La PCR, réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction), est une technique

permettant d'obtenir, à partir d'un échantillon d'ADN, d'importantes quantités d'une séquence
d'ADN spécifique.

Principe de la qPCR :
La PCR quantitative mesure le nombre d'amplicon (portion d'ADN définie par un couple d'amorces).

Elle permet de suivre en continu (« en temps réel ») le processus d'amplification PCR en détectant la
fluorescence.

Le profil d'une réaction PCR quantitative classique peut se décomposer en 3 phases :

 une première phase dite de bruit de fond : la quantité de fragment amplifié est
insuffisante pour générer un signal fluorescent supérieur au bruit de fond de l’appareil
 une seconde phase exponentielle de croissance : la quantité de fragment amplifié
génère un signal fluorescent supérieur au seuil de détection de l'appareil, puis le
nombre de produits amplifié double à chaque cycle. En coordonnées logarithmiques,
cette phase est représentée par une droite.
 une dernière phase de plateau : certains composants de la réaction (et en
particulier le nombre de molécules d’ADNpol Taq disponibles) deviennent limitant. Le
système ne permet plus une amplification exponentielle.

Le CT représente le « cycle seuil » qui est la valeur à partir de laquelle le signal est
supérieur à celui du bruit de fond.

La détection peut se faire à l'aide d’un agent intercalant comme le SYBR green, composé
organique fluorescent qui se lie aux acides nucléiques, ou de sonde marquée (sonde
d’hybridation) comme la sonde Taqman ou FRET.
Le principe de la sonde TaqMan repose sur l'activité exonucléase 5´–3´ de la Taq
polymérase qui clive une sonde marquée lors de son hybridation à la séquence
complémentaire permettant l'émission d'une fluorescence. Ce qui permet de suivre
l’amplification on utilisant un thermocycleur (qui possèdent la capacité de quantifier la fluorescence
présente in situ dans chacun des tubes à la fin de chaque cycle d'amplification)

Quantification d’une solution d’ADN par qPCR :

 Pour n’importe quel Ct on trouve la quantité d’ADN correspondante (N0).

On réalise la qPCR sur une série

de solution d’ADN de
concentration initialement connue
(N0) et pour chacune d’entre elles
on trouve les Ct. Ensuite on trace
la droite (Cti) en fonction du
logarithme des concentrations
d’ADN. On obtient donc la gamme
d’étalonnage suivante.

Pour la solution inconnue il suffit de la passer en PCR, de déterminer son Ct, puis la valeur
du Ct sera reportée sur la gamme d’étalonnage puis sur l’axe des x pour obtenir la
concentration de la solution inconnue.
Pourquoi doser l’ADN après son extraction ?
 Lorsqu’on utilise l’ADN dans une expérimentation on a besoin de savoir la
quantité précise d’ADN dont on dispose pour effectuer des calcules non
erronés.
 Dans le domaine de la recherche il est toujours question de répéter des
expériences en variant les réactifs du produit, quantifier l’ADN permet de
garder la concentration d’ADN constante ce qui est très utile a la validation
des résultats.
 Savoir que la quantité d’ADN va être suffisante ou pas avant de mener votre
étude.
 Maitriser votre concentration en ADN peut vous éviter de devoir renouveler
des extractions à chaque expérience. Vous gagnez du temps.
 Etre sûr d’utiliser le bon type d’ADN (simple brin ou double brin)