l'enzyme de restriction, un ADN cible possédant ce site de restriction est généré à l'aide
de la polymérase. Sur un seul brin, la digestion enzymatique génère une extrémité 3' qui peut être
allongée  par  la  polymérase  tout  en  déplaçant  le  brin  adjacent.  Le  processus  aboutit  à  une
amplification  de  la  cible  assez  rapide  et  peu  coûteuse.  Il  est  appliqué  au  diagnostic  de  certaines
infections bactériennes.

© 2003  Elsevier SAS. Tous droits réservés.

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PRINCIPES DE LA TECHNIQUE

La  SDA  (single strand displacement amplification  ou  amplification  par  déplacement  de  brin)  est  une
méthode isotherme utilisant deux enzymes thermorésistantes : une enzyme de restriction, BsoBI ou
BsrI, et une ADN polymérase dépourvue d'activité exonucléasique (exo­)  [1, 10, 11].

Grâce à deux couples d'amorce contenant notamment le site de coupure pour l'enzyme de restriction,
un  ADN  cible  possédant  ce  site  est  généré  à  l'aide  de  la  polymérase  qui  incorpore  un  nucléotide
modifié,  dATP  [  δS].  L'incorporation  de  ce  nucléotide  rend  la  coupure  impossible  sur  le  brin  modifié.
Sur l'autre brin, la digestion enzymatique génère une extrémité 3' et une extrémité 5'.

L'ADN  polymérase  réalise  alors  l'élongation  du  brin  coupé  et  son  manque  d'activité  exonucléasique
permet le déplacement du brin adjacent.

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ÉTAPES

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Préparation des échantillons
Les échantillons tels que sécrétions, plasma, urines peuvent être préparés de façon classique. L'ADN
obtenu doit être très propre de façon à éliminer les problèmes d'inhibiteurs.

Amplification

Génération de la cible (fig 1)
L'ADN est dénaturé par la chaleur. Deux couples d'amorces sont ajoutés : deux amorces externes et
complètement  complémentaires  de  la  séquence  cible  (E1  et  E2),  et  deux  amorces  internes
partiellement  complémentaires  comportant  le  site  de  restriction  de  l'enzyme  BsoBI  (ou  BsrI)  (I1  et
I2).  Le  mélange  réactionnel  est  chauffé  à  la  température  idéale  d'hybridation  et  d'élongation  des
amorces. Le processus est identique et inverse sur chaque brin.

E2  et  I2  s'hybrident  et  l'élongation  par  l'ADN  polymérase  exo­  a  lieu  à  partir  des  deux  amorces
déplaçant le brin initié par I2. Elle incorpore un dATP [δS] qui rend la coupure impossible sur le brin
modifié.  Sur  ce  dernier  brin  peuvent  s'hybrider  E1  et  I1  et  un  brin  possédant  à  chacune  de  ses
extrémités la séquence cible de BsoBI est généré puis rendu double brin à l'aide de l'ADN polymérase.

Processus d'amplification
L'ADN double brin possédant à ses extrémités 5' et 3' le site BsoBI est dénaturé, puis un processus de
déplacement de brin identique et opposé a lieu sur chaque brin. L'extension de l'amorce I1 génère un
ADN  qui  peut  être  digéré  par  BsoBI.  L'ADN  polymérase  exo­  réalise  une  extension  à  partir  de
l'extrémité 3' libre et déplace ainsi le premier brin qui est une copie de la séquence cible, équivalente à
un amplicon : le processus est devenu cyclique (fig 2)

Détection des amplicons
Les  amplicons  peuvent  être  détectés  par  les  méthodes  classiques  comme  la  migration  en  gel
électrophorétique en présence de BET, puis par hybridation en phase liquide ou solide.

La société Becton Dickinson a développé une trousse de détection chimiluminescente en phase solide.
L'amplicon  est  capturé  par  une  sonde  marquée  à  la  biotine  qui  se  fixe  à  un  puits  de  microplaque
recouvert  de  streptavidine.  Le  complexe  est  ensuite  détecté  par  une  deuxième  sonde  marquée  à  la
phosphatase  alcaline.  Un  substrat  chimiluminescent  permet  l'émission  de  photons  quantifiables  par
un luminomètre.

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RÉSULTATS ATTENDUS

De  107  à  1012  copies  peuvent  être  obtenues  en  2  heures.  Au  départ,  la  taille  des  fragments
n'excédait pas 100 pb. La société Becton Dickinson a développé un système qui est réalisé à une plus
haute  température  :  la  taille  des  fragments  peut  alors  atteindre  2  000  pb    [6].  Des  trousses  de
détection  des  mycobactéries    [4,  5,  9]  et  des  deux  germes  Chlamydia  trachomatis  et  Neisseria
gonorrhoeae  sont  aujourd'hui  commercialisées  par  Becton  Dickinson.  Cette  technique  reste
majoritairement qualitative, même si un test de détection pour Chlamydia trachomatis  [3] en temps
réel est aujourd'hui commercialisé  [7].

Il est à noter la mise en oeuvre de SDA in situ sur des coupes ou des cellules    [8].  Cette  technique

serait  plus  facile  à  mettre  en  oeuvre  que  la  PCR  in  situ  puisqu'elle  ne  demanderait  pas  de
thermocycleur.

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AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS

La SDA est une technique isotherme, elle ne requiert donc pas de thermocycleur, ce qui la rend peu
coûteuse. Par ailleurs, elle est très rapide et offre une bonne sensibilité et spécificité de par l'utilisation
de  deux  paires  d'amorces.  Elle  reste  compliquée  à  mettre  en  oeuvre  dans  un  laboratoire  en  dehors
des trousses commercialisées.

Références
[1] Andras  SC,  Power  JB,  Cocking  EC,  Davey  MR  Strategies  for  signal  amplification  in  nucleic  acid
detection. Mol Biotechnol 2001 ; 19 : 29­44
[2] Bogard M, Lamoril J Biologie moléculaire en biologie clinique. I. Méthodes.   Paris: Elsevier1998 
[3] Chan  EL,  Brandt  K,  Olienus  K,  Antonishyn  N,  Horsman  GB  Performance  characteristics  of  the  Becton
Dickinson probetec system for direct detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in
male  and  female  urine  specimens  in  comparison  with  the  Roche  Cobas  system.  Arch  Pathol  Lab
Med 2000 ; 124 : 1649­1652
[4] Hellyer  TJ,  Fletcher  TW,  Bates  JH,  Stead  WW,  Templeton  GL,  Cave  MD  ,  et  al.  Strand  displacement
amplification and the polymerase chain reaction for monitoring response to treatment in patients with
pulmonary tuberculosis. J Infect Dis 1996 ; 173 : 934­941
[5] Ichiyama S, Ito Y, Sugiura F, Iinuma Y, Yamori S, Shimojima  M  ,  et  al.  Diagnostic  value  of  the  strand
displacement amplification method compared to those of Roche amplicor PCR and culture for detecting
mycobacteria in sputum samples. J Clin Microbiol 1997 ; 35 : 3082­3085
[6] Mehrpouyan  M,  Bishop  JE,  Ostrerova  N,  Van  Cleve  M,  Lohman  KL  A  rapid  and  sensitive  method  for
non­isotopic  quantitation  of  HIV­1  RNA  using  thermophilic  SDA  and  flow  cytometry.  Mol  Cell
Probes 1997 ; 11 : 337­347 [crossref]
[7] Nadeau JG, Pitner JB, Linn CP, Schram JL, Dean CH, Nycz CM Real­time, sequence­specific detection of
nucleic  acids  during  strand  displacement  amplification.  Anal  Biochem  1999  ;  276  :  177­
187 [crossref]
[8] Nuovo  GJ  In  situ  strand  displacement  amplification:  an  improved  technique  for  the  detection  of  low
copy nucleic acids. Diagn Mol Pathol 2000 ; 9 : 195­202 [crossref]
[9] Pfyffer  GE,  Funke­Kissling  P,  Rundler  E,  Weber  R  Performance  characteristics  of  the  BDProbeTec
system  for  direct  detection  of  Mycobacterium  tuberculosis  complex  in  respiratory  specimens.  J  Clin
Microbiol 1999 ; 37 : 137­140
[10] Walker  GT  Empirical  aspects  of  strand  displacement  amplification.  PCR  Methods  Appl  1993  ;  3  :  1­
6 [crossref]
[11] Walker  GT,  Fraiser  MS,  Schram  JL,  Little  MC,  Nadeau  JG,  Malinowski  DP  Strand  displacement
amplification  ­  an  isothermal,  in  vitro  DNA  amplification  technique.  Nucleic  Acids
Res 1992 ; 20 : 1691­1696

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Fig. 1 :

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Fig. 1 :

Amplification d'ADN par SDA : génération de l'ADN cible. L'ADN est dénaturé par la chaleur. Deux couples d'amorces sont
ajoutés : deux amorces externes et complètement complémentaires de la séquence cible E1 et E2 et deux amorces internes
et partiellement complémentaires comportant le site de restriction de l'enzyme BsoBI (ou BsrI) I1 et I2. Le processus est
identique et inverse sur chaque brin. E2 et I2 s'hybrident et l'élongation par l'ADN pol exo­ a lieu à partir des deux
amorces déplaçant le brin initié par I2. Sur ce dernier brin peuvent s'hybrider E1 et I1 et un brin possédant à chacune de
ses extrémités la séquence cible de BsoBI est généré puis rendu double brin à l'aide de l'ADN pol.

Fig. 2 :

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Fig. 2 :

Amplification d'ADN par SDA : amplification de l'ADN cible. L'ADN double brin cible généré après la première phase de
synthèse et possédant à ses extrémités 5' et 3' le site BsoBI, est digéré par BsoBI. L'ADN polymérase exo­ réalise une
extension à partir de l'extrémité 3' libre et déplace ainsi le premier brin qui est une copie de la séquence cible, équivalente
à un amplicon : le processus devient cyclique et une accumulation de la cible est obtenue.

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