Université Mohamed Ier, Faculté des sciences

Département de Biologie
Master Physiologie et Ethnopharmacologie
Oujda, MAROC

MEMOIRE
En vue d’obtention du diplôme de Master en Physiologie et Pharmacologie

Présenté par
Mohammed LAKSILI

Contribution à l'étude de l’activité antimitotique, l'étude

toxique et l'étude de l'activité antispasmodique de
quelques tripodes de synthèse.

Sous la direction du
Dr. Ahmed MELHAOUI

Professeur à la Faculté des Sciences d’Oujda

Membres du jury :

- Mr Ahmed MELHAOUI Président

- Mr Mohammed AZIZ Examinateur
- Mme Nadia GSEYRA Examinateur

Date de soutenance :…./07/2011
 Dédicace

A mes très chers parents, à qui je dois tout mon respect

et mon amour

A mes frères Abdessamad, Kamal, Kaoutar,

Fatimazahra et Chaimae.

A tous mes amies et amis de ces 2 années en Master.

2
 REMERCIEMENTS

Au terme de ce travail, qu’il me soit permis d’exprimer mes

plus vifs remerciements à :

Monsieur le Professeur Ahmed MELHAOUI directeur du laboratoire

de Phytochimie et de Pharmacognosie à l’université Mohammed Ier
d’Oujda, pour avoir accepté de diriger ce travail et avoir bien voulu y
consacrer son temps, ses conseils et sa précieuse aide tout au long de
la conduite de cette étude.

Nous remercions vivement Monsieur le Professeur Mohammed AZIZ

pour son aide pour la maîtrise des techniques histologiques et sans qui
notre étude cytologique n’aurait pu être réalisée. Ses conseils et ses
encouragements ont été bénéfiques pour la réalisation de ce travail.
Qu’il soit assuré de notre gratitude pour avoir bien siéger parmi les
membres de notre jury.

Mme Nadia GSEYRA, professeur à la faculté des sciences d’Oujda,

pour avoir bien voulu faire partie des membres du jury

Nous remercions également Monsieur le Professeur Fouad MALEK,

directeur du laboratoire de Chimie organique, Macromolécules et
Produits Naturels pour son aide efficace et son dévouement au cours
de la réalisation de ce travail.

Enfin, notre reconnaissance s’adresse aussi à tous ceux qui ont

participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail.

3
 Résumé

Les deux tripodes pyrazoliques L1 et L2 appartiennent aux familles des

dérivés de pyrazole connues par leurs nombres effets biologiques (anti-
inflammatoire, analgésique, antipyrétiques et antimicrobienne).
L’objectif de notre travail s’inscrit dans l’évaluation de l’activité
antimitotique, l’activité spasmolytique et la recherche de la toxicité des tripodes
L1 et L2.
L’étude de l’activité antimitotique a été réalisée à l’aide du phytotest
Lepidium sativum, cette étude a montré que ces tripodes sont des substances
antimitotiques.
L’étude de l’activité toxique par le test Brine shrimp a été réalisée. La
CL50 24 heurs pour le tripode L2 est de l’ordre de 15,62 µg/ml, et la Cl 50 du
tripode L1 est de l’ordre 312,5 µg/ml.
L’étude sur l’effet spasmolytique de ces deux molécules, montre que L1 et L2
sont des substances antispasmodiques.
Le test antimitotique a été complété par une étude histologique qui
montre que les tripodes L1 et L2 sont des agents antimitotiques.
Cette étude a été réalisée dans le laboratoire de Phytochimie et de
Pharmacognosie sous la Direction du Professeur Ahmed MELHAOUI.

Mots clés : Tripode pyrazolique, dérivés de pyrazole, activité antimitotique,

phytotest, activité antispasmolitique, test Brine shrimp.

4
 Abstract

The two tripods pyrazole L1 and L2 belong to the families of pyrazole

derivatives known by their number of biological effects (anti-inflammatory,
analgesic, antipyretic and anti-microbial).
The objective of our work is part of the evaluation of antimitotic activity,
spasmolytic activity and research of the toxicity of tripods L1 and L2.
The study of the antimitotic activity was performed using the phytotest
Lepidium sativum, this study has shown that these tripods are antimitotic
substances.
The study of the toxic activity by Brine shrimp test was performed. LC50 24
hours for the tripod L2 is in the range of 15,62 µg/ml and the IC50 of the tripod
L1 is about 312,5 µg/ml.
The study on the spasmolytic effect of these two molecules shows that L1 and
L2 are antispasmodic substances.
Antimitotic test was completed by a histological study showing that the tripod
L1 and L2 are antimitotic agents.

This study realized under the supervision of Professor and Doctor Ahmed
Melhaoui responsible of the laboratory of Phytochemistry and Pharmacognosy.

Keywords: Tripod pyrazole, pyrazole derivatives, antimitotic activity, phytotest,

antispasmolitique activity, Brine shrimp test.

5
 Table de Matières

Introduction
Chapitre I : généralité
I. Etude cytostatique
1. Rappel sur le cycle cellulaire
 L’INTERPHASE
a. La phase G1
b. La phase S
c. La phase G2
 LA MITOSE :
a. La prophase :
b. La métaphase :
c. L’anaphase :
d. La télophase :
2. Dérèglement et arrêt du cycle cellulaire
2.1 Agents mitoclasiques ou poisons de fuseau
2.2 Agents antimitotiques
II. Etude toxicologique
Chapitre II : revu bibliographique sur les tripodes pyrazoliques
1. Introduction
2. Synthèse des tripodes pyrazoliques
Chapitre III : Tests biologiques
I. Test antimitotique : Phytotest Lepidium sativum L
1. Description du test
1.2 Description de la plante
1.3 Procédure du test
1.4 Evaluation de l’activité
2. Résultats et discussion
2.1 Evaluation de l'activité antimitotique de L1
2.1.1 Résultats
2.1.2 Interprétation des résultats
2.2 Evaluation de l'activité antimitotique de L2
2.2.1 Résultats
2.2.2 Interprétation des résultats
3. Conclusion
II. Test de toxicité
1. Description du test

6
 1.1 Préparation des nauplii d’Artemia salina
1.2 Procédure du test
1.3 Lecture des résultats
2. Résultats et discussion
2.1 Evaluation de la toxicité du tripode L1
2.1.1 Résultats
2.1.2 Interprétation des résultats
2.2 Evaluation de la toxicité du tripode L1
2.2.1 Résultats
2.2.2 Interprétation des résultats
3. Conclusion
III. Test antispasmodique
1. Introduction
2. Matériels et méthodes
3. Résultats
4. Conclusion
IV. Etude histologique
Conclusion générale
Références 

7
Introduction

Le présent travail fait partie d’un ensemble de recherches effectuées dans

le laboratoire de Phytochimie et de Pharmacognosie.
L’idée principale est de rechercher des activités antimitotiques, des
activités spasmodiques et ainsi l’étude toxique de deux tripodes pyrazoliques
synthétisés au sein de l’équipe de Chimie Bioorganique et Macromoléculaire.
Les dérivés pyrazoliques ont été le sujet de beaucoup de recherche due à
leur importance dans diverses applications. Beaucoup de composés ont été
synthétisés dans un but industriel, biologique et médical.
Plusieurs essais pharmacologiques ont été faits [1, 2, 3] sur plusieurs
tripodes pyrazoliques (figure1) montrent que ces produits sont dotés d’une
activité anticancéreuse.
Ces ligands tridentés montrent de grande analogie structurale avec nos
molécules, ceci nous a conduit à rechercher si ces composés présentaient
également une activité antimitotique et par la suite une activité anticancéreuse.

Figure 1

8
Chapitre I 

Généralité

9
I. Etude cytostatique
1. Rappel sur le cycle cellulaire

Le cycle cellulaire est l’ensemble des modifications q’une cellule subit entre
sa formation par division de la cellule mère et le moment où cette cellule a fini
de se diviser en 2 cellules filles grâce à la mitose. Il comprend donc : interphase
et mitose [4].

L’INTERPHASE :
C’est une période comprise entre la fin de la division et le début de la
suivante, c’est la plus grande partie du cycle, et le noyau est mécaniquement
inactif, elle se décompose en une phase G1, S et G2 [4].

a- La phase G1 :
C’est la phase entre la fin de mitose et début de la synthèse d’ADN, au sein
de cette phase la cellule peut :
* s’engager dans le processus de division, le passage de G1 à la phase S est
irréversible.
* entrer dans la phase G0 où elle reste même des années sans se multiplier.
- La phase G1 est une phase de synthèse :
* la quantité d’ADN reste constante pendent G1 : 2N chromosomes.
* puisque le volume cytoplasmique est faible, la cellule synthétise les molécules
d’ARN (ARNm, ARNr et ARNt) et les protéines nécessaires à l’accroissement
de la cellule [4].

b- La phase S :
Au cours de cette phase il y a :
- Synthèse de l’ADN : réplication de l’ADN.

10
- Synthèse des ARNm des histones.
- Arrêt de la synthèse des autres ARN [4].

c- La phase G2 :
C’est une phase courte qui débute dés que la réplication est activée; la
cellule est diploïde, Cette phase se caractérise essentiellement par des synthèses
d’ARN et de protéines [5].

LA MITOSE :
Au cours de laquelle les chromosomes dédoublés sont répartis dans les
deux cellules-filles, grâce au fuseau de division. Cette phase M est
classiquement découpée en quatre périodes: la prophase, La métaphase,
I’anaphase et la télophase [6].

a. La prophase :
La chromatine se condense tellement qu’il donne l’aspect de l’hétéro
chromatine. Le micro filament s’allonge. La condensation est contrôlé par un
facteur mitotique, c’est une phosphorylation des histones H1 dans le même
temps, le nucléole commence à disparaître progressivement, l’enveloppe
nucléaire se dépolymérise et l’espace membranaire s’élargie. Les micros
filaments et tubules se transformes et le fuseau de division apparaît. Ils
s’agencent autour du centrosome [7].

b. La métaphase :
Les chromosomes sont courts et épais, bien individualisé. Au niveau des
centromères se forment les kinétochores. Le fuseau se duplique, le matériel
micro tubulaire augmente, s’allonge et vienne colonisée les deux pôles de la
cellule : ligne équatorial, plaque équatorial fusorial [7].

11
c. L’anaphase :
Il y a division des centromères, les deux chromosomes se séparent. Ces
chromosomes glissent en direction opposée vers les deux pôles de la cellule [7].

d. La télophase :
Il y a séparation de la cellule en cellules filles avec la disparition et
l’apparition des éléments [7].

2. Dérèglement et arrêt du cycle cellulaire

Les recherches sur les agents susceptibles de troubler le déroulement du
cycle mitotique ont été depuis toujours très nombreuses.
L’arrêt du cycle mitotique peut se réaliser naturellement en G2 et beaucoup plus
généralement, en G1 [8, 9].

2.1 Agents mitoclasiques ou poisons de fuseau

Diverses substances dites mitoclasiques, inhibent le fonctionnement du

fuseau achromatique et produisent avec une grande régularité, le doublement du
stock chromosomique. On donne le nom de stathmocinèse à la mitose aberrante
qu’elles provoquent.
Dans la stathmocinèse, le clivage des chromosomes s’opère, mais leur
répartition en deux lots équivalents est rendue impossible par l’absence de
fuseau : le noyau devient polyploïde [10, 11, 12].
La substance mitoclasique, dont l’action a été le plus étudiée, est la
colchicine, les dérivés de cette substance [12], le phényluréthane [13] et le
chlorothal [14] produisent les mêmes effets.

12
 2.2 Agents antimitotiques

Ce sont des substances ou radiations capables d’inhiber la mitose, soit par

action non spécifique ou par action spécifique : sur l’ADN pendant l’interphase,
sur le fuseau, sur les chromosomes ou sur la cytodiérèse, et voici quelque
exemples de ces substances selon le mode d’inhibition de la mitose [4] :
 Lésions de l’ ADN : interruption du cycle cellulaire :
ATB : actinomycine D, cycloheximide…
Antimétabolites : inhibent les synthèses : 6 mercaptopurine…
Agents alkylants : moutardes azotées…
Certains colorants : éthidium…
 Atteinte fusoriale : inhibition de l’appareil mitotique: colchicine,
podophyline, vincristine, vinblastine.
 Lésion des chromosomes :
Séparation d’une manière défectueuse : trypoflavine.
Fragmentation des chromosomes : radiations ionisantes.
 Inhibition de la cytodiérèse : inhibition du clivage cytoplasmique: lithium…

II. Etude toxicologique

L’étude toxicologique d’une nouvelle molécule fait aujourd’hui

couramment appel à des expérimentations in vivo. Elle a pour but d’établir le
risque encouru par l’homme, avant tout contact (administration per os ou voie
sanguine, exposition cutanée ou des voies respiratoires, …) qu’il s’agisse d’un
médicament, d’un produit chimique, d’un polluant ou encore d’un pesticide. Il
faut aboutir à des réponses rapides, fiables, d’un coût limité et ne nécessitant
qu’un nombre réduit d’animaux. Depuis quelques années beaucoup s’interrogent

13
sur la contribution potentielle des tests in vitro à l’établissement de ce risque.
Mais comment définir un risque toxicologique potentiel pour l’homme à partir
de critères de toxicité in vitro ? L’extrapolation des données suscite beaucoup
d’interrogation. Néanmoins, il est aujourd’hui généralement admis que la
contribution des tests in vitro peut-être essentielle dans différents domaines tel le
tri (criblage) de molécules dans la phase initiale de leur découverte, l’élaboration
de la structure la plus efficace de la molécule et bien sûr l’identification des
mécanismes de toxicité. Pour aborder de telles études, il convient de définir
l’approche in vitro. Il est clair qu’un test in vitro ne peut à lui seul remplacer le
modèle animal, il peut seulement apporter des informations sur un type
cellulaire, ou mieux sur un organe. Les tests in vitro reposent sur l’analyse
individuelle de chaque composé, le recueil de toutes les données relatives à
celui-ci, le constant dialogue avec les chimistes qui en assurent la synthèse et
des études du mécanisme d’action in vitro complétés par une expérimentation in
vivo. Cette stratégie est applicable à différents types de produits et donc
utilisable par différentes industries pharmaceutiques, chimiques, cosmétiques
[15]…

14
 Chapitre II 

Revu bibliographique sur les tripodes

pyrazoliques

15
1. Introduction

Plusieurs dérivés de pyrazole ont été synthétisés à des fins médicales,

industrielles et biologiques, ces composés sont souvent utilisés comme
intermédiaires dans l’industrie des colorants [16] ou comme produits
biodégradables en agrochimie [17]. Ils sont aussi utilisés comme insecticides
[18, 19]; herbicides [18, 20] et fongicides [18, 21] et dans la synthèse des
polymères résistants à la chaleur [22].
Ces dérivés de pyrazole se sont montrés capables de posséder une activité
anti-inflammatoire, analgésique, antipyrétiques cher les modèles animaux et
antimicrobienne [23] et présenter aussi des propriétés cytotoxiques [18, 24].
L’activité biologique bien documentée des dérivés pyrazoliques est souvent
liée aux phénomènes de chélation [25, 26].
Ces composés tripodales se caractérisent par la présence de deux atomes
d’azote pyrazolique sp2 et un atome d’azote aminique sp3, pouvant contribuer à
la complexation d’un métal. En effet, les trois sites de complexation sont bien
disposés pour orienter leur doublet de façon pyramidale étant donné que la
complexation se fait selon un arrangement en tripode [2]; l’azote sp3 lié par deux
chaînes carbonnées à deux pyrazoles. Le pyrazole étant lié à la chaîne soit au
moyen d’un carbone : ligand à jonction azote-carbone-carbone, soit au moyen
d’un azote : ligand à jonction azote-carbone-azote [3]. Dans ce travail nous
sommes intéressés uniquement aux tripodes de la série N-C-N (figure 2).

16
 Figure 2 : Structure générale des tripodes de la série N-C-N
Les structures tridentées étudiées sont données par la figure 3. Leur
synthèse et l’étude de leurs propriétés complexantes et catalytiques sont
réalisées au sein de l’équipe de Chimie Bioorganique et Macromoléculaire [2];
La synthèse de ces composés repose sur la création des jonctions N-C-N. Les
deux structures portent sur leur bras latéral une chaîne aliphatique plus ou moins
longue et fonctionnalisée par un groupement hydroxyle (OH). Dans la structure
L1, le noyau pyrazole porte en position para un groupement méthyl tandis que
dans la structure L2, il est substitué par un groupement méthoxycarbonyl.

Figure 3 : Structure des composés L1 et L2

L1 : 2-{bis[(3,5-diméthyl-1H-pyrazol-1-yl)méthyl]amino}éthane-1-ol

17
L2 : 1-[((4-hydroxybutyl){[3-(méthoxycarbonyl)-5-méthyl-1H-pyrazol-1-
yl]méthyl}amino)méthyl]-5-méthyl-1H-pyrazole-3-carboxylate de méthyle

2. Synthèse des tripodes pyrazoliques de la série N-C-N

La jonction Azote-Carbone-Azote est obtenue par action d'un alcool sur

une amine; la synthèse de cette famille de tripode se fait en deux étapes; la
première étape consiste à synthétiser le 1-hydroxyméthyl-3,5-diméthylpyrazole
1 et le (hydroxyméthyl)-3-carbométhoxy 2 par condensation du formol en
solution aqueuse (35%) sur le 3,5-diméthylpyrazole et sur le 3-carbométhoxy-5-
méthylpyrazole dans l’éthanol à reflux pendant une heure, ensuite le mélange
réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 12 heures
[2, 3] (Schéma 1).

La seconde étape consiste à condenser le dérivé pyrazolique avec une

amine primaire (Schéma 2).

18
 Chapitre III 

Tests biologiques
19
 Dans cette partie, on va évaluer l’activité antimitotique en utilisant le
phytotest Lepidium sativum L, l’activité toxique par le test Brine Shrimp sur les
larves d'Artémia salina et l’activité antispasmodique de deux tripodes
pyrazoliques: L1 et L2 synthétisés par l’équipe de Chimie Bioorganique et
Macromoléculaire [2].

I. Test antimitotique : Phytotest Lepidium sativum L

Ce test a été proposé en 1972 par GAGIU pour un tirage préliminaire des
molécules agissant au niveau de la croissance végétale sans présumer de leur
lieu précis d’action.
Plusieurs auteurs ont apporté leur contribution à l’étude de la validité de ce
test. Les résultats obtenus par cette méthode pour plusieurs composés nouveaux
ont été comparés à l’activité antimitotique de plusieurs dérivés cytostatiques
couramment utilisés dans la chimiothérapie du cancer. Ce test a l’avantage
d’être simple et relativement rapide puisque les résultats sont obtenus en 48
heures. De plus, la graine de Lepidium sativum ne possède qu’une seule radicelle

20
dont la croissance appréciable permet une mesure facile. C’est un biotest basé
sur la mesure de la longueur de la radicelle d’une graine germée de Lepidium
placée dans un milieu contenant la substance à tester. On estime le pourcentage
d’inhibition de la croissance par comparaison avec un lot témoin.
Conditions du test :
 Température de 25°C
 Humidité ambiante
 Obscurité
 Milieu de culture : Eau distillée

1. Description du test

1.1 Description de la plante

Lepidium sativum L appartient à la famille des crucifères, connue sous le

nom commun du cresson alénois. C’est une plante annuelle, à saveur âcre, dont
la tige haute de 20 à 50 cm est dressée et rameuse. Les feuilles inférieures sont
pennatiséquées, alors que les feuille supérieures sont linéaires et entières. Les
fleurs sont petites et blanches, ont quatre pétales en croix sont groupées en
grappes terminales. Le fruit est silicule très courte, aplatie, échancrée et ailée
dans sa partie supérieure.
C’est une plante originaire de l’Iran, elle est cultivée dans les potagers et
souvent sub spontanée au voisinage des habitations. La plante est consommée,
les graines sont souvent utilisées en médecine traditionnelle [] (BERANGER-
BEAUQUESNE, 1982).

21
 1.2 Procédure du test

En boîtes de Pétri, des graines de Lepidium sativum ont été mises à germer
sur du papier filtre imbibé de d’eau distillée (10 graines par boite).
Les boites sont incubées à l’obscurité pendant 24 heures à une température
de 25 °C. Le biotest est basé sur la mesure de la longueur de la radicelle de
Lepidium sativum placée pendant 24 heures dans un milieu contenant le produit
à tester.

1.3 Evaluation de l’activité

L’activité du produit est évaluée en calculant le pourcentage d’inhibition de
la croissance cellulaire. Celui ci est estimé en comparant le lot testé avec un lot
témoin suivant la formule :
% d’inhibition: LT-LC/LT.100
LT: longueur des radicelles témoin
LC: longueur des radicelles traitées

2. Résultats et discussion
Nous avons réalisé un suivi de l’activité inhibitrice des tripodes L1 et L2 pendant une
durée de traitement de 24, 48 et 72 heures et pour les concentrations 25, 50, 100, 150 et 250
µg/ml.
Le pourcentage de l'inhibition de la croissance des racines par le DMSO 2% et le
méthanol 2% ne dépasse pas 1% pour toutes les expériences qu'ont été faites.
La colchicine a été utilisée comme témoin positif à effet antimitotique déjà connu dans
le but de confirmer les résultats.

2.1 Evaluation de l'activité antimitotique de L1

2.1.1 Résultats

Produits Concentrations % d’Inhibition

22
 T. DMSO 250 µg/ml 0,97
Colchicine 1000 µg/ml 57,55
25 µg/ml 4,44
Tripode 50 µg/ml 5,23
L1 100 µg/ml 16,09
150 µg/ml 28,62
250 µg/ml 49,16

Tableau 1 : Les valeurs de l'inhibition en % de la croissance des radicelles des

graines de Lepidium sativum par le tripode L1 (solution mère = 5mg/ml DMSO)

Activité antimitotique du Tripode L1

100
90
80
% d’inhibition

70
60
50
40
30
20
10
0
25 50 100 150 250
Concentration (µg/ml)

Figure 4 : Activité inhibitrice de la croissance racinaire sous l’action du tripode

L1

2.1.2 Interprétation des résultats

Le tripode L1 provoque une inhibition significative de la croissance des

radicelles des graines de Lepidium sativum, cette inhibition augmente de plus en
plus avec l’augmentation de la concentration (Figure 4).

- Les résultats montrent que l'effet inhibiteur du tripode L1 est plus important
que celui de la colchicine; à la concentration 1000 µg/ml la colchicine ne donne

23
que 57% d’inhibition tandis que à un quart de cette concentration le L1
provoque une inhibition de 49% (tableau 1).
- Nous avons déjà travaillé sur une molécule identique aux L1 et L2 dont le bras
latéral est substitue par un cycle benzénique, elle nous donne aucune résultat, ce
qui nous a incité à suggérer que l’activité antimitotique du L1 a été sans doute
en relation avec la présence d’un bras latéral et surtout d’un groupement
hydroxyle.
2.2 Evaluation de l'activité antimitotique de L2

2.2.1 Résultats

Produits Concentrations % d’Inhibition

T. Méthanol 2% 1
Colchicine 1000 µg/ml 59,496
25 µg/ml 2,52
Tripode L2 50 µg/ml 4,95
100 µg/ml 9,72
150 µg/ml 13,77
250 µg/ml 34,2

Tableau 2 : Les valeurs de l'inhibition en % de la croissance des radicelles des

graines de Lepidium sativum par le tripode L2 (solution mère = 5mg/ml
méthanol 2%)

24
 Activité antimitotique du Tripode L2

100
90
80
70
% d’inhibition

60
50
40
30
20
10
0
25 50 100 150 250
Concentration (µg/ml)

Figure 5 : Activité inhibitrice de la croissance racinaire sous l’action du tripode

L2

2.2.2 Interprétation des résultats

Le tripode L2 entraîne une inhibition de la croissance des radicelles des graines

de Lepidium sativum, cette inhibition augmente de plus en plus que les
concentrations augmentent (figure 5).
- L’effet inhibiteur commence à augmenter à partir de 25 µg/ml, et il atteint son
maximum à 250 µg/ml (tableau 2).
- Puisque la structure du tripode L2 présente aussi un groupement hydroxyle au
niveau du bras latéral, on peut conclure que l’effet antimitotique de cette
molécule est en relation avec la présence de ce groupement.
3. Conclusion

25
 L'activité antimitotique du tripode L1 est plus importante en comparaison avec
le tripode L2.
Les seules différences entre le tripode L1 et le tripode L2, c’est que L2 présent
un bras latéral plus long (2 carbone de plus), et porte en position para de ces
noyaux pyrazoliques un groupement méthoxycarbonyl tandis que dans la
structure L1, ce groupement est substitué par un groupement méthyl, donc on
peut conclure que le groupement méthoxycarbonyl provoque la diminution de
l’effet antimitotique chez L2.
Nous suggérons que la différance de l’activité antimitotique entre ces deux
molécules due au mode d’action de ces tripodes sur les cellules en division, et
plus précisément sur l'ADN.

II. Test de toxicité

1. Description du test

Pour réaliser cette étude visant à rechercher l’activité toxique des

tripodes L1 et L2, nous nous sommes appuyés sur le test Brine Shrimp (B.S.)
mis au point par MEYER et al. (1982). Cette méthode permet de connaître
l’activité toxique d’un produit par son effet sur des larves de crevettes d’eau
salée de l’espèce Artemia salina. Cette activité toxique se traduit par la mort de
ces larves en présence du produit testé.

1.1 Préparation des nauplii d’Artemia salina

26
 Une quantité de 0,5 g des œufs d’Artemia salina nauplii sont mis à
éclore dans une solution de NaCl (19 g de NaCl dans 500 ml de l’eau distillée)
pendant 48h, à une température de 25°C avec une faible source de lumière et
une source d’oxygène.
Les naupliis peuvent être collectés et utilisés pour le test à l’aide d’une
pipette pasteur.

1.2 Procédure du test

Les produits sont testés à des concentrations différentes: 25, 50, 75,
100, 150, 250 et 500 µg/ml. Pour chaque concentration trois tubes sont préparés.
La solution du produit à tester est ajoutée dans le tube contenant les larves. A
l'aide d'une pipette Pasteur quinze larves sont transférées dans chaque tube à
hémolyse. Le volume est ensuite ajusté à 5ml avec de l’eau salée. Une série de
tubes témoins est réalisée aux concentrations suivantes: DMSO 2%, méthanol
2% et un témoin de l’eau salée.
Les tests sont ensuite laissés 24 heures sous éclairage.

1.3 Lecture des résultats

Après 24h, 48h et 72h on compte le nombre des larves mortes sous une
loupe biloculaire. On considère que les naupliis sont mortes si on n’observe
aucun mouvement durant 10 secondes.
Le test est valide si la mortalité dans les tubes témoin ne dépasse pas
10%. Quand cette condition est réalisée, on calcule le pourcentage de mortalité
corrigé. La méthode qu'on utilise est celle d'Abbot( MEYER, 1982)[].

27
 A partir des résultats, la concentration létale 50% (CL50) reflétant la
toxicité des produits, est estimée à partir de la courbe de mortalité qui exprime le
pourcentage des larves mortes en fonction de la dose du produit utilisée.

2. Résultats et discussion

Nous avons préparé une gamme de concentrations à partir des solutions

mères 5mg/ml pour les deux molécules à testées (L1 et L2). Pour chaque
concentration trois tubes sont préparés (figure 6).
Dans chaque tube on a met une quantité de 4ml de l’eau salée sur
laquelle on a ajouté la concentration du produit à tester, d’une façon à obtenir
des tubes à 15 larves dans 5ml.
Nous avons préparé également des tubes témoins (3 tubes pour chaque
témoin) : un témoin blanc (l’eau salée), un témoin contrôle contenant le DMSO
2% pour le tripode L1 et un témoin contrôle contenant le Méthanol 2% pour le
tripode L2.

Figure 6: Protocole de test de toxicité

Solution mère (5mg/ml)

25µg/ml 50µg/ml 75µg/ml 100µg/ml 150µg/ml 250µg/ml 500µg/ml

3 répétitions pour chaque concentration

2.3 Evaluation de la toxicité du tripode L1

2.3.1 Résultats

28
 Les résultats obtenus pour le tripode L1 sont présentés dans le tableau 3 et la
représentation graphique de la CL50 (Figure 7).

%Mortalité Mortalité Mortalité Mortalité

Produits après24h après 48h après 72h
T. DMSO (500µg/ml) 0 2,22 8,88
25 µg/ml 0 6,81 9,75
50 µg/ml 0 11,36 12,19
75 µg/ml 2,22 15,9 19,51
100 µg/ml 4,44 20,54 24,39
150 µg/ml 6,66 27,27 29,26
250 µg/ml 15,55 31,81 43,9
500 µg/ml 20 38,63 63,41

Tableau 3 : Mortalité des larves de A. salina en fonction des concentrations en L1

apportées.

Evaluation de la toxicité du tripode L1

après 24h
100
après 48h
90
80 après 72h
% de mortalité (%)

70
60
50
40
30
20
10
0

Concentration (µg/ml) CL 50 = 312,5 µg/ml

Figure 7 : Pourcentage de mortalité des larves d’Artemia salina en fonction des
concentrations du tripode L1

29
 2.3.2 Interprétation des résultats

Les résultats montrent que le pourcentage de mortalité des larves

d’Artemia salina augmente proportionnellement avec l’augmentation de la
concentration en tripode L1 (figure 7).
La valeur de la concentration létale est de 312,5 µg/ml, alors nous
pouvons conclure que le tripode L1 présente une toxicité faible sur les larves
d’Artemia salina.

2.4 Evaluation de la toxicité du tripode L2

2.4.1 Résultats

Les résultats obtenus pour le tripode L2 sont présentés dans le tableau 4 et la

représentation graphique de la CL50 (Figure 8).

%Mortalité Mortalité Mortalité Mortalité

Produits après24h après 48h après 72h
T. méthanol (150µg/ml) 2,22 2,22 8,88
25 µg/ml 79,54 100 100
50 µg/ml 97,72 100 100
75 µg/ml 100 100 100
100 µg/ml 100 100 100
150 µg/ml 100 100 100

Tableau 4 : Mortalité des larves de A. salina en fonction des concentrations en L2

apportées.

30
 Evaluation de la toxicité du tripode L2

100
90
% de mortalité (%)

80 après 24h
70
60 après 48h
50
40 après 72h
30
20
10
0

CL 50 = 15,62 µg/ml concentration (µg/ml)

Figure 8 : Pourcentage de mortalité des larves d’Artemia salina en fonction des
concentrations du tripode L2

2.4.2 Interprétation des résultats

La représentation graphique indique clairement que le tripode L2 possède

une activité toxique très importante, le pourcentage de la mortalité des larves
augmente de plus en plus avec l’augmentation de la concentration en tripode L2
(figure 8), La concentration létale CL50= 15,62 µg/ml.
La figure 8 montre que la toxicité commence déjà à partir de la
concentration 10µg/ml après 24 heures, et elle atteint son maximum à 25 µg/ml
après 48 heurs (tableau 4).
La structure du tripode L2 présente un groupement méthoxycarbonyl au
niveau de ces noyaux pyrazoliques, et en comparaison avec la structure du
tripode L1, nous conclurons que l’activité toxique du L2 a été sans doute en
relation avec la présence de ce groupement.

31
 3. Conclusion

En comparent les résultats des deux produits, nous conclurons que :

- Les deux molécules ont montré une activité toxique mais à doses
différentes. En effet le tripode L2 présente une toxicité élevée (CL 50=
15,62 µg/ml), tandis que le tripode L1 présente une toxicité faible
(CL50= 312,5 µg/ml).
- Le produit L2 est à peu près vingt fois plus toxique que le produit L1.
- La dose du produit testé et l'age des larves sont parmi les paramètres
qui influencent sur l'activité toxique.
- Le produit L1 a une faible toxicité mais il peut avoir d’autres intérêts
phytopharmacologiques que toxique. Notre objectif c’est de
rechercher son pouvoir anticancéreux et antitumoral dans notre
recherche à venir.

III. Test antispasmodique

1. Introduction

Le but de cette étude était la recherche de l'activité antispasmodique des

tripodes L1 et L2 sur le muscle lisse du jéjunum du lapin.
Les antispasmodiques ou les spasmolytiques sont des substances utilisés
pour lutter contre les spasmes musculaires lisses, ils sont indiqués dans le
traitement des spasmes digestifs, utérine et biliaires. Les spasmes sont des
contractions brèves et involontaires, la plupart du temps douloureuses et qui
touchent notamment la musculature du tube digestif.

32
 2. Matériels et méthodes

L'activité spasmolytique des tripodes L1 et L2 a été étudiée en utilisant une

préparation du jéjunum isolée du lapin (sexe male, m=1,6kg). L'animal a été tué
par décapitation. Aucun agent anesthésique a été administré qui peut influencer
sur les réponses de relaxation des tissus. Une partie du jéjunum (2cm) a été
enlevé et monté dans une cuve à organe isolé contenant 10ml de la solution de
Krebs (KHB).
La température de la solution de la cuve est maintenue à 37 ° C, pH7, et
oxygénée de façon continue. Une période de stabilisation de 30min a été
effectuée au cours de laquelle la solution physiologique a été changé toutes les
10 min. Après stabilisation des contractions du muscle lisse spontanée de
jéjunum de lapin, les doses cumulatives des tripodes L1 et L2 ont été ajoutés
directement dans la cuve à organe.

3. Résultats

Nous avons utilisé le DMSO qui permet la solubilisation des produits à tester,
un volume de 55µl de DMSO a été ajouté et qui correspond à la plus grande
concentration du produit à tester pour évaluer son effet sur le muscle lisse du
jéjunum du lapin (figure).

33
 DMSO
55µl

Figure : L’effet de DMSO sur les mouvements spontanés du muscle lisse du jéjunum du
lapin.

La figure montre bien que le volume du DMSO ajouté n’a aucun effet sur les
mouvements spontanés du muscle lisse du jéjunum du lapin.

Effet du tripode L1 sur les mouvements spontanés du muscle lisse du

jéjunum du lapin

Control

10-6M 5.10-6M
10-5M 3.10-5M Tripode L1

Figure : L’effet de L1 sur les mouvements spontanés du muscle lisse du jéjunum du lapin.

A partir de la concentration 10-6 on remarque une diminution du tonus

musculaire continue pendant 8 min avec une légère augmentation de tonus au
bout de 3 min.

34
A 5.10-6 on remarque qu’il y a au début une légère augmentation de tonus, après
2 min on note une faible relâchement des fibres musculaires lisses avec une
diminution de tonus musculaire.

A la concentration 4.10-4 on remarque une forte contraction musculaire au début

suivi d’une relâchement total des fibres musculaires lisses du jéjunum.

Effet du tripode L2 sur les mouvements spontanés du muscle lisse du

jéjunum du lapin

Control

10-6M 3.10-5M Tripode L2

5.10-6M 10-5M

Figure : L’effet de L2 sur les mouvements spontanés du muscle lisse du jéjunum du lapin.

On constate clairement que le tonus musculaire diminue avec l'ajout des

concentrations: 10-6 et 5.10-6.

A la concentration 10-5 le tonus musculaire continue à diminuer et atteint son

maximum après 2 min, et au bout de 4 min on note une légère contraction
musculaire.

A 3.10-5 on note une inhibition totale des contractions des muscles lisses du
jéjunum.

4. Conclusion

35
 A partir des résultats nous pouvons conclure que les deux tripodes L1 et L2
provoquent en général la diminution du tonus musculaire ç-à-d ils ont un effet
relaxant sur les contractions des fibres musculaires du jéjunum.

IV. Etude histologique

Nous avons effectué cette étude pour le but de vérifier les résultats
expérimentaux de l’évaluation des activités antimitotiques des tripodes L1 et L2

36
en comparant avec l’activité antimitotique de la colchicine connue par son effet
antimitotique.
1. Discription de l’étude

1.1 Fixation des cellules de l’apex racinaire de Lepidium sativum

Le but de la fixation histologique est d’immobiliser les structures, en

respectant, dans toutes les mesures du possible, leur morphologie, de les
conserver et de permettre la confection des préparations permanentes (GABE,
1968).
La contrainte c’est que la plus part des liquides fixateurs ne sont pas des
conservateurs et les objets qui ont été immergés subiraient des altérations graves
si on tentait leur inclusion à la paraffine. Le rôle du liquide conservateur est,
dans le domaine histologique, de s’opposer à l’autolyse cadavérique des tissus
ou des cellules, de maintenir l’objet prélevé dans un état aussi proche que
possible de la morphologie in vivo et permettre l’observation au microscope
(GABE, 1968).
L’agent fixateur que nous avons utilisé est un mélange de trois agents
fixateurs, le formol, l’acide acétique et l’alcool éthylique dans les proportions
(10, 5, 85) en s’inspirant de la technique d’AGAEV et al., 1987. La fixation
dure 24 heures et s’effectue à température ambiante.

1.2 Arrêt de la fixation

La plus part des histologistes préfèrent le lavage à l’eau courante, ce

lavage permet l’extraction de l’excès en agent fixateur (M.GABE, 1968).
Nous avons effectué un prélavage à l’eau du matériel que nous avons
préparé, avant chaque lavage et toujours à l’eau courante durant dix minutes.

37
 1.3 Inclusion à la paraffine

L’inclusion s’effectue en quatre temps :

 La déshydratation traditionnelle qui est utilisée le plus souvent et à base de
l’alcool éthylique successivement à 70% (10 min), à 90% (10 min) et à
100% (20 min).
 L’alcool n’étant pas miscible à la paraffine, il va empêcher la pénétration
de la paraffine dans les différentes parties du matériel à préparer (GABE,
1968). Il est ainsi éliminé par deux lavages successifs (de 10 minutes
chacun) au toluène, le toluène étant un solvant spécifique de la paraffine.
 La pénétration par la paraffine dont le but est d’obtenir une imprégnation
aussi complète que possible du matériel à préparer. Ce matériel est donc
gardé pendant quatre heures (on change le paraffine d’incubation après
deux heurs) dans la paraffine à une température de 52°C.
 Enfin le coulage du bloc est réalisé

1.4 Réalisation des coupes

 Le collage à la gélatine
Avant de faire couler la gélatine, les lames sont dore et avant mises dans
l’alcool 90% (9 V) et l’acide chlorhydrique 10% (1V) de façon à avoir une
proportion 9/1. Les coupes ainsi préparées sont égouttées et séchées à 36°C
pendant 24 heures. La gélatine sert donc à étaler les coupes et les coller sur la
lame.
1.5 Préparation des solutions

 Réactif de schiff (méthode de COLAMAN)

 Dissoudre 1g de fuchsine basique dans 200ml d’eau froide
 Porter le mélange obtenu à ébullition, il est maintenu à cette
température 1 à 2 minutes.
 Laisser refroidir pour éliminer certaines impuretés et on filtre

38
  Ajouter 2g de métabisulfite de potassium ou de sodium sec et 10
ml d’acide chlorhydrique 1N
 Laisser se reposer 24 heures dans un flacon bouché et à l’abri de
la lumière
Au bout de ce délai la coloration de la préparation est jaune, si ce n’est
pas le cas on décolore en ajoutant 0.3 g de charbon actif, on agite vivement le
mélange pendant 15 à 30 secondes et on filtre. Le filtrat ainsi obtenu est rose.
On attend alors que la décoloration soit complète, cela peut prendre quelques
heures, au bout de laquelle le réactif de Schiff est près pour l’emploi.
Le réactif de Schiff préparé est conservé dans un flacon bien fermé, au
frais et à l’abri de la lumière. Par ces précautions on limite la perte d’anhydride
sulfureuse, facteur essentiel de la détorioration du réactif de Schiff.
 Eau sulfureuse
L’eau sulfureuse est préparée selon la méthode de LILLIE (1951), on met 1g de
métabisulfite de sodium et 10 ml d’acide chlorhydrique 1M dans 200 ml d’eau
distillée (GABE, 1968).
 Méthode de coloration :
La technique de coloration comporte 11 étapes qui sont :
 Le déparaffinage des coupes : il doit être complet avant le
traitement ultérieur des pièces, une irrégularité de
déparaffinage entraînerait une mauvaise pénétration des
colorants et des réactifs histochimiques. On déparaffine les
lames en les plongeant dans du toluène deux fois pendant 5
minutes.
 La déshydratation par le passage des lames dans des
solutions d’alcool éthyliques à des concentrations
décroissantes (100% pendant 5 minutes, 90% pendant 2
minutes, 70% pendant 2 minutes).
 Laver les lames à l’eau courante pendant 15 minutes.

39
  Une hydrolyse à température ambiante pendant 20 minutes
dans une solution d’acide chlorhydrique 6 M.
 Laver les lames à l’eau courante (5 minutes).
 Une immersion pendant 3 heures dans le réactif de Schiff
préparé afin de colorer l’ADN.
 Laver dans 3 bains d’eau sulfureuse successifs de 3 minutes.
 Laver avec l’eau du robinet pendant 10 minutes.
 Une déshydratation par le passage des lames dans une
solution d’alcool éthylique à 100% pendant 2 minutes
 Enlever l’alcool non miscible par un bain de 2 fois 5 minutes
dans du toluène.
 Coller les lames avec le DPX (ou beaume de Canada)
 Laisser sécher et observer au microscope.

Résultats :

40
Objectif 40 Objectif 100

Figure : La colchicine

Objectif 40

Figure : Le DMSO

41
Objectif 40 Objectif 100

Figure : H2O

Objectif 40

Figure : Tripode L1

42
 Objectif 100

Figure : Tripode L2

43
Conclusion

L’objectif de ce travail était une contribution à l'étude toxique, l'étude de

l’activité antimitotique et l'étude de l'activité antispasmodique de quelques
tripodes pyrazoliques.
Dans notre travail nous avons présenté dans un premier temps une étude
bibliographique sur les structures tripodales et nous montré leur intérêt dans la
biologie cellulaire.
Nous avons présenté ensuite, la synthèse et la caractérisation de nos molécules
qui sont appartient à la famille de tripodes pyrazoliques à jonction N-C-N.
Dans un deuxième temps nous avons étudié l’action des tripodes L1 et L2
sur la croissance racinaire. L’étude de cette activité a été réalisée à l’aide du
phytotest Lepidium sativum. Ces molécules sont douées de propriétés
pharmacologiques intéressantes.
L’étude de la toxicité de ces molécules vis-à-vis les larves d’Artemia salina
montre des bons résultats pour le tripode L2. Le tripode L1 présente une faible
toxicité sur ces larves, ce produit peut avoir d’autres intérêts
phytopharmacologiques que toxique.
Le test antimitotique a été complété par une étude histologique qui montre
que les tripodes L1 et L2 sont des agents antimitotiques qui bloquent la division
cellulaire à l’interphase.
En fin nous avons évalué l’effet antispasmpdique de ces deux molécules, les
résultats de cette étude montrent que L1 et L2 sont des substances
antispasmidiques.

En conclusion, les résultats de nos études montrent bien que les tripodes
examinés, présentent des activités cytotoxiques et antimitotiques très
importantes peuvent être poussées pour rechercher l’activité anticancéreuse de
ces molécules.

44
Comme perspectives d’avenir, nous pouvons:
 Etudier les activités anticancéreuses sur ces deux molécules
 Etudier la relation la structure et l’activité biologique de ces
molécules.
 Enfin essayer de comprendre les mécanismes d’action de L1 et L2
présentes des activités antimitotiques.

45
Références

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