Bases moléculaire du diagnostic

et du traitement de la LMC

Sokhna Aïssatou TOURE

Interne des hôpitaux
20/05/2016 Master II hématologie 1
 Plan
INTRODUCTION

I-RAPPELS

II-PATHOGENIE

III-DIAGNOSTIC MOLECULAIRE

IV-TRAITEMENT

CONCLUSION

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 Introduction

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 1-Définition

 Leucémie Myéloïde Chronique: LMC

maladie clonale de la cellule souche hématopoïétique
Appartenant au groupe des syndromes myéloprolifératifs

 prolifération médullaire prédominante de la lignée

granuleuse
 présence d’une anomalie chromosomique quasi-
spécifique, le chromosome Philadelphie (Ph) t(9;22)
(q34;q11) : translocation entre les chromosomes 9 et 22
 réarrangement bcr/abl

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 2-Intérêt

 Diagnostique
 Leucémogènese bien connue
 Cytogénétique et biologie moléculaire

 Thérapeutique
 Avancée thérapeutique ces dernières années:
inhibiteurs de la tyrosine kinase
 Allogreffe de moelle: seul traitement curatif

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 I-Rappels

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 1-Gène ABL et sa protéine

 Structure
 En position 9q34
 Deux variantes possibles pour le 1er exon: 1a et 1b
 ARN messagers mesurent respectivement 6 et 7 kb
 Deux variétés de protéines d’environ 145 kDa synthétisées
en fonction du premier exon
 Possède des domaines d’homologie SH (Src homology)
semblables à ceux de la protéine Src.)

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 1-Gène ABL et sa protéine

 Structure
 Le domaine SH3 est un régulateur négatif du domaine SH2,
qui est un régulateur positif du domaine SH1, support de
l’activité tyrosine kinase de la protéine Abl .

 Dans la partie C-terminale de la protéine: il existe une

séquence de localisation nucléaire (NLS) ainsi que des
domaines lui permettant de se fixer aux filaments d’actine et à
l’acide désoxyribonucléique (ADN).

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 1-Gène ABL et sa protéine

 Structure

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 1-Gène ABL et sa protéine

 Propriétés
 Protéine Abl : dualité structurale et fonctionnelle

 Rôle à la fois dans le noyau et dans le cytoplasme de la

cellule et de transiter entre les deux compartiments.

 Son action dépend de sa localisation nucléaire ou

cytoplasmique.

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 1-Gène ABL et sa protéine

 Propriétés
 Compartiment nucléaire: régulateur négatif du cycle
cellulaire.

- Phase G0: liaison à l’ADN et formation de complexe avec

protéines inhibitrices du cycle telles que pRb.

- Transition G1/S: pRb est phosphorylée et se dissocie d’Abl

permettant son activation.

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 1-Gène ABL et sa protéine

 Propriétés
 Compartiment cytoplasmique:

- Rôle important dans la croissance et la prolifération cellulaire

- Participe à la transduction du signal initiée par certains

récepteurs aux facteurs de croissance

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 2-Gène BCR et sa protéine

 Structure
 Bras long du chromosome 22
 S’étend sur 135 kb:
- 23 exons et transcription de deux types d’ARNm avec
respectivement 4,5 et 6,7 kb
- Codent une protéine de 160 kDa, d’expression ubiquitaire.
 Protéine:
localisation cytoplasmique lorsque la cellule n’est pas en cycle
exprimée de manière périchromosomique lors de la mitose

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 2-Gène BCR et sa protéine

 Protéine Bcr constituée de plusieurs domaines

 Partie N-terminale:
- domaine 1B ,région importante permettant la dimérisation
de la protéine Bcr-Abl et ouverture de l’activité kinase,

- domaine 2B comprend deux sites de liaison aux domaines

SH2 comme ceux portés par la protéine Abl et la protéine
Grb2.

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 2-Gène BCR et sa protéine

 Région centrale: domaine d’homologie avec les protéines Dbl

(facteur d’échange guanosine triphosphate [GTP]/guanosine
diphosphate [GDP]).

 Partie C-terminale de Bcr, absente dans la protéine de fusion

Bcr-Abl:
- a une fonction GAP (GTPase activating protein) pour les
protéines G de type Rac
- joue en réalité un rôle dans la bactéricidie des
polynucléaires

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 2-Gène BCR et sa protéine

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 II-Pathogénie

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 1-Gene BCR-ABL et protéine de fusion

Cette translocation aboutit à un chromosome 22 très court (= Phi) sur lequel se

trouve le gène chimérique BCR-ABL, formé du début de BCR et de la fin d’ABL

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 Différents points de cassure

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 1-Gene BCR-ABL et protéine de fusion

La conservation du cadre de lecture permet la synthèse d'ARN messagers

hybrides dits chimériques comportant des séquences bcr en 5' et c-abl en
3'.

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 Transcrits et Protéines

 e1a2:
issu cassure m-BCR(minor BCR)
produit une protéine de 190KDa avec activité tyrosine kinase++
LAL BCR-ABL+

 e19a2:
issu cassure micro-BCR(μ-BCR)
protéine de 230KDa
hémopathie d’évolution lente

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 Transcrits et Protéines

 b2a2 et b3a2: plus fréquent++

issu cassure major-BCR (M-BCR)
produisent une protéine de 210KDa
Protéine produite par b3a2 est plus fréquente et comporte 25
AA de plus que celle produite par b2a2
LMC( pas de différence d’évolution clinique ou biologique
entre ces 2 variantes)

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 1-Gene BCR-ABL et protéine de fusion


Protéine Bcr-Abl de 210 kDa

domaines SH1, SH2, SH3 et tous les autres domaines d’Abl.


Du côté Bcr: le motif de dimérisation+++
dimérisation de la protéine Bcr-Abl et son
autoactivation par transphosphorylation.


Perte partie N-terminale d’Abl supprime son auto-inhibition.

activation permanente de la tyrosine kinase

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 1-Gene BCR-ABL et protéine de fusion


La protéine tyrosine kinase Abl


physiologique, autorégulée de manière physique(modification
conformationnelle)


Sa fusion à Bcr modifie cette auto-inhibition et active en
permanence la kinase.

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 2-conséquence Bcr-Abl: dérégulation moléculaire

Altération des protéines d’adhésion

Activation des signaux mitotiques

Inhibition de l’apoptose

Dégradation des protéines par le proteasome

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Instabilité génique
 III- Diagnostic moléculaire

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 1-Caryotype

 Réalisé sur échantillon médullaire

 Met en évidence dans 95 % des cas la présence du

chromosome Philadelphie t(9;22) (q34;q11)

 Permet de détecter des anomalies cytogénétiques

surajoutées

préciser la phase de la maladie.

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 1-Caryotype

 Technique:

 Prélèvement: sang sur héparine de lithium en fonction de

l’échantillon

 Lectine à fort pouvoir mitogène = phytohémagglutinine ou

PHA

 synchronisation des cultures et/ou blocage de l’appareil

fusorial = colchicine ou colcémide

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 1-Caryotype

Technique de Culture

SANG
RPMI MOELLE
PHA ou RPMI
phytohémmaglutinine Pénicilline –
Pénicilline - Streptomycine
Streptomycine Glutamine
Glutamine FBS ou
FBS ou Sérum de Veau Foetal Sérum de Veau Foetal

Marrow-Max

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 1-Caryotype

 marquage = alternance de bandes transversales faiblement ou

fortement colorées dont la séquence est spécifique à chaque
paire de chromosomes
En bande G ou en bande R

 La résolution de la cytogénétique classique est celle de la

microscopie photonique et ne dépasse pas 5.106 pb.

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 1-Caryotype

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 1-Caryotype

Anomalies cytogénétiques additionnelles

 Anomalies de nombre
- trisomie 8
- trisomie19
- trisomie 21
- perte du chromosome Y
 Anomalies de structure :
- isochromosome 17q
- ider(22) t(9;22)(q34;q11)
- t(3;21)(q26;q22)
 Anomalies de nombre et de structure : duplication du Ph1
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 2-Hybridation fluorescente in situ ou FISH

Visualise directement le gène de fusion Bcr-Abl sur les noyaux

 Avantage:
détecter remaniements Bcr-Abl sans chromosome Philadelphie

être plus sensible que caryotype

 Inconvénient:
Ne visualise pas les anomalies cytogénétiques additionnelles

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 2-Hybridation fluorescente in situ ou FISH

 Principe:
basée sur la complémentarité entre les brins d’ADN et une
sonde de marquage avec sa séquence cible

 Dénaturation:
- thermique: température > 76C
- chimique: soude 0,07 molaire

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 2-Hybridation fluorescente in situ ou FISH

 Sonde couplée au fluorochrome

utilisation de couleurs différentes

 Type de sonde:
- CEP ou centromerique
- LSI ou locus spécifique
- WCP ou chromosomique

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 2-Hybridation fluorescente in situ ou FISH

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 2-Hybridation fluorescente in situ ou FISH

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 2-Hybridation fluorescente in situ ou FISH

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 3-Biologie moléculaire

Prélèvement :
- Sang sur tube EDTA
-Etudes ont démontrés qu’il y avait une corrélation
d’expression de l’ARN entre le sang et la moelle


Reverse transcriptase polymérase chain reaction (RT-PCR)
Test qualitatif sur ARN (fragile+++)
Recherche les transcrits de fusion Bcr-Abl
Définit le sous type moléculaire
Attention à la technique (quels transcrits recherchés, nécessité d’un control interne
pour vérifier la qualité de l’ARN)

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 3-Biologie moléculaire

 Reverse transcriptase polymérase chain reaction (RT-PCR)

Extraire ARN par différentes méthodes: colonne, phénol,…

- Quantifier l’ARN extrait par mesure de densité optique
(nanodrop)
- Qualification par un gène ubiquitaire

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 3-Biologie moléculaire

Reverse transcriptase polymérase chain reaction (RT-PCR)

Technique: thermocycleur avec 3 étape

- Dénaturation par chauffage (température aux environs de
95⁰C)
- Hybridation des amorces
- Elongation des brins d’ADN grâce a la Taq polymérase

Fin PCR: migration sur gel pour différencier les différents

trancrits

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 3-Biologie moléculaire

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 3-Biologie moléculaire

 Quantification des transcrits BCR-ABL par qRT-PCR

 par sonde couplée a un fluorochrome: sonde Taqman

 la quantité de fluorochrome est inversement
proportionnelle a la Q de molécule présente au départ

Courbe d’étalonnage standardisée à l’échelle internationale

Résultat = %(Copies BCR-ABL/copies Gene control)

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 3-Biologie moléculaire

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 3-Biologie moléculaire

 Rationnel de la quantification des transcrits BCR-ABL

 Evolution vers une leucémie aiguë de mauvais pronostic en
l’absence de traitement et en cas d’échappement
thérapeutique
 Cinétique de décroissance du transcrit sert d’indicateur de
réponse au traitement
 Suivi au long cours permet de déceler précocement
l’inefficacité du traitement
 Méthode la plus sensible pour quantifier la maladie
résiduelle

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 IV-Traitement

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 1-les inhibiteurs de la tyrosine kinase

 1ere génération: imatinib mesylate

 2eme génération: nilotinib et dasatinib
 3eme génération: Ponatinib et Bosutinib
 Essai en cours: Anti-T315I

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 1-les inhibiteurs de la tyrosine kinase

DATE D’APPROBATION FDA

2ème ligne 1ère ligne

Imatinib 2001 2002

Dasatinib 2006 2010
Nilotinib 2007 2010
Bosutinib 2012
Ponatinib 2012

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 2-mécanisme d’action des ITKs

20/05/2016 49
 2-mécanisme d’action des ITKs

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 2-mécanisme d’action des ITKs

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 Conclusion

 la LMC est une hémopathie maligne dont la leucémogènese

est bien connue.

 Nécessité d’une bonne compréhension des bases

moléculaires

 Diagnostic beaucoup amélioré par la biologie moléculaire

 ITKs ont beaucoup révolutionnés sa prise en charge 

Espérance de vie normale pour certains

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 Merci de votre attention

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