REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE AKLI MOHAND OULHADJ DE BOUIRA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE et SCIENCE DE LA
TERRE

Spécialté : Biotechnologie

Module : Methodes scientifique et

technique d’etude vivant
Groupe 2

Groupe : 2

Thème

Présenté par :

 Chelali Abdel moumen

 Coupes histologiques

Microscope photonique
- La préparation d'une coupe histologique permet l'étude des tissus en y apportant aussi peu
de changements que possible elle consiste à confectionner des coupes c'est à dire des tranches
très fines d'organes de tissus destinés à être observées par transparence

Dissection

-L'animal est anase y est on dissèque aussi rapidement que possible organe a étudié ici une
portion d'intestin

Fixation

-Afin d'éviter l'autolyse l'échantillon est immédiatement plongé dans un liquide fixateur
contenant de l’aldehyde afin de précipiter les constituants cellulaire et de les durcir

Déshydratation

-L'échantillon est ensuite déshydraté dans des bains d'alcool croissant de 30 à 100 % en
éliminant ainsi toute trace d'eau pour pouvoir immergé ensuite la pièce dans une résine ici la
paraffine non miscibles à l'eau en effet pour pouvoir réaliser des coupes régulière dans des
tissus il faut inclure l'échantillon dans un bloc solide à la température de coupe l'échantillon
est ensuite éclaircies dans le méthyle cyclohexane un solvant de la résine puis il y as
substitution du méthyl cyclohexane part de la paraffine fondu à 58 degrés celsius

Imprégnation

- L'imprégnation de l'échantillon par la paraffine à 58 degrés celsius durera de 2 à 6 heures

Inclusion

-L'imprégnation terminer un moule est rempli de paraffine une étiquette est mis au fond du
bloc puis l'échantillon est appuyé dans la résine ou paraffine en faisant attention à son
orientation dans le moule

-Une fois durcie à température ambiante le bloc et démouler et taillé afin d'avoir un front de
coupe à bord parallèle

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 -Le bloc ainsi taille et va être placé sur un porte objets lui-même fixé sur un microtom afin
d'obtenir des coupes d'épaisseur régulière entre 1 et 5 micromètres le bloc est débité sur un
couteau ou lame de rasoir les coupes obtenu ce col l'une à l'autre et sont déposés sur une lame
de verre à ce stade de la manipulation l'observation de la coupe au microscope n'apporte que
peu d'informations c'est pourquoi une coloration est nécessaire cependant à ce stade les
coupes sont hydrophobe alors que les colorants sont aqueux

Déparaffinage

-Donc les coupes sont déparaffines et dans des bains de méthyle cyclohexane puis hydrater
par des bains d'alcool decroissants et a mené à l'eau avant d'être plongé dans une ou plusieurs
solutions de coloration

Montage

-Pour pouvoir être observée les coupes sont ensuite recouvertes d'une lamelle de verre sur
laquelle a été déposée une goutte de milieux de montage la coupe est maintenant prête pour
l'observation au microscope photonique

Observation

-Pour cela les coupes sont éclairées avec une lumière blanche est observée à travers
différents objectifs permettant d'obtenir différents grossissement ainsi on visualise les
villosités intestinales avec un objectif grossissante dix fois à plus fort grossissement on peut
voir les villosités le tissu conjonctif riche en collagène colorés en bleu .

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 microscopie électronique à transmission

-L'étude de l'organisation et du fonctionnement de cellulaires requiert une connaissance

approfondie de la cellule et de ces organismes c'est pourquoi l'utilisation du microscope
électronique à transmission est indispensable pour atteindre la résolution nécessaire

Dissection

-Afin d'être observé les échantillons doivent subir des traitements particuliers qui leur
permettront de résister au vide poussé et aux faisceaux d'électrons du microscope nous allons
voir quelle préparation doivent subir les échantillons ici l'intestin de souris pour être ainsi
observé

Fixation

-L'organe prélevé est placée immédiatement dans un fixateur ici le glutaraldéhyde qui fixe
les protéines les sucres et les acides nucléiques cette fixation par réticulation des
macromolécules permet d'éviter la lisent et la perte de substance ceci afin de conserver les
structures pour améliorer la pénétration du fixateur et faciliter les étapes suivantes
l'échantillon est réduit en fragments d'environ un millimètre cube lorsque l'organe présente
une orientation particulière les fragments sont découpées en bandelettes d'un mm de large de
manière à pouvoir ensuite c'est les orienter pour réaliser des coupes transversales ou
longitudinal

Post fixation

-Une étape supplémentaire de postes fixation au tétroxyde d’osmium et nécessaire afin de

fixer les lipides observé que les échantillons deviennent noirs au contact de l'osmium

Déshydratation

-Les échantillons sont ensuite déshydraté dans des bains successives d'alcool de plus en plus
concentré de 30% jusqu'à 100 % d'alcool afin d'éliminer toute trace d'eau

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Substitution

-Pour pouvoir réaliser des coupes ultra fine des tissus les échantillons doivent être inclus
dans une résine initialement fluide qui deviendra un bloc dur ultérieurement pour ceux ci les
échantillons sont placés dans un bain de substitution composé d'alcool 100% et de résine.

Imprégnation

-Puis ils sont longuement imprégnée dans la résine seul .

Inclusion

-Enfin les échantillons sont placés dans des moules que l'on remplit de résine pur contenant
un agent polymérise ans les fragments non orientés sont inclus dans des gélules alors que pour
les tissus orienté on utilise des moules à plat une étiquette portant la date et la nature de
l'échantillon est placé dans le moule les inclusions sont inclus à 37 degrés puis à 60 degrés
pendant plusieurs jours à l'aide d'un couteau de vert sur lequel une petite cuvette est scellé
après avoir fixé le couteau la cuvette est remplie d'eau distillée et le couteau est lentement
approché de l'échantillon afin de réaliser les premières coupes qui flotteront à la surface de
l'eau les coupes d'environ 1 micromètres d'épaisseur apparaissent irisé à la surface de l'eau
elles sont récupérées sur des lames de verre coloré est observé au microscope photonique les
détails de l'architecturé cellulaires sont visibles comme le noyau ainsi que des organites dans
le cytoplasme si la qualité est l'orientation des tissus sont satisfaisantes des coupes ultra fines
sont alors réalisées au couteau de diamants exactement de la même manière qu'avec le
couteau de verre ces nouvelles coupes de moins de 100 nanomètres d'épaisseur apparaissent le
double traitement permet d'augmenter la densité aux électrons des différentes structures et
ainsi d'améliorer le contraste les échantillons sont enfin prêts à être observé

Observation

- le microscope électronique est constitué d'un tube aux parois épaisses dans lequel réaliser
un vide poussé car les électrons sont vite arrêté par l'air à l'extrémité supérieure de ce tube
arrive le courant à haute tension un canon à électrons et mais un flux d'électrons sous l'effet
du chauffage d'un filament les électrons sont arrêtés sous une différence de potentiel de l'ordre
de 100 kgv vers une anode perforé le faisceau ainsi obtenus à travers cette perforation est
focalisée par un système de deux condenseur ou lentilles électromagnétiques l'image de l'objet
se forment sur l'écran fluorescents remarquer à faible grossissement le quadrillage dessiné par

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la grille métallique sur laquelle sont déposés les coupes grâce à des commandes extérieures la
grille est déplacé selon deux direction perpendiculaire le grossissement peut être modifiée par
paliers successifs les zones intéressantes sont numérisés puis étudié ainsi l'utilisation de
techniques comme celle que nous venons de voir permet de décrire avec de plus en plus de
précisions l'ultra structures cellulaires sur ces bases la biologie cellulaire et la biologie
moléculaire mèneront à mieux comprendre le fonctionnement des cellules normales et
pathologiques

Différences entre le microscope optique et électronique

-La principale différence entre le microscope optique et le microscope électronique réside
dans leur méthode d’illumination et d’agrandissement. Le microscope optique utilise la
lumière visible pour éclairer l’objet d’étude, tandis que le microscope électronique utilise un
faisceau d’électrons pour l’illuminer. En outre, le microscope optique peut agrandir jusqu’à
1000x, tandis que le microscope électronique peut atteindre des agrandissements de plus de
100 000x. Les microscopes optiques sont généralement plus abordables et plus portables que
les microscopes électroniques, car ils sont généralement moins complexes et plus petits.

-La résolution et l’agrandissement sont des facteurs importants à considérer lors de

l’utilisation d’un microscope. Les microscopes optiques sont limités à une taille maximale
d’environ 1000x, tandis que les microscopes électroniques peuvent atteindre des
agrandissements de jusqu’à 1 million de fois. En outre, la résolution des microscopes optiques
est limitée à environ 0,2 microns, tandis que les microscopes électroniques peuvent fournir
une résolution allant jusqu’à 0,002 microns. Cela signifie que les microscopes électroniques
sont capables de détecter des objets plus petits et plus détaillés que les microscopes optiques.

-Les microscopes optiques et électroniques diffèrent par le type de source de lumière et

d’énergie qu’ils utilisent. Les microscopes optiques utilisent une source de lumière visible, ce
qui permet à l’utilisateur de voir directement l’objet à l’œil nu. Les microscopes
électroniques, en revanche, utilisent une source d’énergie électrique pour illuminer l’objet, ce
qui permet à l’utilisateur de voir des détails beaucoup plus fins. Les microscopes
électroniques nécessitent également une source de vide pour fonctionner, ce qui est
impossible avec les microscopes optiques.