IMMUNOLOGIE ET TECHNIQUES

IMMUNOLOGIQUE

TP N° 3 : ANALYSE ET PURIFICATION DES

SOUS-POPULATIONS LYMPHOCYTAIRES

Réalisé par :
ZHIOUA FARAH
BOUSSADIA SALMA
 Techniques de purification de sous populations
lymphocytaires:

La rosette:
Rosettes Les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) (ou parfois dites « cellules
mononucléaires périphériques sanguines » sont toutes les cellules du sang périphérique
ayant un seul noyau1. Ces cellules sont constituées de lymphocytes (cellules T, cellules B,
cellules NK) et de monocytes, alors que les érythrocytes et les plaquettes n'ont pas de
noyaux, et que les granulocytes (neutrophiles, basophiles et éosinophiles) ont des noyaux
multilobés

Etapes :
-isolement des cellules mononucléaires (PBMC) par Ficoll-Hypaque : Dans un tube conique
mettre 10ml de sang hépariné frais. Avec une pipette stérile rajouter un volume égal de PBS
et mélanger bien. Dans un autre tube conique mettre 6 ml de de Ficoll-Hypaque Incliner le
tube de 45 ° et rajouter lentement le sang dilué en le faisant couler sur la paroi. -
centrifugation 30 min 20°C sans frein (2000rpm).

-avec une pipette pasteur stérile et un petit pore, aspirer soigneusement l’anneau de
PBMC en évitant de prendre de Ficoll-Hypaque et le récupérer dans un autre tube.
-Laver les PBMC aves un excès de PBS et centrifuger 10 min (1500rpm)
-Jeter le surnageant, le culot cellulaire sera laver une autre fois dans du PBS afin

d’éliminer la plupart des plaquettes

-Resuspendre le culot dans un PBS .compter les cellules et déterminer la viabilité par
exclusion au bleu trypan.
-séparation des lymphocytes B et T par la technique de rosettes
-Transférer les PBMC dans un tube de 10 ml. Centrifuger 10 min (1500rpm)

-Enlever le surnageant et resuspendre les cellules dans un milieu RPMI complet

-Ajouter de FCS (fœtal calf sérum) et de SRBC (sheep red blood cells) et PBMC.
-incuber 10 min a 37°C.centrifuger 5 min a 800 rpm et 4 °c incuber sur glace pendant
1 h.

-mettre 1.5 ml de Ficoll-Hypaque dans un tube de 10 ml.

-resuspendre doucement le mélange PBMC/FCS/SRBC. Pour cela prendre le tube
horizontalement entre les mains et le faire rouler.
-centrifuger 35 min a 2000 rpm et 4°c

-les cellules B sont récupérées par aspiration de l’anneau et lavage deux fois au PBS
et les cellules T sont obtenues après lyse des SRBC avec de l’eau distillée et lavage
avec du milieu RPMI puis avec PBS.

L'analyseur-trieur de cellules (Fluorescence-activated cell sorter: FACS)

Le FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) est un appareil qui permet de réaliser
une cryométrie en flux sur une population de cellules, de les analyser et de les trier

en différentes sous-populations grâce à leurs marqueurs de surface qui sont souvent

identifiées par des anticorps monoclonaux marqués à la fluorescéine. Chaque cellule
est analysée et triée individuellement.
Ces appareils mesurent la dispersion de la
lumière, le volume et la fluorescence. Les paramètres de tri (taille, granulosité,

intensité de Fluorescence, etc.) Sont définis par le manipulateur. En pratique, les

cellules de l'échantillon sont marquées avec des réactifs fluorescents détectant des
molécules membranaires. Ces cellules sont alors introduites dans une chambre à
partir de laquelle des gouttes, renfermant chacune une cellule, vont tomber et passer

devant un faisceau laser. Grâce à des filtres appropriés et un jeu miroirs et de

photomultiplicateurs, l'appareil enregistre l'intensité de la fluorescence de chaque
cellule passant devant la source laser. Le système mesure la diffusion de la lumière
aux petits angles (FSC: forward angle light scatter), à angle droit (RSC: right angle

scatter) et l’intensité de la fluorescence .Pour au moins deux longueurs d'ondes

différentes (rouge et verte), ce qui permet de détecter simultanément deux
marqueurs de surface.
Les gouttes peuvent être chargées électriquement et déviées
de de leur trajectoire sous l’impulsion d’un champ électrique. Par conséquent, le

FACS permet une analyse multiparamétrique en déterminant pour chaque cellule la

taille (diffusion de la lumière aux petits angles), la granulosité (diffusion de la lumière
à angle droit) et l'intensité de fluorescence avec trois fluorochromes différents.

La technique utilisant des plaques couplées à un antigène ou à un anticorps :

Elle consiste à séparer des cellules exprimant un antigène spécifique à l'aide de l'anticorps
correspondant fixé de façon non-covalente sur le plastique d'une boîte de Pétri. Le mélange
cellulaire est déposé sur la boîte recouverte de l'anticorps. Les cellules exprimant l'antigène
se fixent sur la boîte. Les cellules non fixées peuvent être éliminées, avec précaution, par
lavage de la boîte. On peut aussi fixer un antigène donné sur une plaque et les cellules
exprimant un récepteur pour cet antigène s'accrochent sur la plaque. Dans certains cas, les
cellules fixées peuvent être récupérées par un traitement enzymatique ou par changement
des conditions de culture ou encore par refroidissement violent. Un exemple d'application
de cette technique est la séparation des cellules Th et Tc en utilisant des anticorps anti-CD4
ou anti-CD8 ; après avoir séparé les lymphocytes T des lymphocytes B grâce à un anti
immunoglobuline qui se fixe sur les anticorps de surface des cellules B. Cette technique est
mieux adaptée à l'élimination d'une population d'une suspension cellulaire ; car les cellules
qui se sont fixées sur la plaque sont souvent altérées.

La technique des billes magnétiques :

Une technique apparentée utilise des billes magnétiques recouvertes d'anticorps spécifique
(par exemple anti-CD4). Ces billes sont mélangées à la population cellulaire et se fixent sur
les cellules reconnues par leurs anticorps. Ces cellules peuvent alors être éliminées ou
séparées par application d'un champ magnétique.

Répartition des cellules Lymphocytaires Les lymphocytes sanguins :

nombre total = 1.0 – 4.0 G/L [Approximativement à 10-20% de B, 70% de T et 10 % de nonB
– nonT (=NK)] Lymphocytes B = 0.1 – 0.4 G/L (environ 10 -20 % du total des Ly) Lymphocytes
T = 1.0 – 3.5 G/L (environ 70 % du total des Ly) Rapport CD 4 / CD 8= 1.2 – 3.0 cellules NK =
0.1 – 0.4 G/L (environ 10 % du total des Ly) Grands lymphocytes granuleux (LGL) : 10 – 20 %
des lymphocytes (< 0.5 G/L)
• Pas de relation entre morphologie et immunophénotype, sauf pour les LGL (CD8+ ou NK)
• Le sang des enfants de moins de quatre ans contient un pourcentage plus élevé de
lymphocytes que celui des adultes.
Définition
L'histocompatibilité, appelé également HLA, ou L-A système (de l’anglais Human
Leucocyte Antigens), est le principal système faisant intervenir des antigènes
(éléments non reconnus par l’organisme, donc considérés comme étrangers), dont
dépend le succès d’une greffe.
Il y a typiquement trois composantes dans le typage HLA pour déterminer la
compatibilité :
- Typage HLA du donneur et du receveur, cette étape implique d’identifier les
allèles HLA. La technique peut être sérologique ou moléculaire (ADN). Les
membres de la famille qui sont volontaires pour donner de la moelle osseuse ou
un organe sont testés pour voir s'ils sont compatibles pour le parent qui a besoin
d’une greffe. Si vous voulez vous rendre disponible pour faire un don de moelle
osseuse pour quelqu’un qui en a besoin, vous pouvez vous mettre en contact avec
l’agence de Biomédecine . Le typage HLA sera réalisé dans un laboratoire proche
de chez vous puis le résultat sera conservé dans la base de données nationales,
pour être comparé aux résultats des patients qui ont besoin d’une greffe de
moelle osseuse.
- Dépistage des anticorps anti-HLA du receveur. Cette recherche est réalisée
chez le receveur pour déterminer s'il a des anticorps présents dans la circulation
qui viseraient le tissu ou l’organe greffé. Certaines personnes ont des anticorps
anti- HLA spécifiques qu’elles ont développés après une exposition à un antigène
du « non soi ». Il y a essentiellement trois raisons à cette exposition d’antigènes du
non soi : la grossesse, en particulier majoré après plusieurs grossesses (lié à
l’exposition au HLA du père qui ont été transmis au fœtus), la transfusion de sang
ou de plaquettes, ou une précédente greffe. Une fois présent, les anticorps anti
HLA doivent être considérés, parce qu'ils pourraient potentiellement attaquer les
tissus du donneur qui a le HLA correspondant. La recherche des anticorps anti
HLA est réalisée régulièrement et mise à jour pour déterminer si la personne en
attente pour un organe « compatible » développe des anticorps anti HLA en plus.
L’évaluation des antiHLA peut également être utilisée après la greffe afin de
déterminer si le bénéficiaire a développé des anticorps nouveaux ou un niveau
d’anticorps accrus contre le donneur (on parle alors de DSA).
- Le cross match. Cette étape survient lorsqu’un donneur potentiel est identifié.
Elle aide à déterminer si le receveur a des anticorps contre les antigènes présents
sur les lymphocytes du donneur.
Le sérum du receveur est mélangé avec les globules blancs du donneur. Lorsque
qu’une réaction est détectée (lyse), cela indique qu’il y a probablement une
incompatibilité. Le résultat du cross match doit toujours être interprété avec les
informations connues concernant les anticorps spécifiques anti HLA du receveur
et le typage HLA du donneur