17/6/2015 Visualisation 

de l'impression de l'article : Agrégométrie ­ EM|Premium

Imprimé par ALGERIE CERIST le mercredi 17 juin 2015

Biologie médicale
[90­60­0010]

Agrégométrie

Tahar Chakroun : Assistant hospitalo­universitaire
Ismail Elalamy : MD, PhD
service d'hématologie biologique, hôpital Hôtel­Dieu, 1 place du Parvis Notre­Dame, 75181 cedex 04, Paris
 France

Résumé
L'agrégométrie est un test spécifique d'exploration des fonctions plaquettaires. Ce test est réalisé à 37
°C dans un agrégamètre. Ce dernier mesure la variation de transmission lumineuse d'une suspension
de plaquettes (plasma riche en plaquettes ou plaquettes isolées) soumise à une agitation mécanique
en  présence  d'un  agoniste  plaquettaire  exogène  (ADP,  collagène,  acide  arachidonique...).  Le
pourcentage de transmission lumineuse et les caractéristiques des tracés d'agrégation obtenus sont le
reflet  de  la  capacité  fonctionnelle  des  plaquettes.  Outre  l'étude  des  fonctions  plaquettaires,
l'agrégométrie est utilisée pour l'exploration du facteur Willebrand et pour le diagnostic biologique des
thrombopénies induites par l'héparine.

© 2005  Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Haut de page  ­ Plan de l'article

INTRODUCTION

L'hémostase  primaire  est  la  résultante  de  l'interaction  de  la  paroi  vasculaire  lésée  et  des  plaquettes
avec  certains  facteurs  plasmatiques  (facteur  Willebrand,  fibrinogène).  L'anomalie  de  l'hémostase
primaire  se  traduit  cliniquement  par  des  manifestations  hémorragiques  principalement
cutanéomuqueuses (purpura, ecchymoses...) plus ou moins sévères. Le diagnostic biologique de ces
déficits est basé sur des techniques dites globales (temps de saignement, temps d'occlusion in vitro ou
PFA100TM)  et  des  techniques  plus  spécifiques  qui  permettent  d'apprécier  l'aspect  quantitatif  et/ou
qualitatif des plaquettes et des facteurs plasmatiques.

Les  fonctions  plaquettaires  peuvent  être  étudiées  par  agrégométrie.  Les  tests  d'agrégation  sont
réalisés  en  sang  total,  en  plasma  riche  en  plaquettes  (PRP)  ou  en  suspension  de  plaquettes  lavées.
Cette  méthode  évalue  in  vitro  la  capacité  des  plaquettes  à  agréger  en  réponse  à  des  agonistes  de
nature diverse. Décrite pour la première fois par Born (1962), la méthode photométrique en PRP reste
la technique la plus courante pour l'étude de l'agrégation plaquettaire.

Haut de page  ­ Plan de l'article

PRINCIPE (FIG 1)

http://www.em­premium.com.www.sndl1.arn.dz/module/displayarticle/article/61444/impression/vue5 1/8
17/6/2015 Visualisation de l'impression de l'article : Agrégométrie ­ EM|Premium

Le  test  d'agrégation  plaquettaire  est  réalisé  dans  un  agrégamètre  à  37  °C.  Un  faisceau  lumineux
(monochromatique) traverse une cuvette en verre siliconé à fond plat (7,5 mm/50 mm) contenant la
suspension  plaquettaire.  Un  moteur  placé  sous  la  cuvette  de  mesure  permet  d'agiter  un  barreau
magnétique siliconé (3 à 5 mm) pour faciliter le mélange et l'homogénéisation du milieu et créer une
force  de  cisaillement  apte  à  activer  mécaniquement  les  plaquettes  et  à  amplifier  la  réponse  aux
agonistes.  En  présence  d'agoniste,  les  plaquettes  soumises  à  une  agitation  continue  (1100  tr/min)
vont  agréger.  Cette  agrégation  entraîne  un  éclaircissement  du  milieu  se  traduisant  par  une
augmentation  de  la  transmission  lumineuse  (TL).  Une  cellule  photoélectrique  mesure  en  continu  la
variation  de  TL.  Les  résultats  sont  représentés  sous  la  forme  d'une  courbe  d'agrégation  (TL/temps)
dont l'aspect dépend de la nature et de la concentration de l'agoniste utilisé.

Haut de page  ­ Plan de l'article

TECHNIQUE

Préparation de l'échantillon
Le  sang  est  prélevé  par  ponction  veineuse  franche  dans  un  tube  en  plastique  ou  en  verre  siliconé
contenant du citrate trisodique 3,8 % ou 3,2 % tamponné (1 v de citrate/9 v de sang) et centrifugé à
150  g  pendant  10  minutes  à  20  °C.  Les  prélèvements  peuvent  être  réalisés  en  flux  libre  ou  sous
®
Vacutainer  (Becton Dickinson). Après centrifugation, le PRP est décanté et conservé à température
ambiante  (18  à  20  °C)  en  tube  bouché  (pour  limiter  les  variations  de  pH).  Le  plasma  pauvre  en
plaquettes (PPP) est obtenu par centrifugation du sang résiduel à 2500 g pendant 15 minutes. Les
tests d'agrégation doivent être effectués dans les 3 heures suivant le prélèvement compte tenu de la
désensibilisation de certains récepteurs et de l'épuisement potentiel des plaquettes.

Dans  certains  cas  et  pour  apprécier  l'influence  éventuelle  de  certains  facteurs  plasmatiques  sur  la
fonction  plaquettaire,  l'isolement  des  plaquettes  par  «  lavage  »  est  nécessaire,  la  méthode  la  plus
utilisée étant la technique de Mustard modifiée.

Étalonnage de l'agrégomètre
Il s'effectue après stabilisation de la température à 37 °C. La référence 100 % de TL s'effectue sur
une cuve contenant du PPP et le 0 % sur une cuve contenant du PRP autologue.

Inducteurs
Ils  peuvent  être  de  nature  physiologique  ou  synthétique  et  ils  sont  utilisés  à  différentes
concentrations. Il est recommandé de préparer les solutions d'inducteur extemporanément à partir de
solutions  mères  et  de  les  garder  dans  la  glace  fondante  durant  toute  la  manipulation.  Il  est  aussi
fortement recommandé de les ajouter au milieu réactionnel à des faibles volumes (5 à 10 μl).

Inducteurs naturels
Ce sont les inducteurs responsables de l'activation plaquettaire in vivo.

Adénosine  ­3,2­  diphosphate  (ADP,  Stago)  :  il  agit  en  se  fixant  sur  des  récepteurs  purinergiques
(P2Y1, P2Y12, P2X1) et est utilisé à des concentrations variables (10, 5, 2,5 et 1,25 μM).

Acide  arachidonique  (AA,  sigma)  :  il  entraîne  l'activation  de  la  voie  des  cyclo­oxygénases  et  la
formation  du  thromboxane  A2  (TXA2),  puissant  inducteur  de  l'agrégation  plaquettaire.  La
concentration habituellement utilisée est de 1 mM.

Thrombine  :  elle  ne  peut  être  utilisée  que  sur  une  suspension  de  plaquettes  lavées.  Elle  est
habituellement utilisée à la concentration de 0,1 U/ml.

Adrénaline : elle est utilisée le plus souvent à deux concentrations (50 et 5 μM).

Collagène : utilisé à des concentrations variables (5, 1, 0,5 et 0,25 μg/ml), il entraîne la sécrétion et
http://www.em­premium.com.www.sndl1.arn.dz/module/displayarticle/article/61444/impression/vue5 2/8
17/6/2015 Visualisation de l'impression de l'article : Agrégométrie ­ EM|Premium

l'agrégation plaquettaire en se fixant sur la GPIa, CD36 (GPIV)...

Inducteurs synthétiques
U46619 : analogue structural des endoperoxydes cycliques de prostaglandines dont la PGH2. C'est un
TXA2 mimétique et il agit via ces récepteurs.

TRAP (thrombin receptor agonist peptide) : peptide de synthèse thrombine mimétique.

Ristocétine : antibiotique non utilisé en clinique qui entraîne la fixation du facteur Willebrand sur le
complexe GPIb­IX.

Ionophore A 23187 : utilisé pour l'étude des mouvements calciques...

Phorbol myristate acétate (PMA) : utilisé pour l'exploration de l'activation de la protéine kinase C (PKC)
voie royale de l'activation plaquettaire.

Protocole expérimental
Selon  les  appareils,  de  250  à  300  μl  de  PRP  ajusté  à  300  G/l  par  l'ajout  de  PPP  autologue  sont
introduits  dans  une  cuve  de  mesure  contenant  un  barreau  magnétique.  Après  1  à  2  minutes  de
stabilisation  (équilibre  thermique  et  électrique)  sous  agitation  (1100  tr/min)  et  à  37  °C,  l'inducteur
est ajouté (10 à 20 μl) à différentes concentrations (en général deux concentrations). Cinq agonistes
sont  habituellement  utilisés  :  ADP,  AA,  collagène,  adrénaline  et  ristocétine.  L'enregistrement  se
déroule sur 5 à 10 minutes.

Haut de page  ­ Plan de l'article

RÉSULTATS ET INTERPRÉTATION

Les  résultats  sont  représentés  sous  la  forme  d'une  courbe  d'agrégation  (fig 2).  L'analyse  de  cette
courbe permet de définir quatre paramètres :

le temps de latence (l) : exprimé en s représente le temps écoulé entre l'ajout de l'agoniste
et le début de l'augmentation de la TL;
la vélocité d'agrégation (en % de TL/min) : la pente de la tangente à la courbe d'agrégation;
la TL maximale (en %);
le pourcentage de désagrégation à 5 minutes.

L'aspect  des  courbes  d'agrégation  dépend  de  l'agent  agrégeant,  de  sa  concentration  et  de  la  qualité
fonctionnelle des plaquettes. Chez le sujet normal, les courbes obtenues avec l'ADP, le collagène, l'AA
et l'adrénaline sont représentées en figure 3.

Haut de page  ­ Plan de l'article

CAUSES D'ERREUR

Prélèvement de plus de 3 heures, numération plaquettaire dans le PRP trop faible pour la sensibilité de
détection  de  l'appareil  (<  100  G/l),  plasma  hyperlipémique  ou  ictérique  responsable  d'une  turbidité
trop  élevée  donnant  une  différence  trop  faible  de  TL  entre  le  PRP  et  le  PPP;  vitesse  d'agitation  trop
lente ou trop rapide qui influence la réactivité des plaquettes, température d'incubation inadéquate...

Haut de page  ­ Plan de l'article

VARIANTES

http://www.em­premium.com.www.sndl1.arn.dz/module/displayarticle/article/61444/impression/vue5 3/8
17/6/2015 Visualisation de l'impression de l'article : Agrégométrie ­ EM|Premium

Mesure de l'agrégation plaquettaire en sang total par impédancemétrie
L'agrégation  est  mesurée  par  la  variation  d'impédance  entre  deux  électrodes  de  platine  immergées
dans le sang. Après la stabilisation du passage du courant, l'inducteur induit la formation d'agrégats
dont le dépôt entraîne une modification de l'impédance proportionnelle à la taille des agrégats formés.
Les  courbes  d'agrégation  sont  seulement  de  type  monophasique,  irréversible,  à  la  différence  de  la
photométrie.  L'impédancemétrie  présente  l'avantage  de  pouvoir  étudier  les  plaquettes  dans  leur
milieu physiologique et en cas de thrombopénie (< 100 G/l). En revanche, elle est moins sensible que
la  technique  photométrique  et  sujette  à  plusieurs  interférences  (hématies  qui  gênent  le  dépôt  des
agrégats sur l'électrode).

Haut de page  ­ Plan de l'article

APPLICATIONS DE L'AGRÉGOMÉTRIE

Recherche d'une hyperactivité plaquettaire
Une  hyperactivité  plaquettaire  peut  être  à  l'origine  d'accident  thromboembolique  artériel.  Cette
activité  accrue  peut  se  traduire  par  une  autoagrégation  (sans  l'apport  d'agoniste)  ou  par  une
agrégation encore présente aux faibles doses d'au moins deux agonistes différents qui normalement
n'induisent pas dans ces conditions d'agrégation chez un sujet normal. Trip et al (1990) ont montré
que  les  sujets  avec  une  agrégation  spontanée  ont  un  risque  élevé  de  récidive  d'infarctus  du
myocarde. Mais il est important de noter qu'une hyperactivité in vivo peut se traduire in vitro par une
hypoagrégabilité due à l'épuisement plaquettaire.

Exploration des anomalies fonctionnelles plaquettaires
Elle  représente  la  principale  application  de  ce  test.  Les  thrombopathies  peuvent  être  acquises  ou
constitutionnelles (tableau I).  Les  courbes  d'agrégation  typique  des  anomalies  les  plus  fréquentes
sont représentées sur la figure 4.

Diagnostic des thrombopénies induites par l'héparine (TIH)

La  TIH  survient  généralement  entre  le  5 e  et  le  10 e  jour  chez  environ  3  %  des  sujets  traités  par
l'héparine.  Cette  affection  est  due  à  une  activation  plaquettaire  in  vivo  par  un  mécanisme
immunologique.  Le  test  d'agrégation  permet  de  mettre  en  évidence  dans  le  plasma  de  malade  des
anticorps  dirigés  contre  le  complexe  PF4­héparine  capables  d'entraîner  l'agrégation  de  plaquettes
témoins en présence d'héparine. Il faut noter que ce test n'est qu'un des éléments du diagnostic de la
TIH.

Dosage de l'activité cofacteur de la ristocétine du facteur Willebrand (FvW :CoR)
Dans  tous  les  types  de  la  maladie  de  Willebrand  (excepté  le  type  2N),  les  taux  de  FvW  :CoR  sont
diminués. L'agrégométrie est le test de référence pour le dosage du FvW :CoR. La vélocité des courbes
d'agglutination en présence de ristocétine est proportionnelle au taux du FvW plasmatique.

Autre
Étude de la sécrétion d'ATP intragranulaire, contrôle de qualité des concentrés plaquettaires...

© 2005  Elsevier SAS. Tous droits réservés.

http://www.em­premium.com.www.sndl1.arn.dz/module/displayarticle/article/61444/impression/vue5 4/8
17/6/2015 Visualisation de l'impression de l'article : Agrégométrie ­ EM|Premium

Fig. 1 :

Fig. 1 :

Principe de fonctionnement d'un agrégomètre.

1. Source lumineuse polychromatique.

2. Filtre monochromatique

3. Faisceau monochromatique.

4. Cuve contenant du PRP.

5. Barreau magnétique.

6. Moteur rotatif 1100 tours/min.

7. Lumière transmise.

8. Diode photoélectrique.

9. Enregistreur.

Fig. 2 :

http://www.em­premium.com.www.sndl1.arn.dz/module/displayarticle/article/61444/impression/vue5 5/8
17/6/2015 Visualisation de l'impression de l'article : Agrégométrie ­ EM|Premium
Fig. 2 :

Profil agrégométrique en présence de collagène (1 μg/ml). l : représente le temps de latence. Tg : la tangente à la courbe
dont la pente représente la vélocité de l'agrégation.

Fig. 3 :

Fig. 3 :

Profils agrégométriques obtenus pour un sujet normal par la technique photométrique.

Fig. 4 :

http://www.em­premium.com.www.sndl1.arn.dz/module/displayarticle/article/61444/impression/vue5 6/8
17/6/2015 Visualisation de l'impression de l'article : Agrégométrie ­ EM|Premium

Fig. 4 :

Profils agrégométriques des principales anomalies plaquettaires.

http://www.em­premium.com.www.sndl1.arn.dz/module/displayarticle/article/61444/impression/vue5 7/8
17/6/2015 Visualisation de l'impression de l'article : Agrégométrie ­ EM|Premium

Tableaux
  Tableau I
Tableau I ­ Principales thrombopathies constitutionnelles et acquises.

Thrombopathies héréditaires 

Anomalies des récepteurs  Anomalies de sécrétion  Anomalies de synthèse 

­ Déficit en GPIIbIIIa (maladie de ­ Anomalies des granules denses ­ Déficit en cyclo­

Glanzmann) (maladie du pool vide) oxygénase
­ Déficit en GPIb­V­IX (maladie de Bernard­ ­ Déficit en
Soulier) ­ Anomalies des granules  thromboxane­synthétase
­ Anomalie qualitative de la GPIb ou (plaquettes grises)
pseudomaladie de Willebrand
­ Anomalies des récepteurs

Thrompathies acquises 

Médicamenteuses  Autres 

­ Aspirine ­ Syndrome néphrotique
­ Anti­inflammatoires stéroïdiens ­ Syndromes myéloprolifératifs
­ Antiagrégants plaquettaires (ticlopidine, clopidogrel, ­ Maladie hépatique
dipyridamole)

http://www.em­premium.com.www.sndl1.arn.dz/module/displayarticle/article/61444/impression/vue5 8/8