Maturation des protéines et

cycle cellulaire
Par Alexandre Ottaviani, MCF UCA, IRCAN

TD L1SV OMM Ecue 1 UCA

Les phases du cycle cellulaire

2
Les points de contrôle principaux du cycle cellulaire

3
Les composants clés du système de contrôle

APC
Transition
Transition G2/M Métaphase/Anaphase

Points de
contrôle

Transition G1/S

4
Les problèmes capables de bloquer le cycle (1)
Lésion de l’ADN

Activations

ATM ATR
Phosphorylations / Activations

Chk2 Chk1
Phosphorylations /
Phosphorylations /
Stabilisation
Phosphorylation / Dégradation Séquestration

p53 Cdc 25 A Cdc 25 C

Expression
Déphosphorylation / Activation
p21 Répression

Inhibition Inhibition Cycline B-Cdk1

Déphosphorylation /
Activation
Cycline E-Cdk2

Transition G1 / S Transition G2 / M
5
Les problèmes capables de bloquer le cycle (1)

Réplication inachevée

Activation
ATM ATR ADN simple brin
Phosphorylations / Activations

Chk2 Chk1
Phosphorylations /
Phosphorylations /
Stabilisation
Phosphorylation / Dégradation Séquestration

p53 Cdc 25 A Cdc 25 C

Expression
Déphosphorylation / Activation
p21 Répression

Inhibition Inhibition Cycline B-Cdk1

Déphosphorylation /
Activation
Cycline E-Cdk2

Transition G1 / S Transition G2 / M
6
Les problèmes capables de bloquer le cycle (2)
Kinétochore non attaché
au fuseau mitotique

Activation

Inhibition
Mad2

7
 Les problèmes capables de bloquer le cycle (3)
Réplication inachevée Kinétochore non attaché
Mauvais alignement en métaphase
APC
Transition
Transition G2/M Métaphase/Anaphase

Lésion de l’ADN Points de

Environnement défavorable contrôle
Croissance insuffisante

Transition G1/S

8
200%

100%

9
 UV
Réplique
Levures

Boîte incubée à 20°C Réplique incubée à 37°C

Mutations Température permissive

Température restrictive

Mutants
thermosensibles

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Les colonies qui se sont développées uniquement sur la boîte de pétri à 20°C sont appelées A, B, C et D.
Pour déterminer le rôle de ces mutations dans ces levures, nous utilisons différentes expériences.
Les expériences 1 et 2 représentent deux façons différentes d’arriver à des conclusions semblables et sont à considérer indépendamment.
Expérience 1 :
Les souches de levures A, B, C et D ainsi qu’une souche non mutée (sauvage ou Wt) sont d’abord incubées à partir de t = -2h (2 heures est la
durée approximative du cycle cellulaire chez la levure) à 20°C en présence d’un inhibiteur de la phase M, puis à t = 0h on les passe dans un
milieu à 37°C sans inhibiteur mais en présence de thymidine radioactive. Au cours de la période représentée sur le graphique ci-dessous,
l’incorporation de la thymidine dans l’ADN est suivie par des prélèvements toutes les 5 min d’échantillons du milieu de culture et d’une mesure
de la radioactivité présente dans les préparations d’ADN génomique des levures de chacun de ces échantillons.

Question 3 : Expliquer les courbes d’intégration de la radioactivité pour les différentes levures.
En quelles phases du cycle cellulaire sont bloquées les levures mutantes A, B, C et D ?

G2

G2

G1
G1

G1

Wt
A, D
B, C
11
M
Expérience 2 :
Les levures sont traitées par de l’hydroxyurée, qui bloque la synthèse d’ADN en inhibant la synthèse des désoxyribonucléotides. Le blocage
de la synthèse d’ADN peut être levé en changeant simplement le milieu d’incubation.
A / Après synchronisation en phase M, on incube les différentes souches mutantes de levures ainsi qu’une souche non mutante à 20°C
pendant 1 heures 30 (durée de l’interphase chez la levure). On les transfère alors dans un milieu contenant de l’hydroxyurée à température
restrictive (37°C).
Les levures de la souche non mutée et les levures des souches B et C réalisent une division cellulaire.
B / On inverse à présent l’ordre du traitement : on incube les souches à 37°C pendant 1h30 dans un milieu sans hydroxyurée, puis on le
transfère dans un milieu contenant de l’hydroxyurée à 20°C.
La souche non mutée ainsi que les souches A et D réalisent une division cellulaire.

Question 4 : Expliquer ces résultats. En quelles phases du cycle cellulaire sont bloquées les
levures mutantes A, B, C et D ? En quoi ces résultats différent de ceux de l’expérience 1 ?

A/ Wt
B, C
A, D
M
G1 G2
1h30 à 20°C hydroxyurée à 37°C
B/ Wt

A, D

M
G1 G2
1h30 à 37°C hydroxyurée à 20°C 12
Expérience 2 :
Les levures sont traitées par de l’hydroxyurée, qui bloque la synthèse d’ADN en inhibant la synthèse des désoxyribonucléotides. Le blocage
de la synthèse d’ADN peut être levé en changeant simplement le milieu d’incubation.
A / Après synchronisation en phase M, on incube les différentes souches mutantes de levures ainsi qu’une souche non mutante à 20°C
pendant 1 heures 30 (durée de l’interphase chez la levure). On les transfère alors dans un milieu contenant de l’hydroxyurée à température
restrictive (37°C).
Les levures de la souche non mutée et les levures des souches B et C réalisent une division cellulaire.
B / On inverse à présent l’ordre du traitement : on incube les souches à 37°C pendant 1h30 dans un milieu sans hydroxyurée, puis on le
transfère dans un milieu contenant de l’hydroxyurée à 20°C.
La souche non mutée ainsi que les souches A et D réalisent une division cellulaire.

Question 4 : Expliquer ces résultats. En quelles phases du cycle cellulaire sont bloquées les
levures mutantes A, B, C et D ? En quoi ces résultats différent de ceux de l’expérience 1 ?

A/ Wt
B, C
A, D
M
G1 G2
1h30 à 20°C hydroxyurée à 37°C
B/ Wt

A, D

M B, C
G1 G1 G2
1h30 à 37°C hydroxyurée à 20°C 13
Question 5 : Interpréter ces résultats. Que nous apprennent-ils sur les mutants A, B, C et D ?

Haploïdes Croisement Diploïde

Le diploïde a un allèle
Mutant du gène Y: (X; y) sauvage dominant
(X/x ; y/Y) pour chaque gène,
donc un phénotype
Mutant du gène X: (x; Y)
sauvage
Sauf si… X=Y!
➢ On appelle ce type de test un test de complémentation fonctionnelle. Ici B et C
appartiennent au même groupe de complémentation car leur croisement ne restaure
pas le phénotype sauvage. Ils sont probablement mutés dans le même gène. 14
 II Expérience de « pulse-chasse »
Expérience 1 :
Cette expérience consiste à incuber brièvement les cellules avec un acide aminé radioactif (leucine 3H), suivi d’une incubation de longue
durée dans un milieu de culture normal. On réalise à différents temps des extractions protéiques des différents compartiments cellulaires
séparés par centrifugation différentielle. Le graphique suivant représente le suivi de la radioactivité dans les différents compartiments
cellulaires.

Question 6 : A partir de vos connaissances de la voie de sécrétion des protéines, trouver et

expliquer à quels compartiments appartiennent les courbes.

Vésicules
REG
Golgi

Pulse Chasse

Pulse : Incubation avec un précurseur marqué

Chasse : Incubation avec le précurseur non marqué
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➢ Technique permettant d’étudier le devenir d’un précurseur et la cinétique de sa
prise en charge par un système biologique.

➢ Selon le type de précurseur et la méthode d’analyse utilisés, on peut déterminer :

▪ des changements localisation subcellulaire (microscopie, fractionnement,…),
▪ des caractéristiques des synthèses de macromolécules biologiques,
▪ des clairances de différents types de composés.

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Expérience 2 :
On réalise une incubation brève de cellules dans un milieu contenant un ose radioactif (galactose 3H), suivie d’une
incubation de longue durée dans un milieu de culture normal. On réalise à différents temps des extractions protéiques des
différents compartiments cellulaires séparés par centrifugation différentielle. Le graphique suivant représente le suivi de la
radioactivité dans les différents compartiments cellulaires.

Question 7 : A partir de vos connaissances du système endomembranaire, trouver et expliquer à

quels compartiments appartiennent les courbes.

REG
Vésicules
Golgi

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