Université Kasdi Merbah Ouargla

Faculté des sciences de la nature et de la vie

Niveau : Master1 Biochimie Appliquée

Module: Technique d’analyse biologiques I

Les appareils des analyses

Présenté par : Encadrement par :

 Ben azza Aya *Dr /Chouana

Toufik

Année scolaire: 2021/2022

plant de travail:

1. La résonance magnétique nucléaire(RMN).

2. Rotavaporateur.
3. Microscope électronique à balayage(MEB)
4. spectrometre d'absorption atomique(SAA).
5. La spectrométrie de masse.
6. Lyphilisateur(Lyophilisateur crios)
 I.La résonance magnétique nucléaire(RMN) :
 Définition:
La résonance magnétique nucléaire (RMN) est fondée sur la mesure de
l'absorption de la radiation de radiofréquence (RF) par un noyau
atomique dans un champ magnétique fort.
L'absorption de la radiation pousse le spin nucléaire à se réaligner ou à
retourner dans la direction de la plus haute énergie. Après avoir absorbé
l'énergie, les noyaux atomiques réémettront une radiation RF et
retourneront à leur état initial de moindre niveau d'énergie.

Figure01: l'appareil de RMN

 Le principe :
 Le principe de la RMN est le suivant : les noyaux atomiques dotés d'un
nombre impair de protons, de neutrons ou des deux, auront un spin
nucléaire intrinsèque. Lorsqu'un noyau atomique avec un spin non nul
est placé dans un champ magnétique, le spin nucléaire peut s'aligner soit
dans la même direction soit dans la direction opposée au champ. Ces
deux types d'alignement de spin nucléaire sont caractérisés par des
énergies différentes, et l'application d'un champ magnétique facilite la
levée de dégénérescence des spins nucléaires. Un noyau atomique dont
le spin est aligné avec le champ aura une moindre énergie que lorsque
son spin est aligné dans la direction opposée du champ.
L'énergie d'une transition de RMN dépend de la force de champ
magnétique ainsi que d'un facteur de proportionnalité s'appliquant à
chaque noyau appelé rapport gyromagnétique. L'environnement local
autour d'un noyau donné dans une molécule a tendance à légèrement
perturber le champ magnétique local exercé sur ce noyau et à affecter
son énergie de transition exacte. Cette dépendance de l'énergie de
transition vis-à-vis de la position d'un atome particulier dans une
molécule rend la RMN extrêmement utile pour la détermination de la
structure des molécules.
La spectroscopie par RMN constitue l'un des plus puissants
instruments de détermination de la structure des espèces organiques
aussi bien qu'inorganiques. Cette technique s'est également montrée utile
dans la détermination quantitative des espèces absorbantes.
 Les applications:
Les domaines d'application sont très variés et concernent l'analyse
structurale des substances organiques en solution, la caractérisation des
matériaux organiques et inorganiques à l'état solide et l'imagerie par
résonance magnétique (IRM).
La RMN des liquides est un outil de base pour l'étude des petites
molécules organiques en solution, substances naturelles ou synthétiques,
et l'étude des macromolécules solubles (protéines, acides nucléiques,
polysaccharides, polymères synthétiques).
 La RMN des solides permet d'étudier des substances amorphes ou
faiblement cristallines telles que les verres et les polymères naturels ou
synthétiques insolubles ; c'est une technique très complémentaire de
cristallographie par rayons X. Une technique similaire est destinée à
l'étude d'échantillons hétérogènes très variés tels que les supports solides
pour la synthèse organiques ou les sols pour une caractérisation
environnementale.
L'IRM, telle qu'elle est pratiquée dans le cadre d'un laboratoire de
RMN conventionnel, peut être qualifiée de micro-IRM car elle est
adaptée à l'étude d'échantillons de la taille du centimètre avec une
résolution de quelques dizaines de micromètres. Elle est applicable à
l'étude des matériaux et des tissus biologiques, en particulier pour le
suivi au niveau tissulaire des stratégies thérapeutiques.
 l'appareillage :
d'un aimant à l'origine du champ Bo. Il s'agit d'un électro-aimant
constitué d'un solénoïde alimenté par un courant continu c-c stabilisé.
Lors du passage du courant, l'élévation de température (par effet Joule)
de l'aimant nécessite également la mise en place d'un circuit de
refroidissement de l'aimant. Ce circuit de refroidissement n'est pas
mentionné sur ce schéma. Pour des champs importants (à partir de 2
Tesla), on a recours à des cryoaimants utilisant des bobines
supraconductrices refroidies à l'hélium liquide. On ne voit plus alors la
bobine qui est insérée dans un énorme vase de Dewar, pour ces matériels
B0 est vertical.
 d'un émetteur-récepteur de radiofréquences RF. Cet émetteur
est constitué d'une bobine alimentée par un courant alternatif
(de fréquence égale à la fréquence de Larmor). Après
l'impulsion, cette bobine est utilisée en récepteur pour capter
le F.I.D.

 d'une bobine de découplage. Cette bobine, analogue à celle

constituant l'émetteur-récepteur RF permet de réaliser des
expériences de double irradiation, servant entre autres à
 supprimer des couplages spin-spin (expérience de
découplage). Nous verrons ce type d'expérience en
spectroscopie de RMN du 13C.
 d'un ordinateur. Cet ordinateur est couplé à l'émetteur-
récepteur et aux différents éléments constitutifs de
l'appareillage RMN. Il est à la fois chargé de piloter le
spectromètre, de stocker les F.I.D., d'assurer les
transformations de Fourier et de gérer la table traçante.
 d'une table traçante. Ce dernier élément permet l'obtention du
spectre sur support papier.
I. Rotavaporateur:
 Principe:
 Il s'agit ni plus ni moins d'une distillation simple : le liquide bout, les
vapeurs sont recondensées dans le réfrigérant et le solvant tombe dans le
ballon de récupération. Le soluté, en général solide dans ces conditions,
se dépose sur la paroi du ballon principal. La basse pression permet
d'abaisser la température d'ébullition du solvant, ce qui accélère
considérablement l'évaporation et évite tout risque de dégradation
thermique éventuelle du produit.

Figure02:Les cristaux
apparaissent sur la paroj
du ballon au fur et à
mesure que le solvant
s'évapore
 L'appareillage:
est composé de plusieurs
parties :
 un réfrigérant en spirale, équipé d'une prise de vide et d'un
robinet pour casser le vide,
 un ballon de recette pour le distillat, situé dans la partie basse
du réfrigérant,
 un moteur, qui assure la rotation du ballon évaporateur (en
forme de poire), par l'intermédiaire d'un tube rotatif
d'admission des vapeurs. Le ballon évaporateur contient la
solution dont on doit chasser le/les solvant(s),
 un bain marie, chargé de chauffer le ballon évaporateur (car
l'évaporation est un processus endothermique).
 Par mesure de sécurité, le réfrigérant doit être emballé d'un
filet en plastique, qui permet de limiter la dispersion des
morceaux de verre en cas d'implosion du dispositif. Le
chauffage du ballon évaporateur est assuré par un bain d'eau
thermostaté afin de ne pas imposer trop de contraintes
thermiques à l'appareillage. Le plus souvent, l'évaporateur
rotatif est installé sous une sorbonne, dont on baisse la vitre
durant la manipulation, afin de pallier à une éventuelle
implosion (ou explosion si le résidu sec obtenu s'avère être
très instable).
 Le mouvement de rotation permet de créer un film liquide sur
la surface interne au ballon évaporateur, afin d'augmenter la
surface de chauffe et d'évaporation et donc diminuer le temps
d'évaporation. La conduite de cette technique sous pression
réduite permet d'abaisser la température d'ébullition des
solvants, et donc réduire le temps de distillation, mais
également pour protéger les molécules sensibles des "hautes"
températures.
 Figure03:
L'appareil de
rotaevaporateur
I. microscope
électronique à balayage:
 Principe :
Le principe de la microscopie électronique transmission a été
proposé pour la première fois en Allemagne en 1935, par Knoll et von
Ardenne et développé par Zworykin, Hillier et Snyder dans les
laboratoires RCA aux Etats-Unis (1940). Elle a connu son véritable
essor dans les années 60, grâce aux progrès techniques de la
télévision et des détecteurs d'électrons (Oatley). Le microscope
électronique à balayage n'est pas proprement dit un microscope
conventionnel dans le sens optique du terme. En effet, il n'y a pas
formation d'une image par une lentille objectif comme cela est le cas
en microscopie optique et en microscopie électronique en
transmission mais l'image est formé de manière séquentielle en
balayant la surface de l'échantillon et en recueillant les particules
émises. Suivant le type de particules détectées , le microscope
électronique à balayage fournit des images différentes dont les
informations complémentaires.
 L'appareillage :
1. Pistolet à électrons : les pistolets à électrons ne sont pas
une arme futuriste utilisée dans le dernier film de Vin
Diesel. Au lieu de cela, ils produisent le flux constant
d'électrons nécessaires au fonctionnement des SEM. Les
canons à électrons sont généralement de deux types. Les
canons thermoioniques, qui sont le type le plus courant,
appliquent de l'énergie thermique à un filament
(généralement en tungstène, qui a un point de fusion
élevé) pour éloigner les électrons du canon et les diriger
vers l'échantillon examiné. Les canons à émission de
champ, en revanche, créent un champ électrique puissant
pour éloigner les électrons des atomes auxquels ils sont
associés. Les canons à électrons sont situés soit tout en
haut, soit tout en bas d'un SEM et tirent un faisceau
d'électrons sur l'objet examiné. Cependant, ces électrons
ne vont pas naturellement là où ils en ont besoin, ce qui
nous amène au prochain composant des MEB.
2. Objectifs : Tout comme les microscopes optiques, les
MEB utilisent des objectifs pour produire des images
claires et détaillées. Cependant, les lentilles de ces
appareils fonctionnent différemment. D'une part, ils ne
sont pas en verre. Au lieu de cela, les lentilles sont
constituées d'aimants capables de courber le chemin des
électrons. Ce faisant, les lentilles focalisent et contrôlent le
faisceau d'électrons, garantissant que les électrons se
retrouvent précisément là où ils doivent aller.
3. Chambre d'échantillon : La chambre d'échantillon d'un
SEM est l'endroit où les chercheurs placent le spécimen
qu'ils examinent. Étant donné que l'échantillon doit être
maintenu extrêmement immobile pour que le microscope
produise des images claires, la chambre d'échantillon doit
être très robuste et isolée des vibrations. En fait, les MEB
sont si sensibles aux vibrations qu'ils sont souvent installés
 au rez-de-chaussée d'un bâtiment. Les chambres
d'échantillons d'un MEB font plus que maintenir un
échantillon immobile. Ils manipulent également le
spécimen, le plaçant sous différents angles et le déplaçant
afin que les chercheurs n'aient pas à remonter
constamment l'objet pour prendre différentes images.
4. Détecteurs : Vous pourriez considérer les différents types
de détecteurs d'un SEM comme les yeux du microscope.
Ces dispositifs détectent les différentes manières dont le
faisceau d'électrons interagit avec l'objet échantillon. Par
exemple, les détecteurs Everhart-Thornley enregistrent les
électrons secondaires, qui sont des électrons délogés de la
surface externe d'un spécimen. Ces détecteurs sont
capables de produire les images les plus détaillées de la
surface d'un objet. D'autres détecteurs, tels que les
détecteurs d'électrons rétrodiffusés et les détecteurs de
rayons X, peuvent renseigner les chercheurs sur la
composition d'une substance.
5. Chambre à vide : les MEB nécessitent un vide pour
fonctionner. Sans vide, le faisceau d'électrons généré par
le canon à électrons rencontrerait une interférence
constante des particules d'air dans l'atmosphère. Non
seulement ces particules bloqueraient le chemin du
faisceau d'électrons, mais elles seraient également
projetées hors de l'air et sur l'échantillon, ce qui
déformerait la surface de l'échantillon.
 Figure04: microscope électronique à balayage

I.spectrometre d'absorption atomique :

 Principe:
 L'absorption atomique de flamme est une méthode qui permet de
doser essentiellement les métaux en solution. Cette méthode d'analyse
élémentaire impose que la mesure soit faite à partir d'un analyte
(élément à doser) transformé à l'état d'atomes libres. L'échantillon est
porté à une température de 2000 à 3000 degrés pour que les
combinaisons chimiques dans lesquelles les éléments sont engagés
soient détruites. La spectrométrie d'absorption atomique est basée sur
la théorie de la quantification de l'énergie de l'atome. Celui-ci voit son
énergie varier au cours d'un passage d'un de ses électrons d'une orbite
électronique à une autre : E = h. v où h est la constante de Planck et v
est la fréquence du photon absorbé ou émet. Généralement seuls les
électrons externes de l'atome sont concernés.
 Appareillage:
 Une colonne chromatographique capillaire d'une longueur de 30 m *
0,25 mm d.i., de type PE-5 dont la phase est d'une épaisseur de 0,25
um.

Figure05:  l'appareil de spectrometre d'absorption

atomique(SAA)
 I. La spectrométrie de masse :
 Principe:
L'analysepar spectrométrie de l'ionisation, généralement dans une
enceinte où règne un vide poussé d'échantillon, afin de créer des
ions ; ces espèces chargées sont alors soumises à l'action de champs
électriques et/ou masse repose sur (10-4Pa), d'une très petite quantité
magnétiques, suivant les appareils. L'étude des trajectoires suivies
permet de déterminer le rapport masse/charge des ions, donc
éventuellement leur nature. La représentation sous forme graphique
de l'abondance des ions sur la base. de leur rapport masse/charge
constitue le spectre de masse Celui-ci traduit la fragmentation, à
l'échelle statistique, du très grand nombre d'espèces individuelles qui
composent tout produit soumis à cette analyse. La méthode, d'une
extrême sensibilité, détruit l'échantillon.
La charge étant généralement égale à 1 pour les molécules ayant
une masse moléculaire < 1000 g/mol Le spectre classique dit de
fragmentation est sous forme de traits verticaux dont le plus intense
est appelé pic de base auquel on donne une valeur de 100. Toutes les
autres intensités étant calculées à partir de cet indice 100.

L'ionisation est de 3 types suivant la technique utilisée: Il'ionisation

par impact électronique, l'ionisation chimique positive et par
bombardement par atomes rapides (FAB). Les ions formés sont
ensuite accélérés puis séparés à l'aide d'un champ magnétique suivant
le rapport m/e. La détection est basée sur les mesures de charges
transportées par les ions... On ne détecte donc que les ions

 L'appareillage:

Nous décrirons un spectromètre de masse classique au sens

historique (secteur magnétique) dans la mesure où avec l'évolution
des techniques d'introduction et d'ionisation, un grand nombre de
nouvelles techniques se sont développées. Elles permettent de séparer
les ions et ainsi de les compter et de les “peser“. En effet, la molécule
ionisée doit être différenciée des molécules de masse différentes et
associée à toutes les molécules identiques. Nous sommes alors dans la
troisième performance attendue d'un spectromètre de masse : l'analyse
des ions. Construisons un spectromètre classique :
 Dans un premier temps, il faut introduire les molécules à analyser et
les ioniser : c'est la chambre d'ionisation. Dans cet exemple simplifié,
le composé est à l'état gazeux et à basse pression, maintenu par un
vide dynamique (des pompes sont en action en continue et
maintiennent l'ensemble du spectromètre à une très basse pression .
Le principe d' ionisation le plus ancien, toujours utilisé en routine et
de mise en œuvre aisée, est l'impact électronique ; comme nous
l'avons vu dans le chapitre d'introduction des électrons accélérer par
une ddp de v volts ont une énergie de v eV. Ces électrons rencontre
les molécules, les atomes et leurs électrons qu'ils arrachent lors d'un
impact.
 Figure 08:l'appareil de La spectrométrie de masse

I.Lyphilisateur (Lyophilisateur crios) :

De part sa technologie, le lyophilisateur de paillasse Crios -50°C

pour solvants aqueux ou -85°C pour solvants organiques répond aux
facteurs déterminant de la lyophilisation, à savoir : le froid dans le
piège, le chauffage et le vide. De ces trois points dépend le réussite de
l'opération et la qualité du produit.
 Points forts :
 Piège -50°C.
 0,053 à 0,1 m2 de surface d'exploitation par plateaux.
 Les plateaux chauffants permettant la chaleur nécessaire à
la sublimation des produits (optionnel).
 Possibilité de réguler le niveau de vide par vanne
d'aspiration (optionnel)
 Possibilité de bouchage sous vide pour lyophilisation en
vials
 Volume du piège important de 2 à 4 litres brut suivant
modèle.
 3 sondes de température produits pour le suivi, la sécurité
de la lyophilisation et l'optimisation du temps.
 Évaporateur serpentin en acier inox 316. Dégivrage rapide
par aspersion d'eau.
 Orifice d'écoulement pour faciliter de dégivrage du piège.
 Affichage digital, avec la température du piège, des
plateaux, et des produits.
 Affichage lumineux de l'alarme température, filtre et vide.
 Figure 09:Lyophilisateur crios

I.Références :

1. Daniel Canet .La RMN .concepts et méthodes.Inter

Editions .1991
2. .Orion, B33 - Michel ZANCA, 2009
3. .Spectral Database of Organie Compounds SDBS -
date d'accès 2013.
4. National Institute of Advanced Industrial Science and
Technology.
5. Laboratoire de Dynamique et Structure Moléculaires
par Spectrométrie de Masse Tour de Chimie
6. Françoise Brénon-Audat – Fondation Maison de la
Chumie – 2013
7. CREPC.ouargla.30/11/2021
8. http://dlecorgnechimie.fr
9. https://science.howstuffworks.com.
10. https://www.gci.ulaval.ca
11. https://fac.umc.edu.dz
12. http://www.foad.uadb.edu.sn
13. https://fmedecine.univ-setif
14. http://www.cryotec.fr/nos-produits/lyophilisateur/
crios.