MINISTÈRE DE L’ENSEI GNEMENT SUPÉRIEURET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUÉES ET TECHNOLOGIES

PROJET SPECTROSCOPIE
SPECTROSCOPIE DE RÉSONANCE MAGNÉTIQUE NUCLÉAIRE RMN

SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENCE

ANALYSE PAR GC/MS

DEPARTEMENT DE CHIMIE ET BIOLOGIE

4EME ANNÉE CHIMIE INDUSTRIELLE

Ismail Zitouni

Ines Touati

Fatma Laghmani

Nourelhoude Meliani
 SPECTROSCOPIE DE RÉSONANCE MAGNÉTIQUE NUCLÉAIRE RMN

I. PRINCIPE:

1. Fondements Physiques:

La RMN repose sur le concept de spin nucléaire. Les noyaux atomiques, composés de protons et
de neutrons, possèdent un moment angulaire intrinsèque appelé spin. Ce spin peut être visualisé
comme une sorte de rotation de la particule sur elle-même.

Lorsque ces noyaux sont placés dans un champ magnétique externe, le spin des noyaux peut
s'orienter de deux manières possibles : parallèle ou antiparallèle au champ magnétique. Ces
deux orientations ont des niveaux d'énergie légèrement différents, le niveau parallèle étant
légèrement plus bas en énergie que le niveau antiparallèle.
2. Résonance :

La résonance se produit lorsqu'une certaine quantité d'énergie est absorbée par les noyaux, les
faisant passer de l'état d'énergie le plus bas à l'état d'énergie le plus élevé, ou vice versa. Cette
transition d'énergie est possible lorsqu'une onde électromagnétique d'une fréquence spécifique
est appliquée au système.

La fréquence de résonance est directement proportionnelle à la force du champ magnétique

externe appliqué. Cette relation est décrite par l'équation de résonance de Larmor :

ω=γB0

Où :

𝜔 est la fréquence de résonance,

γest le rapport gyromagnétique, une constante spécifique à chaque noyau,

B0 est l'intensité du champ magnétique externe.

3. Spectroscopie RMN:

La spectroscopie RMN implique l'observation des transitions entre les niveaux d'énergie des
noyaux dans un échantillon. Pour obtenir un spectre RMN, plusieurs étapes sont nécessaires :

- L'échantillon est placé dans un aimant, créant un champ magnétique statique et uniforme.

- Des ondes radiofréquences (RF) de différentes fréquences sont appliquées au champ

magnétique. Chaque fréquence correspond à une transition spécifique entre les niveaux
d'énergie des noyaux.

- Lorsque la fréquence correcte est appliquée, les noyaux absorbent de l'énergie et changent
d'état, ce qui est détecté comme un pic dans le spectre RMN.
4. Interprétation des Spectres :

Les spectres RMN fournissent des informations précieuses sur la structure moléculaire. Les
caractéristiques principales d'un spectre comprennent :

- La position chimique, exprimée en parties par million (ppm), qui indique l'environnement
chimique du noyau.

- L'intensité des pics, qui est proportionnelle au nombre de noyaux contribuant au pic.

- Le couplage spin-spin, qui révèle les interactions entre les noyaux voisins et fournit des
informations sur la connectivité atomique de la molécule.

II. APPAREILLAGE

On dispose :

 d'un aimant à l'origine du champ Bo. Il s'agit d'un électro-aimant constitué d'un
solénoïde alimenté par un courant continu c-c stabilisé. Lors du passage du courant,
l'élévation de température (par effet Joule) de l'aimant nécessite également la mise en
place d'un circuit de refroidissement de l'aimant. Ce circuit de refroidissement n'est pas
mentionné sur ce schéma. Pour des champs importants (à partir de 2 Tesla), on a recours
à des cryoaimants utilisant des bobines supraconductrices refroidies à l'hélium liquide.
On ne voit plus alors la bobine qui est insérée dans un énorme vase de Dewar, pour ces
matériels B0 est vertical.

 d'un émetteur-récepteur de radiofréquences RF. Cet émetteur est constitué d'une

bobine alimentée par un courant alternatif (de fréquence égale à la fréquence de
Larmor). Après l'impulsion, cette bobine est utilisée en récepteur pour capter le F.I.D.

 d'une bobine de découplage. Cette bobine, analogue à celle constituant l'émetteur-

récepteur RF permet de réaliser des expériences de double irradiation, servant entre
autres à supprimer des couplages spin-spin (expérience de découplage). Nous verrons
ce type d'expérience en spectroscopie de RMN du 13C.

 d'un ordinateur. Cet ordinateur est couplé à l'émetteur-récepteur et aux différents

éléments constitutifs de l'appareillage RMN. Il est à la fois chargé de piloter le
spectromètre, de stocker les F.I.D., d'assurer les transformations de Fourier et de gérer la
table traçante.

 d'une table traçante. Ce dernier élément permet l'obtention du spectre sur support
papier.
Comment ça marche?

– Les échantillons à étudier sont dissous dans un solvant et introduits dans des tubes spéciaux.

– Le tube est introduit dans un spectromètre et arrive dans la sonde de mesure.

– L’opérateur introduit les commandes pour contrôler l’aimantation du noyau choisi.

– Ces commendes sont transmises à la console qui envoie le rayonnement dans la sonde de
mesure.

– Le signal émis par les noyau passe dans la sonde et la console et est récupéré par
l’ordinateur. – Les données brutes sont traité par l’ordinateur.
III. PARTIE EXPERIMENTALE: CARACTÉRISATION STRUCTURALE PAR RMN DE
MÉTABOLITES SPÉCIALISÉS CHEZ LE COLZA (BRASSICA NAPUS)

1. Mode operatoire:

Pour la caractérisation structurale, il a fallu des étapes supplémentaires de purification des

fractions semi-purifiées de la matiere vegetale. Cette étape s'est focalisée sur les deux
molécules d’intérêts (PHL_R13 et PHL_R18).

Figure 1 : Spectromètre RMN BRUKER 500 GHz (CRMPO)

- La console est une armoire électronique qui permet de récupérer et stocker les données.

- La station est un ordinateur qui permet de lancement des expériences et l'acquisition des
spectres-

- L’aimant est constitué d’une bobine supraconductrice responsable du champ magnétique B0.

Principales expériences effectuées en RMN liquide:

-1H: RMN du proton,

-JMOD: RMN du carbone 13,

-HSQC : connexion d’un carbone avec son hydrogène,

-HMBC connexion d’un carbone avec un’hydrogène voisin,

-COSY: connexion entre deux hydrogène à travers les liaisons,

-NOESY proximité entre deux hydrogènes dans l’espace

1) Les composés « PHL_R13 » et le « PHL_R18 » ont été repris dans 0,5 ml de méthanol deutéré
(MeOD), chloroforme deutéré, d’ACN deutéré, puis transféré dans un tube de RMN.

2) Les tubes ont été fermés avec un bouchon et placer un spinner11 avant de les injecter
séparément dans un spectromètre RMN Bruker 500 MHz avec une sonde BBFO 12

3) Nous avons effectué deux types d’expériences en RMN : les expériences dites une dimension
(1D) permettent d’identifier le nombre de noyaux d'hydrogène (RMN 1H) et carbone (RMN 13C
ou JMOD) dans la molécule. Les expériences dites deux dimensions (2D) permettent de voir les
différentes connexions entre ces noyaux (HSQC, HMBC, COSY, NOESY). La spectroscopie de
diffusion (DOSY) est une expérience 2D qui analyse le coefficient de diffusion de chaque
composé présent dans l’échantillon. En effet, les différents composés ne diffusent pas à la
même vitesse dans la solution. Les analyses ont été effectuées dans l’ordre suivant:

RMN 1H ou JMOD, COSY, HSQC, HMBC et NOESY

4) Le signal RMN obtenu par ces expériences est caractérisé par 4 paramètres:

La multiplicité (M) qui représente sa forme est définie par le nombre de raies et leur forme
(doublet, triplet, doublet de doublet…). La multiplicité d’un signal est influencée par la nature et
le nombre des noyaux voisins.

Le déplacement chimique (∂) qui est la fréquence à laquelle sort le signal exprimé en ppm. De
plus, la constante de couplage est la différence entre deux raies d’un même signal.

L’intégration qui mesure l’aire sous le pic d’un signal et donne le nombre de noyaux qui lui sont
associés

RQ: Un spinner est un support qui permet de placer un tube de RMN dans le spectromètre.

Une sonde BBFO est adaptable à tous les noyaux.

Les deux formules des deux ech sont : PHL_R13 = C13H15N5O5 ; PHL_R18 = C17H15N5O5
(Attribuées par spectrométrie de masse à haute résolution)

2. Interpretation des résultats :

Étant donné que les expériences ont été programmées une par une, les résultats de
caractérisation du composé PHL_R13 ont été obtenus progressivement.
Figure 2 : Spectroscopie de diffusion de l’échantillon contenant PHL-R13 qui présente 3 coefficients de diffusion

Figure 3: Spectre RMN 1H de l’échantillon contenant le composé PHL-R1

Les signaux encadrés en bleu correspondent au composé PHL_R13 tandis que les signaux
encadrés en orange correspondent au sulforaphane.

Tout d’abord, dans le dessein de caractériser les espèces transitoires par la détermination de
leurs tailles, nous avons effectué une spectroscopie de diffusion DOSY.

Cette analyse a révélé la présence de trois coefficients de diffusion distincts associés à notre
échantillon dont le premier de couleur verte est celui du solvant (MeOD) (Figure 17).

Ces résultats suggéré la présence d’au moins deux composés majoritaires dans notre
échantillon, ce qui est en accord avec les résultats de la spectrométrie de masse

En parallèle, de manière à déterminer le nombre d’hydrogène, nous avons effectué une RMN
de l’hydrogène.

Nous avons obtenu des signaux majoritaires dans la région des aliphatiques (entre 0 et 4 ppm)
dont l’intégration des différents pics n’était pas cohérente (Figure 18).

En effet, l’intégration mesure l’aire comprise sous un pic qui est proportionnelle au nombre de
noyaux qui résonnent.

Pour les signaux d’un même composé, la valeur de l’intégration est toujours très proche d’un
nombre naturel entier N (le nombre décimal est toujours très proche de 1 ou de 0 : < 0,1 et >
0,9).

L’obtention de valeurs d’intégration avec un nombre décimal proche de 0,5 confirme la

présence de deux composés dont les signaux se superposent.

En s’appuyant sur les résultats de la MS, nous avons cherché le spectre RMN du sulforaphane
dansla base de données NMRDB15. Ce dernier correspond parfaitement à une partie de notre
spectre RMN.

Une fois les signaux du polluant identifiés, nous nous sommes focalisés sur l’interprétation des
signaux du composé PHL_R13.

Tout d’abord deux doublets qui intègrent pour 3 hydrogènes chacun ont été repérés avec un
déplacement chimique de 0,99 et 1,02 ppm.

Ces deux signaux pouvaient être, soit des hydrogènes isolés les uns des autres, soit des méthyles
CH3).

NMRDB est une base de données qui permet prédire et d’annoter des spectres de RMN

En RMN de l’hydrogène, un doublet est un signal formé de deux raies identiques indiquant la
proximité d’unseul hydrogène.
 Figure 4 : Spectre HSQC du composé PHL-R13.

L’axe des abscisses représente les spectre 1H et l’axe des ordonnées représente le spectre 13C.
Le signal 1 H à 0,99 ppm est connecté au signal 13C à 20 ppm tandis que le signal 1H à 1,02
ppm est au connecté au signal 13C à 22ppm

Figure 5 : Spectre COSY du composé PHL-R13

Les axes des abscisses et des ordonnées représente le même spectre 1H. Corrélation des
signaux 1H à 0,99 ppm et 1H à 1,02 ppm avec le signal 1H à 1,85 ppm.
 3. Conclusions

Figure 6: Fragment du composé PHL_R13 constitué d’un amide greffé sur une leucine

Grâce à la HSQC (corrélation d’un H avec son C) qui a montré que chacun de ces doublets est
connecté à un seul carbone (Figure 19), nous avons pu conclure qu’il s’agit de deux méthyles
(2CH3). La multiplicité de ces deux signaux indique qu’ils se retrouvent tous les deux à proximité
d’un seul hydrogène voisin.

De manière à élucider la proximité entre deux atomes d'hydrogène, nous avons réalisé une
expérience COSY (corrélation H-H à travers les liaisons). Bien que la multiplicité de l’hydrogène
voisin n’était pas définie car son signal était superposé à celui du polluant et nous a permis
d'identifier cet hydrogène voisin (Figure 20).

De plus, la HSQC nous a révélé le carbone auquel il est directement connecté. De la même
façon, cet hydrogène est lié à un méthylène (CH2) lui-même connecté à un hydrogène.

Grâce à la COSY, nous avons obtenu que ce dernier est, d’une part, lié à un hydrogène qui n’a
pas de connexion avec un carbone qu'a révélé la HSQC, mais connexion à un carbonyle à été
dévoilé par la HMBC (connexion C avec un H voisin).

En s’appuyant une fois encore sur les résultats de la MS, ce signal ne pouvait être que celui de
l’hydrogène d’un amide (NH-C=O). D’autre part, la HMBC a montré que le CH est lié à
carbonyle (C=O) qui est lui-même à proximité d’un d'hydrogène très déblindé17 spécifique d’un
acide carboxylique (HCOO).

L’ensemble de ces informations nous donne une chaîne aliphatique constituée d’un amide
greffé sur une leucine dont la formule brute est : C7H12NO3

En plus de la chaîne aliphatique, les différentes expériences ont montré certains signaux dans la
région des composés aromatiques (6-8 ppm) dont 2 hydrogènes repérés en RMN 1H.

En RMN, un noyau déblindé désigne qu’il a un déplacement chimique très élevé dû en partie à
la présence d’un groupement chimique électro-attracteur.

Néanmoins, le signal très faible en JMOD ne permettait pas de détecter les carbones présents
dans cette région. Cela est dû en partie à la présence du polluant qui réduit la concentration
de notre échantillon d’intérêt dans le solvant. Par ailleurs, l’analyse du composé PHL_R18 a
montré un signal très faible. Cela est dû à la faible quantité analysée. Face à cette déception,

nous avons décidé de d’éliminer ces polluants

 SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENCE

I. INTRODUCTION À LA FLUORESCENCE :

1. Définition de la fluorescence :

- Domaine du spectre électromagnétique:

Proche ultraviolet : 200 à 400 nm

Visible : 400 à 800 nm

La fluorescence est un type spécifique de luminescence.

La fluorescence est la propriété de certains atomes et molécules qui leur permet d’absorber la
lumière à une longueur d'onde particulière (excitation : Ex) suivie d’une brève émission (Em) de
lumière à une longueur d’onde plus longue.

Les molécules qui fluorescent sont en majorité cycliques et rigides. On les appelle « des
fluorophores » ou « fluorochromes ».

La fluorescence implique une source de lumière externe pour exciter l’échantillon à une
longueur d'onde particulière. Lorsque la molécule est excitée à la longueur d'onde appropriée,
elle passe d’un état fondamental à un état excité. Lorsque la molécule retourne à l’état
fondamental, de l’énergie est libérée sous forme de chaleur (perte d’énergie) et de lumière à
une longueur d’onde plus longue et différente de celle d’énergie plus faible (Figure 3).
 2. Importance et applications de la fluorescence dans divers domaines :

Découverte pour la première fois de manière fortuite par George Gabriel

Stokes en 1852, la fluorescence est aujourd'hui au cœur de nombreuses
recherches et technologies. Elle est non seulement un sujet de curiosité pour
les scientifiques, mais elle trouve aussi des applications pratiques dans des
domaines aussi variés que la médecine, la biologie, l'ingénierie
environnementale et même l'art.

3. Objectif du projet :

L'objectif principal de ce projet est d'explorer le phénomène de fluorescence, en mettant

l'accent sur ses principes fondamentaux, ses applications en spectroscopie et en microscopie,
ainsi que les avancées récentes dans ce domaine.
 II. PRINCIPES FONDAMENTAUX DE LA FLUORESCENCE :

1. Explication du processus de fluorescence :

Le principe de la fluorescence est le suivant : L’énergie E d’un photon fait passer un électron
d’un état basal à un état excité. Il perd un peu d’énergie sous différentes formes (radiation,
conversion interne,…) avant de retrouver son état de repos en libérant l’énergie restante sous-
forme d’un photon. Ainsi, le photon libéré est moins énergétique que le photon incident.
D’après la loi de Planck, la longueur d’onde (couleur) est inversement proportionnelle à
l’énergie. Le photon émis a ainsi une plus grande longueur d’onde que le photon incident.

E = hc/ λ

avec c = 299 792 458 m/s

h = 6,626 17×10-34 J.s

Les électrons ne sont pas tous issus des mêmes sous-couches électroniques et ne seront pas non
plus sur la même couche ou sous-couche électronique une fois excités. De même, ils ne seront
pas sur la même sous-couche électronique après leur relaxation.

Pour chaque fluorochrome on peut établir un spectre de longueur d’onde capable de l’exciter
et un spectre de longueur d’onde de fluorescence. Ces spectres sont définis par plusieurs
caractéristiques :

une longueur d’onde d’absorption (excitation) et une longueur d’onde d’émission

(fluorescence) maximales, spécifiques pour chaque fluorochrome.

la longueur d’onde d’excitation est plus faible que la longueur d’onde de fluorescence (en
fluorescence monophoton)

une symétrie des spectres d’excitation et d’émission.

L’écart de Stockes = écart entre les valeurs maximales d’excitation et d’émission.

Plus l’écart de Stokes est grand, plus simple est la discrimination de la fluorescence.
III. APPAREILLAGE :
 1. SOURCE

La source d'un fluorimètre est polychromatique ce qui permet la sélection de la longueur

d'excitation parmi une large gamme spectrale. La plus courante est la lampe Xenon qui a une
gamme d'émission allant d'environ 250 nm à l'infra-rouge. Lampe Xenon

2. Les appareils de fluorescence possèdent en général 2 monochromateurs.

Comme en absorption, en fluorescence les molécules sont excitées par une lumière
monochromatique. Le monochromateur d'excitation permet donc la sélection précise de la
longueur d'onde excitatrice.

Afin de tracer le spectre d'émission de fluorescence, l'intensité de fluorescence est mesurée

séquentiellement. Le monochromateur d'émission permet quant à lui une lecture longueur
d'onde par longueur d'onde de l'intensité émise.

La sélection de la longueur se fait par déplacement du réseau.

 3. ECHANTILLON

Les échantillons sont placés dans des cuves en quartz par exemple.

L'émission de fluorescence a lieu dans toutes les directions. La détection se fait généralement à
90° par rapport à la source afin de ne pas "polluer" le signal avec la lumière excitatrice,
permettant ainsi la détection de signaux de faible intensité.
 4. MONOCHROMATEUR D'EXCITATION ET D'ÉMISSION

Les appareils de fluorescence possèdent en général 2 monochromateurs.

Comme en absorption, en fluorescence les molécules sont excitées par une lumière
monochromatique. Le monochromateur d'excitation permet donc la sélection précise de la
longueur d'onde excitatrice.

Afin de tracer le spectre d'émission de fluorescence, l'intensité de fluorescence est mesurée

séquentiellement. Le monochromateur d'émission permet quant à lui une lecture longueur
d'onde par longueur d'onde de l'intensité émise.

La sélection de la longueur se fait par déplacement du réseau.

5. DÉTECTEUR

La détection correspond au comptage des photons émis par

une molécule. Les photomultiplicateurs et les photodiodes

sont des détecteurs très courants en fluorescence.

Photomultiplicateur:
Comment ça marche?

Préparation de l'échantillon : Avant de commencer l'expérience, l'ingénieur prépare

l'échantillon à analyser : la purification de l'échantillon, la dilution dans un solvant approprié, ou
la préparation d'une solution ou d'une suspension contenant le fluorophore d'intérêt.
Il est important que l'échantillon soit préparé de manière à ce que le fluorophore soit présent
dans des conditions optimales pour la fluorescence.

Configuration de l'appareillage : L'ingénieur configure l'appareillage de spectroscopie de

fluorescence en sélectionnant les paramètres appropriés pour l'expérience. Cela comprend le
choix de la longueur d'onde d'excitation, la largeur de la fente d'excitation, la longueur d'onde
d'émission, la température de l'échantillon, etc.

Acquisition des données : Une fois l'appareillage configuré, l'ingénieur procède à l'acquisition
des données de fluorescence. Cela implique généralement d'exposer l'échantillon à la lumière
d'excitation ( une lampe à arc, une LED ou un laser) pendant un certain temps, puis de mesurer
l'intensité de la lumière fluorescente émise à différentes longueurs d'onde qui est mesurée par un
détecteur ( des photodiodes, des photomultiplicateurs (PMT), des caméras CCD (charge-
coupled device) ou d'autres types de capteurs ).
L'intensité de la lumière fluorescente émise est enregistrée à différentes longueurs d'onde à
l'aide d'un spectromètre ou d'un monochromateur. Ces données peuvent ensuite être utilisées
pour construire un spectre de fluorescence, qui montre l'intensité de la fluorescence en fonction
de la longueur d'onde.

Analyse des données : Une fois les données acquises dans un logiciel de contrôle, l'ingénieur
analyse les résultats pour extraire les informations pertinentes. Cela peut inclure la détermination
de la concentration du fluorophore, l'identification des pic de fluorescence, l'analyse des
spectres d'émission, etc.

Interprétation des résultats : L'ingénieur interprète les résultats de l'analyse pour tirer des
conclusions sur les propriétés de l'échantillon. Cela peut impliquer de comparer les données
avec des échantillons de référence, d'identifier des interactions moléculaires, ou de déterminer
des caractéristiques structurales ou fonctionnelles spécifiques.
 IV. PARTIE EXPERIMENTALE:

I. PRINCIPE:

En général, la solution étudiée est placée dans une cuve de quartz parallélépipédique de
section carrée (1 cm x 1 cm). La lumière fournie par une lampe au xénon traverse un
monochromateur dit d’excitation et arrive sur la cuve avec une intensité Io. L’échantillon émet
alors une fluorescence dans toutes les directions. Celle-ci est observée perpendiculairement à
l’excitation pour ne pas être gêné par la lumière incidente transmise dont l’intensité It est
beaucoup plus intense. Après passage dans un monochromateur dit d’émission, elle est
mesurée par un photomultiplicateur. On aboutit au schéma de principe:

II. materiels

Pour cette étude, nous utiliserons l’acide salicylique (acide 2-hydroxybenzoïque) et nous
terminerons par son dosage dans une spécialité pharmaceutique.

-Spectrofluorimètre Biotek Kontron SFM 25, équipé de cuves en quartz pour fluorescence,

- Spectrophotomètre UV-visible,

- Balance de précision à 0,1 mg,

- Béchers de 50 mL,

- Fioles jaugées de 20 mL et 50 mL,

- Pipettes graduées de 1 mL et de 1 mL graduée tous les 0,01 mL (ou mieux micropipette à

piston de volume réglable entre 200 μL et 1 000 μL),
- Acide salicylique 99 % (toxique), 9,6 les 100 g,

- Tampon phosphate pH = 7,00,

- Éthanol,

- Synthol

III. Spectre d’émission de fluorescence

Pour être dans les conditions de linéarité de l’intensité de fluorescence avec la concentration,
soit A ≤ 0,05, préparer une solution 10-5 mol.L-1 d’acide salicylique dans le tampon phosphate
0,01 mol.L-1. Tracer deux spectres d’émission, l’un après excitation à 310 nm et l’autre après
excitation à 290 nm. Dans cette opération, le monochromateur d’excitation est fixe et c’est le
monochromateur d’émission qui travaille.

Figure 7 : Spectres d’émission de fluorescence de l’acide salicylique 10-5 mol.L-1 (en vert λexc = 290 nm, en rouge λexc
=310 nm). Milieu tampon phosphate pH = 7.
 Figure 8 : Spectre d’absorption (bleu ) de l’acide salicylique de concentration 2,10-4 mol.L-1 (cuve d’épaisseur 1 cm).
Spectres d’excitation de fluorescence de l’acide salicylique 10-5 mol.L-1 ( vert λém = 400 nm, rouge λém = 430 nm).
Intensités de fluorescence en unités arbitraires (u.a.). Milieu tampon phosphate pH = 7.

IV. Interpretations

-Ils ont les mêmes caractéristiques (maximum à 409 nm et largeur à mi-hauteur de 57

nm). La forme du spectre de fluorescence ne dépend donc pas du choix de la longueur
d’onde d’excitation. Cette propriété est caractéristique de la présence d’un composé
fluorescent unique (différence avec un mélange ou avec la diffusion, voir ci-après). Ce résultat
est tout à fait en accord avec le diagramme énergétique de Jablonski dans lequel l’émission se
fait toujours à partir du niveau vibrationnel le plus bas de l’état excité.

- On vérifie bien que le spectre d’émission de fluorescence est déplacé vers les grandes
longueurs d’onde par rapport au spectre d’absorption.

Spectres d’excitation de fluorescence

- Avec la même solution, se placer à λém = 400 nm et tracer le spectre d’excitation.

Faire de même pour λém = 430 nm. Cette fois-ci, le monochromateur d’émission est fixe et c’est
le monochromateur d’excitation qui travaille. La forme du spectre d’excitation ne dépend pas
du choix de la longueur d’onde d’émission et ce pour la même raison que pour le tracé des
spectres d’émission. Le spectre d’excitation présente deux maxima à 298 nm et 236 nm, qui
correspondent à peu près aux maxima du spectre d’absorption (295 et 228 nm). A noter que le
maximum à 236 nm a une intensité beaucoup plus faible qu’à 298 nm, alors que la situation est
inverse pour le spectre d’absorption. Ce phénomène est dû à la chute rapide de l’intensité Io
de la lampe xénon au-dessous de 270 nm. Si on prend en compte les variations de Io, spectres
d’excitation et spectres d’absorption coïncident en général.
 ANALY SE GC/MS

I. PRINCIPE:

La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, abrégé CPG-SM,

ou GC-MS de l'anglais Gas chromatography-mass spectrometry, est une technique d'analyse
qui combine les performances de la chromatographie en phase gazeuse, pour la séparation
des composés d'un échantillon, et de la spectrométrie de masse, pour la détection et
l’identification des composés en fonction de leur rapport masse sur charge. Cette technique
permet d'identifier et/ou de quantifier précisément de nombreuses substances présentes en très
petites quantités, voire en traces.

1) Introduction de l'échantillon: La chromatographie en phase gazeuse (GC) est utilisée pour

séparer les composants volatils d'un mélange. Il fonctionne en chauffant un échantillon liquide
jusqu'à ce qu'il se transforme en vapeur pouvant être transportée par un gaz comme l'hélium ou
l'hydrogène. L’échantillon est introduit en tête de la colonne dans l’injecteur par une
microseringue. Le gaz (appelé gaz porteur ou phase mobile) transporte l’échantillon à travers
un tube long et mince en verre ou en métal (colonne) recouvert d’un produit chimique (phase
stationnaire). Au fur et à mesure que les composés vaporisés sont poussés à travers la colonne,
ils ralentissent lorsqu’ils interagissent avec la phase stationnaire et sont donc amenés à se
détacher les uns des autres en fonction de leur affinité avec cette phase. Une fois séparées, ces
différentes composantes sont détectées en sortie de colonne par un détecteur, le spectromètre
de masse. Les composantes sont alors introduites directement dans ce dernier qui est relié au
chromatographe.

2) Ionisation: Alors que la GC fournit des informations sur le temps de rétention et l’intensité
maximale, la spectrométrie de masse ajoute une troisième dimension: les informations de
masse. Les informations de masse peuvent être utilisées pour identifier, quantifier et déterminer
les propriétés structurelles et chimiques des molécules.
Le premier composant que les produits chimiques rencontrent dans le spectromètre de masse
est appelé source d'ions , où les molécules neutres éluées de la colonne GC sont ionisées. Une
source d'ions courante est une source d'ionisation électronique (EI) qui contient généralement
un filament métallique (la cathode), semblable au filament d'une ampoule. Lorsqu'une charge
électrique est appliquée au filament, celui-ci émet un flux d'électrons vers les composés
entrants, les brisant en fragments, dont beaucoup ont une charge positive. Les molécules qui ne
sont pas ionisées sont éloignées de la source par le vide poussé. Le motif des fragments
résultants agit comme une « empreinte digitale » hautement spécifique qui peut être utilisée
pour identifier le produit chimique.

Au sein de la source d'ions, une série d'électrodes appelées lentilles éloignent les molécules
chargées de la source et les dirigent vers un analyseur de masse quadripolaire (ou filtre de
masse) pour augmenter la sensibilité et la sélectivité. Un quadripôle est constitué de quatre tiges
auxquelles sont appliquées une tension continue et une radiofréquence. Diverses combinaisons
de ces forces garantissent que seuls des fragments d'une masse spécifique (appelée rapport
masse/charge ou m/z) parcourent le champ électrique du quadripôle vers le détecteur à un
moment donné.

3) Séparation des ions: Il s’agit maintenant de l’étape de séparation des ions qui se fait dans
l’analyseur de masse à quadripôle. Sous l’effet d’un champ magnétique, les ions vont osciller le
long de l’axe des z du filtre quadripolaire à une tension continue (U) et une tension alternative
(V) réglées par l’appareil afin que seuls les ions de rapport masse sur charge (m/z) choisis
puissent traverser le filtre quadripolaire et se rendre jusqu’au détecteur.
4) Détection des ions: La dernière étape est la détection des ions. À ce moment-là, les ions sont
récoltés sur un multiplicateur d’électrons. D’une part, le détecteur convertit les ions en signal
électrique (plus il y a d’ions, plus le courant est important). D’autre part, le détecteur amplifie le
signal obtenu ce qui permet le traitement informatique, c’est-à-dire l’obtention de spectre.

II. APPAREILLAGE :

a. L’injecteur :

L’injecteur est une zone chauffée où l’échantillon est introduit en solution au moyen d'une
seringue puis vaporisé et mélangé au gaz vecteur.

Le gaz vecteur, classiquement de l’hélium, constitue la phase dite "mobile".

Son rôle consiste à véhiculer les analytes depuis l’injecteur jusqu’au détecteur via la colonne
analytique. La viscosité d’un gaz variant avec la température, la plupart des
injecteurs sont aujourd’hui équipés d’un régulateur électronique de débit. Ce dernier aju
ste la pression du gaz en fonction de la température, de manière à ce que le débit gazeux
dans la colonne soit constant, ce qui améliore considérablement les performances du
chromatographe.

Il existe deux familles d’injecteurs. La première regroupe les injecteurs dits "à fuite". Le mode
d’injection le plus répandu est l’injection en "split" ou injection avec "division de flux", il est utilisé
pour l’analyse de solutions concentrées. L’injection se fait à haute température. L’échantillon est
rapidement introduit dans l’injecteur où il est instantanément vaporisé et mélangé au gaz
vecteur. Une électrovanne permet de régler le débit de fuite. Ce procédé permet de faire en
sorte qu’une fraction importante du flux gazeux soit évacuée, diminuant ainsi la quantité
d’échantillon qui pénètre dans la colonne et évitant ainsi de saturer la phase stationnaire (voir
ci-dessous).
 La seconde famille regroupe les injecteurs "sans fuite". L’injection "splitless", ou "sans
division de flux", est utilisée pour introduire des analytes en solution diluée. L’électrovanne est
fermée pendant les quelques dizaines de secondes qui suivent l’injection, de manière à
ce qu’une quantité maximum d’analyte pénètre dans la colonne. Elle est ensuite ouverte pour
purger l’injecteur d’éventuels résidus. L’échantillon est injecté à une
température telle que solvant et solutés sont instantanément vaporisés à l’entrée de la
colonne. Pendant l’injection, la température du four est inférieure de 20 à 30°C à la
température d’ébullition du solvant afin de condenser ce dernier en tête de colonne
et de piéger les molécules. Dans un premier temps, le solvant joue le rôle de phase
stationnaire vis-à-vis des différents constituants du mélange. Sa polarité doit donc être
compatible avec celle de la phase stationnaire de manière à ce que le solvant se répartisse de
façon homogène en tête de colonne. En raison de son pouvoir de rétention important, cette
phase condensée permet de ralentir les molécules volatiles jusqu'à ce qu'elle soit entraînée par
le gaz vecteur. Plus performante
que le "splitless" en terme de répétabilité et de sensibilité,
l'injection "on column" consiste à introduire directement l’analyte en solution dans la colonne
ou dans une précolonne dont la fonction est de permettre l'injection d'un grand volume
d'échantillon et/ou de protéger la colonne analytique d'éventuels polluants matriciels..
L'injection s'opère le plus souvent "à froid" : l’échantillon est introduit à l'état liquide en tête de
colonne avant d’être rapidement vaporisé et condensé. A chaud, en effet,
l’expansion brutale du volume de la
solution injectée entraînerait dans la colonne une surpression telle que le gaz refluerait v
ers l’injecteur.
b.Le four et la colonne capillaire :

Le four contient l’élément clé de la séparation chromatographique : la colonne analytique. De

nos jours, les colonnes utilisées en GC-MS sont des colonnes dites "capillaires". La colonne est
constituée d'un tube de silice fondue dont la

paroi interne est couverte d’un film chimique nommé "phase stationnaire" ; la paroi externe est
gainée d’un revêtement en polyimide qui confère souplesse et robustesse à la colonne. La
phase stationnaire est caractérisée par les fonctions chimiques greffées sur la silice. Si ces
dernières sont peu polaires (chaînes alcanes ou groupements phényles, par exemple), la
colonne est dite "peu polaire". Si, au contraire, la phase stationnaire est constituée de composés
polaires tels que, par

exemple, des polyéthylènes glycols, la colonne est dite "polaire". Les constituants d’un mélange
sont séparés en fonction de leur polarité si la phase stationnaire est polaire, de leur volatilité si
cette dernière est apolaire ; leurs différences de propriétés physicochimiques leur confèrent des
vitesses d’élution différentes et ils sont donc séparés en fonction du temps. Confronté à un
mélange mixte, on privilégie souvent le choix d'une colonne peu polaire, les phases stationnaires
peu polaires étant

généralement plus robustes et thermiquement beaucoup plus stables que leurs homologues
polaires. En plus de la nature de la phase stationnaire, la colonne capillaire est caractérisée par
trois paramètres géométriques : sa longueur (de 10 à 100 m), son diamètre interne (de 0,1 à 0,5
mm), l’épaisseur de sa phase stationnaire (de 0,1 à 5 µm) ; chacun exerce une influence
déterminante sur la qualité de la séparation. La plupart des applications de GC-MS utilisent des
colonnes de 25 à 30 m.Augmenter l'épaisseur de la phase stationnaire augmente les
interactions entre celle-ci et les solutés,ce qui améliore la séparation chromatographique mais
augmente la durée de l'élution donc de l'analyse. On choisit généralement une épaisseur de
film importante lorsque l'on souhaite séparer des composés très volatils. L'augmentation du
diamètre interne permet de raccourcir les temps d'analyse mais se traduit par une diminution de
l'efficacité.La colonne capillaire est placée dans un four car les interactions entre les composés
et la phase stationnaire sont fonction de la température. Augmenter cette dernière favorise
l’élution des composés et diminue ainsi les temps d’analyse.
La colonne capillaire sort du chromatographe et entre dans le spectromètre de masse via une
"ligne de transfert’’. Il s’agit d’un cylindre intensément chauffé (environ 300°C) de manière à
éviter que les molécules éluées ne se recondensent entre les deux appareils.

c. La source:

La source est la partie du spectromètre de masse où sont produits des ions gazeux à partir des
molécules introduites. En couplage avec un chromatographe

en phase gazeuse, où les composés élués arrivent au spectromètre à l’état gazeux, les sources
utilisées sont dites à "ionisation électronique" ou à "ionisation chimique"; on parle d’"EI" pour
"Electron Ionization", de "CI" pour "Chemical Ionization". Leur usage est réservé à l’analyse des
composés gazeux ou facilement volatilisables (point d’ébullition n’excédant pas 400°C). La
source est maintenue à une température élevée (généralement comprise entre 100 et 250°C)
pour éviter la

condensation des analytes. L’ionisation électronique consiste à "bombarder" les molécules par
un faisceau d’électrons de haute énergie. Les électrons sont produits par le chauffage d’un
filament métallique (tungstène ou rhénium, le plus souvent) et accélérés par une différence de
potentiel de 70 V, ce qui leur confère une énergie cinétique de 70 eV. Le fait de disposer d’un
standard mondial pour l’énergie des

électrons ionisants permet de comparer des spectres de masse réalisés sur différents appareils et
d’avoir recours à des bases de données (comprenant plusieurs dizaines de milliers de spectres)
dispensant d’interpréter les spectres obtenus pour identifier les analytes. Les algorithmes de
recherche extraient des bases de données les composés dont les spectres de masse
ressemblent le plus au spectre étudié et il est parfois difficile de trancher entre les solutions
proposées. Les bases de données ne sont évidemment efficaces que si les spectres des
composés étudiés y sont répertoriés. Lorsque ça n'est pas le cas, l'analyste doit tenter
"d'interpréter" le spectre de masse, ce qui est souvent difficile.
d. L’analyseur:

Les analyseurs sont caractérisés par quatre paramètres : la résolution, la vitesse de balayage, la
gamme de rapports masse/charge balayée et la transmission. La résolution traduit la précision
sur la mesure des rapports m/z des ions. Celle d'un analyseur dit "quadripolaire" est liée à sa
vitesse de balayage en m/z : plus le balayage est rapide et moins bonne est la résolution. Avec
un tel analyseur, on travaille le plus souvent avec une vitesse de balayage très élevée
(jusqu'à 6000

Thomson par seconde) et une résolution unitaire ; cela signifie que les rapports m/z des ions sont
donnés sans chiffre après la virgule. En balayant beaucoup moins vite, on ne pourrait accéder
qu’à deux chiffres significatifs sur la mesure des m/z, ce qui ne présente pas un grand intérêt en
GC-MS dans la mesure où un rapport m/z avec deux chiffres significatifs ne permet pas de
déterminer une formule brute.

Il existe deux catégories d’analyseurs quadripolaires ; la première regroupe les quadripôles, la

seconde est constituée des trappes ioniques (encore appelées "pièges à ions") :

Quadripôles:

Comme le montre la figure 6, un quadripôle est systématiquement associé à un système

d’extraction et de focalisation des ions produits en source. Il s’agit le plus souvent d’un hexapôle
ou d’une lentille électrostatique (analogue électrique d’une lentille optique). Le quadripôle est
constitué de quatre électrodes métalliques parallèles raccordées électriquement deux
à deux, de section idéalement hyperbolique. Ces électrodes sont cylindriques et longues de
douze à vingt centimètres selon les modèles. L'application d’un potentiel de type U+Vcosωt
crée un champ quadripolaire entre les électrodes. Deux électrodes symétriques par rapport à
l’axe central du quadripôle sont portées à un potentiel de type U+Vcosωt, les deux autres au
même potentiel mais de signe opposé (U-Vcosωt). U et Vcosωt sont, respectivement, les
composantes de tension continue et de tension

alternative du potentiel de radiofréquence. V et ω sont, respectivement, l'amplitude et la

pulsation de la tension alternative. Dans la pratique, le quadripôle fonctionne comme un
filtre à ions: on fait varier simultanément les valeurs de U et de V de manière à ce que les ions
produits par la source soient stables à tour de rôle. A un instant t donné, ne sont détectés que
les ions d’un m/z donné. Les autres

ions vont heurter les électrodes ou les parois internes du spectromètre ; ils se déchargent et sont
entraînés par le système de pompage.

Trappes ioniques:

Il existe deux types de trappes ioniques en couplage GC-MS. Lorsque les ions sont produits dans
une source analogue à celle d’un quadripôle avant d’être introduits dans la trappe, on parle
de "trappe ionique à source externe". Lorsque les ions sont directement produits au cœur de la
trappe (la colonne chromatographique "arrive" dans la trappe), cette dernière joue tour à tour
le rôle de source et d'un analyseur ; on parle alors de "trappe ionique à ionisation interne". Une
trappe ionique est

constituée de trois électrodes métalliques: une électrode annulaire et deux électrodes dites
"chapeaux". Des "séparateurs" ou "spacers" en forme d’anneau jouent le rôle d’isolants
électriques entre ces électrodes. Les deux électrodes chapeaux sont percées en leur centre,
l'une pour permettre l'introduction séquentielle d’électrons ou d’ions (selon que l’ionisation est
interne ou non),

l'autre pour permettre l'éjection des ions vers le détecteur. Contrairement au quadripôle, la
trappe ionique possède la capacité de stocker les ions.
e. Le détecteur:

Le rôle du détecteur est double : détecter les ions proportionnellement à leur nombre et
amplifier le courant correspondant (de l’ordre de 10-12 Ampères) pour le rendre détectable
par l’électronique du système. La plupart des appareils de GC-MS sont équipés de détecteurs
de type "chaneltron". Un "chaneltron" présente la forme d’un

entonnoir courbe ou d’une corne d’abondance. L’intérieur est enduit d’un alliage plomb/oxyde
de plomb qui a la propriété d’émettre des électrons sous l’effet d’un choc. Une différence de
potentiel de 1000 à 3000 V est appliquée entre l’entrée et la sortie de l’entonnoir. Lorsqu’un ion
vient heurter la paroi interne, il y a émission d’électrons qui, accélérés par la différence de
potentiel, rebondissent de part et d’autre de la paroi. Chaque choc décroche de nouveaux
électrons qui sont eux-même accélérés ; on parle de "cascade électronique". Un "chaneltron"
fournit un gain de l’ordre de 105; c'est à dire que l’arrivée d’un ion est traduite par un courant
de 105 électrons.
III. PARTIE EXPERIMENTALE: ANALYSE GC-MS DES PHTALATES:
COMPARAISON DE 7 PHASES STATIONNAIRES

Les phtalates, largement présents dans notre environnement, exigent un contrôle en raison de
leurs effets néfastes potentiels sur la santé humaine. La chromatographie en phase gazeuse
(GC) est privilégiée pour séparer ces composés, avec des modes de détection tels que la
capture d’électrons, l’ionisation de flamme et la spectrométrie de masse (GC-MS). Dans cette
étude, le logiciel Pro EZGC a été utilisé pour optimiser les conditions de l'analyse GC-MS des
phtalates, en identifiant la meilleure phase stationnaire parmi sept examinées.

Les phtalates sont associés à diverses pathologies, et leur utilisation est réglementée par des
organismes tels que l'Union européenne et l'EPA. La GC-MS est préférée pour leur analyse en
raison de sa simplicité et de sa rapidité. Cependant, les similitudes structurelles des phtalates
rendent leur identification et quantification difficiles, d'où la nécessité de colonnes
chromatographiques optimales. Le logiciel Pro EZGC a été utilisé pour créer une bibliothèque de
37 phtalates, permettant d'optimiser les conditions analytiques pour chaque phase stationnaire.
Les résultats ont montré que les colonnes Rtx-440 et Rxi-XLB offraient la meilleure résolution pour
les 37 phtalates étudiés. Des différences dans l'ordre d'élution ont été observées avec d'autres
colonnes, mais ces deux colonnes ont pu séparer efficacement tous les phtalates répertoriés.
Malgré certaines difficultés à résoudre complètement les isomères, notamment dans les
mélanges d'isomères de grade technique, les ions spécifiques ont permis leur identification et
quantification.En conclusion, cette étude a démontré l'efficacité de la GC-MS pour l'analyse
des phtalates, avec des recommandations spécifiques concernant les phases stationnaires pour
obtenir les meilleures séparations.Voici les parametres de la GC/MS
 Temps de rétention prévus par le

logiciel Pro EZGC avec une colonnes Restek

Une étude exhaustive comparant les performances

des sept phases stationnaires pour la séparation de 37
phtalates a été menée en utilisant les temps de
rétention prédits par le logiciel Pro EZGC. Les conditions
analytiques spécifiées ont permis de séparer 34 des 40
pics avec les colonnes Rtx-440 et Rxi-XLB en moins de
40 minutes, malgré des différences dans l'ordre
d'élution entre les deux phases. Un chromatogramme
représentatif obtenu avec la colonne Rtx-440 est
présenté.

Bien que certaines paires de pics n'aient pas été

résolues à la ligne de base, la résolution était suffisante
pour une analyse qualitative. Il n'a pas été possible de
trouver des conditions analytiques optimales pour
toutes les phases. Le programme générant les meilleurs
résultats en termes de durée d'analyse et de nombre
de pics résolus a été sélectionné pour cette
comparaison, sachant que ces conditions peuvent
être affinées avec le logiciel Pro EZGC pour d'autres
composés.

En tenant compte des durées d'analyse et des

séparations obtenues, les colonnes Rtx-440 et Rxi-XLB se
distinguent comme les meilleures options pour l'analyse
des phtalates.