Génie génétique

Les outils du génie génétique

Principaux outils enzymatiques pour la

manipulation des acides nucléiques

1
 2. Polymérases
2.1.ADN polymérases
A. Propriétés des polymérases
✓ 1. Activité ADN polymérase ADN dépendante
5’ PPP 3’ 5’ 3’ 5’ PPP 3’ 5’ PPP OH
3’
➢ dNTP OH PPP OH OH

➢ Brin matrice A T G C
➢ Amorce complémentaire à extrémité 3’
➢ Chaîne en croissance 5’→3’
5’ PPP OH
3’

5’ 3’ 3’ A
OH
OH
T C G AC T TAA
A G C T G AAT T C T G A G T C C T G G A G G AAT G G C T T G

3’ 5’
2
2.1.ADN polymérases
A. Propriétés des polymérases
➢ 1. Activité ADN polymérase ADN dépendante
➢ 2. Activité 3’-5’ exonucléase
➢ Correction d’erreurs
➢ Réduction erreurs
➢ Même sous-unité protéique ou deux sous-unités protéiques différentes

5’ PPP OH
3’

5’ 3’ 3’ C
OH
OH
TC GACTTAC
A G C T G AAT T C T G A G T C C T G G A G G AAT G G C T T G

3’ 5’
3
 2.1.ADN polymérases
A. Propriétés des polymérases
➢ 1. Activité ADN polymérase ADN dépendante
➢ 2. Activité 3’-5’ exonucléase – correction d’erreurs
Enzyme Emplacement des domaines Taux d’erreur
de synthèse et de correction sans correction avec correction
d’épreuves d’épreuves d’épreuves
ADN polymérase I sous-unité unique 10-5 5. 10-7
d’Escherichia coli
ADN polymérase III sous-unités séparées 7. 10-6 5. 10-9
d’Escherichia coli
ADN polymérase de T4 sous-unité unique 5. 10-5 10-7

ADN polymérase de T7 inconnu 10-5 10-6

Transcriptase reverse aucun 10-5

4
D’après Gene, 1999
2.1.ADN polymérases
A. Propriétés des polymérases
➢ 1. Activité ADN polymérase ADN dépendante
➢ 2. Activité 3’-5’ exonucléase
➢ Correction d’erreurs
➢ Problèmes :
➢ diminution rendement et vitesse de réplication de l’ADN
➢ dégradation amorce

5
 2.1.ADN polymérases - ADN dépendantes

A. Propriétés des polymérases

➢ 1. Activité ADN polymérase ADN dépendante
➢ 2. Activité 3’-5’ exonucléase
➢ 3. Activité 5’-3’ exonucléase

5’ P 3’
OH 5’ P OH
3’

G G
3’ 5’ 5’ 3’ 3’
3’
3’
5’ OH OH5’ OH
OH
OH
T C GAC TTAAGAC T CA G GAC C T C C TTAC C GA
A G C T G AAT T C T G A G T C C T G G A G G AAT G G C T T G

3’ 5’

➢ Utilisation : Nick translation (translation de coupure)

6
 Nick translation = Marquage par translation de coupure
Cf IV.2,1,4
5’ 3’

3’ 5’
Traitement à la
DNase I
5’ 3’

3’ 5’
ADN polymérase avec activité 5’ – 3’ exonucléase
+ dNTP dont 1 marqué
5’ 3’

3’ 5’
Sonde fragmentée

7
 2.1.ADN polymérases - ADN dépendantes

A. Propriétés des polymérases

➢ 1. Activité ADN polymérase ADN dépendante
➢ 2. Activité 3’-5’ exonucléase
➢ 3. Activité 5’-3’ exonucléase
5’ P OH
3’ 5’ 3’
P OH

G G

5’ 3’
OH5’ OH
T C G AC T TAAG AC T CA AC CTC CTTAC C GA
A G C T G AAT T C T G A G T C C T G G A G G AAT G G C T T G

3’ 5’

➢ Utilisation : Nick translation (translation de coupure)

➢ Système Taqman (PCR en temps réel) 8
https://www.youtube.com/watch?v=fkUDu042xic
 2.1.ADN polymérases - ADN dépendantes
A. Propriétés des polymérases
➢ 1. Activité ADN polymérase ADN dépendante
➢ 2. Activité 3’-5’ exonucléase
➢ 3. Activité 5’-3’ exonucléase
➢ 4. Déplacement de brin 5’ 3’
OH
G GAC CTC CTTAC C GA
5’

5’
5’ 3’ 5’ 3’ 3’
3’ 3’
OH OH
OH OH
OH
TT CC G
GAACC TTTTAAAAG
GAAC
C TT C
CAA G
GGGA
ACCC
C TT C
CCC TT TT A
ACC C
CGGA
AA C
A G C T G AAT T C T G A G T C C T G G A G G AAT G G C T T G

3’ 5’

9
2.1.ADN polymérases - ADN dépendantes
A. Propriétés des polymérases
➢ 1. Activité ADN polymérase ADN dépendante
➢ 2. Activité 3’-5’ exonucléase
➢ 3. Activité 5’-3’ exonucléase
➢ 4. Déplacement de brin
➢ 5. Processivité
➢ 6. Fidélité
➢ 7. Vitesse d’élongation
➢ Nbre nucléotides incorporés /sec/molécule ADN polymérase
5’ PPP 3’
➢ 8. Activité terminale transférase OH

5’ 3’ A

T C G A C T TAA G A C T C A G G A C C T C C T TA C C G AA C
A G C T G AAT T C T G A G T C C T G G A G G AAT G G C T T G
10

3’ 5’
2.1.ADN polymérases - ADN dépendantes
B. Familles d’ADN polymérases
➢ Famille A
➢ Polymérases réplicatives et polymérases de réparation
➢ Réparation par excision
➢ Synthèse brin Okazaki
➢ Famille B
➢ Polymérase réplicative
➢ Synthèse du brin avancé et du brin retardé
➢ Famille C
➢ Chez bactéries
➢ Contiennent aussi activité exonucléase 5’→3’
➢ Famille D
➢ ADN polymérase retrouvée chez Archea

11
2.1.ADN polymérases - ADN dépendantes
B. Familles d’ADN polymérases
➢ Famille A
➢ Famille B
➢ Famille C
➢ Famille D
➢ Famille X
➢ Réparation ADN par excision de base
➢ Famille Y
➢ Polymérases de translésion
➢ Pas activité exonucléase 3’→5’.
➢ Faible fidélité

12
 2.1.ADN polymérases - ADN dépendantes
ADN polymérases eucaryotes
5 chez mammifères, 3 chez levure
ADN
a (I) d (III) e (II) b g
polymérase

Famille B B B X A

Emplacement Nucléaire Nucléaire Nucléaire Nucléaire Mitochondrial

Fonction de Amorce Synthèse Réparation Réparation Réplication

synthèse d’ADN

Autres
fonctions
3’-5’ exonucléase - + + - +
5’-3’ exonucléase - - + - - 13
D’après Gene, 1999 + infos complémentaires
 2.1.ADN polymérases - ADN dépendantes
ADN polymérases chez eubactéries
5 ADN polymérases
➢ Pol I
➢ Réparation ADN, synthèse fragments Okasaki, dégradation
amorces ARN
➢ Activités polymérase, exonucléase 3’→5’ , exonucléase 5’→3’
➢ Pol II
➢ Réplication ADN endommagé
➢ Activités polymérase, exonucléase 5’→3’
➢ Pol III
➢ Principale polymérase, élongation chaîne

14
 2.1.ADN polymérases - ADN dépendantes
ADN polymérases chez eubactéries
5 ADN polymérases
➢ Pol I
➢ Réparation ADN, synthèse
fragments Okasaki, dégradation
amorces ARN
➢ Activités polymérase, exonucléase
3’→5’ , exonucléase 5’→3’
➢ Pol III
➢ Principale polymérase, élongation
chaîne

15
Biologie 6°
 2.1.ADN polymérases - ADN dépendantes
ADN polymérases chez eubactéries
5 ADN polymérases
➢ Pol I
➢ Réparation ADN, synthèse fragments Okasaki, dégradation
amorces ARN
➢ Activités polymérase, exonucléase 3’→5’ , exonucléase 5’→3’
➢ Pol II
➢ Réplication ADN endommagé
➢ Activités polymérase, exonucléase 5’→3’
➢ Pol III
➢ Principale polymérase, élongation chaîne
➢ Pol IV
➢ Polymérase famille Y
➢ Pol V
16
➢ Polymérase famille Y
2.1.ADN polymérases
C. Exemples d’ADN polymérases
1. ADN polymérase I
= Enzyme de Koenberg (103 kD)
➢ Enzyme d’Escherichia coli codée par PolA
➢ Polymérase de réparation de la famille A
➢ Fonction principale : réparation de l’ADN
➢ Fonction accessoire : réplication de l’ADN

➢ Activités :
➢ 5’→ 3’ polymérase
➢ 3’ → 5’ exonucléase
➢ 5’→ 3’ exonucléase

➢ Utilisation :
➢ Nick translation 17
2.1.ADN polymérases

C. Exemples d’ADN polymérases

2. Klenow
= Fragment de Klenow de la Polymérase I (68 kD)
➢ obtenue par
➢ traitement enzymatique de la PolI (subtilisine)
➢ Clonage (enzyme recombinante)

➢ Activités :
➢ 5’→ 3’ polymérase
➢ 3’ → 5’ exonucléase
➢ 5’→ 3’ exonucléase

18
2.1.ADN polymérases
C. Exemples d’ADN polymérases
2. Klenow
= Fragment de Klenow de la Polymérase I (68 kD)
➢ obtenue par
➢ traitement enzymatique de la PolI (subtilisine)
➢ Clonage (enzyme recombinante)
➢ Activités :
➢ 5’→ 3’ polymérase
➢ 3’ → 5’ exonucléase
➢ Utilisation :
➢ Remplissage extrémités protrudantes 5’
5’ 3’ 3’
T C G A C T T A A G A C T C A GG A C C T C C T T A C G G A T C
A G C T G AAT T C T G A G T C C T G G A G G AAT G C C TA G

3’ 19
5’
2.1.ADN polymérases

C. Exemples d’ADN polymérases

2. Klenow
= Fragment de Klenow de la Polymérase I (68 kD)
➢ obtenue par
➢ traitement enzymatique de la PolI (subtilisine)
➢ Clonage (enzyme recombinante)
➢ Activités :
➢ 5’→ 3’ polymérase
➢ 3’ → 5’ exonucléase
➢ Utilisation :
➢ Remplissage extrémités protrudantes 5’
➢ Random priming

20
Klenow : Random priming

Random priming
Utilisation d’hexamères aléatoires
5’ 3’

3’ 5’
1. Dénaturation par la chaleur
3. Polymérisation avec
2. Hybridation des amorces nucléotides marqués
5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’

5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’
Sonde fragmentée
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’

5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’
21
2.1.ADN polymérases
C. Exemples d’ADN polymérases
3. T4 DNA polymérase
➢ Enzyme d’Escherichia coli infectée par phage T4
➢ Polymérase de la famille B
➢ Activités :
➢ 5’→3’ polymérase
➢ 3’→5’ exonucléase
(200 X + que Klenow)
➢ Applications
➢ Marquage d’extrémités 3’ récessives (5’ protrudantes)

5’ 3’ 3’
T C G A C T T A A G A C T C A GG A C C T C C T T A C G G A*T C
A G C T G AAT T C T G A G T C C T G G A G G AAT G C C TA G

3’ 22
5’
 2.1.ADN polymérases
C. Exemples d’ADN polymérases
3. T4 DNA polymérase
➢ Enzyme d’Escherichia coli infectée par phage T4
➢ Activités :
➢ 5’→3’ polymérase
➢ 3’→5’ exonucléase
(200 X + que Klenow)
➢ Applications
➢ Marquage d’extrémités 3’ récessive (5’ protrudantes)
➢ Conversion d’extrémités protrudantes en extrémités
franches

5’ 3’ T4 DNA Pol 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 23
5’
2.1.ADN polymérases
C. Exemples d’ADN polymérases
4. T7 DNA polymérase
➢ Enzyme d’Escherichia coli infectée par phage T7
➢ Polymérase réplicative de la famille A

➢ Activités :
➢ 5’→3’ polymérase
➢ 3’→5’ exonucléase
(1000 X + que Klenow)
➢ Gde processivité
➢ Enzyme modifiée sans activité exonucléase (enzyme
recombinante = Sequenase)

➢ Applications
➢ Séquençage
➢ Pas de discrimination entre dNTP et ddNTP en présence
24
de Mn2+
2.1.ADN polymérases
C. Exemples d’ADN polymérases
5. Polymérases thermostables
➢ Taq
➢ Isolée à partir de Thermus aquaticus
bactérie thermophile
➢ Activités :
➢ 5’→ 3’ polymérase
fonctionne à t° 75-80°c
activité fortement réduite qd t° descend
➢ 5’→ 3’ exonucléase
➢ Terminal transférase

➢ Autres polymérases thermostables :

➢ Pfu, Pwo, Tth, Vent, ….
25
 2. Polymérases
2.2. ADN polymérases - ARN dépendantes
Transcriptase reverse
➢ Activité ADN polymérase ARN dépendante
➢ Brin matrice : ARN ou ADN
➢ Pas activité 3’-5’ exonucléase
➢ Mg2+
➢ Activité RNase H
➢ 5’ → 3’
➢ 3’ → 5’

➢ AMV :
➢ provient retrovirus aviaire
➢ (forte activité RNase H) pH 8,3
➢ Mo-MLV :
➢ Provient Moloney murine leukemia virus (forme recombinante)
➢ pH 7,6 26
 2. ADN polymérases
Comparaison des propriétés des polymérases
Enzyme Processivité Vitesse de Activités Matrice T°
polymérisation exonucléases
(dNTP/sec)

Fragment de Faible 10-12 3’→5’ ADN 37°c

Kenow (10-50)

Sequenase Haute > 300 3’→5’ 37°c

(2000-3000) ADN
inactivée

Taq DNA Moyenne > 20 5’→3’ ADN 70-80°c

polymérase
3’→5’
faible à nulle

42°c
AMV Transcriptase Moyenne 4 aucune ARN, 27
reverse ADN
 2. Polymérases
2.3.Terminal transférase
Addition séquentielle de nucléotides à extrémité 3’OH
= Homopolymère tailing
➢ Pas besoin de brin matrice
➢ Sur ADN db ou sb

1. En présence Co2+ : ajout pyrimidines

5’ 3’ 5’ 3’
TTTTT
TTTTT
3’ 5’ Co2+ 3’ 5’

2. En présence Mg2+ : ajout purines

5’ 3’ 5’ 3’
AAAAA
AAAAA
3’ 5’ Mg2+ 3’ 5’ 28
2.3.Terminal transférase
Homopolymère tailing
➢ Utilisation pour faciliter clonage

29
Gene, 1999
 2. Polymérases
2.4. ARN polymérases

➢ 1. Activité ARN polymérase ADN dépendante

➢ 2. Nécessité d’un promoteur spécifique

➢ Promoteurs de phages
➢ SP6
➢ T3
➢ T7

➢ 3. Activité en présence Mg2+ et des 4 rNTP

30
 3. Enzymes de modification
3.1. Phosphatases alcalines
➢ Catalyse l’élimination des 5’ PO4
➢ Action sur
ADN, ARN, rNTPs, dNTPs
5’ 3’ 5’ 3’
P
P
3’ 5’ 3’ 5’

➢ BAP (bactérienne)
➢ Très active
➢ Très résistante à la chaleur, aux inhibiteurs
➢ CIP (veau)
➢ Inactivation facile par chaleur +EDTA
➢ SAP (crevette)
➢ Inactivation facile par chaleur

➢ Utilisation : Empêche plasmide de se recirculariser sans incorporation

31
fragment
 3. Enzymes de modification
3.2. Polynucléotide kinase
➢ Transfert phosphate en g de l’ATP vers extrémité 5’ ADN
ou ARN NH 2

N
- - - N
O O O

HO P O P O P O CH2 N N
O
O O O

g b a
OH H

5’ 3’ 5’ 3’
P
P
3’ 5’ 3’ 5’

32
 3.2. Polynucléotide kinase
Applications :Marquage de l’extrémité 5’
A
5’ 3’
P
P
3’ 5’
1. Phosphatase alcaline 2. T4 polynucléotide kinase + g32P ATP

5’ 3’
P
P
3’ 5’

5’ 3’
P
P
3’ 5’
T4 polynucléotide kinase
+ ADP en excès
+ ATP32
5’ 3’
P 33
P
3’ 5’
 Références du cours
• Lewin B. (2006) Gene IX Jones and Bartlett
Publishers, Inc
• Andrey R. Pavlov, Nadejda V. Pavlova, Sergei
A. Kozyavkin and Alexei I. Slesarev, Recent
developments in the optimization of
thermostable DNA polymerases for efficient
applications, TRENDS in Biotechnology Vol.22
No.5 May 2004
• Primrose S., Twyman R., et Old R. (2015)
“Principes de genie génétique” De Boeck
• Raven H., Johnson G., Mason K., Losos J.,
Singer S. (2017), Biologie, De Boeck, 4° edition34