DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE DE LA SYPHILIS

3ème année TLP/BM

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 Méthode TPHA
(Treponema Pallidum Hemagglutinations Assay)

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 Plan
I. Introduction
II. Principe
III. Réactifs et Matériels
IV. Echantillon
V. Précautions
VI. Contrôle de qualité
VII.Techniques
VIII.Interprétation des résultats

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 I. Introduction
❑ C’est un test à antigène tréponémique, semi-quantitatif plus
spécifique mais moins sensible, positif 12jrs après le chancre.
❑ Elle consiste en une hémagglutination passive entre des
hématies d’animaux (mouton ou volaille) sensibilisées par le
Treponema pallidum et les anticorps contenus dans le sérum
du patient.
❑ Le titre est donné par l’inverse de la dernière dilution positive
qui correspond à une hémagglutination.
❑ La lecture est moins rapide que le RPR et les résultats sont
rendue en inverse de la dilution.

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 II. Principe
❑ L’antigène constitué par un lyophilisat de Treponema pallidum
est fixe sur les hématies formolées et tannées.
❑ Lorsqu’un échantillon positif dilué est mélangé avec la
suspension d’hématies test, les anticorps dirigés contre
l’antigène entraînent une agglutination des hématies.
❑ Les hématies forment un réseau caractéristique au fond des puits
de la plaque de micro titration.
❑ En l’absence d’anticorps, les hématies forment un bouton
compact au fond du puits.
❑ Des hématies tannées non sensibilisées sont utilisés comme
cellules de contrôle.
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 III. Réactifs et matériels
❑ Hématies sensibilisées
❑ Hématies non sensibilisées
❑ Sérum de contrôle positif
❑ Sérum de contrôle négatif
❑ Diluant
❑ Plaque de microtitration en U.
❑ Pipettes permettant de délivrer des volumes de 25 et
100 μl.
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 IV. Echantillons
❑ Prélever du sang veineux chez le patient à tester et
attendre la formation et la rétraction du caillot.
❑ Les sérums doivent être clairs et exempts de toutes
particules.
❑ Les échantillons qui ne sont pas testés le jour
même, peuvent être conservés à 2–8°C pendant 3
jours. Au delà, congeler à –20°C, pendant 4 à 6
semaines au maximum.

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❑ Ne pas utiliser d’échantillon hémolysé ou
contaminé.
❑ Les échantillons congelés et décongelés plusieurs
fois peuvent présenter une baisse du taux
d’anticorps.
❑ Ne pas utiliser de plasma.

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 V. Précautions
❑ Les réactifs peuvent contenir de l’azoture de sodium, utilisé
comme conservateur.
❑ L’azoture de sodium est toxique et peut réagir avec les
canalisations en plomb ou en cuivre pour donner des composés
potentiellement explosifs.
❑ Pour prévenir l’accumulation de ce composé dans les
canalisations, l’éliminer avec un rand volume d’eau.
❑ Les précautions d’usage doivent être respectées lors de la
manipulation des sérums humains.
❑ Les Pipettes, plaques, etc . . . doivent être éliminés dans un
désinfectant à base d’hypochlorite.
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 VI. Contrôle de qualité
❑ Pour vérifier la validité des suspensions de hématies test et
contrôle, les contrôles positif et négatif fournis doivent être
utilisés une fois par jour avant de tester les échantillons.
❑ Le sérum de contrôle positif entraîne une agglutination des
hématies test en 60 minutes à température ambiante en
formant un réseau caractéristique au fond des puits des
plaques de microtitration.
❑ Aucune agglutination ne doit apparaître en 60 minutes avec
le sérum de contrôle négatif. Un bouton compact de cellules
doit se former au fond des puits des plaques de
microtitration.
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 VII. Techniques
❑ Chaque test nécessite 4 puits
❑ Répartir le diluant sur la plaque de microtitration de la façon suivante:
✓ puits 1 : 25 μl
✓ puits 2 : 100 μl
✓ puits 3 et 4 : 25 μl
❑ Ajouter 25 μl d’échantillon dans le puits 1.
❑ Diluer les échantillons de la façon suivante:
✓ A l’aide d’une pipette multicanaux , mélanger le puits 1 et transférer 25 μl dans le
puits 2.
✓ Mélanger et transférer 25 μl du puits 2 dans le puits 3, mélanger et éliminer 25 μl
du puits 3.
✓ Transférer 25 μl du puits 2 dans le puits 4, mélanger et éliminer 25 μl du puits 4.
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❑ Agiter les flacons des hématies test pour les remettre en
suspension avant utilisation.
❑ Ajouter 75 μl d’hématies test sensibilisées dans le puits 3 et
75 μl d’hématies non sensibilisées dans le puits 4. Les
sérums sont ainsi
❑ dilués au 1/80 dans les puits 3 et 4.
❑ Tapoter doucement la plaque pour mélanger.
❑ Couvrir et laisser repose 45 à 60 minutes (et jusqu’à une
nuit) à température ambiante.
❑ Examiner l’agglutination.
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 Puits

1 2 3 4

Diluant 25µl 100µl 25µl 25µl

Sérum du patient 25µl

Hématies test positif 75µl

Hématies test négatif 75µl

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 VIII. Interprétation Résultats
❑ Résultat positif:
Les hématies agglutinées
forment une couche au fond du
puits.
❑ Résultat négatif
Les hématies non agglutinées
forment un bouton compact au
centre du puits.
fort moyen faible
❑ Résultats positif (faible)
Les cellules faiblement
agglutinées forment un anneau
caractéristique.

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❑ Les résultats du test de dépistage sont exprimés
qualitativement : Négative (-) ; Douteux (+\-) ou
Positif par + a ++++.
❑ Les résultats du test quantitative sont exprimé en
inverse de dilution.

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 Cette photo par Auteur inconnu est soumise à la licence CC BY-NC

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