TD n°2 : Réactions d’agglutination

➔ Formation d’agglutinats

Dans les techniques immunologiques ; pour quantifier il faut faire des dilutions (tjrs) => la dilution est la base da la quantification

I. Agglutination directe ou active

Techniques qualitatives Techniques quantitatives

= Agglutination rapide sur lame - Séro-agglutination de Wright : brucellose
Objectifs : - Agglutination de Félix et Widal : salmonellose
- Recherche d’antigènes (ces Ag se trouvent sur des bactéries) ex :
o Sérotypage de Salmonella (entérobactéries surtout chez le bétail) Les techniques quantitatives sont basées sur la dilution : on prend
▪ Les Ag se places sur la paroi (Somatiques), sur le flagelle (flagellaire), … des bactéries et on les met en suspension dans de l’eau
→ formule antigénique (Institut Pasteur centre de référence physiologique dans laquelle on ajoute des anticorps et on effectue
de sérotypage) : on fait entrer en contact une colonie avec un des dilutions à partir du tube
Ag spécifique ;
Au début, on observe une précipitation à la suite de
Si la réaction reste homogène = il s’agit d’une réaction l’agglutination ; Les complexes immuns formés sont lourds ils
négative précipitent au fond du tube

Si on obtient une image d’agglutination = il s’agit d’une
réaction positive ; l’Ag existe chez cette bactérie
o Groupages sanguins (Anti-D pour savoir le rhésus)
A la suite des dilutions, on n’a plus assez d’anticorps ; les
bactéries restent en suspension → milieu trouble ;⇒ Plus on
effectue des dilutions plus la turbidité du milieu augmente
Titre = 1/La plus grande dilution entrainant une réaction
positive ; ordre de grandeur pour comparer les prélèvements

- Recherche d’Anticorps
o Epreuve à l’antigène tamponné EAT ou épreuve au rose bengale, Bengtest… =
recherche d’anticorps anti-Brucella (Test réalisé à l’école lors de la recherche de
brucellose par exemple)
o Recherche d’Ac anti-mycoplasmes aviaires (IRVT centre de référence de
détection de mycoplasmes par la sérologie en Tunisie)
o Recherche d’Ac anti-Salmonella aviaires, …

➔ Solution tamponnée de
brucella inactivée colorée en rose

II. Agglutination indirecte ou passive : utilisation d’intermédiaires ; soit des billes de latex sur lesquels on fait adsorber les
Anticorps ou les Antigènes (labo qui fabrique les kits de réactifs,..), soit des GR

Techniques qualitatives Techniques quantitatives

Fixation d’antigènes solubles ou d’anticorps sur des particules : hématies ou billes de latex ⇒ Hématies sensibilisées avec un Antigène viral (ou bactérien,
recherche d’anticorps ou d’antigènes parasitaire)
➔ Titrage des anticorps anti-virus X par la technique
=> pour augmenter les chances d’avoir des réactions + : le fait d’avoir des billes de latex ça permet d’hémagglutination ;
d’avoir un réseau de complexes immuns observable plus facilement ; technique plus sensible même si
ces derniers sont en petite quantité ils seront être détectés
Ex : Streptocoque

En ajoutant le sérum dilué de l’échantillon ; d’abord on a une

hémolyse (=agglutination), après quelques dilutions on obtient un
bouton de GR (= le nombre d’anticorps à diminuer on n’a plus
d’agglutination →
Sédimentation des GR
qui n’ont pas réagi)
 III. Hémagglutination (HA) et inhibition de l’hémagglutination (IHA)

Techniques qui vont faire intervenir les hématies

Diagnostic Direct Diagnostic indirect

➔ Pour détecter les Ag ➔ Pur détecter les Ac
On va utiliser la propriété d’hémagglutination des virus pour les GR ; Technique de fixation du complément très peu utilisée car compliquée
essentiellement les virus aviaire (New Castle, influenza aviaire : virus But du complément : lyse des pathogène
hémagglutinants), on utilise essentiellement Exemple pour la recherche de brucellose
- Des écouvillonnage (animaux vivants) ou
- Des prélèvements de tissus (animaux morts)
Ces virus hémagglutinants lorsqu’il sont en contact avec les GR ils vont subir
une hémagglutination ; ils vont former un réseau de (virus + GR)
⇒ une image d’agglutination

Bovins 1 :
• Pour un sérum d’un animal accompagné d’antigène (bactéries
inactivées) et du complément ; lors de présence d’anticorps anti-
Brucella ; le complément se trouve face à ces bactéries et leurs
Ces virus possèdent des protéines qui leur donne la propriété anticorps spécifiques → activation de la voie classique du
d’hémagglutination : complément ⇒ Lyse de la bactérie
- Hémagglutinine (chez virus influenza aviaire on peut la retrouver • Dans un deuxième temps (après incubation) on ajoute des couples
indépendante) hémolytiques (des Ac fixés a des Gr) ; le complément ayant été
- Neuraminidase consommé précédemment → Absence d’hémolyse, anticorps + ⇒
Pour la maladie de Newcastle c’est la même protéine qui joue le rôle de Animal infecté
neuraminidase et d’hémagglutinine
Bovins 2 : un témoin sérum
Etapes pré-analytiques • En absence d’Ac anti-Brucella ; le complément ne se sera pas activé
1. Inoculation • Suite a l’ajout du couple hémolytique ; le complément étant intact il
On recourt à des Œufs embryonnées contenant un va avoir lyse des GR → Hémolyse, anticorps - ⇒ Animal indemne
embryon vivant âgés de 9 à 11 j pour multiplier le
virus (parce que le prélèvement d’origine ne contient
pas assez de virus et on a besoin d’une quantité
importante pour réaliser l’agglutination, la
multiplication du virus se fait dans des œufs embryonnés ou
dans des cellules [cellules de foie d’embryon de poulet, Vero])
SPF œuf embryonnée Specified Pathogen Free (ne contient
aucun pathogène spécifique aux volailles)
Endroit particulier pour l’inoculation varient selon les virus recherchés
Par exemple :
- Pour les virus influenza et
maladie de Newcastle on
va inoculer la cavité
allantoïdienne,
- Pour les herpes virus on
les inocule au niveau du
sac vitellin
2. Colmatage
3. Incubation 2 à 7 jours à 37°C
A partir de 2 jours, on observe quotidiennement la viabilité des
embryons ; on regarde ce qui se passe avec le virage des œufs ; on
va observer l’œuf sous une source lumineuse pour vérifier la
mortalité embryonnaire
(Lorsqu’on fait bouger l’œuf,
➢ Si l’embryon bouge → il est encore vivant, on le retient,
➢ Si l’embryon est devenu sombre → Il est mort, on passe au
prélèvement du liquide allantoïdien a 7 jours au maximum)
⇒ on utilise les techniques d’hémagglutination HA et de
l’inhibition de l’hémagglutination IHA sur le prélèvement
[Globules rouges de poulets GRP] (lors d’autre épreuve, on prélève
l’organe/structure où on a fait l’injection)
Matériel :
• Des plaques en polystyrènes de micro-titration ou des
plaques de dilutions (96 puits) (fond rond ou en V)
• Echantillon à tester : Liquide allantoïdien
• Globules rouges de poulet concentré a 1% lavé avec
PBS (liquide salin comme eau oxygénée)
Choix de la technique :
• Rapide
• Sensible
• Peu couteuse
• Lecture facile
Principe et protocole des test :
Protocole : dilution au ½
On étudie toujours le témoin avant les échantillons
• Témoin sérum 1 : hémolyse → témoin sérum valide
• S1 : lors d’absence d’hémolyse on a Anticorps anti-pathologie
recherchée puis il n’y a plus suffisamment d’Ac → hémolyse
• S2 : témoin sérum valide ; absence d’hémolyse puis hémolyse →
titre = 256
• S3 : témoin sérum valide , absence d’hémolyse titre = 2
• S5 : il faut un deuxième prélèvement
• S6 : titre < 2
• S7 : témoin négatif : absence d’hémolyse ; un deuxième
prélèvement pour le témoin et on refait l’expérience
La formule est applicable seulement en cas de brucellose

Pourquoi prélève-on 2 sérums séparés par 15j ?

Pour savoir si l’infection est récente ou non

Qu’est ce qui prouve que l’infection elle est récente ?

Si le titre ↗ : infection récente : titre doit être multiplier par 4 =>
séroconversion

D’où proviennent les Anticorps à part une infection récente ?

infection ancienne, vaccination, immunité néonatale
 Test d’Hémagglutination Test d’inhibition de l’hémagglutination Témoin

Principe

On va faire entrer en contact le virus avec les
GR, si le virus possède la propriété
hémagglutinants il y aura une réaction
d’hémagglutination = liquide rose ⇒ on
confirme avoir un virus hémagglutinants
→ on passe alors à la réaction d’inhibition de
l’hémagglutination pour savoir qui est ce virus
On va faire entrer en contact un Anticorps
spécifique pour un certain virus avec un virus
hémagglutinants qu’on veut identifier ; il y a
formation de complexe immuns entre le virus et
l’Anticorps spécifique ; il s’agit d’une réaction
d’inhibition d’hémagglutination = formation de
bouton de globules rouges
On met les GR utilisé dans une solution
de PBS : pour démontrer qu’il s’agit de
GR de bonne qualité ne portant aucune
anomalie
→ si on obtient une solution rose ⇒ il a eu
hémolyse = les GR sont défectueux

→ Si l’anticorps n’est pas spécifique au virus ; il aura une

réaction d’hémagglutination
Protocole

2ème étape : identification par IHA du virus isolé

- Liquide allantoïdien + anticorps anti-virus
recherché
- Incubation 30 min à 37°C
- Puis addition d’hématies de poule et
incubation
Résultat :

on va ajouter le sérum (#Ag ds HA) parce qu’il

s’agit d’une dilution de sérum (c’est une technique
réglementée où on ajoute exactement 4 unités
hémagglutinine) => si Anticorps spécifique :
formation de complexes immuns
Technique

Au début : Inhibition d’hémagglutination (⛔

On réalise des prélèvements de poumon parce
que les maladies recherchées a savoir
l’influenza aviaire et la maladie de Newcastle
donnent surtout des atteintes respiratoires
⇒ Résultat : présence d’un virus
hémagglutinants
sédimentation, ⛔ bouton de GR)
Puis hémagglutination parce qu’on n’a plus assez
d’Anticorps
Qu’est-ce que c’est les 4 unités hémagglutinants
(4UHA) ?
C’est la concentration supérieure en Ag