INTRODUCTION DE L’ENSEIGNEMENT

L’immuno-hématologie est une discipline émergente en Biologie Clinique. Le

développement des techniques pour la recherche des antigènes te des anticorps en
Immuno-Hématologie est plutôt récente. Le professionnel du laboratoire de Biologie
Clinique se doit de d’adapter à l’évolution des disciplines et des techniques. Ainsi, il
s’outillera en matière de détermination des antigènes érythrocytaires et des anticorps anti-
érythrocytaires réguliers mais devra également être en mesure de solutionner les
difficultés liées aux groupages sanguins et les examens complémentaires y afférant parmi
lesquels la recherche et la détection des anticorps irréguliers.

L’enseignement d’Immuno-hématologie capacite l’étudiant dans les techniques

immunohématologiques et lui donne les outils nécessaires à la résolution des difficultés
liées à cette activité. Il abordera dans un premier temps la détermination des groupes
sanguins ABO tel que recommandée. La deuxième séquence décrira comment élucider
les difficultés en cas de discordances dans les groupages sanguins ABO. La troisième
partie se penchera sur la détection des anticorps irréguliers et la 4 e déroulera la démarche
pour l’identification des agglutinines irrégulières.

1
Séquence 1: le groupage sanguin ABO

Objectif spécifique de la séquence

A la fin de la séquence, l’apprenant devrait effectuer et interpréter un groupage sanguin

avec les contrôles recommandés.

Eléments contenus de la séquence

Introduction

I. Les antigènes du système ABO

II. La détermination des groupes sanguins ABO

III. Les préalables à un groupage sanguin ABO

Pré-requis : connaitre les procédures de détermination des groupes sanguins ABO

https://www.youtube.com/watch?v=wfqnNuYIY78

Pré-test : QCM

Vrai Faux
1. Dans l’épreuve de Beth Vincent, sont mis en présence le sérum du patient avec les
hématies tests
2. Les phénotypes A et B ont tous une réactivité identique par rapport aux sérums-
tests.
3. La présence de l’antigène A sur les hématies implique la présence de substances
A dans les secrétions

4. Un patient Rhésus D faible est considéré comme un receveur Rhésus D négatif

5. Les anticorps chauds ont une température optimale de réaction de 37 degrés
Celsius
6. Les charges électrostatiques négatives sont maintenues à la surface de l’hématie
par un grand nombre de résidus d’acide sialique
7. Les déterminants antigéniques dans le système ABH sont de nature
oligosaccharidique
8. Le système de groupage sanguin ABH est caractérisé par trois antigènes
9. Il existe une relation réciproque qui lie les antigènes ABO et leurs anticorps dans
le plasma
10. Un patient peut avoir le gène A et présenter un phénotype non A

2
Post-test : QCM

Vrai

1. Le déterminant antigénique de l’antigène B est D-galactose

2. L’apparition de la substance H est soumise à la présence concomitante du gène H
e du gène Se
3. Le phénotype O Bombay : pas d’antigène H mais les gènes codant pour l’Ag A et
l’Ag B sont présents : Ah, Bh, ABh
4. Une différence entre les types A1 et A2 est : il existe un anticorps anti-A1 dans
le sera A2 mais pas dans ceux A1
5. L’absence d’agglutination avec le sérum test anti-A n’indique pas forcément une
absence d’antigène A.

Faux

6. Les substances ABH hydrosolubles sont retrouvées dans la salive des non
sécréteurs
7. Le potentiel zêta diminue les forces de répulsion entre les hématies
8. La réaction négative du témoin SAB valide l’épreuve sérique
9. La présence de macromolécules telles que l’albumine allonge le temps de réaction
Ac-Ag
10. La vérification des réactions du système ABO se fait à 37°c

3
Devoir

Quels sont les groupes sanguins ABH – Rh D des patients suivants?

Epreuve globulaire Epreuve sérique Contrôles Résultats

Patient Anti- A Anti – B Anti-AB Anti - Hem A Hem Hem o Auto- Sérum Groupe sanguin ABH Rh D
D B agglut AB
i (SAB)
nation
1 Positif + Négatif Positif ++ Positif Négatif Positif Négati Négati Négatif
Homme ++ + +++ +++ f f
adulte

2 Négatif Négatif Négatif Positif Négatif Négati Négati Négati Négatif

2 jours f f f
Féminin

3 Négatif Négatif Négatif Positif Positif Positif Positif Négati Négatif

45 ans f
Féminin

4 Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif

26 ans
Masculin

4
I. Les antigènes du système ABO
I.1. Biosynthèse
Un système de groupe sanguin est ensemble d’Ag génétiquement déterminés, présents à
la surface de la membrane des cellules sanguines, regroupés en entités génétiquement
codés et indépendants les uns des autres. Le système ABO est caractérisé par trois
antigènes : Ag H, Ag A et Ag B et la relation réciproque qui existe entre ses anticorps
dans le plasma et les antigènes sur la surface des hématies. Dans le plasma est retrouvé
l’anticorps de l’antigène absent. Les épitopes des antigènes de ce système ABO sont des
oligosaccharides. C’est le seul système de groupe sanguin dans lequel il existe des
anticorps sans stimulation antigénique érythrocytaire. Des gènes situés à trois différents
loci interagissent pour former les antigènes ABH : le gène ABO, le gène Hh et le gène
Se. Les gènes Hh et Se ne font pas partie du système ABO mais influencent la synthèse
des antigènes AB. Ces gènes codent pour des enzymes spécifiques, des
glycosyltransférases (figure 1). Ces dernières ajoutent des oses à un précurseur
(paraglobosideor glycan) (figure 2).

Figure 1 : l’action des glycosyltransférases

5
Figure 2 : Précurseur (paraglobosideor glycan)

Le gène H code pour une L-fucosyl transférase qui ajoute au précurseur un L-fucose
(figure 3)

Figure 3 : formation de l’antigène H

6
L’Ag H ainsi formé est le précurseur des antigènes A et B. Le gène A et le gène B
codent pour deux enzymes qui modifient d’une manière différente l’Ag H pour obtenir
l’Ag A et l’Ag B. La N-acetyl-galactosaminyl transférase ajoute un N-acetyl-galactose à
l’Ag H pour obtenir l’Ag A (figure 4). La D-galactosyl transférase ajoute un D-
galactose à la substance H pour obtenir l’Ag B (figure 5). La biosynthèse des antigènes
ABO est récapitulée sur la figure 6.

La spécificité des antigènes du système de groupage sanguin ABO est déterminée par des
glucides caractéristiques :

o N – acetylgalactosamine pour l’Ag A

o D - galactose pour l’Ag B

Figure 4 : Biosynthèse de l’Ag A

7
 Figure 5: Biosynthèse de l’Ag B

Figure 6 : Biosynthèse des antigènes ABH

L’antigène Ag H est présent chez les individus du groupe O, A, B, AB. Le tableau I

résume les gènes et les phénotypes enzymatique et antigénique du système ABO. Les

8
gènes H et Se sont sur le chromosome 19 et celui ABO sur le chromosome 9. Le gène
sécréteur Se induit la présence des Ag A et B dans les sécrétions

Tableau I : gènes et phénotype du système ABO

génotype (allèles
Phénotype
présents)

gène H gène Enzymatique Antigénique

enzyme H fonctionnelle :

L-fucosyl transférase
O, O O
pas d'enzyme A ni B
fonctionnelle

O,A enzyme H fonctionnelle :

L-fucosyl transférase
enzyme A fonctionnelle : A
A, A
N-acetyl-galactosaminyl
transférase
H,H
O,B enzyme H fonctionnelle :
ou
L-fucosyl transférase
H,h B
enzyme B fonctionnelle :
B, B
D-galactosyl transférase

enzyme H fonctionnelle :

L-fucosyl transférase
A
enzymes A et B
A,B fonctionnelles :

D-galactosyl transférase
B
N-acetyl-galactosaminyl
transférase

9
 pas d'enzyme H
les enzymes A et B peuvent
n'importe
être ou fonctionnelles ou
h,h quelle
pas, mais elles n'ont pas de Ce phénotype, rare, est dénommé
combinaison
substrat, en l'absence phénotype "Bombay"
d'antigène H...

Les phénotypes A et B peuvent avoir des réactivités différentes. Ceux de faibles

réactivités constituent les sous-groupes.

II.2. Sous groupes ABO

Les sous-groupes ABO représentent les phénotypes présentant une faible réactivité avec
les anti-sérum polyclonal humain anti-A, anti-B, et anti-A,B. Cette faible réactivité est
attribuée au nombre de site antigéniques moins nombreux sur la membrane du globule
rouge.

II.2.1. Les sous-groupes A

Les sous-groupes A sont plus fréquents que les sous-groupes B. La classification des
sous-groupes A repose sur :

o le nombre de déterminant antigénique moins important provoquant une absence

ou faible réactivité avec le sérum humain polyclonal anti - A ;
o une agglutination de degré variable avec anti A et anti-B ;
o une présence variable de l’Ag H induisant de fortes réactions avec anti-H ;
o l’absence et la présence de l’anti-A1 dans le sérum.

On distingue: A1, A2, Ax, Aend, Am, Ay, Ael. A1 et A2 qui sont les plus importants
quantitativement 99% dont 80% sont A1. Leurs caractéristiques sont résumées dans le
tableau II. Ils sont régulièrement à l’origine de difficultés lors des groupes sanguins.

Tableau II : Caractéristiques des sous-groupes A

10
Diverses techniques sérologiques permettent de différencier les sous-groupes A :

o La recherche d’Ag A et Ag H grâce à l’épreuve globulaire utilisant les anti-séra

anti-A, anti-A,B, et anti-H;

o La recherche d’isoagglutinines ABO par l’épreuve sérique et la présence

d’ anti-A1;

o Les techniques d’adsorption-élution avec l’anti-A ;

o Les analyses dans la salive pour détecter la présence de substances A et H ;
o Les techniques de biologie moléculaire pour la détection de mutations ou l’étude
des glycosyltransférases.

La démarche d’identification de ces sous-groupes de l’Ag A nécessite l’exclusion de

maladies en cours. La présence des antigènes ABO peut être altérée dans certaines
maladies telles que les leucémies, maladies immunodéficientes, les occlusions
intestinales. L’histoire de la maladie du patient devrait être investiguée pour relever les
paramètres pouvant induire des discordances dans les réactions sérologiques : transfusion
récente, grossesse, médications. L’algorithme différentiel de détermination des
phénotypes A est représenté à la figure 7.

11
Figure 7 : Investigation des sous-groupes A

II.2.2. Sous-groupes B

De la même manière que les sous-groupes A, les sous-groupes B sont déterminés par
l’intensité et le type de réaction avec les sérums anti-B et anti-AB. Les techniques
sérologiques utilisées sont:

o L’épreuve globulaire : intensité de la réaction avec les anti-B, anti AB, anti-H ;
o L’épreuve sérique : présence ou absence isoagglutinines ABO dans le sérum ;
o L’adsorption-élution avec l’anti-B;
o La présence de la substance B substance dans la salive ;
o La biologie moléculaire.

Il a été reporté quatre phénotypes B : B3, Bx, Bm, et Bel. Leurs caractéristiques sont
présentées dans le tableau III.

II.2.3. Phénotypes Bombay (Oh) ou Hnul

Les phénotypes Bombay résultent de la présence d’une double dose du gène h produisant
le gène hh, très rare. La résultante est que l’antigène H ne peut être formé et par
conséquent les Ag A et Ag B non plus sur la membrane érythrocytaire malgré la présence
des gènes A, B et O. Les groupes sont notés OhA, OhB, OhAB en fonction du gène présent.

12
Tableau III: Caractéristiques des phénotypes B

Il existe plus de 130 phénotypes Bombay. Leurs hématies ne réagissent ni avec anti-A, ni
avec anti-B. les réactions sont similaires à celle d’un groupe O mais les hématies O h ne
réagissent pas avec anti-H. Dans le sérum, anti-A, anti-B, anti-AB et anti-H sont présent.
L’anti-H est une IgM active à 37°complément dépendant qui peut causer la lyse en cas de
transfusion à une personne de groupe O. Les substances ABH sont également absentes
dans les sécrétions.

La cause moléculaire est une mutation du gène FUT1 d’où le gène silencieux incapable
de produire la fucosyltransferase, H transférase. Concomitamment, le gène FUT2, gène
Se est également silencieux. Les caractéristiques des phénotypes Bombay sont résumées
dans le tableau IV

Tableau IV : Caractéristiques des groupes Oh

13
 II. Les problèmes potentiels lies au groupage ABO

II.1. La réaction Anticorps-Antigène en Immuno-Hématologie

La réaction Antigène-Anticorps en Immunohématologie est une association de deux

molécules l'épitope ou déterminant antigénique de l’antigène et le paratope de l’anticorps.
Elle nécessite une bonne complémentarité stérique entre les deux sites réactifs. La
réaction Ag-Ac est exothermique, spécifique et réversible. Elle se déroule en deux
étapes: la sensibilisation et la visualisation de cette sensibilisation. La réaction se produit
malgré les forces de répulsion grâce à l’affinité Ag/Ac, la réduction des forces de
répulsion et la théorie de l’eau hydratation. Selon la théorie de l’eau hydratation, les
cellules en solution sont maintenues éloignées par des molécules d’eau étroitement liées à
la surface cellulaire. La force de liaison est inversement proportionnelle à la distance
séparant les molécules d’eau et la membrane cellulaire. Les Ac fixés aux cellules
diminuent la couche d’eau d’hydratation et en conséquence le pouvoir de la cellule à
agglutiner est augmenté : environ 40 molécules d’eau sont déplacées par chaque molécule
d’Ac.

Les facteurs qui influencent une réaction Ag-Ac sont :

o La structure de l’anticorps : IgM, IgG, IgA, liaison au complément ;

14
 o La spécificité de l’anticorps : complémentarité exacte entre le site antigénique et
le fragment fab de l’anticorps, nombre de charges électrostatiques au point
d’interaction de l’antigène et de l’anticorps ;
o La densité de l’antigène ;

o Les forces intercellulaires : force de Van Der Walls, forces électrostatiques =

liaisons ionique, liaisons hydrogènes, liaisons hydrophobes
o Le milieu réactionnel : la température, la force ionique du milieu, la constante
diélectrique, le potentiel zêta

Les globules rouges présentent à leur surface des charges négatives dues à la présence des
molécules COO- provenant notamment des différents antigènes. Ces charges négatives
repoussent les globules rouges entre eux, mais conduisent également à l'accumulation de
cations autour des globules rouges. Ce nuage de cations devient solidaire du globule
rouge. Le potentiel Zêta est la différence entre les charges électriques situées à la surface
des globules rouges et celles du nuage externe (figure 9).

Ce potentiel Zêta influence la possibilité pour les anticorps d'être en contact avec les
antigènes correspondants. In vitro, ce potentiel zêta est augmenté à l'aide d'une
solution de basse force ionique ou diminué par des traitements enzymatiques (bromeline,
papaïne).

Lorsque le potentiel Zêta augmente à l'ajout de solution de basse force ionique, les
globules rouges s'éloignent, permettant d'augmenter l'accessibilité des antigènes aux
anticorps, augmentant ainsi la rapidité de fixation des anticorps. Lorsque le potentiel Zêta
diminue par la réduction des charges sur les acides sialiques dans le traitement par la
papaïne, les globules rouges se rapprochent facilitant l'agglutination des hématies.

Figure 9 : le potentiel Zeta

15
II.2. La réalisation du groupage sanguin ABO

Les groupes sanguins ABO sont définis à la fois par la mise en évidence des antigènes A,
B et H à la surface des hématies et par la présence simultanée des anticorps anti-A et anti-
B ou anti-A+B dans le sérum par agglutination. Il est recommandé de respecter la règle
de 4x4 :

o Deux épreuves différentes : épreuve globulaire ou technique de Beth Vincent et

l’épreuve sérique ou technique de Simonin-Michon ;
o Deux manipulateurs différents travaillant en double aveugle travaillant en double
aveugle avec un plus expérimenté que l’autre ;
o Deux réactifs de fournisseurs différents ou à défaut de deux lots différents ;
o Deux échantillons sanguins différents de préférence prélevés avec 15 jours d’écart
et à distance de maladies pouvant provoquer des discordances.

Le prélèvement pour un groupe sanguin ABO est généralement effectué dans un tube
EDTA mais en situation d’urgence tous les tubes peuvent être utilisés. L’identification du
patient devrait être exhaustive. Les résultats sont enregistrés dans un registre comportant
les rubriques suivantes :

o La date du jour d’exécution de l’analyse;

o Identification du patient : noms, prénoms, date et lieu de naissance,
sexe ;
o Renseignements administratifs : numéro de téléphone, quartier, profession,… ;
o Résultats épreuve globulaire : réactions d’agglutination et interprétation partielle ;
o Résultats épreuve sérique : réactions d’agglutination et interprétation partielle ;
o Résultats des contrôles : réaction avec pool d’hématies O; autoagglutination,
réaction avec le sérum AB (SAB) ;
o Interprétation des deux épreuves ;
o Observations éventuelles ;
o Noms et signatures des manipulateurs.

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Le schéma 10 présente la plaque de réaction du groupage sanguin ABO

Epreuve globulaire de Epreuve sérique Contrôle Contrôl Contrô

BETH-VINCENT de SIMONIN- agglutination e auto- le SAB
MICHON non-spécifique aggluti
au système nation
ABO

Anti-A Anti-B Anti- Plasma Hématie Pool Hématies Plasma Sérum

AB du sB O du AB
+ +
patient patient
+ + + +
Hématie Hémati
+ +
s patient es Hématie Plasma Plasma patient Hématie
patient s patient Hémati patient Hématie s patient
es s patient
patient

Le rapport Ag/Ac est de un volume d’antigène pour deux volumes d’anticorps

Schéma10 : Plaque réactionnelle du groupage sanguin ABO

Pour la lecture et l’interprétation, observer et reporter dans le registre:

- Présence ou absence d’agglutination de chaque réaction. Si agglutination, une

appréciation semi-quantitative des intensités des réactions devraient être
effectuées : +, ++, +++, ++++. Elle permet d’orienter en cas de discordances.
- Présence ou absence d’hémolyse. L’hémolyse est une réaction à ne pas négliger
en Immuno-hématologie.
- Présence d’agglutination mixte ou double population.
- vérifier que les réactions de contrôle de non –spécificité, d’auto-agglutination et
SAB sont négatives. Si non, se référer la procédure des groupes sanguins à
problème et alerter le responsable.
- Comparer les résultats de l’épreuve globulaire et de l’épreuve sérique. Si
concordance avec les contrôles valides, conclure. Si discordance, se référer la
procédure des groupes sanguins à problème et alerter le responsable.

La validation analytique du typage érythrocytaire repose sur :

1. Les résultats conformes des CQI ;

2. L'absence d'ambiguïté réactionnelle avec chaque réactif ;

17
 3. L'absence de double population ;

4. Un profil réactionnel cohérent ;

5. Absence de discordance entre deux réalisations ou à l’intérieur d’une épreuve;

6. Absence de discordance avec des résultats antérieurs.

Certaines vérifications devraient être faites lors la réalisation d’un groupage sanguin
ABO.

II.3. Les préalables au typage érythrocytaire

1. Les réactifs

Les réactifs utilisés doivent être conformes aux caractéristiques et normes définies par la
réglementation en vigueur. Un certificat et un numéro figurant sur les flacons attestent
que le réactif est conforme. Le numéro du clone doit figurer sur la fiche technique et le
flacon. Un numéro normalisé doit figurer sur l'emballage.

Pour chaque série d'analyse, les réactifs utilisés, sérum-tests, pour la détection des
antigènes érythrocytaires des groupes ABO seront testés vis-à-vis d'hématies-tests de
groupe ABO connus. Les hématies-tests, de la même manière, seront testées avec des
sérums connus. Ces contrôles seront réalisés quotidiennement dans les mêmes
conditions techniques que celles des échantillons. Les sérum-tests seront évalués pour
leur avidité, spécificité et leur titre ; les hématies-test pour leur spécificité et intégrité.

a. les sérums-tests :
i. avidité : aptitude à agglutiner rapidement les hématies par la mesure du
temps de réaction Ag/Ac à l’aide d’un chronomètre (< 20 secondes)
ii. spécificité : chaque sérum-test est éprouvé à l’aide d’hématies A et B,
Agglutination uniquement avec l’Ag correspondant
iii. titre : le titre trouvé devrait correspondre à celui annoncé par le fabricant.
b. les hématies-tests
i. spécificité : Chaque sérum-test est éprouvé à l’aide d’hématies A et B,
Agglutination uniquement avec l’Ac correspondant
ii. absence de lyse.

18
Les témoins ou Contrôle de Qualité Interne réglementaires sont effectués à chaque série
dans les mêmes conditions que les patients. Les témoins sont le réactif témoin négatif,
les témoins autologue, allo et le sérum AB.

a. le réactif témoin négatif

La réalisation de tout typage érythrocytaire comporte obligatoirement l'utilisation d'un

sérum-test contenant l'anticorps spécifique de l'antigène à rechercher et d'un réactif
témoin négatif de composition strictement identique au sérum-test fourni par le même
producteur mais dépourvu d'activité anticorpale. Toute réaction positive constatée avec
le réactif témoin remet en cause la validation du typage érythrocytaire et en particulier
toute réaction positive constatée avec le sérum-test. La positivité d'une réaction avec le
réactif témoin peut parfois être le fait d'un phénomène de rouleaux, constaté dans
certaines pathologies lymphoprolifératives où l'excès de synthèse d'immunoglobulines
est responsable d'un empilement en ‘‘pile d'assiette’’ des hématies qui est facilement
distingué au microscope, d'une réelle agglutination. La réalisation du typage après
lavage des hématies permettra de lever cette incohérence et de valider le groupage.

Le plus souvent, la positivité d'une réaction avec le réactif témoin est le fait d'une
sensibilisation in vivo des hématies dont les étiologies sont les suivantes : maladie
hémolytique du nouveau-né, incident immunologique de transfusion sanguine, anémie
hémolytique auto-immune, anémie hémolytique immuno-allergique. Il conviendra dans
ces situations de réaliser les typages avec 2 lots différents d'anticorps monoclonaux de
nature IgM utilisables en milieu salin.

b. Témoin Allo

Deux gouttes de plasma du patient mis en présence de une goutte d’un pool d’hématies
O ; si agglutination alors présence d’un anticorps érythrocytaire dans le plasma autre que
anti -A et anti -B. Ce témoin garantit, s'il est négatif, l'épreuve plasmatique.

c. Témoin Auto

Deux gouttes de plasma du patient sont mélangées à une goutte d’hématies du patient.
Une agglutination indique la présence d’auto-anticorps à explorer.

d. Témoin sérum AB (SAB) ou milieu de dilution d'un réactif monoclonal

Une goutte de d’hématies du patient est mélangée à deux gouttes de sérum de patient AB.
Si la réaction est négative, épreuve globulaire est validée. Si elle est positive, il peut

19
s’agir d’une présence de rouleaux ou une réaction causée par d’autres spécificités
différentes de anti-A et anti-B.

Les CQI de l’épreuve globulaire comportent au minimum un échantillon de groupe A, B

et O. Toute incohérence entre l'épreuve globulaire et l'épreuve plasmatique impose de ne
pas valider le groupe sanguin, de rendre un conseil transfusionnel et d'explorer
l'anomalie.

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