3e année Médecine Immunologie

Les techniques d’agglutination et

d’hémagglutination
I/- Introduction :

(Comme on l’a vu précédemment, le choix des techniques immunologiques dépend du type de

l’antigène ou de l’anticorps qu’on veut doser. Ces techniques diffèrent par leur sensibilité et la
quantité minimale d’Ag ou d’AC qu’on peut doser ‘’voir tableau du cours précèdent’’)

 Ces techniques reposent également (comme l’immunoprécipitation) sur l’interaction [Ag-AC], qui
se définit par la réaction entre un épitope et un paratope. C’est un phénomène réversible,
rapide, invisible, constant et très spécifique.
 La réaction entre les Ag particulaires et les AC spécifique induit la formation d’un agglutinat, c’est
un réseau (ou amas) de complexes immuns, visible à l’œil nu.
 Ces réactions obéissent à la courbe d’Heidelberger : on peut observer ce réseau (agglutinat) dans
la zone d’équivalence.

II/-Définitions et aspects fondamentaux :

 Phénomène caractérisé par la réunion en amas de particules à la suite d’une réaction antigène-
anticorps.
 L’antigène est particulaire ou cellulaire (bactéries, hématies, billes de latex …) ; les complexes
immuns forment un agglutinat, par un fragment Fab sur une particule et par le second Fab sur
une autre particule.
 La réaction Ag-Ac a deux grands types d'applications :
 La détection et le titrage des antigènes et des anticorps
 Observation directe de la réaction Ag-AC
(visible à l’œil nu)

III/-Types d’agglutination :

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L’agglutination directe L’agglutination indirecte

L’Ag appartient à la particule (naturel).  L’Ag doit être fixé sur une particule de manière
Si la particule est : synthétique → antigène
 GR → Hémagglutination. figuré.
 GB → Leucoagglutination.  Particules inertes :
 Plaquette → Thrombroagglutination.  Bille de latex.
 Bactéries.  Cristaux de cholestérol.
 Particules de charbon.
Agglutination → Sérologie positive.  GR d’une espèce différente.
(La plus part des temps, on fixe des AC sur les biles)

III/- Paramètres intervenants dans l’agglutination :

1. Les paramètres de réaction :

 Les Ac dits agglutinants (IgM en majorité) sont capables de produire une agglutination des
particules en suspension dans un milieu salin de [Na Cl] = 0,15 M.
 Les Ag : il existe une relation entre l’agglutination et :
 Leur localisation.
 Nombre de sites à la surface de la particule : (sites = Ag),
l’AC agglutinant peut devenir non agglutinant si le nombre
de sites est insuffisant → Faux négatif.
2. Influence de la température : la T° est indirectement liée à la
structure de l’AC étudié :
 IgM = AC à optimum thermique froid : AC froids (4°C).
 IgG = AC à optimum thermique chaud : AC chauds (37°C).
3. PH neutre.
4. La force ionique : elle contrarie l’union Ag-AC mais favorise la
formation du réseau par la diminution du potentiel Ʒ.
5. Concentrations de l’AC et de l’Ag : ‘’phénomène de Prozone
(ou de zone)’’,
 A fortes concentrations d’AC, le nombre de sites de
liaison de l’AC peut excéder celui des épitopes antigéniques (ce meme phénomène se produit
en cas d’excès d’Ag).
 Les AC ne se lient à l’Ag que d’une façon univalente. Il n’y a donc pas de formation de réseau
d’agglutinat (agglutination).
 Tout sauf zone d’équivalence.

Exemple : Dans le cas d’infection à la brucellose, le sérum du patient contenant l’Ag, lorsque on lui
ajoute l’AC en excès → Test négatif (pour corriger, on dilue la solution d’AC afin de diminuer la
concentration d’AC→ zone d’équivalence, nous allons mieux comprendre la notion de dilution par la
suite).

Il existe des techniques qualitatives et des techniques semi-quantitatives et une autre technique
qu’on verra à la fin du cours.

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IV/- Les techniques qualitatives :

Suivant le système Ag-AC étudié, la réaction peut s’effectuer :

 En tube.
 Ou sur lame de verre.

Réaction d’agglutination en tube Réaction d’agglutination sur lame de verre

1. Sérum du patient (contenant des AC) + Ag figurés  Technique plus utilisée.
(Ag fixés sur GR ou bactéries).  Une goutte de sérum du patient (contenant des
2. Après incubation, on agite légèrement le tube. AC) sur lame de verre + Une goutte de suspension
3. Formation d’un culot de sédimentation ‘’la lecture antigénique → Lecture se fait au microscope (peut
se fait à l’œil nu’’. se faire à l’œil nu).
4. Le culot se fragment en amas très nets  Positif :
(fragmentation) → Réaction positif. amas
 Plusieurs types de réactions en tube : plus ou
 S moins
e
r
o
d volumineux, aspect hétérogène.
i  Négatif : la préparation reste homogène (pas de
a formation de réseau).
g  Exemple : technique sur lame, sérotypage des
n antigènes O, H et Vi chez la salmonella.
o 1. On fixe ces antigènes sur les billes de Latex (sur
s lame de verre).
ti 2. On ajoute un antisérum (sérum contenant des AC).
c de Widal : Salmonelloses. 3. agitation par mouvement circulaire
 Serodiagnostic de Weil et Felix : Brucellose. 4. régulier/relativement lent.
 Serodiagnostic de Martin et Petit : Leptospiroses. 5. Lecture dans les 5min
(Elles sont anciennes, très peu utilisés) 6. Si la souche possède l’antigène correspondant à
l’antisérum testé, il se forme des agglutinats
Réaction sur microplaque à fond conique en V+++ visibles à l’œil nu (parfois plus visibles si on
 Réaction positive : on a formation d’un tapis regarde la lame par-dessous) (si elle est négatif la
homogène. réaction reste homogène)
 Réaction négative : particules rassemblées au fond  Cette agglutination
Test négatif
repose sur la détermination
(en bouton) des

antigènes O qui donne une agglutination

granuleuse.

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V/- Techniques semi-quantitatives : ‘’Méthodes de dilutions successives’’

1. On prend le tube contenant des Ag.

2. On prend le sérum du patient (contenant des anticorps) qui est dilué et on l’ajoute aux Ag.
3. On obtient un test négatif ‘’Prozone’’.
4. On dilue encore par une solution physiologique jusqu’à ce qu’on arrive à la zone
d’équivalence.

(On peut remplacer les Ag par les AC, voir exemple pour mieux comprendre)

 On rend un titre (pas un chiffre), le titre en AC du sérum est représenté par ‘’le facteur de
dilution’’ de la dernière dilution positive avant de retomber dans la prozone (négatif) c'est-à-dire
la dilution la plus grande associée à une agglutination franche. (Le titre = l’inverse de la plus
grande dilution donnant encore une réaction positive)

Exemple : Dosage de la protéine C réactive (CRP), la CRP est le marqueur des infections à bactéries
pyogènes.

1. On fixe les AC anti-CRP sur les billes de Latex (dans un tube).

2. On ajoute le sérum du patient contenant la CRP, et on dilue jusqu’à ce qu’on obtient
l’agglutinat ‘’zone d’équivalence’’.

REMARQUE :

 La CRP est élevée lorsqu’on est à un stade avancée de l’infection, ou inflammation aigue.
 La CRP est basse lorsqu’on est en fin ou au début de l’infection.

On classe ces techniques également selon le type d’antigène : particulaire (directe) ou soluble fixé sur
une particule (indirecte) ‘’voire applications’’.

VI/- Applications :

a. Hémagglutination directe ou active : Antigène directement particulaire ex : hématie, bactérie

 Groupage ABO et rhésus.

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 Recherche d’anticorps anti-érythrocytaires pathologiques :

 Antigène directement particulaire ex : hématie, bactérie
 Anémie hémolytique auto-immune.
 Post transfusionnels.
 Iso-immunisation fœto-maternelle.

Groupage ABO et rhésus

On peut rechercher les globules
Technique d’hémagglutination,

rouges du sang qui possèdent à

leur surface l’épitope A et/ou B
ou aucun de ces épitopes.
de Beth Vincent

On utilise des anticorps anti-Ag A

ou B + GR du patient.

On recherche les AC du système

ABO (IgM), ce sont des AC
Technique d’agglutination, de

réguliers (Ag correspondant est

absent et inversement Càd si
Simonin Michon

l’individu est de groupage A il

possède des AC anti-B).
On utilise des Ag érythrocytaires
fixés sur les GR + AC du sérum du
patient.

 Ce qui permet la détermination des groupes sanguins dans le système ABO selon les
épreuves précédentes.

Anémie hémolytique du nouveau-né

La maladie hémolytique du nouveau-né est causée, pendant la grossesse, par l'action sur les
érythrocytes (=globules rouges) fœtaux ‘’de rhésus positif’’ d'anticorps provenant de la mère
‘’Anti-rhésus positif’’ (la mère étant de rhésus négatif). 2 Techniques de dosage :

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Le sang du nouveau-né contenant des réseaux de GR-IgG + des Anti-IgG → Agglutination →

Test positif.
(IgG = Anti-rhésus positif)
Test de Coombs direct

b. Réaction d’agglutination directe des bactéries :

Agglutination d’une suspension de brucelles par

Réaction de Whright ‘’brucellose’’
le sérum de malade (contenant les AC) atteint
de fièvre de Malte.
Réaction de Widal et Felix ‘’Salmonelloses’’ Salmonelles + sérum du patient
Typage et recherche de germes E. Coli, streptocoques.

c. Réaction d’agglutination indirecte ou passive : Elle est réalisée entre un Ac et un Ag

normalement soluble, mais rendu particulaire par fixation sur une particule inerte ex : latex,
hématie

 La nature des particules figurées utilisées comme support est variable :

 Particules de Latex.
 Cristaux de Cholestérol.

 Exemples :

 Dosage de la CRP (on l’a vu précédemment).

 Dosage du facteur rhumatoïde :

Il est représenté par un auto-anticorps d’isotype ‘’IgM’’ dirigées contre les déterminants isotypiques
des ‘’IgG’’. On retrouve cet AC (IgM) chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde. Différents
test permettent de le mettre en évidence, tel que :

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Quand il s’agit de savoir si un sérum contient des anticorps dirigés contre des globules
rouges.
Principe : incubation des globules rouges avec le sérum du patient puis en ajoutant
l’anticorps anti-immunoglobulines pour agréger les cellules.
Sérum de la maman (contenant les IgG Anti-rhésus positif) + GR du nouveau-né (contenant
des Ag rhésus (+)) → Hémagglutination → Test positif.
Test de Coombs indirect

 On fixe un IgG sur une bile de latex (ou Particules de polystyrène) = Particules de
polystyrène sensibilisés par des IgG humaines
 On ajoute le sérum du patient qui contient le facteur rhumatoïde → Agglutination →
Positif.
(C’est une technique qualitative, mais elle peut être semi-quantitative par la dilution)
Cette technique est plus spécifique car on utilise des IgG humains.
La Technique au latex

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 On fixe un IgG de lapin sur un globule rouge de rhésus négatif = GR O Rh Neg humains
sensibilisés par des Ac de lapin anti-GR humains
 On ajoute le sérum du patient contenant le facteur rhumatoïde → hémagglutination →
La technique de Waaler Rose

Positif.
(Les IgG de lapin ont une similitude structurale et antigénique avec les IgG des humains)
Cette technique est plus sensible car c’est une réaction d’hémagglutination.

 TPHA (Treponema pallidum hemagglutination assay) : Globules rouges de mouton

syphilitique
Sérologie

sensibilisés par ultrason de Térponèmes (Ag tréponémiques= spécifique)

 VDRL (veneral disease research laboratory) : Microcristaux de cholestérol sur lesquels
sont adsorbés des molécules antigénique de cardiolipide (Ag non tréponémique = non
spécifique)

VII/- Réaction d’inhibition de l’agglutination indirecte :

1. Introduction : réaction basée sur la compétition entre un antigène soluble (solution à étudier)
et le même Ag fixé sur une particule (Latex, hématie) pour la fixation sur l'Ac.

2. Etapes et explication :
1) On utilise un sérum-test adéquat contenant des agglutinants (ou réseaux) → Complexes Ag-
AC.
2) On ajoute des Ag ou des AC afin de défaire et séparer le réseau. (Si le réseau est défait ‘’Test
positif’’).
 Cette réaction repose sur le principe de compétition entre un Ag libre et le même Ag fixé sur
une particule (Ou AC ‘’on remplace Ag par AC’’).

3. Principes :
 Cette réaction est destinée à mettre en évidence un Ag grâce à des sérums-test (Ac spécifiques).
 Il s’agit de méthodes complexes faisant intervenir :
 L’Ag recherché dans un milieu biologique.
 Un sérum test adéquat.
 Et des particules figurées, sensibilisées préalablement par l’Ag correspondant.

(On peut remplacer Ag par AC)

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4. Applications :

a) Diagnostic immunologique de la grossesse : la grossesse entraine le passage d’hormones

gonadotropes dans les urines (βHCG)
1) On fixe sur une bile de latex un AC anti-HCG.
2) On ajoute l’hormone HCG. Test de grossesse
3) Formation d’un réseau (agglutinat)
4) Lorsqu’on ajoute les urines de la femme enceinte contenant l’HCG on aura une inhibition de
l’agglutination → Test de grossesse positif.

b) Diagnostic sérologique d’un certain nombre d’infections virales.