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Imprimé par ALGERIE CERIST le mercredi 17 juin 2015

Biologie médicale
[90­60­0055]

CPR (cycling probe reaction)

Isabelle Vassias : Ingénieur
CNRS ESA 7060, centre universitaire des Saint­Pères, 45 rue des Saints­Pères, 75006 Paris  France

Résumé
La CPR (ou cycling probe reaction pour amplification par dégradation cyclique de sonde) n'est pas une
réaction  d'amplification,  mais  un  processus  de  dégradation  partielle  de  sonde.  Une  sonde  composite
ADN­ARN­ADN spécifique de la séquence cible recherchée est utilisée. Une RNase H thermorésistante
dégrade la portion ARN de la sonde hybridée à l'ADN cible, libérant les fragments d'ADN de la sonde.
En très peu de temps, on observe une accumulation de ces petits fragments facilement détectables.
Cette technique n'a pas d'application diagnostique commerciale en France actuellement. Cependant,
des tests de détection de gènes de résistance aux antibiotiques de certaines bactéries sont disponibles
dans d'autres pays.

© 2003  Elsevier SAS. Tous droits réservés.

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PRINCIPES DE LA TECHNIQUE

La CPR (ou cycling probe reaction pour amplification par dégradation cyclique de sonde) n'est pas une
réaction d'amplification à proprement parler, mais un processus de dégradation partielle de sonde   [3].
Elle  est  fondée  sur  l'utilisation  d'une  sonde  chimère  acide  ribonucléique  (ARN)­acide
désoxyribonucléique  (ADN),  et  utilise  les  propriétés  enzymatiques  de  la  RNase  H  thermorésistante  :
cette  enzyme  dégrade  la  portion  ARN  de  la  sonde  hybridée  à  l'ADN  cible,  générant  des  fragments
d'ADN facilement détectables après dénaturation de l'hybride.

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ÉTAPES

Préparation des échantillons
Les échantillons tels que sécrétions, plasma, urines peuvent être préparés de façon classique. L'ADN
obtenu doit être très propre, de façon à éliminer les inhibiteurs chimiques éventuels.

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Processus d'amplification (fig 1)

Hybridation
Une  sonde  composite  ADN­ARN­ADN  spécifique  s'hybride  à  65  °C  à  la  portion  d'ADN  cible
complémentaire.

Dégradation de la sonde
La RNase H dégrade uniquement l'ARN des hybrides ADN­sonde (elle n'agit pas sur l'ARN simple brin).
Elle détruit donc spécifiquement la partie centrale de la sonde lorsque celle­ci est hybridée. Les deux
fragments d'ADN restant sont déstabilisés, car leur longueur est telle que leur hybridation à la cible
n'est  pas  stable  dans  les  conditions  de  température  et  de  force  ionique  employées.  En  fait,  seule  la
sonde composite peut s'hybrider dans les conditions de la réaction. Il en résulte la libération des deux
fragments  d'ADN.  L'ADN  cible,  qui  se  retrouve  alors  sous  la  forme  simple  brin,  peut  s'hybrider  avec
une  nouvelle  sonde  composite,  et  un  nouveau  cycle  commence.  Au  fur  et  à  mesure  des  cycles,  les
petits  fragments  s'accumulent.  Leur  détection  permet  de  prouver  la  présence  de  la  cible  dans  le
mélange réactionnel.

Détection des produits amplifiés
En raison de leur petite taille, les fragments d'ADN libérés ne sont que très difficilement détectables
par migration électrophorétique. Il faut préférer une détection par hybridation en milieu liquide ou sur
phase solide.

La société ID biomedical a développé un système de détection particulier. La sonde ADN­ARN­ADN est
marquée à chaque extrémité par deux molécules différentes : la biotine et la fluorescéine. Si la sonde
est entière, elle est capturée par la streptavidine présente sur des microplaques, puis la fluorescéine
est  détectée  par  un  anticorps  couplé  à  la  peroxydase.  Le  tout  est  révélé  par  un  substrat
colorimétrique. En revanche, si la cible était présente dans l'échantillon, la sonde est scindée en deux
fragments  d'ADN,  et  seul  celui  marqué  à  la  biotine  se  fixe  à  la  microplaque.  Aucune  réaction
colorimétrique ne peut alors avoir lieu.

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AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS

Cette  méthode  présente  l'avantage  d'être  rapide  (moins  d'1  heure  en  général)  et  nécessite  peu  de
mise au point. De plus, elle est isotherme, elle ne nécessite donc pas d'appareillage coûteux comme
un  thermocycleur.  Enfin,  elle  présente  un  avantage  majeur  :  seuls  des  fragments  de  sonde
s'accumulent, incapables de s'hybrider à nouveau à un ADN cible, rendant ainsi toute contamination
impossible. La spécificité de cette technique est donc très grande.

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APPLICATIONS POSSIBLES

Peu de sociétés ont développé la CPR au sein de trousses de diagnostic. Seul, ID biomedical propose
des tests de détection de gènes de résistance aux antibiotiques de certaines bactéries   [2,  5,  7]. Mais
rien  ne  s'oppose  à  la  détection  de  génomes  viraux  ou  bactériens,  comme  cela  a  été  décrit  pour
Mycobacterium tuberculosis [1].

Références
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[1] Beggs  ML,  Cave  MD,  Marlowe  C,  Cloney  L,  Duck  P,  Eisenach  KD  Characterization  of  Mycobacterium
tuberculosis  complex  direct  repeat  sequence  for  use  in  cycling  probe  reaction.  J  Clin
Microbiol 1996 ; 34 : 2985­2989
[2] Bekkaoui F, McNevin JP, Leung CH, Peterson GJ, Patel A, Bhatt RS , et al. Rapid detection of the mecA
gene  in  methicillin  resistant  staphylococci  using  a  colorimetric  cycling  probe  technology.  Diagn
Microbiol Infect Dis 1999 ; 34 : 83­90 [crossref]
[3] Bekkaoui F, Poisson I, Crosby W, Cloney L, Duck P Cycling probe technology with RNase H attached to
an oligonucleotide. Biotechniques 1996 ; 20 : 240­248
[4] Bogard M, Lamoril J Biologie moléculaire en biologie clinique. I. Méthodes.   Paris: Elsevier1998 
[5] Cloney  L,  Marlowe  C,  Wong  A,  Chow  R,  Bryan  RN  Rapid  detection  of  mecA  in  methicillin  resistant
Staphylococcus  aureus  using  cycling  probe  technology.  Mol  Cell  Probes  1999  ;  13  :  191­
197 [crossref]
[6] Fong WK, Modrusan Z, McNevin JP, Marostenmaki J, Zin B, Bekkaoui F Rapid solid­phase immunoassay
for  detection  of  methicillin­resistant  Staphylococcus  aureus  using  cycling  probe  technology.  J  Clin
Microbiol 2000 ; 38 : 2525­2529
[7] Modrusan  Z,  Marlowe  C,  Wheeler  D,  Pirseyedi  M,  Bryan  RN  Detection  of  vancomycin  resistant  genes
vanA and vanB by cycling probe technology. Mol Cell Probes 1999 ; 13 : 223­231 [crossref]

© 2003  Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Fig. 1 :

Fig. 1 :

CPR (ou cycling probe reaction). La sonde composite ADN­ARN­ADN s'hybride à l'ADN cible. La RNase H dégrade
spécifiquement l'ARN de la sonde, lorsque celui­ci est fixé à l'ADN de la cible. Les petits fragments d'ADN déstabilisés sont
libérés, dégageant ainsi l'ADN cible qui sera prêt pour un autre cycle d'amplification.

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