COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

S5
Chapitre III

PCR quantitative ou qPCR

Application de la qPCR dans le diagnostic du
COVID-19

Pr. Mohieddine MOUMNI

Année universitaire : 2020/2021
Traçabilité des molécules
 Traçabilité des molécules
1. Marquage de l’ADN en 5’

Le marquage de l’ADN simple brin suit le même principe

 Traçabilité des molécules
1. Marquage de l’ADN en 5’

1 2 1 2

Southern blot
+
autoradiographie

Image autoradiographique

 Dans le puits N°1 on met l’ADN non marqué.

 Dans le puits N°2 on met l’ADN marqué en position 5’ par le ³²P.
 On fait un southern blot.
 Après le southern blot, on applique un film d’autoradiographie, on
développe le film et on analyse les résultats.
 Traçabilité des molécules
1. Marquage de l’ADN en 5’

Remarque:
le film d’autoradiographie est sensible aux rayons radioactifs.
lorsqu’un rayon radioactif tombe sur le film, il provoque une tache noire.

Composition de la réaction de marquage de l’ADN en 5’.

 L’ADN à marquer
 (δ³²P)ATP
 Tampon
 Enzyme : polynuclétide kinase
 Traçabilité des molécules
2. Marquage de l’ADN en cours de synthèse

 On ajoute de petites séquences d’ADN

formées de 6 nucléotides
(hexanucléotides).
 Ce sont des séquences aléatoires qui vont
se fixer de manière aléatoire sur chacun
des deux brins de l’ADN matrice.
 On marque les dNTP en un seul (dCTP).
On va le marquer en position α.

Composition de la réaction de marquage.

 L’ADN matrice
 Les hexanucléotides
 Les dNTP avec (α ³²P)dCTP
 Tampon
 ADN polymérase I
 Traçabilité des molécules
2. Marquage de l’ADN en cours de synthèse

Remarque:
 Cette technique de marquage s’appelle: le marquage de l’ADN par
amorçage aléatoire.
 Cette méthode est utilisée à chaque fois qu’on dispose d’un ADN à
marquer ayant une taille supérieur à 150 bp
 Si l’ADN à marquer a une taille inférieur à 150 pb, on utilise le marquage
en 5’.
 Technique de la PCR en temps réel

Technique de la PCR en temps réel

La PCR en temps réel (qPCR) est une technique permettant la

visualisation, en temps réel, de l'amplification progressive
d'une réaction de PCR

La PCR en temps réel nous permet de mesurer de petites

quantités de séquences d'ADN contenues dans un échantillon
PCR conventionnelle VS PCR en temps réel (qPCR)

PCR CLASSIQUE qPCR

 Permet d'analyser une courte  permet la détection, la

séquence d'ADN en amplifiant un caractérisation et la quantification
segment sélectionné. d'acides nucléiques
 Technique qualitative.  Technique quantitative
 Produit détecté par  Produit détecté dans chaque cycle
électrophorèse sur gel d'agarose.
VS d'amplification
 Données collectées à la fin de la  Données collectées pendant la
réaction phase exponentielle de la réaction
 Prend plus de temps.  Prend moins de temps
PCR en temps réel (qPCR)
TECHNIQUE

Principe de la Technique Sybr Green

TECHNIQUE

Principe de la Technique Sybr Green

 Real-Time PCR
• Mesure en temps réel de la quantité de produits amplifiés (à chaque cycle)
• Détection des produits de PCR via la production d’un signal fluorescent

SYBRGreen (Molecular Probe)

• Marqueur fluorogénique
• Emission d’un fort signal fluorescent quand
liaison à l’ADN double brin après excitation

dsDNA

•Limite : Liaison à tout ADN double brin (pas

de spécificité)
TECHNIQUE

Le SYBR Green est un composé

organique aromatique de formule
chimique C32H37N4S faisant
partie des cyanines asymétriques
(fluorophores).

Formule chimique
TECHNIQUE

Principe de la Technique TaqMan

Sonde TaqMan

GCACTACATC
5’ 3’
 TECHNIQUE

Principe de Technique TaqMan

Etape 1 Dénaturation

5 3
GCACTACAT ’
’TAGCAC TAC ATCACTAGCATCTAC CTATCACCTAGCTAG
C GCACTACAT
GCACTACAT ATCGTGATGTAGTGATCGTAGATGGATAGTGGATCGATC C
C 3 5
’ ’
 Principe de Technique TaqMan
Etape 2 Hybridation

5 3
’T A G C A C T A C A T C A C T A G C A T C T A C C T A T C A C C T A G C T A G ’

TAGTGGATC 5
’ ATCTACCTAT
5 TAGCACTAC
’
ATCGTGATGTAGTGATCGTAGATGGATAGTGGATCGATC
3 5
’ ’
 Principe de Technique TaqMan
Etape 3 Polymérisation

5
’TAGCACTAC TCACTA CAT CTACCT
A A
ATCGTGATGTAGTGATCGTAGATGGATAGTGGATCGATC
3 5
’ ’
 Principe de Technique TaqMan
Etape 4 : Emission de fluorescence

5
’T A G C A C T A C A T C A C T A CC
AA A TC AT C
TC A C TAAT T
G
ATCGTGATGTAGTGATCGTAGATGGATAGTGGATCGATC
3 5
’ ’
 Real-Time RT-PCR
• Mesure en temps réel de la quantité de produits amplifiés (à chaque cycle)
• Détection des produits de PCR via la production d’un signal fluorescent

TaqMan (Applied Biosystems)

• Utilisation d’une sonde d’hybridation (Probe) :
> en 5’ un fluorochrome émetteur (Reporter)
(ex. FAM, 6-carboxy fluorocéine)

> en 3’ un fluorochrome suppresseur (Quencher)

(ex. TAMRA, 6 carboxy tetramethyl rhodamine)

• Lors de de l’étape d’élongation,

la Taq polymérase hydrolyse la sonde hybridée
du fait de son activité 5’exonucléase.

• Le Reporter est libéré de l’environnement

suppresseur du Quencher.

=> Emission de fluorescence directement

proportionnelle à la quantité de produit de PCR
 TECHNIQUES

Principe de la Technique TaqMan

Liste des Fluorophores

  

 

 

 



 


TECHNIQUES

Ct = nombre de cycles à partir duquel le produit devient

détectable

Cette quantification n’étudie donc pas la fin de la PCR et n’est donc pas affectée par les éléments
limitants identifiés lors de la phase du plateau. Ce concept de Ct est à la base de la précision et de
la reproductibilité de la technique.
CONCLUSION

Taq Man
Avantages de TaqMan :
• Une hybridation spécifique entre la sonde et la cible est nécessaire
pour générer un signal fluorescent
• Les sondes peuvent être marquées avec différents colorants
rapporteurs distincts, ce qui permet l'amplification et la détection de
deux séquences distinctes dans un tube à réaction
• Le traitement post-PCR est éliminé, ce qui réduit les coûts de la main-
d'œuvre et des matériaux

Inconvénients de TaqMan :
• Le principal inconvénient est que la synthèse de différentes sondes est
nécessaire pour différentes séquences.
 CONCLUSION

SYBR Green
Avantages de la méthode SYBR Green :

•Il peut être utilisé pour surveiller l’amplification de toute séquence d’ADN double
brin.
•Aucune sonde n'est requise, ce qui peut réduire les coûts de configuration et
d'exploitation du test, à condition que les amorces PCR soient bien conçues et que
la réaction soit bien caractérisée.

Inconvénient de la méthode SYBR Green :

Le principal inconvénient est qu’elle peut générer de faux signaux positifs; En

d'autres termes, étant donné que le colorant SYBR se lie à un ADN double brin, il
peut également se lier à des séquences d'ADN double brins non spécifiques.

Par conséquent, il est extrêmement important d'avoir des amorces bien

conçues qui n'amplifient pas les séquences non cibles et d'effectuer une analyse
par courbe de fusion.
 Par la chimie de Par la chimie de
détection « TaqMan » détection « Sybr Green »

 Eau
 MgCl₂  Eau
 Tampon  MgCl₂
 dNTP  Tampon
 Amorces  dNTP
 Sonde TaqMan  Amorces
 Taq polymérase  Sybr Green Dye
 ADN matrice  Taq polymérase
 ADN matrice
Application de la qPCR dans le
diagnostic du COVID-19
 Phylogénie et structure du SARS-CoV2
A. Structure virale :
le SARS-CoV-2 forme une particule sphérique d’un diamètre de 100-160 nm
composés d’ARN simple brin polarisé positivement et de cinq protéines de
structures: la protéine Spike sous forme trimérique qui se lie au récepteur
cellulaire, trois autres protéines transmembranaires (la glycoprotéine d’enveloppe
[E], de membrane [M] et l’Hémagglutinine-Esterase [HE]) et la protéine de
capside (N). La nucléocapside formée de l’ARN viral complexé à la protéine N
est enchâssée à l’intérieur de l’enveloppe. Génome viral: le gène réplicase (orf1a
et orf1b) code pour deux larges polyprotéines (pp1a et pp1b) clivées en seize
protéines non structurales incluant deux protéases et une ARN-polymerase ARN-
dépendante. Le reste du génome code pour les protéines de structures et de
multiples ORF via la transcription en ARN sous-génomiques.

B. Phylogénie simplifiée des coronavirus humains (HCoV).

Les HCoV faiblement pathogènes sont représentés en bleu et les HCoV
fortement pathogènes en rouge.
Pénétration et cycle virale du SARS-CoV2
 Pénétration et cycle virale du SARS-CoV2

C. Représentation de l’entrée du SARS-CoV-2 dans la cellule (principalement

le pneumocyte de type 2), et de son cycle de réplication.
Après fixation de la protéine S sur le récepteur ACE2 et activation par clivage de S par la
protéase membranaire TMPRSS2 (1), le complexe viral est endocyté. La fusion
membranaire libère la nucléocapside dans le cytosol (2) où le gène réplicase (orf1a et orf1b)
de l’ARN viral est traduit en polyprotéines pp1a et pp1ab (3). La protéolyse de ces
polyprotéines par la protéase encodée par orf1a (4) donnera les protéines formant un vaste
complexe de transcription et de réplication (5). Ce complexe protéique permet de reproduire
l’ARN génomique et, via la synthèse d’ARN sous-génomique, de former les protéines de
structures virales (6). Les nouvelles particules virales sont assemblées à partir de l’ARN
génomique, de la protéine de capside et des glycoprotéines d’enveloppe (7). La diminution
de l’expression membranaire d’ACE2 résultant de l’endocytose du complexe viral pourrait
activer localement le système rénine-angiotensine-aldostérone et aggraver les lésions
pulmonaires. Abréviations: ORF opening reading frame; TMPRSS2 Transmembrane
protease serine 2; ACE Enzyme de conversion de l’angiotensine; IEC inhibiteur de
l’enzyme de conversion; ARA2 inhibiteur du récepteur à l’angiotensine 2.
Diagnostic du COVID-19 par la
technique de qPCR
 Les étapes du diagnostic du
COVID-19
- Prélèvement d’un échantillon de la muqueuse nasale ou
buccale,

- Extraction des ARN totaux,

- Réaction de réverse transcription suivie d’une réaction

de qPCR au sein du même appareil,

- Interprétation des résultats.

 Réaction de Réverse Transcription (RT) :
principe général à partir de l’ARNm

Etape 1 : Reverse Transcription (RT) ou Transcription inverse

Synthèse d’un ADN complémentaire (ADNc) à partir de l’ARNm
catalysée par une reverse transcriptase, polymérase de l'ADN ARN-dépendante

Utilisation d’une amorce, ici primer Oligod(T)

AAAAA 3’ Oligo dT primer is

RT TTTTT 5’ bound to mRNA

AAAAA Reverse transcriptase (RT)

RT copies first cDNA strand
TTTTT
 RT-PCR
Etape 1 : Reverse Transcription (RT) ou Transcription inverse

• Utilisation d’une amorce :

- OligodT
- hexamère aléatoire (random)
- spécifique du transcrit
 Gènes cibles pour le diagnostic du
coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.

 Gènes cibles pour le diagnostic du
coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.

 Gènes cibles pour le diagnostic du
coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.

 Gènes cibles pour le diagnostic du
coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.

 Gènes cibles pour le diagnostic du
coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.

 Gènes cibles pour le diagnostic du
coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.