Plan

1-Introduction

2-Les techniques d'analyse de la syphilis

a) Technique de TPHA
b) Technique de VDRL

3-Les techniques d'analyse de VIH

a) Test rapide de VIH
b) Technique de Western Blot

4-Conclusion
 Inroduction

Afin de clôturer nos trois années d'études en filière « Techniciens de

laboratoire », nous avons passé un stage de professionnalisation, qui a englobé
pusieurs modules, dont ona passé un en service de sérologie, ce stage d'une durée
de 6 Jours, au niveau de
CHR Agadir.
Le but de ce rapport n'est pas de faire uniquement une présentation exhaustive
de tous les aspects théoriques qu'on a pu apprendre ou approfondir, mais aussi, des

aspects pratiques.
La sérologie est un examen de biologie médicale utilisant le sérum pour établir
des diagnostics médicaux. Elle est basée sur la recherche d'anticorps
spécifiques (IgM ou IgG), afin de de
pouvoir poser un
diagnostic de
maladie
ntectieuse, de suivre l'évolution d'une maladie ou encore de vérifier l'efficacité des
vaccinations. Les virus les plus diagnostiqué dans ce service sont la syphilis et le
VIH
La syphilis non traitée est une maladie systémique contagieuse caractérisée
par des stades cliniques séquentiels ajoutés aux années de latence. L'infection,
causée par la bactérie Treponema pallidum, est endémique dans plusieurs parties
du monde et continue de rester un
problème de santé publique.
Le VIH, ou virus de l'immunodéficience humaine, est un type de virus qui peut
causer une maladie appelée SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise).
Linfection au VIH atteint le système immunitaire. Si elle n'est pas traitée, de
graves maladies peuvent survenir. Des infections normalement anodines, comme
une grippe ou une bronchite, peuvent s'aggraver, devenir très difficiles à traiter ou
même entraîner le décès. De plus, le risque de cancer est aussi accru.

-Alors quels sont les techniques qui permettent leur diagnostic et leur
confirmation ?
 Les techniques d'analyse de la syphilis :
a) TPHA

LeTPHA (Treponema Pallidum Hemagghutination Assay) un test biologique quantitatif

spécitique de lespèce Treponema Pallidum utilisé pour le dépistage de la syphilis,
On associe généralement le test spécifique (TPHA) et un test non spécifique (VDRL)
pour confirmer le diagnostic de syphilis.

o Principe

Le test TPHA est test d'agglutination directe passive utilisé pour la recherche des
un

anticorps de Tréponème pallidum dans le sérum/plasma humain. Ce sont des anticorps

sériques anti-polyoside, dirigés contre l'antigène polyosidique;

Des érythrocytes de poulet sont sensibilisés par des composants

antigéniques de T. pallidum pathogène

"Les anticorps spécifiques de T. pallidums éventuellement présents dans le

sérum vont s'unir à ces cellules « test » provoquant l'hémagglutination des
particules, visible facilement à l'ceil nu.

En l'absence d'anticorps, les cellules forment un bouton compact au fond du

puits.
 Cinétique:
Le TPHA se positive vers 3-4ème senmaine après le début de l'nfection (environ 1
semaine après l'apparition du chancre).
Figure T: Evolufion des anticorps dans une syphilis non traitee
Titre des anticorps

FTA
TPHA

VDRL

temps
Chancre 2 moiss 4 mois

Contamination
Titre des anticorpps

FTA
TPHA

VDRL

temps
Chancre 2 mois 4 mois

Evolution des anticorps dans une syphilis traitée

Ce test reste positif après traitement. I permet de porter le diagnostic de

syphilis mais pas de distinguer une syphilis active d'une " cicatrice

sérologique".
 Mode opératoire:
Ajouter 190 uL de diluant et 10 uL de sérum dans le puits 1.

Transfêrer 25 pL de cette dilution dans le puits 2 et 3.et mélanger

Prélever 25 uL de sérum dilué du puits 2 et diluer en aliquotes de 25 uL de
manière répétée pour tous les puits, en rejetant 25 uL de la dilution du dernier
puits.
Ajouter à chaquepuits 75 L de cellules test. Ceci conduit à une dilution
1/80 dans le puits 1,
1/60 dans le puits 2,
1/320 dans le puits 3...

Homogénéiser mécaniquement ou manuellement le contenu des puits.

Couvrir la plaque et la placer à l'abri de la lumière, de la chaleur
Incuber 45-60 minutes à température ambiante. Lire les résultats.

Lecontrôle:
25 uL des contrôle (-) + 75 des cellules contrôle Négatif

25 uL des contrôle (-) + 75 des cellules test Négatif

25 L des contrôle (+) + 75 des cellules contrôle Négatif

25 uL des contrôle (+) + 75 des cellules test Positif

 Résultats:
TPHA positif: Voile couvrant le puits.
TPHA négatif: Absence de voile.

Positve Control0000 Tests

Negative Control

b)-VDRL
Un test non tréponémique utilisant des antigènes lipoïdiques (cardiolipin,
lécithine et cholestéro) qui floculent avec 1'immunoglobuline M ou G
Ces anticorps, appelés réagines, sont produits lors de l'invasion des tissus de
T'hote.
VDRL est plus sensible que le TPHA. I1 utilise un antigène
cardiolipine-lécithine-cholestérol purifié pour détecter les anticorps anticardiolipine
produite par une infection tréponémique.

Avantages:
o Peu coûteux,
o Simple
o Adapté au dépistage de masse

Réactifs:
Suspension stabilisée contenant des cardiolipides
Contrôle positif: sérum immunitaire humain.
Contrôle négatif: sérum animal non réactif de réagine plasmatique.
 VDRL Test

OO J

OOOOO
RPR-CANBON

laatlnhast

PROCEDURE:
Test Qualitatif (sérum ou plasma)
Porter les réactifs et les échantillons à la température ambiante.
A l'aide d'une pipette automatique placer 50 OL de chaque échantillon dans un cercle
séparé sur la plaque.
Serrer doucement le flacon de distribution et fournir 1 goutte d'antigène à chaque
cercle à côté de l'échantillon à examiner
Mélanger le contenu de chaque cercle à une baguette à usage unique et répartir le
mélange sur toute la surface du cercle.
Placer la plaque sur un rotateur mécanique et tourner à 180 r.p.m. pendant 4 minutes.
"Observer visuellement la floculation et les résultats sont confirmés par l'examen au
microscope (100x).

Lecture:
Non-réactif: Les particules demeurent en suspension dispersée sans agrégats
évidents.
Réactif: Dans un résultat positif même légère

Test Quantitatif (serum ou plasma)

Pour chaque échantillon placer avec une pipette automatique 50 L de solution saline à
0,9% dans chacun de 5 cercles sur la plaque de réaction.
Dans le cercle 1 ajouter 50 L d'échantillon à la solution saline, , mélanger la solution
transférer 50 L du mélange à la solution saline dans le second cercle.
Continuer les dilutions en série de façon similaire jusqu'au cinquième cercle, et jeter
50 L de ce cercle.
Les dilutions finales des échantillons seront : 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32.
 Lecture titre de l'échantillon est
Pareil que dans le qualitatif (sérum ou plasma).Le
test
montre une réactivité. La prochaine
rapporté comme dilution la plus élevée qui
dilution la plus élevée devrait être négative.
S i la dilution la plus élevée examinée est
réactive répéter le test en
au 1:16.
commençant par une dilution préliminaire

L e contrôle positif doit produire une floculation claire.

.Le contrôle négatif ne doit pas présenteruneJloctulaton .

Résultat négatif Résultat positif

(microscope optique x 100)
(microscope optique x 100)

Sources d'erreur
touchés les
plaques de test devraient ne jamais être
avec
Les cercles des
doigts
N e pas réaliser le test près des systèmes de chauffage ou les climatiseurs pour

éviter des réactions positives fausses

l'excès de l'échantillon, les réactifs
L e défaut de fonctionnement de rotateur,
froids la température de chambre froide, et l'antigène périmé

Limites dutest VDRL:

La fausse négativité due au phénomène de la prozone, l'interprétation subjective
l'automatisation sont quelques autres limitations de ces tests.
et l'inadaptation à

Algorithme pour le diagnostic dela syphilis selonla pratique

 TPHA Sérologie négative

VDRL-

TPHA+ Syphilis traitée (1)

Syphiis non traitée

TPHA+- ou traiée tardivement
(2)

VDRL+
Syphilis primaire 3)
TPHA
(chancre)

Faux positif en VDRL

(anticorps anti-
cardiolipidiques)

Groupe1 des réactions faussement

Peut comporter également les patients ayant
positives en TPHA
difficile, et les réactions
Les syphilis latentes tardives dont le diagnostic est parfois
des
croisées avec les tréponématoses non vénériennes chez les patients originaires
zones d'endémies.

Groupe2
Lorsque les taux d'anticorps sont élevés le diagnostic est aisé surtout si les signes
cliniques sont évocateurs
En l'absence de signes cliniques, lorsque les taux d'anticorps sont faibles

l'interprétationdes sérologies est plus délicate. Le diagnostic reposera sur la

notion de syphilis acquise antérieurement de prise d'antibiotiques, la comparaison
avec d'éventuelles sérologies antérieures.

Groupe 3:
Le profil le plus fréquemment rencontré au stade de syphilis primaire est VDRL+
et TPHA+, mais au stade très précoce de la syphilis primaire, on peut observer,
plus rarement, le profil VDRLt, TPHA-. Le diagnostic à ce stade sera basé
d'abord sur la clinique.
Les techniques d'analyse de VIH:
a)Letest rapide:

Principe:
Le test première réponse HIV 1+2/ Syphilis Combo Card est basé surle
principe de l'immunochromatographie pour la détection qualitative des
anticorps((gG et IgM) spécifiques des VIH 1 &2 et/ou de la syphilis.
La membrane de nitrocellulose est recouverte d'un cocktail d'antigènes
recombinants pour le VIH 1 (gp41) et le VIH 2 (gps6) au niveau de laligne de
test " HIV " et d'antigènes recombinants (P47, P46, P17, P15) spécifiques du

Treponema pallidum au niveau de la ligne de test " Syp " et d'un réactif de

contrôle au niveau de la ligne de contrôle " C".

Lorsque l'échantillon de sérum, de plasma ou de sang total est déposé dans

le puits du dispositif de test, le cocktail d'antigène recombinant VIH 1+2 (gp41
et gp36) et du conjugué réagit avec les anticorps spécifiques du VIH et/ou de
la syphilis, sils sont présents dans l'échantillon.
Le complexe antigène-anticorps-CGC et le tampon de test se déplacent le

long de la membrane par chromatographie jusqu'aux zones de test et forment

une ligne visible de couleur violette au fur et à mesure que le complexe
antigène-anticorps-CGC se forme avec un haut degré de sensibilité et de

spécificité.
Mode opératoire:
1. S'assurer que le dispositif de test et les
autres composants sont à température
ambiante (20°C à s0°C).

e. Identifier le dispositif de test avec le numéro

du patient.
3. Placez le de test
dispositif sur une surface

plane, propre et sèche.

5. Ajoutez une goutte (20ul) de sang
total/sérum/plasmna dans le puits

d'échantillon (S).
6. Ajoutez deux gouttes de tampon de dosage
ans le puits de l'échantillon (S).
Result at 15-25 min.
7. Laisser agir pendant 15 minutes.

8. Observer les résultats.

Interprétation

La ligne d e t e s t " HIV"

Absence de
Trait violet
coloration

Positif Négatif

" "
La ligne de test Syp

Absence de
Trait violet colorationn

Positif Négatif

La ligne de contrôle de couleur violette apparaît indépendamment de

la réactivité ou de la non-réactivité de l'échantillon. La ligne de contrôle
est un contrôle de procédure, elle sert à démontrer le fonctionnement des
réactifs et la migration correcte du liquide.

bWesternblot
Principe
Le principe du western blot est l'interaction entre les protéines et les sondes
utilisées pour la détection des protéines.
Les protéines sont séparées par électrophorèse de gel pour les obtenir sur
une matrice de gel.
Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose ou
de tluorure de polyvinylidène où elles sont immobilisées: le buvardage.
La protéine sur la membrane peut être détectée par l'utilisation d'un
anticorps primaire étiqueté rapporteur dirigé contre la protéine ou d'un anticorps
secondaire étiqueté rapporteur dirigé vers >'anticorps primaire.
Le signal ou la couleur généré parla sonde nécessite un système de détectio
adapté au signal ou àlintensité généré.