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Univ Blida I.

FSNV Master 1 Microbiologie (2020)


Techniques de base de la biologie moléculaire Polymorphisme
Introduction :
Le polymorphisme exprime une variabilité intra populationnelle.
Il existe des polymorphismes nucléotidiques (révélés au niveau des sites nucléotidiques de la
séquence).
Des polymorphismes biochimiques (affectant la structure d'une enzyme).
Des polymorphismes chromosomiques (affectant la structure des chromosomes) correspondant à
des remaniements non associés à des états délétères (n’entraine pas la mort de l’individu porteur de
l’anomalie).
Un locus est polymorphe lorsqu'il présente plus d'un allèle.
Selon la nature des caractères étudiés et de leur déterminisme génétique, divers outils d’analyse sont
utilisés.
MARQUEURS DU POLYMORPHISME :
Le marqueur génétique, de nature biochimique, chromosomique ou moléculaire, permet de révéler
un polymorphisme.
1- Marqueur biochimique :
L'avènement des nouvelle techniques de biologie moléculaire, telles l'électrophorèse sur gel, a
permis de mettre en évidence qu'une grande proportion des locus enzymatiques était polymorphe.
On appelle alloenzymes les enzymes que l’on différencie par leur mobilité électrophorétique, c'est-
à-dire par leur vitesse de migration, déterminée par leur charge ionique totale de la molécule. Ces
enzymes ont la même fonction et sont codées par un seul gène (locus). Chaque alloenzyme
représente un variant allélique à ce locus.
2- Marqueurs chromosomiques :
Les techniques de cytologie moléculaire et les techniques d'hybridation in situ, à l'aide de sondes
ADN marqués, permettent de les visualisés.
3- Marqueurs moléculaires :
Différentes techniques permettent de repérer et de mettre en évidence des sites polymorphes sur la
molécule d'ADN, extraite à partir d'individus provenant de populations à étudier.
3.1- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism):
marqueurs moléculaires reflétant un polymorphisme au niveau de sites particuliers reconnus par des
enzymes de restriction. Ces marqueurs permettent d’obtenir pour un individu donné un profil de
restriction.
L’ADN est extrait de différents individus à étudier. La digestion enzymatique peut concerner
l’ADN génomique ou l’ADN mitochondrial ou sur une région génomique ciblée après
amplification. Après digestion enzymatique, les fragments de restriction pour chaque échantillon
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sont soumis à une électrophorèse en gel d’agarose ou de polyacrylamide, ce qui permet leur
séparation en fonction de leur taille. Après migration, les fragments peuvent être révélés par
différentes techniques, comme l’utilisation du BET fluorescent aux UV. La variabilité d’un site de
restriction se manifeste par la présence ou l’absence de celui-ci, ce qui se traduit par un
polymorphisme de la longueur des fragments de restriction (Figure 1).

Fig. 1

Exemple:

Fragments de restriction d'un segment de 275-bp du gène ARNr 16S amplifié par PCR et digérés
avec DdeI, HaeIII et HinfI représentant les cinq groupes différents comprenant 5 espèces différentes
d'Enterococcus. Lignes A: Enterococcus faecalis; B: Enterococcus haemoperoxidus;
C: Enterococcus avium; D: Enterococcus faecium; E: Enterococcus ratti; U: fragment non coupé
de 275 pb; Échelle d'ADN de 1: 25 pb; Échelle d'ADN de 2: 50 pb.
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3.2- RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA's):
Proposé en 1990 par Williams et collaborateurs. Elle repose sur la PCR, mais contrairement à une
PCR classique, une seule amorce non spécifique (au lieu de 2 spécifiques) est utilisée. Cette amorce
présente une séquence nucléotidique aléatoire, généralement limitée à 10 nucléotides. En raison de
sa petite taille, l’amorce a une grande probabilité de s’hybrider à des sites complémentaires proches
les uns des autres et en orientation inversée sur l’ADN matrice. Pour un génome donné, il peut y
avoir un certain nombre de sites d’hybridation pour cette amorce. A la fin de cette RAPD, un profil
multi locus est obtenu. Les produits d’amplification varient en longueur et par la nature de leur
séquence. L’application de cette technique ne nécessite pas de connaissance au préalable du génome
étudié. Les produits d’amplification obtenus (200 à 2000pb) sont analysés par électrophorèse sur gel
d’agarose ou acrylamide. A chaque fragment correspond un locus. L’absence d’un fragment peut
être liée à un changement nucléotidique intervenu dans les sites complémentaires des amorces
utilisées. Le mauvais appariement entre les amorces et l’ADN empêche alors l’amplification.
La RAPD permet l’obtention d’un grand nombre de marqueurs identifiables simultanément,
utilisables soit en génétique des populations soit pour la constitution des cartes génétiques (Figure
2).

Fig. 2

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Exemple

Produits amplifiés de neuf isolats sauvages de soja Colletotrichum. truncatum de différents états brésiliens. Profils
RAPD générés par l'amorce OPA-11 (A) et l'amorce OPA-18 (B).
Les colonnes C à D représentent des isolats de l'état de Paraná; Colonne H, de l'état de Goiás; Colonnes G et F, de l'État
de São Paulo; Les colonnes I et E, respectivement de l'État de Mato Grosso et de Minas Gerais; Colonnes M et N,
marqueurs moléculaires et contrôle négatif, respectivement. Les flèches indiquent certaines bandes polymorphes.

3.3- AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism):


La technique permet la détection du polymorphisme de fragments de restriction par PCR et de
générer des marqueurs moléculaires. Aucune information préalable sur le génome étudié n’est
nécessaire. L’ADN extrait est digéré par 2 enzymes de restriction (en général MseI et EcoRI). Des
adaptateurs sont liés à chacune des extrémités et les fragments d’ADN sont liés. Les adaptateurs
deviennent donc des séquences incluses dans le génome à étudier. Selon la taille du génome, la
procédure de digestion-ligation peut générer des centaines de fragments avec adaptateurs. Une
fraction du génome est ensuite amplifiée pour permettre une visualisation par électrophorèse. Les
amorces utilisées sont complémentaires de la séquence des adaptateurs et sont étendues d’1 à 3
bases arbitrairement choisies, ce qui réduit le nombre de fragments amplifiés. Les produits d’AFLP-
PCR sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose ou de polyacrylamide. Le génotypage
automatique sur un séquenceur permet une analyse optimale. Les AFLP, bien qu’étant des
marqueurs dominants, permettent de réaliser des études en systématique, en génétique des
populations ou pour le génotypage d’échantillons (Figure 3).

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Fig. 3

Processus de la technique:

- Digestion de l’ADN par les


enzymes qui générent de nombreux
fragments de restriction

- Hybridation des adaptateurs aux


produits de restriction obtenus

- Pré-amplification avec des


amorces rallongées d’1 nucléotide

- Amplification sélective finale avec


des amorces rallongées de 2 à 3
nucléotides sélectifs. Les Amorces
EcoRI sont marqués

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Exemple :

Analyse de la population F2 d’une culture de soja, par le marqueur AFLP. Les deux lignes de gauche désignées par Mi
et Mo correspondent aux parents, Mi et Mo, respectivement, avec une combinaison d'amorces AFLP, E35 (GAG) et M7
(CTG). Les lignes 3-21 ont été générées à partir de la population F2 avec la même combinaison d'amorces. Les flèches
sur le côté gauche du gel indiquent les marqueurs AFLP cartographiés. Le marqueur de taille HaeIII est indiqué dans la
ligne indiquée par M avec la taille (en bp) sur le côté droit du gel.

3.4- SNP (Single Nucleotid Point) : sites de mutations uniques ne touchant qu'une seule paire de
bases.
Ils sont répartis le long du génome aussi bien dans des séquences codantes que non codantes. Leur
mise en évidence permet de révéler le polymorphisme.

Les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) constituent la forme la plus abondante de variations
génétiques dans le génome humain. Ils représentent plus de 90% de toutes les différences entre in-
dividus. C'est un type de polymorphisme de l'ADN dans lequel deux chromosomes diffèrent sur un
segment donné par une seule paire de bases.

Dans deux génomes humains tirés au hasard, 99,9% de la séquence d'ADN est identique. Les 0,1%
restants contiennent des variations de séquence dont le type le plus commun est le polymorphisme
pour un nucléotide (SNP). Les SNP sont stables, très abondants et distribués uniformément dans

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tout le génome. Ces variations sont associées à de la diversité entre populations ou individus, une
différence de sensibilité à des maladies et la réponse individuelle aux médicaments.

De nombreux SNP ont été mis en évidence lors de l'étude de sujets sains et malades portant des
allèles différents d'un gène donné. Il existe aujourd'hui de nombreuses méthodes pour mettre en
évidence des différences d'un nucléotide. Une des plus performante actuellement est l'usage des
puces à ADN. Il existe de très nombreuses connues, à l’exemple de celle responsable de l’anémie
falciforme (Figure 4)

Figure 4. Différence entre la séquence de β-globine normale (A) et mutante (S) de l'anémie
falciforme et identification de chaque allèle

En moyenne un SNP est rencontré tous les 100 à 1000 nucléotides. Il y en a de l'ordre de 5 x
106 dans le génome humain. Certaines associations de SNP sont caractéristiques de certaines
populations. La distribution des SNP est au hasard. Dans n'importe quel gène on peut attendre une
moyenne de 10 SNP, mais certains peuvent n'en présenter aucun.

3.5- Les microsatellites ou SSR ou STR ( Single Sequence Repeat ou Single Tandem Repeat):
Courtes régions d’ADN présentant un court motif répété qui peut comporter 2 à 5 nucléotides. Le

motif peut être dinucléotidique (comme (CA)n, trinucléotidique comme (CAT)n ou plus. Les

microsatellites sont présents dans le génome nucléaire de la plupart des Eucaryotes mais également
dans le génome de certains chloroplastes et de quelques mitochondries.

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Fig. 5

La technique de PCR est utilisée pour révéler le polymorphisme des microsatellites. Une paire
d'amorces spécifiques des bordures droite et gauche d'un microsatellite est utilisée pour amplifier le
même microsatellite chez différents individus (Figure 5). En effet, chaque microsatellite est bordé
par des séquences uniques qui lui sont propres (Figure 6).

Fig. 6 Séquences bordantes uniques

Les fragments d'amplification sont ensuite révélés par électrophorèse. Un individu B, possédant
plus d'unités de répétition que A, a un produit d'amplification qui migre plus lentement que A
(Figure 5).