REPUBLIQUE DU BENI N

MINISTERE DE LA SANTE REPUBLIQUE

CLINIQUE DE LA FRONTIERE

LABORATOIRE D’ANALYSES BIOMEDICALES

Réalisation et interprétation des tests

TPHA et VDRL

Présenté au laboratoire : 25/ 08/ 22

Par : BIOKOU Rizikatou
Sous la supervision de : Mr AHOUANSE Pamphile

Réalisation et interprétation des tests TPHA et VDRL présentée par BIOKOU

Rizikatou 17 août 2022
Plan
Introduction
I- Généralités
A. IST
B. Syphilis
II- Intérêt de dépistage de syphilis
III- Principe de TPHA et VDRL
IV- Méthode de réalisation et interprétation des résultats :
A. TPHA
B. VDRL
V- Traitement
Conclusion

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 GLOSSAIRES
Turbidité : capacité d’un liquide à absorber ou diffuser la lumière incidente,
étant ainsi trouble.
Lipémique : c’est le cas si l’on ne peut lire du papier imprimé au travers.
VDRL : Veneral Disease Research Laboratory
TPHA : treponema pallidum hemagglutination assay
FTA : fluorescent Treponemal antibody absorption test
IST : infection sexuellement transmissible
MST : maladies sexuellement transmissibles
LCR : liquide céphalo-rachidien
Paralysie :

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INTRODUCTION
Les maladies sexuellement transmissibles, communément appelées
maladies vénériennes ou MST, sont des maladies infectieuses transmises d’un
individu à un l’autre exclusivement lors de rapports sexuels. Il en existe de
nombreuses formes propagées par des virus, des champignons, des protozoaires
et des bactéries dont la syphilis. La seule façon de savoir si une personne à une
MST est de se faire dépister. Le dépistage de la syphilis passe par la réalisation
du TPHA/VDRL. Nous parlerons de la réalisation du TPHA/VDRLet de
l’interprétation des résultats.

I- GENERALITES
A. Infection sexuellement transmissible (IST)

Les infections sexuellement transmissibles se transmettent principalement par

contact sexuel, notamment lors d’un rapport vaginal, anal ou oral. Certaines
peuvent aussi se propager par d’autres voies, comme le sang ou les produits
sanguins. De nombreuses IST notamment la chlamydiose, la gonorrhée,
l’hépatite B, le VIH et la syphilis peuvent également se transmettent de la mer à
l’enfant pendant la grossesse ou l’accouchement. Les IST ne peuvent pas se
propager par simple contact, par exemple en donnant à manger ou à boire, en
éternuant ou lors d’une accolade.

S’ils se manifestent, les symptômes de ces infections curables sont notamment

des écoulements vaginaux, des écoulements urétraux chez l’hommes, des
ulcères génitaux, une miction douloureuse et des douleurs abdominales.

B. La syphilis

La syphilis est une affection grave, transmise lors d’un rapport vaginal, anal
ou oral. Elle se manifeste par l’apparition d’ulcérations, appelées chancres, sur
les organes génitaux. Non traitée, la syphilis peut entrainer des problèmes graves

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et permanents (lésions cérébrales, cécité ou paralysie). De nombreuses
personnes atteintes de syphilis ne présentent pas de symptômes et ne savent pas
qu’elles sont infectées.

La syphilis évolue en trois stades : le stade primaire se caractérise par

l’ulcération, le stade secondaire par des éruptions cutanées et un gonflement des
ganglions lymphatiques. Au stade tertiaire, le cerveau, le cœur ou d’autres
organes peuvent être touchées.

II- Intérêt de dépistage de syphilis

La syphilis est une maladie vénérienne. Elle évolue selon trois phases
distinctes avec des phases sans symptômes pendant lesquelles seul le diagnostic
sérologique permet de la détecter. Dans sa phase terminale, elle peut engager le
pronostic vital, ou tout au moins des troubles neurologiques et cardiovasculaires.
De plus, il existe un risque de transmission materno-fœtale, donc le dépistage de
la maladie est systématique chez les femmes enceinte.

Le diagnostic de la syphilis repose principalement sur des analyses

sérologiques qui visent à détecter des anticorps- tréponème (la bactérie en
cause). Plusieurs méthodes sont utilisées, principalement :

 La VDRL qui n’est pas spécifique du tréponème ;

 Le TPHA spécifique du tréponème ;
 La FTA, lui aussi spécifique du tréponème il est surtout utilisé pour
le diagnostic chez le nouveau-né ou en présence d’un chancre en
tout début de maladie, si les tests VDRL et TPHA sont négatifs.

La sélection des tests diagnostiques dépend du stade auquel la syphilis est

suspectée. L’infection neurologique est détectée et suivie de façon optimale
par des tests réaginiques quantitatifs du LCR. Les cas confirmés doivent être
déclarés aux autorités sanitaires.

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 III- Principe de TPHA et VDRL
 TPHA

Des érythrocytes de volaille tannés sont sensibilisés par un antigène

spécifique et mis en suspension dans un diluant. Lorsqu’un échantillon positif
dilué est mélangé avec la suspension de cellules tests, les anticorps dirigés
contre l’antigène entrainent une agglutination des cellules. Les cellules forment
un réseau caractéristique au fond des puits de la plaque de microtitration.

En absence d’anticorps, les cellules forment un bouton compact au fond du

puits.

Des érythrocytes de volaille tannée non sensibilisés sont utilisés comme cellules
contrôle.

 VDRL

Le réactif RPR font appel à des particules de charbon sensibilisées avec

un mélange d’antigènes lipidiques qui se combinent aux anticorps présents dans
le sérum ou le plasma du patient. Ces particules sont en suspension dans des
milieu contenant des substances destinées à éliminer les réactions non
spécifiques. Les réactions positives sont indiquées par l’agrégation des
particules. Bien que ce kit soit destiné essentiellement à un usage qualitatif, il est
également possible de titrer le taux d’anticorps par dilution de raison 2.

L’interprétation de l’agglutination se fait par une lecture visuelle.

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 IV- Méthodes de réalisation et interprétation des résultats :

 TPHA (BIO-labo)
 Prélèvement

Le TPHA peut être effectué sur sérum, sur plasma, ou liquide céphalo-
rachidien (LCR). Nous avons choisi d’étudier la procédure avec le sérum. Celui-
ci ne doit pas être hémolysé, ni présenter de turbidité. Il ne doit pas être
lipémique (c’est le cas si l’on ne peut lire du papier imprimé au travers).

Pour obtenir du sérum :

o Prélever du sang veineux dans un tube sec selon les normes

o Laisser coaguler le total à température ambiante pendant au moins 20
minutes ou centrifuger à 3000tr/min pendant 5minutes dès que le culot est
pris.
o Transférer le sérum dans un autre tube (tube Eppendorf par exemple) et
étiqueter le tube.
Si le test n’est pas exécuté dans les 4 heures, réfrigérer le sérum à 2-8°C.
Si le test n’est pas exécuté dans les 5 jours, le congeler à -20°C. L’on doit
laisser revenir le sérum à la température ambiante (23-30°C) avant le test.
Il faut toujours vérifier qu’il ne présente pas de débris avant le test.
 Procédure du TPHA

Matériels

o Microplaque de titration à 96 puits à fond U, qui permet un pipetage

facile et libre de résidus ;
o Micropipette pouvant distribuer des volumes de 10,25,75 et 190µL ;
o Gants à usage unique ;
o Solution décontaminante pour y jeter les cônes.

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 Réactifs

Selon le kit Biolabo, nous comptons parmi eux :

o Le tampon de dilution : c’est un diluant. Il sert à prédiluer les

spécimens. Il contient un extrait de tréponèmes de Reiter qui ont pour
rôle d’absorber les anticorps de tréponèmes non pathogènes ;
o Cellules-test : érythrocytes aviaires stabilisées à eau formolée,
auxquelles sont fixés des antigènes de T. pallidum (souche de
Nichols).
o Cellules-contrôle : érythrocytes aviaires stabilisées. Des antigènes n’y
sont pas fixés.
o Contrôle positif : sérum predilué au 1/20 titré à 1/640.
o Contrôle négatif : sérum humain predilué au 1/20, exempt d’anticorps
contre T. pallidum.
 Etapes techniques
Méthode qualitative
Prévoir 3 puits de la microplaque par échantillon. Dans cet ordre, il
faut :
1- Ramener chacun des composants du kit à température ambiante.
De même que les échantillons si nécessaire.
2- Avec la micropipette, déposer 190µL de tampon de dilution dans le
puits A.
3- Déposer 10µL de sérum dans le puits A avec un nouveau cône.
4- A l’aide d’une micropipette, mélanger le contenu du puit A et
transférer 25µL de cette dilution 1/20 dans les puits B et C.
5- Remettre en suspension par retournement les cellules-test et
contrôle
6- Ajouter 75µL de cellules contrôle dans puits B
7- Ajouter 75µL de cellules test dans puits C

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 8- Homogénéiser mécaniquement ou manuellement le contenu des
puits
9- Couvrir la plaque et la placer à l’abri de la lumière de la chaleur et
de toutes sources de vibrations
10- Incuber pendant 45-60 minutes à température ambiante. Lire
les résultats.

Ceux-ci sont stables pendant 24 heures si la plaque est couverte et si les

précautions énoncées ci-dessus ont été respectées. Pour les contrôles positifs et
négatifs, il faut suivre les mêmes manipulations que pour l’échantillon.

Méthode semi-quantitative

Prévoir 5 puits supplémentaires par patient. A numéroter de D à H. Les sérums

contrôlent positif et négatif peuvent ne pas être testés, puisqu’ils l’ont déjà été.

Il faut procéder ainsi :

 A l’aide de micropipette, distribuer 25µL de tampon dans les puits D à

H;
 Transférer 25µL de sérum précédemment dilué au 1/20 dans le puit D
et mélanger en aspirant et refoulant.
 Prélever 25µL de sérum dilué au 1/40 du puit D et le déposer dans le
puit E. mélanger encore et faire la même chose pour les puits F, G, H.
prélever 25 µL du mélange puits H et le jeter.
 S’assurer que les cellules-test sont bien remises en suspension. Ajouter
75µL de ces cellules dans les puits D à H inclus, successivement. Ceci
conduit aux dilutions suivantes :

Puits D E F G H
Dilution 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560
Facteurs de dilution du sérum pour la phase semi-quantitative

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  Homogénéiser mécaniquement ou manuellement le contenu des puits en
tournant le plaque en cercle ;
 Couvrir la plaque et la placer à l’abri de la lumière, de la chaleur et des
vibrations.
 Incuber pendant 45-60 minutes à température ambiante. Lire les résultats.

Les résultats sont stables pendant 24 heures si la plaque est couverte et les
précautions suscitées ont été prise.

 Principe de lecture du résultat

S’il y a agglutination (voile au fond du puits de la plaque) alors le patient a des

anticorps contre T pallidum. La réaction est positive.

Si les hématies ne s’agglutinent pas et se déposent en fond bouton compact au

fond du puits, alors le patient ne possède pas anticorps recherchés. La réaction
est négative.

Si le mélange présente un voile lors de cette phase qualitative, l’on peut passer à
la titration des anticorps du sérum du patient. C’est la phase quantitative. Il
s’agit de faire une dilution en série de sérum, puis de le mélanger aux hématies-
test, jusqu’à l’obtention d’une agglutination nulle du mélange. L’on obtient le
titre en multipliant l’inverse du facteur de dilution du dernier mélanger positif
par le seuil de dépistage du kit du fabricant du test.

 Facteurs qui influencent la technique

Parmi ces facteurs, nous pouvons dégager :

o La propreté désireuse de la microplaque si elle a été recyclée et mal

nettoyée peut affecter la réaction antigène-anticorps. Il faut donc
s’assurer de sa propreté.
o La bonne conservation des réactifs : à 2-8°C et à l’abri de la
lumière. Ils ne doivent pas atteint leur date de péremption.

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 o Le technicien ne doit pas mélanger les réactifs de différents lots.

 Limites de la procédure et proposition pour surmonter ces limites

Si l’agglutination dans la série des cellules-contrôle est supérieure ou
égale à celle de la série des cellules-test, alors, la réaction est non-
spécifique. La procédure ci-dessous doit être appliquée :
1- Transférer 100µL de sérum à tester dans un petit tube puis ajouter
400µL de cellules-contrôle. Ensuite, bien mélanger, et laisser incuber
pendant une heure.
2- Centrifuger 15 minutes à 1000 tpm et tester le surnageant avec la
méthode qualitative. Le spécimen est ainsi dilué au 1/5. Nous prenons
cela en compte pour les futures manipulations lors du passage à la
quantification.

Si le test est à nouveau non spécifique, il faut faire un autre test, alternatif ou
complémentaire et non le TPHA.

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  Lecture du résultat

Expression, interprétation et analyse des résultats

 Expression des résultats

Le titre correspond à la plus forte dilution conduisant à une agglutination. Le

compte rendu de résultat indique généralement la positivité ainsi que ce titre et
les valeurs de référence.

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  Interprétation des résultats

Les anticorps développés après peuvent persister après guérison. C’est

pourquoi un TPHA positif peut indiquer une infection présentée ou passée.
Dans ce cadre, il faut interpréter les résultats du TPHA en les complétant
avec ceux de VDRL et éventuellement du FTA-ABS tel que suit :

VDRL - TPHA - Sérologie est N’exclut pas le

négative diagnostic de
syphilis
débutante
VDRL - TPHA + Syphilis traitée Le FTA est en
général négatif,
ou faiblement
positif
(FTA ≤ 400)
VDRL + TPHA + Syphilis non Les 3 marqueurs
traitée ou traitée VDRL, TPHA,
tardivement et FTA sont à
taux variables
selon le stade de
l’infection
VDRL + TPHA - Syphilis primaire FTA positif
(chancre)
Faux positif en
VDRL (anticorps
FTA anti-négatif
cardiolipidiques).
Interprétation des résultats du TPHA en regard des examens complémentaires.

 VDRL (BIO-RAD)
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  Réactif : description

Identification de Description Présentation 72515 Préparation

l’étiquetage 100 tests 72516
500 tests
R1 RPR Antigen Antigène RPR 1 flacon 1 flacon
Particules de charbon 2ml 10ml
Sensibilisées avec des
antigènes de
cardiolipide, de lécithine
et du cholestérol dilués
en tampon phosphate
R2 Positive control Contrôle positif 1flacon 1flacon
Sérum humain contenant 1ml 2ml
des anticorps associés
aux T pallidum, négatif
en AgHBs, anti-HIV-1/2
et anti-VHC dilué en
tampon phosphate
R3 negative control Contrôle négatif 1flacon 1flacon
Sérum de lapin dilué en 1ml 2ml
tampon phosphate
Compte-goutte 1 1
(réutilisable)
Aiguille de 1 1
distribution(réutilisable
)
Cartes de test (10 10 50
cercles)
La trousse doit être conservée à +2-8°C, stockée les flacons verticalement.

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  Prélèvement

Les échantillons de sérum ou plasma (EDTA, Citrate de Sodium, Héparine de

Sodium) ne doivent pas contenir les cellules sanguines. Ils peuvent être stockés
entre +2 à 8°C jusqu’à 7 jours avant d’être testés. Les échantillons devant être
conservés plus longtemps devront être congelés à -20°C.

 Procédure
Matériel

Micropipette et cônes pouvant distribuer un volume de 50µL, solution saline à

0,9%, agitateur rotatif pour rotation des cartes de test à 100 t/min sur un cercle
d’environ 1cm de diamètre, dispositifs de compte-gouttes et aiguille
correctement étalonnés et entretenus pour la distribution des particules de
charbon.

Mode opératoire

Utiliser les contrôles positifs (R2) et négatifs (R3) pour chaque série de test.

 Test qualitatif
1- Placer 50µL d’échantillon ou de contrôle dans un cercle sur la carte de
test.
2- Etaler régulièrement l’échantillon et les contrôles sur la surface du cercle
sur la carte.
3- Agiter le flacon de RPR Antigen pour bien l’homogénéiser, juste avant de
l’utiliser afin d’éviter la sédimentation.
4- Monter l’aiguille de distribution sur le flacon compte-goutte en plastique
et aspirer le RPR Antigen.
5- Retourner le flacon compte-goutte et presser légèrement pour chasser l’air
de l’aiguille.
6- En maintenant verticalement le flacon compte-goutte au-dessus de
l’échantillon (sur la carte), distribuer une seule goutte d’antigène.
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 7- Placer la carte sur un agitateur de carte et agiter à 100 tpm pendant 8
minutes.
8- Lire immédiatement et interpréter visuellement les résultats sous un bon
éclairage. (Se référer à l’interprétation des résultats)

Si la lecture n’est pas immédiatement, la carte doit être maintenue sur l’agitateur
de carte jusqu’à 15 minutes.

9- Transférer l’antigène non utilisé du flacon compte-goutte dans son flacon

initial.
10- Nettoyer le flacon compte-goutte et l’aiguille à eau distillée et
laisser bien sécher avant de les utiliser à nouveau.
 Test semi-quantitatif
1- Préparer des dilutions de raison 2 en solution saline (0,9%) à partir de
l’échantillon non dilué jusqu’à la dilution au 1/16.
2- Déposer 50µL de chaque dilution et contrôles dans des cercles distincts
sur la carte de test.
3- Etaler régulièrement chaque dilution sur tout le cercle.
4- Continuer comme pour le test qualitatif à partir de la section 3.

Le titre de l’échantillon sera exprimé en inverse de la plus haute dilution pour

laquelle on aura constaté une agrégation des particules de charbon.

Si la plus haute dilution testées (1/16e) est réactive, procéder avec une autre série
de dilution en préparant des dilutions au ½ de l’échantillon avec une solution
saline à 0,9% du 1/32e au 1/512e.

Bien homogénéiser et reprendre à partir de l’étape 2 du test semi-quantitatif.

Utiliser le contrôle positif (R2) et contrôle négatif (R3) pour valider l’essai.

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 Interprétation des résultats

Les échantillons réactifs seront interprétés comme positifs et devront être

soumis à d’autre tests (étant donné la non-spécificité des anticorps détectés) afin
de déterminer la présence ou l’absence d’anticorps anti -tréponémique
spécifiques. Pour que l’essai soit valide, le contrôle positif fourni doit donner un
résultat nettement positif et le contrôle négatif un résultat nettement négatif.

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 Test qualitatif (liquide cérébrospinal réticulaire)

Selon le kit VDRL Antigen MR (Cromatest)

1- Préparer une suspension saline à 50% de l’antigène (Ex : 0,5ml de VDRL

Antigen MR +0,5ml de solution saline)
2- A l’aide d’une pipette automatique placer 50µL de chaque échantillon
dans un cercle séparé sur plaque. Employer un embout différent pour
chaque échantillon et jeter après utilisation.
3- Comme décrit dans les étapes 5-6 pour le test qualitatif (sérum ou
plasma), fournir 1 goutte d’antigène à chaque cercle à coté de
l’échantillon à examen.
4- Mélanger le contenu de chaque cercle à une baguette à usage unique et
répartir le mélange sur toute la surface du cercle. Utiliser différentes
baguettes pour chaque mélange.
5- Placer la plaque sur un rotateur mécanique et tourner à 180 rpm pendant 8
minutes.
6- Observer visuellement si la floculation et les résultats sont confirmés par
l’examen microscopique (100X).

Lecture

Non-réactif : les particules demeurent en suspension dispersée sans agrégats

évidents.

Réactif : dans un résultat positif même légèrement des blocs évidents

marqués et intenses sont vus.

Limites du test

Aucun test ou standard de référence n’est disponible pour chaque stade de

la maladie. Ainsi, le diagnostic de la syphilis repose essentiellement sur des tests
sérologiques, exigeant des résultats à la fois non tréponémique et tréponémique.
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Des réactions faussement positives peuvent être observées dans le cas où la
lecture ne se fait pas immédiatement après agitation de la carte.

Les tests RPR non-tréponémique ne sont pas spécifique de la syphilis. Il est

recommandé pour tous les échantillons trouvés positifs selon les critères
d’interprétation du test RPR de vérifier la spécificité de la réaction en utilisant la
méthode : Treponema pallidum par hemagglutination passive (TPHA).

V- Traitement de la syphilis
 Pénicilline G benzathine pour la plupart des infections
 Pénicilline aqueuse pour la syphilis oculaire ou la
neurosyphilis
 Traitement des partenaires sexuels

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 CONCLUSION

La syphilis est causée par le spirochète Treponema pallidum et caractérisé

par 3 stades symptomatique séquentiels séparés par des périodes d’infection
latente asymptomatique. Les manifestations habituelles comprennent des
ulcérations génitales, des lésions cutanées, une méningite, une maladie aortique
et des syndromes neurologiques. Le diagnostic repose sur les tests sérologiques
et autres tests selon le stade de la maladie. La pénicilline est le médicament de
choix.

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 Références
1- Biolabo.(2014).TPHA. Récupéré sur
Biolabo :https://www.biolabo/fr/biolabo/pdfs/noticesFR/syphilisFR
/FT%204500100%20TPHA.pdf
2-
3- Larsen AS.,Petit, et Coll, EDTA-treated plasma in the Rapid
Plasma Reagin card test and the toluidine red unheated serum test
for serodiagnosis of syphilis.J Clin Microbiology 1983,17,431-5.
4- Boulevard Raymond Poincaré, kit pour la detection qualitative et
quantitative des anticorps, reagine, non, treponémaux associés à la
syphilis dans le serum ou plasma humain par agrégation
macroscopique sur des cartes de tests jetables. www.bio-rad.com:
2014.
5- LINEAR CHEMICALS, S.L.U. Joaquim Costa 18 2a
planta.08390Montgat SPAIN. www.linear.es NIF-
VAT :B60485687

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