SENSIBILITE ET RESISTANCE DES

STAPHYLOCOQUES AUX ANTIBIOTIQUES

Pr S. Bouhalila Besbes
laboratoire de biologie clinique - Institut M. Kassab d’orthopédie
EPU 2014
1
 Introduction
 S. aureus occupe une place importante en pathologie humaine,
 De nombreux anti staphylocoque sont disponibles dans presque
toutes les familles d’antibiotique sauf les polymixines et les
imidazoles
Initialement sensibles  ils ont développé des résistances
 Situation initiale: sont isolées d’une part des souches
multirésistantes aux antibiotiques essentiellement acquises en
milieu hospitalier et d’autre part des souches restant sensibles à
de nombreux antibiotiques et isolées surtout dans la
communauté.
 Aujourd’hui: diffusion mondiale des SARM communautaire
(C-SARM: SCCmec de type IV, PVL+, peu ou pas de R
associées)
2
 Et

3
Antibiotiques à tester selon CASFM-
EUCAST 2014 ****

Pristinamycine en cours
4
Antibiogramme Staphylococcus spp.
 Méthode par diffusion en milieu gélosé
 Milieu: Mueller Hinton
 Inoculum: 0,5McFarland
 Incubation: 35±1°C, 18±2h
 Lecture: mesure du diamètre d’inhibition sur un fond noir
éclairée par une lumière réfléchie.
 Contrôle de qualité:
Staphylococcus aureus ATCC 29213, souches complémentaires:
Staphylococcus haemolyticus CIP 107204, S. aureus NCTC 12493,
résistantes à la méticilline

5
 I – Bêta- lactamines

Activité
Résistance
Méthode de détection

6
I – Bêta- lactamines
– Activité (1)

 Antibiotiques bactéricides temps dépendant actif sur les

staphylocoques à l’exception des monobactams ( Aztrhreonam).
 Les Bêta-lactamines inhibent la synthèse du
peptidoglycane, principal constituant de la paroi bactérienne.
 Elles agissent à la dernière étape en inhibant les protéines liant
la pénicilline (PLP). Les PLP ont une activité transpeptidasique,
carboxypeptidasique et transglycolasique.
 S. aureus possède 5 PLP (1,2,2b,3 et 4)
 Chez les autres espèces de Staphylocoque, le nombre de PLP
varie de 2 à 5.

7
Protéines liant la pénicilline (PLP) de S. aureus

PLP MM Affinité Rôle

préférentielle
1 85 000 Imipenème Essentiel
2 80 000 Céfotaxime Essentiel +++
Céfuroxime
Ac clavulanique
2a 78 000 ? Résistance
intrinsèque
2b 70 000 ? ?
3 75 000 Méticilline Essentiel
Céphradine
4 45 000 Céfoxitine Non essentiel

8
Pour pénétrer dans la bactérie à travers la membrane externe
hydrophobe, les ATB empruntent fréquemment le canal
hydrophile des « porines » enchâssées dans cette membrane
ATB

Paroi Paroi
Gram + Gram -

ATB Porine

LPS 0000000000000 00000000

ME ^^^^^^^ ^^^^^^
Peptidoglycane 0000000000000 000000000

Périplasme
Transpeptidase
PLP PL PLP PL
P Transglycosylases
P
000000000000000000000000 00000000000000000000000000
Bi couche
phospholipide

000000000000000000000000 0000000000000000000000000
Cytoplasme
9 Le résultat final est une inhibition de la synthèse du peptidoglycane
I – Bêta- lactamines
– Activité (2)
 Les Bêta-lactamines, en se fixant sur les PLP, modifient la
structure de Peptidoglycane ce qui fragilise la paroi
bactérienne; Dans un second temps, on observe une lyse
bactérienne; ce témoin de l’activité bactéricide des Bêta-
lactamines est due à l’incapacité du PG altéré a maintenir la
pression osmotique intra-cytoplasmique.
 Deux mécanismes sont évoqués:
 Un mécanisme physique de ségrégation du nouveau
peptidoglycane dans un seul et même plan;
 Un deuxième mécanisme implique les autolysines comme le
gène lyt.

10
I – Bêta- lactamines
– Activité (3)

 La Pénicilline G et l’amoxicilline restent les plus actives (CMI

modale : 0.03mg/L) mais de nombreuses souches ont développé
des résistances
 L’oxacilline est la plus constamment active (CMI modale: 0.25mg/L)
 Les céphalosporines ne sont pas plus actives que l’oxacilline et ne
sont utilisés qu’en cas d’infection mixte.
C3°G  C2° G  C1°G
 CMI de la céfalotine : 0.1-0.5mg/L
 CMI du céfotaxime : 2-4 mg/L
 L’imipénème a une activité comparable à celle de l’oxacilline

11
CMI (mg/l) des béta-lactamines vis-à-vis de
souches sauvages de S. aureus

Béta -lactamines CMI médiane CMI extrêmes

Pénicilline G 0,03 rares 0,03-0,06
Ampicilline 0,06 0,06-0,12
Oxacilline 0,5 0,25-1
Céfalotine 0,25 0,12-0,5
Céfamandole 0,5 0,12-1
Céfotaxime 2 1-8
Céfoxitine 2 2-4
Moxalactam 8 4-8
Imipénème 0,03 0,01-0,06

12
 - Résistance bactérienne acquise
 Apparition rapide après mise sur le marché des ATB
Péni G Oxacilline Glycopeptides

1940...1942................1961...1962 ......1970......................1990...1997

S aureus R Peni S aureus Staphylocoques

R/méticilline VISA, GISA

13
 I – Bêta- lactamines
– Résistance

2 mécanismes essentiels :
 Résistance enzymatique : production de pénicillinase

 Modification de la cible : résistance intrinsèque à la

Méticilline
 Deux possibilités existent:
 L’acquisition d’une PLP exogène et/ou
 La modification des PLP endogènes.

14
1/ Production de Pénicillinase

Actuellement plus de 90% des souches de S. aureus sont

résistantes à la Pénicilline G par production de pénicillinase
Cette Bêta lactamase à type pénicillinase ouvre le cycle bêta-
lactame de la molécule  inactivation de l’antibiotique.

15
Production de Pénicillinase

 La pénicillinase est un polypeptide de 257 AA (MM:28kDA). Au

moment de sa synthèse, elle possède, en plus, une séquence
leader peptide de 24 AA qui est plus ou moins clivée lors de
son excrétion et qui fait que la pénicillinase peut rester liée à la
paroi bactérienne.

 La synthèse de l’enzyme est inductible:

la méticilline, l’oxacilline et le cefotaxime : inducteurs
les plus efficaces.

16
Pénicillinase
 Elles inactivent :
o Les Pénicillines G et V
o Les carboxypénicillines ( ticarcillines)
o Les aminopénicillines ( ampicillines, amoxicilline)
o Les ureidopénicillines ( mezlocilline, pipéracillines)

 L’activité de la pénicillinase est inhibée par:

o Les inhibiteurs de bêta-lactamase ( acide clavulanique,
sulbactam, tazobactam)
o L’augmentin* est le plus actif contre les souches productrices
de pénicillinase

17
 La régulation est de type contrôle négatif avec un répresseur
diffusible, (produit du gène bla I, lié au gène de structure bla Z).

 Il existe un anti répresseur (produit du gène bla R1) synthétisé

de manière constitutive et inactif. En présence de l’inducteur,
cet antirépresseur est capable d’inactiver le répresseur et de
provoquer la synthèse de pénicillinase.

 Le gène de la pénicillinase appartient à un transposon, localisé le

plus souvent sur un large plasmide, qui peut porter également
des gènes de résistance à d’autres antibiotiques ou à des
métaux lourds. Il peut également s’intégrer dans le
chromosome;

18
 blaI Répresseur
Synthèse constitutive

Anti-Répresseur blaRI

contrôle négatif
Sous la dépendance du gène blaZ régulé par un répresseur constitutif blaI
……………………………………………………………………………………………
et un anti répresseur blaR1, molécule transmembranaire activée par la présence d’une
β-lactamine .
Activé le gène blaR1, entraine la destruction du répresseur et le gène blaZ est exprimé.
19
Production de pénicillinase

β-lactamine  activation de blaR1  destruction de blaI  expression

Expression de blaZ
de blaZ

-lactamine
-lactamine
Méticilline,
Méticilline,
20
oxacilline et
oxacilline et céfotaxime
céfotaxime
+
 La régulation de la production de la pénicillinase


Dispersion des CMI de pénicilline G et amoxicilline


Antibiogramme par diffusion: difficile à interpréter pour
les CMI limites
Pénicillinase

 Il existe 4 types au moins de pénicillinase (A, B, C, D).

 Les activités de ces enzymes sont très voisines: elles
hydrolysent rapidement:
la pénicilline G, l’ampicilline et l’amoxicilline, la ticarcilline, la
pipéracilline mais également certaines céphalosporines comme
la céfazoline.
 Les Bêta-lactamines qui résistent à la pénicillinase :
- Les pénicilline M (méticilline, oxacilline)
- Les céphalosporines (céfamandole, céfuroxime, céfotaxime)
- Les carbapénèmes (imipénème)

22
Concentration inhibitrice 50% (µM) d’une
pénicillinase de type A
 Les pénicillinases de staphylocoques sont sensibles aux
inhibiteurs de β-lactamases:
 L’acide clavulanique a l’activité la plus importante suivi par
le tazobactam; le sulbactam est 10 fois moins actif

inhibiteur Concentration
inhibitrice 50%
Acide clavulanique 0,035
Tazobactam 0,07
Sulbactam 0,45

23
 Pénicillinase

• La détection de production de pénicillinase se fait par

l’antibiogramme standard avec un (disque de Péni G 6g CASFM
2013)/ (Eucast 2014: disque PéniG 1 unité) sur milieu MH avec un
inoculum de 107FC/ml, lecture après 18H d’incubation à 37° C.
• La réponse est valable pour toutes les pénicillines du groupe G et
pour toutes les autres pénicillines sensibles aux pénicillinases.

24
 Interprétation 2013 / Eucast:

 Absence de pénicillinase:
- Si diamètre d’inhibition est S  29mm
(Eucast26mm) et que la bordure de la zone d’inhibition est
floue (zone fantôme).
- Lorsque le diamètre est  29mm (Eucast26mm),
vérifier l’absence de production de pénicillinase
par une technique chromogénique (test à la nitrocéfine )
casfm 2013

 Présence de pénicillinase:
Si diamètre d’inhibition est < 29 /26 mm (CMI>0.25mg/L)

25
Absence de pénicillinase Présence de pénicillinase

26
 Présence de pénicillinase :
Si on observe une zone nette avec des colonies de grande
taille en bordure quel que soit le diamètre d’inhibition (parfois
D >29mm/ 26) ou des colonies « squatters » dans la zone
d’inhibition.
 La présence de « squatter » colonies dans la zone d’inhibition
et près du bord de celle-ci est un bon témoin de la production
d’une pénicillinase.
 Les « squatters » colonies dans la zone d’inhibition sont de
plus en plus grosse lorsqu’elles sont le plus proche du disque de
PéniG ce qui est complètement différent de la zone fantôme
observée en l’absence de pénicillinase ou les colonies sont de
plus en plus petites et transparentes.

27
 Pénicillinase

A B

28
Une technique chromogénique
( test à la nitrocéfine ++++)

- L'éventuelle présence d'une

ß-lactamase peut être
rapidement recherchée en
préparant un extrait brut de
la souche à examiner puis à le
tester par le virage plus ou
moins rapide d'une ß-
lactamine chromogénique
de type céfinase.

CASFM 2013: Vérifier l’absence de production de pénicillinase par une technique

chromogénique
29
 CASFM- EUCAST 2014

critiques
Charge du

Diamètr
disque

Sigle
antibiotiques (µg)

es
Si Ø <26 Résistant ,
Penicilline G 1Unité P ≥ 26 < 26 si Ø ≥ 26 mm Et bordure floue Sensible si bordure nette
rendre résistant ( technique chromogénique non fiable)
≥ 25 < 22 Il ne doit pas être tenu compte d’une zone fantôme pour la
S aureus lecture des Ø d’inhibition de la céfoxitine. Pour les (S.)
S présentant un Ø compris entre ces bornes, l’expression
Cefoxitine 30µg FOX ludgunensis,
S
d’une PLP2a après induction par une bêta-lactamine ou la
dépistage saprophytic présence d’un gène mecA,mecC doit être recherchée par
us une technique appropriée. Si R, répondre aussi Oxa R

≥ 26 < 24
SCN
Ampicilline 2µg AM ≥ 18 < 18 Si l’ampicilline est testé, les souches de S saprophyticus
S. sensibles à l’ampicilline sont sensible à la méticilline et
saprophyticus peuvent être rendues telles qu’elles sans test avec la
cefoxitine.
Ceftaroline 5 µg Les S aureus sensibles à la méticilline sont sensibles à la
≥ 21 < 19
S. aureus ceftaroline
Moxalactam SCN En cours En En cours
dépistage cours En cours
30
 Particularité :

 Depuis quelques années on observe des S. aureus ayant des

spécificités génétiques particulières appelées « boderline »
ou BORSA.
 Une hyper production de pénicillinase peut être responsable
de l’hydrolyse des pénicillines M des céphalosporines et des
carbapénèmes.
 Ce mécanisme génère un bas niveau de résistance à
l’oxacilline.
 Les inhibiteurs de pénicillinase restaurent in vitro l’activité des
Bêta-lactamines sur ces souches (mec A -).

31
Cas particulier : souche BORSA

Impact sur CMI de l’oxacilline = 2 mg/l

Sensible mais limite

32
2/ Résistance liée à la modification de la
cible: résistance intrinsèque à la Méticilline

Mécanisme de résistance :
1. Acquisition d’une PLP exogène: d’une PLP
additionnelle (la PLP2a ou PLP2’, PLP2c ) d’affinité faible
pour l’ensemble des Bêta-lactamines

2. Modification de la synthèse des PLP endogènes

33
1. Acquisition d’une PLP exogène: PLP 2a
 Elle est très proche d’une PLP de S. Sciuri
 La méticilline, ainsi que les diverses β-lactamines, inhibent le site
transpeptidasique de la PLP 2 mais celle-ci conserve son activité
transglycolase.
 La PLP2a possède une activité transpeptidasique résistante aux
β--lactamines
En présence de β- lactamines, le peptidoglycane du staphylocoque
continue à être synthétisé grâce à l’activité transpeptidasique de la
PLP2a et l’activité transglycolasique de la PLP2.
 La résistance est croisée entre les différentes β-lactamines.
 Toutefois cette résistance est un peu particulière car la PLP 2a ne
se substitue pas aux PLP normales : elle vient en plus et ne
s’exprime qu’en présence de β-lactamines.

34
 PLP2a
 La synthèse de cette nouvelle PLP est sous la dépendance du gène mec A qui fait
partie d’un fragment d’ADN additionnel d’environ 30kb qui s’est intégré dans le
chromosome de S.aureus.
En effet, mecA permet la production de la PBP2a (penicillin binding protein 2a), une transpeptidase qui
catalyse la formation de ponts dans le peptidoglycane de la paroi bactérienne. L’expression de la PBP2a
rend les SARM résistants aux bêta-lactamines car ils ne peuvent pas inhiber l’action de la PBP à cause de
leur faible affinité pour la PBP2a.

 La régulation de l’expression du gène mec A est complexe.

 Dépend au moins de 2 systèmes: répression transcriptionnelle sur mecA

• mecI et mecR1 +++
• blaI et blaR1
 Cette régulation entraîne une expression phénotypique variable :
 Cette résistance peut s’exprimer soit de manière : homogène ou hétérogène

35
 Régulation du gène mecA

2 systèmes chromosomiques impliqués

- mecI/mecR en amont du gène mecA régule synthèse de la PLP2a
- blaI/blaR1 1en amont du gène blaz régule la synthèse de la pénicillinase
et celle de la PLP2a
36
 Régulation de l’expression du gène mecA par les systèmes
mecI/mecR1 et blaI/blaR1

Gène mec I

Fonctionnel Non fonctionnel

( délétions,
insertions)
Bla I-bla R1
Présent ou
absent Bla I-bla R1

Présent Absent

Gène mecA Réprimé Exprimé Exprimé

Mode d’expression Inductible Inductible Constitutif
retardée (oxacilline bon
inducteur)
Phénotype S R R
Fréquence Exceptionnel Le plus fréquent ?/possible
37
Plus de 20 gènes auxiliaires sont également impliqués / fem, mur, fmt, sarA, agr…
Organisation génétique du complexe
mec
 Le complexe des gènes mec se situe sur un élément
génétique mobile très particulier qui s’intègre sur le
chromosome à un site unique situé près de l’origine de la
réplication et du gène de résistance à la novobiocine.
 Il est associé à un complexe de deux gènes de recombinases
de la famille des intégrases-resolvases désignées ccrA et ccrB
qui permettent l’intégration et l’excision du complexe mec-
ccr qui se comporte comme un ilot de résistance aux B-
lactamines et que l’on nomme SCCmec ( Staphylococcus
cassette chromosomal).

38
39
 Classification des ilots génomiques
conférant la résistance à la méticilline
Type SCC Type du Type de Taille (kb)
complexe des recombinase
gènes mecA
I B ccrA1-ccrB1 34
II A ccrA2-ccrB2 52
III A ccrA3-ccrB3 67
IV B ccrA2-ccrB2 21-24
V C ccrC 21-24
---
• détermination du type de cassette : Par PCR
Intérêt épidémiologique des SARM
• La cassette de type IV est décrite chez les S aureus dits communautaires car trouvés
en dehors de l’hopital. Ce type C-SARM ne présente que peu de résistance associées à
la méticilline mais produit parfois la toxine de Panton et Valentine. (infections
cutanées dans des communautés d’enfants)
40
 Il existe plusieurs types de SCCmec : le type I qui s’est
disséminé à partir des premières souches de SARM, ne
contient que le gène mecA ;
 les types II et III sont devenus dominants dans les années
1980, et contiennent plusieurs gènes de résistance aux
antibiotiques d’où le phénotype de résistance associé :
fluroquinolone, macrolides, kanamycine et tobramycine)
 Le type IV est décrite chez les S aureus dits communautaires
car trouvés en dehors de l’hopital. Ce type C-SARM ne
présente que peu de résistance associées à la méticilline mais
produit parfois la toxine de Panton et Valentine. (infections
cutanées dans des communautés d’enfants)

41
Différents types SCCMEC

La combinaison des différentes classes de

complexe mec et des 5 types de
recombinases permet de définir huit types
de cassettes (I-VIII).

Elles diffèrent:
-par leur structure et leur taille (20 à 66kb)
-par leur répertoire de résistances aux
antibiotiques

Apparition nouvelle cassette SCCmec : Type XI

Résistance isolé à la méticilline

42
Expression de la résistance à la méticilline par
production de PLP2a

 Homogène : l’ensemble de la population exprime

la résistance dans les conditions habituelles de
l’antibiogramme

 Hétérogène où seule une partie de la population

(1 bactérie sur 104à 107) exprime cette résistance.

43
L’hétérogénéité de la résistance
 Est due à l’existence de gènes de régulation et de gènes dits
« auxiliaires »: gènes fem,fnt,sarA, agr, etc. Par mutation, il est
possible de transformer une souche hétérogène en souche
homogène;
 De même par, mutagénèse et par transposition , il est
possible de transformer une souche homogène de S aureus
en une souche hétérogène.
 Pour des souches présentant une résistance de type
hétérogène, le niveau de résistance à la méticilline
dépend des conditions de culture: la température,
osmolarité, pH, cations divalents.
 La résistance est augmentée à 30°C ou en milieu
hypersalé (Nacl5%). La résistance est supprimée à
43°C et à pH 5,2.

44
  Détection de la résistance à la méticilline/oxacilline

1/Détection en milieu gélosé

dans les conditions standard de culture
( ancienne méthode)

Milieu Mueller Hinton gélosé+Disque d’oxacilline chargé à 5 g

Inoculum 107UFC/mL pendant 24H à 48H
Incubation 35°-37°C

N’est plus utilisé

Résistance
si diamètre d’inhibition < 20mm ou croissance autour du disque
Résistance homogène (RO) pas de problème d’interprétation
(100% des souches possèdent le gène mec A )
Pb : En cas de résistance hétérogène( RH) une faible partie de la pop. exprime
45 la résistance 1 souche sur 104 à 107
2) Méthode de détection par diffusion en gélose MH
Méthode CA-SFM 2013
Disque d’oxacilline chargé à 5 g
Inoculum lourd 107 UFC/ml

Milieu non supplémenté en sel ou Milieu hyper salé 2 à 4%

Incubation 30°C incubation à 37°C

24H ( 48H pour certain SCN et SARM )

S : Si diamètre  20 mm
R : Si diamètre < 20 mm
46
Ne pas cumuler les deux méthodes
(30°C et Hyper salé)

30° ou milieu hypersalé à 37°C 37°

47
Détection de la résistance hétérogène (RH):
1/ Méthode de détection par diffusion en gélose MH :
Test à la céfoxitine
Le test de la céfoxitine en conditions standards (MH, 37°C, 18-24h) est
bien corrélé à la détection du gène mecA et remplace le test de
l’oxacilline
CA-SFM 2013 (S. aureus et SCN)
Disque de cefoxitine à 30g dans les conditions standards de
l’antibiogramme :
Inoculum 106 UFC/ml et incubation 18-24 h à 37°C
Diamètre  27mm  Sensible
Diamètre < 25 mm  Résistante
25 mm < diamètre  27 mm  test complémentaire :
présence d’un gène mec A ou test PLP2a après induction
(autour d’un disque de β-lactamine, oxacilline ou céphamycine)
48
Détection de la résistance hétérogène (RH):
2/ Méthode de détection par diffusion en gélose
MH :
Test au Moxalactam

CA-SFM 2013 (S. aureus et SCN)

Disque de Moxalactam à 30g dans les conditions standards
de l’antibiogramme :
Inoculum 106 UFC/ml et incubation 18-24 h à 37°C
Diamètre  24mm  Sensible
Diamètre < 23 mm  Résistante
23 mm < diamètre  24 mm  test complémentaire :
présence d’un gène mec A ou test PLP2a après induction
(autour d’un disque de β-lactamine,oxacilline ou céphamycine)

49
 CASFM- EUCAST 2014

Diamètre
disque (µg)

critiques
Charge du

Sigle
Antibiotiques

s
≥ 25 < 22 Il ne doit pas être tenu compte d’une zone fantôme
S aureus pour la lecture des Ø d’inhibition de la céfoxitine.
Cefoxitine S ludgunensis, Pour les (S.) présentant un Ø compris entre ces
30µg FOX S saprophyticus
dépistage bornes, l’expression d’une PLP2a après induction par
≥ 26 < 24 une bêta-lactamine ou la présence d’un gène
SCN mecA,mecC doit être recherchée par une technique
appropriée. Si R, répondre aussi Oxa R
Ampicilline 2µg AM ≥ 18 < 18 Si l’ampicilline est testé, les souches de S
S. saprophyticus saprophyticus sensibles à l’ampicilline sont sensible
à la méticilline et peuvent être rendues telles qu’elles
sans test avec la cefoxitine.
Ceftaroline 5 µg Les S aureus sensibles à la méticilline sont sensibles
≥ 21 < 19
S. aureus à la ceftaroline
Moxalactam SCN En cours En En cours
dépistage cours En cours

Carbapénèmes La sensibilité des Staphylocoques aux carbapénèmes

est déduite de celle à la céfoxitine

50
CASFM- EUCAST 2014
Oxacilline

S. aureus et S. lugdunensis avec une CMI de l'oxacilline >2 mg/L

et
les staphylocoques à coagulase négative avec une CMI de
l'oxacilline > 0,25 mg/l

sont le plus souvent résistants à la méticilline du fait de la

présence d'un gène mec additionnel.

51
CASFM- EUCAST
 Les souches productrices de pénicillinase sont résistantes
à la pénicilline G, à la phénoxyméthylpénicilline, aux
aminopénicillines, aux carboxypénicilines et aux
ureidopénicillines.
 Les souches productrices de pénicillinase et sensibles à la
céfoxitine sont sensibles à l’association pénicilline -
inhibiteur de bêta-lactamase et aux pénicillines résistantes
aux pénicillinases (oxacilline, cloxacilline, dicloxacilline et
flucloxacilline), aux céphalosporines (sauf à la ceftazidime,
cefixime et céftibuten) et aux carbapénèmes. Ces
molécules sont utilisables dans les limites de l’AMM. Il est
inutile de les tester en routine.
52
CASFM- EUCAST 2014
 La sensibilité des staphylocoques aux céphalosporines est
déduite de celle à la céfoxitine, à l'exception de la
ceftazidime, du céfixime et du ceftibuten qui n'ont pas
de concentration critique et ne doivent pas être utilisés
pour le traitement des infections staphylococciques.
 La plupart des S. aureus résistants à la méticilline sont
sensibles à la céftaroline, mais son activité doit être
testée séparément.
 Les staphylocoques résistants à la méticilline sont souvent
résistants à de multiples familles d’antibiotiques; cependant,
certaines souches ont une résistance isolée à l’oxacilline,
notamment les souches possédant le gène mecC
53
 EUCAST 2014
 La résistance des staphylocoques aux isoxazolyl-pénicillines (oxacilline, cloxacilline) est
recherchée à l’aide d’un disque de céfoxitine (30 μg) dans les conditions standards de
l’antibiogramme. Il ne doit pas être tenu compte d’une éventuelle zone fantôme pour la
lecture des diamètres d’inhibition.
Pour S. aureus avec des Diamètre d’inhibition entre 22 et 25 mm et les staphylocoques
autres que S. aureus avec des diamètres d’inhibition compris entre 24 et 26 mm, il convient
de rechercher l’expression d’une PLP additionnelle (PLP2a, PLP2c) après induction par une
bêta-lactamine ou la présence d’un gène mec additionnel (mecA, mecC) par une technique
appropriée.
 Les souches de staphylocoques résistantes à la céfoxitine ou possédant un gène mec
additionnel (mecA, mecC) ou exprimant une PLP2 additionnelle (PLP2a, PLP2c) après
induction par une bêta-lactamine, doivent être interprétées résistantes à toutes les bêta-
lactamines (pénicillines associées ou non à un inhibiteur de bêta-lactamase,
céphalosporines et carbapénèmes), sauf à la ceftaroline qui possède une activité sur les
staphylocoques résistants à l’oxacilline mais dont l’activité doit être confirmée.
 De rares staphylocoques possédant un gène mec additionnel ne sont pas catégorisés
comme résistants à la méticilline par les tests phénotypiques en milieu liquide ou solide. Il
est donc recommandé de vérifier l’absence d’un gène mec additionnel (mecA, mecC), ou
d’une PLP additionnelle (PLP2a, PLP2c) en cas d’échec thérapeutique.
54
Autres méthodes de détection:

 Méthode NCCLS « Oxa Screen » :

Milieu gélosé de MH contenant 4% de NACL,
6mg/L d’oxacilline ou 10mg/L de méticilline
100l d’une suspension bactérienne à 0.5Mc Farland est
étalée en strie ou en spots
Après 24 à 48H à 37°C toute croissance sur ce milieu
indique une résistance à la méticilline
Le « gold standard » est d’associer la méthode de
dépistage et la détection du gène mecA

55
 Détection de la résistance à la méticilline
screening test

Souche à tester

S.aureus ATCC 29213 S.aureus ATCC 43866

S.aureus ATCC 43300

Screening test

MH 4% Nacl; Oxa 6mg/l; inoculum o,5Mac Farland

56
 Recherche de la PLP2a

 Par agglutination grâce à des particules de latex sensibilisées avec

des anticorps monoclonaux anti PLP2a
–Avantages:
•Pas de matériel
•Réponse rapide
–Inconvénients:
•Méthodologie rigoureuse
•Induction par une -lactamine nécessaire
•Non validé pour SCN
 Par immunochromatographie
–Avantages:
•Pas de matériel
•rapide 5 minutes
•Validé pour SCN et S. aureus VPP: 100%
–Inconvénient:
•VPN 100% seulement après induction
 Détermination de la CMI
E test, bandelette imprégné d’un gradient de concentration
de l’antibiotique sur MH contenant 2% de Nacl
(favorise la croissance de micro colonies et l’expression de la
résistance. L’inoculum est ajusté à 0.5 Mc Farland et
1 Mc Farland pour SCN. Incubation 24H à 35°C

 Détection par des techniques de biologie moléculaire

Amplification génique (PCR). Le résultat ne tient pas compte du
caractère homogène ou hétérogène de l’expression de la résistance.

 Automate muni d’un test spécifique

Malgré des progrès certains, la détection de la résistance à la
méticilline peut être en défaut avec les automates surtout pour les
SCN (Leclercq et al., EJCMID, 2001)
Possibilité de tester la céfoxitine sur l’isolement parallèle sur gélose
au sang (anse 10 µl: diamètres critiques 26 et 23 mm)
58
Nouvelles méthodes de détection des
SARM
Culture:
Milieux Chromogènes
BacliteTM MRSA

Détection acides nucléiques

-Hybridation –(isolats et hémocultures)
EVIGENETM MRSA
-Amplification – –(isolats prélèvements dépistages et hémocultures)
-“maison”
-tests Commercial tests
• Hyplex StaphyloResist® (Bag)
• GenoType® MRSA and GenoQuick® MRSA direct (Hain)
• BD GeneOhmTM MRSA
• GeneXpert MRSA®, Cepheid
Stratégies: tous spécifiques, sensibilité variable,
59
Augmentation de la sensibilité avec enrichissement (direct + bouillon)
Malhotra-Kumar S et al. J Clin Microbiol 2008; 46:1577-87
 Nouveaux milieux chromogènes:
Milieux

– Antibiotiques + substrats chromogènes

– Résultats en 24hrs.
– Pas de tests additionnels.

 MRSASelect, (Bio-Rad)
 MRSA ID (BioMérieux)
 MRSA-Screen (Oxoid)
 CHROMagar MRSA (Sclavo Diagnostics)

60
BacLiteTM Rapid MRSA test

Adenylate Kinase

Écouvillons de nez : Sensibilité 90.4%, spécificité 95.7%, NPV 98.7%

Echantillons cliniques: respiratoire, sang…:  Sensibilité 20-75%
TAT : ~ 5hrs + 1 hr manip
 Mais enrichissement aux quinolones: risque de manquer: CA-
MRSA et cipro S HA-MRSA
PCR kit commerciaux

•GenExpert (Cepheid),
•GeneOhm (BD),
•BD Max (BD)
•LightCycler® MRSA
Advanced Test (ROCHE)
•Genotype MRSA
(Biocentric/Hain),
•Evigene MRSA kit (I2A

62
 Coût-efficacité?
1. Détection de la R dans les hémocultures: ajustement précoce du
traitement
dépend de la prévalence SARM
publications discordantes pour l’intérêt (critère: traitement adapté/non
adapté)

2. Dans les écouvillonnages

NEJM: intérêt en prévention des infdections à SARM en chirurgie
cardiaque

63
64
SARM mec C

65
 Ces souches portent un nouveau variant du gène mecA
présentant moins de 70 % d’homologie avec le gène
mecA classiquement décrit.
 Compte tenu de cette faible homologie, ce variant peut
être considéré comme porteur d’un véritable nouveau
mécanisme de résistance. Initialement dénommé mecA
LGA251 du nom de la première souche identifiée (S
aureus LGA251), il portera finalement le nom de mecC
(International World Group for SCCmec Cassette (IWG-
SCCmec).

66
Epidémiologie de la résistance à la méticilline
 La résistance a émergé en France dès 1962 et a atteint
très rapidement des niveaux élevés, 25% à35% des
souches de S aureus isolées à l’Hôpital
 En Suède, Danemark SARM: < 2%
 Dans le monde 5 clones hospitaliers principaux
 Depuis 4 à 7 ans : SARM dans la communauté;
 C.SARM hébergeant la cassette SCC de type IV (R
kanamycine, R acide fusidique)
 H.SARM souches hospitalières diffusent en ville
 Chez les SCN la résistance a atteint 65 à 80%
 Par l’intermédiaire de ces souches monde animal,
chiens chat, chevaux

67
 ou HA-SARM
HA-SARM

ou CA-SARM

68
Evolution de la résistance des S. aureus

 1944 → pénicillinase (actuellement 75% ville - 90% hôpital)

 1961 : commercialisation de la méticilline
 Pénicilline M (oxacilline / cloxacilline)

 1962 : apparition de la résistance à la méticilline

 Codée par un gène porté par une cassette chromosomique (SCCmec)
 Résistance à toutes les béta-lactamines

 1962-1993 : SARM confinés aux structure de soins

« Hospital-Acquired » SARM (HA-SARM)
 Emergence progressive, très liée à la consommation d’antibiotiques
 Dissémination mondiale de 5 clones
 Multi-résistance associée à un coût

 1993-2000 : 1eres épidémies de SARM communautaires

«Community-Acquired» (CA-SARM)
 Australie, Europe, Amérique du Nord
 Clones indépendants entre eux et vis à vis des SARM hospitaliers
 Multi-résistance rare

 2000-2010 : SARM isolés chez l’animal appelés ”Livestock-

Associated” (LA-SARM)
70
71
Evolution des SAMR en France et en Europe 2007

2001 33.4%
2002 32.8%
2003 28.9%
2004 28.7%
2005 27.2%
2006 26.7%
2007 25.8%
2008 21%

Pays Méditerranéens 2005 : Algérie 45%, Turquie 35%, Egypte 60%

72 (HC) Tunisie 19%
73
 Répartition des souches en Tunisie
selon les centres
LART 2011
Centre Nombre de Souches résistantes à la
souches méticilline
Nb (%)
417 100 (23,9)
Centre hospitalo-Universitaire de Sfax
(Hôpitaux Hédi Chaker et Habib Bourguiba)
241 27 (11,2)
Hôpital Charles Nicolle de Tunis
260 44 (16,9)
Hôpital d’enfants de Tunis

147 31 (21)
Hôpital la Rabta
180 53 (29,4)
Hôpital Militaire de Tunis
323 55 (17)
Institut Mohamed Kassab d’orthopédie

Centre de greffe de moelle osseuse 16 3 (18,7)

Hôpital Fattouma Bourguiba de Monastir 406 66 (16,2)

Total 1990 376 (18,8)

 Prévalence des souches de S. aureus résistantes à la
méticilline selon les prélèvements
LART 2011

Nombre total de Nombre de souches %

souches résistantes à la méticillne
(N=1990) (N=376)
Urines 126 23 18

Prélèvements pulmonaires 135 29 22

Ponctions 89 14 16

Hémocultures 348 81 23

Pus 1146 195 17

Autres* 146 34 23

* Matériel
LART 2011
 SARM communautaires

• Apparu initialement hors de l’hôpital

• Contiennent souvent les gènes de la leucocidine de
Panton et Valentine (LPV)
• Cassette SCCmec IV

Europe : clone Européen (≈ 1 à 3% des infections communautaires

à SA)
agr 3
ST80, CC-80

USA : USA 300 (> 50% des infections communautaires à SA)

agr 1,
ST8, CC-8

Asie Océanie : Clone du Sud Ouest Pacific

agr 3
ST 30, CC-30
77
Auteur; R Leclerc
Migrations des SARM-co PVL+
à travers le monde

78
79
Quand évoquer une infection à SARM communautaire ?

Contexte
Pas de FDR classiques de SARM traditionnels
Contexte défavorisé(foyers)
Provenance zone d’endémie (Amérique du Nord,Maghreb)

Forme clinique
Infections cutanées suppuratives récidivantes et transmissibles
Pneumopathie nécrosante et hémorragique

Antibiogramme
Sensibilité aux fluoroquinolones
USA300 : S à doxy, tmp-sulfa, clinda
ST80 (clone européen) : R à kana tétra fucidine

Confirmation = Toxine PVL (PCR)

Auteur: R. leclerc
80
Prévalence des SARM communautaires
Bien que la diffusion des souches CA-MRSA soit mondiale, leur
distribution n’est pas géographiquement uniforme:

• Etats unis: 59% des S.aureus isolés des infections de la peau et

de tissus mous d’origine communautaires. Situation alarmante!
• Afrique du nord, prévalence des CAMRSA est de 48,8%
• En Europe, la distribution n’est pas uniforme:

- Pays a faible diffusion: Royaume uni avec moins de 2% de CA-MRSA

- Pays à forte diffusion telle la Grèce avec 75% de souches CA-MRSA
- En France, prévalence des CA-MRSA faible: 3,6%

81
LES SARM COMMUNAUTAIRES EN
FRANCE
 Clone ST80
 Profil caractéristique de résistance aux antibiotiques
 Résistant pénicilline, oxacilline, kanamycine, tétracycline
 Intermédiaire acide fusidique
 Cassette SCCmec le plus souvent de type IV ou V
 Souvent présence de la leucocidine de Panton Valentine (PVL)
 •Clone Géraldine (clone communautaire et hospitalier)
 Cassette SCCmec type I tronquée
 Phénotype de résistance aux antibiotiques caractéristique :
 Résistant pénicilline, oxacilline, kanamycine, tobramycine
 Intermédiaire acide fusidique.
 Présence du gène codant la toxine du choc toxique staphylococcique (TSST-1) et
non pas la PVL

82
83
84
85
86
Emergence de SARM d’origine
animal: ST 398 aux Pays Bas
 Typiquement associés aux animaux d’élevage (LA-MRSA)
essentiellement le porc
 Non typable par PFGE
 Nombreux ST types (398,621,753,804,813,1066,1067)
 SARM et SASM
 Cassette SCCmec V, IV, NT
 Doxycycline R et métaux lourds (Cd, Cu, Cd/Zn, As=
 Habituellement PVL négatifs
 Portage humain en relation avec un contact animal:
20 % des cas de SARM en pathologie humaine aux Pays-Bas et
près de 30 % au Danemark
 plus fréquente dans les populations professionnellement
exposées. Transmissibilité inter-humaine faible

87
88
Particularité (rare)
 Résistance par modification de PLP
Souches MODSA (rares)
 Ces souches présentaient une CMI de l’oxacilline légèrement augmentée mais ne
possédaient pas le gène de la PLP2a et certaines étaient dépourvues de pénicillinase.
 L’étude des PLP a montré des modifications au niveau de la synthèse de la PLP 4
 Ces souches sont difficiles à détecter car, usuellement, une seule B-lactamine (oxacilline
ou céfoxitine) est étudié alors que ce type de résistance est spécifique de l’affinité de la
PLP modifiée. Et ces souches peuvent présenter un Temps de génération allongé
 Les recherche de PLP2a par agglutination et du gène mec A par PCR sont négatives
 Dans ce cas pour confirmer la souche MODSA, un antibiogramme avec un disque
d’imipenème (PLP1), de céfotaxime (PLP2), d’oxacilline (PLP3) et de céfoxitine (PLP4)
pourrait être réalisé. 0n observe des discordances entre les différents disque: la souche
étant résistante aux uns et pas aux autres.

89
Phénotypes de résistance acquise des Staphylocoques
aux -lactamines
Mécanisme PéniG, Péni A, ATB + Pénicilline Céphalosporines
Carboxyp;,uré inhibiteur M Carbapénèmes
idop. de -
lactamase
Sauvage S S S S

Pénicillinase R S S S

Modification R R R R
des PLP,
gene mec A
BORSA R S/R R S
(rare)
MODSA S S r S
(rare)
90
 Détection de la résistance à la méticilline
Méthodes R intrinsèque BORSA MODSA

Disque d’oxacilline R BNR BNR

Disque de céfoxitine R S ou I S ou I

Association acide R S R
clavulanique

Screen test + - -

CMI > 2mg/l S aureus 4-16 mg/l 4-16 mg/l

>0,25mg/l SCN
Eucast ! !
Agglutination des +/- - -
PLP2a sur latex
Gène mec A ou mec C + - -

Bla
91 /pénicillinase - + -
 II – AMINOSIDES

92
II – AMINOSIDES

 Les aminosides sont actifs et bactéricides contre les

staphylocoques
 Utilisés en association avec les Bêta-lactamines ou les
glycopeptides.
 La résistance acquise de S.aureus aux aminosides relève de 2
mécanismes d’importance inégale.
 1/ Mutation de la cible ribosomale
 2/ Inactivation enzymatique +++ :
La synthèse de ces enzymes est codée par des gènes
plasmidiques ou transposables. Trois classes en fonction de la
réaction biochimique qu’elles catalysent.

93
Modification enzymatique
 Trois classes en fonction de la réaction biochimique
qu’elles catalysent

Aminoside phosphotransférase APH

(phosphorylation d’un groupement hydroxylé)
Aminoside nucléotidyltransférase ANT
(adénylation d’un groupement hydroxylé)
Aminoside acétyltransférase AAC
(acétylation d’un groupement aminé)

Chaque enzyme va reconnaître un certain nombre de substrats qu’elle

modifie ce qui va se traduire par un phénotype de résistance.

94
Modification enzymatique
 Chacune de ces classes peut être divisée en sous-classes en
fonction de la position du carbone qui porte le groupement
aminé ou hydroxyle qui sera modifié (chiffre arabe).
 Au sein de certaines sous-classes, certaines enzymes peuvent
différer par leur profil de substrat , ce qui se par plusieurs
formes isozymes (chiffre romain). Chaque enzyme va
reconnaitre un certain nombre de substrats qu’elle modifie, ce
qui va se traduire par un phénotype de résistance.
 Les enzymes sont constitutives et intracellulaires.
 le niveau de résistance varie selon la classe d’enzymes
les APH conférant un haut niveau de résistance
contrairement aux AAC et ANT

95
Modification enzymatique

 ANT (6)-I confère la résistance à la Streptomycine

 ANT (9)-I confère la résistance à la Spectinomycine
 APH(3)-III confère la résistance à haut niveau à la
kanamycine et à la néomycine (Nm)
 ANT (4’)(4’’)-I confère une résistance à haut niveau à
la kanamycine et surtout à la tobramycine
 AAC(6’)-APH(2’’) confère une résistance à haut
niveau à la kanamycine gentamycine, tobramycine

96
Détection des phénotypes de résistance et interprétation de l’antibiogramme

5 Phénotypes Mécanisme déduit Perte de

observés « pur » bactéricidie
Sauvage
ou sensible
SR ANT(6)- I Streptomycine
(phénotype S) uniquement
Km R, Tm S, Gm S APH(3‘)-III Am et Is
(phénotype K) Phosphotransférase
Km R, Tm R, Gm S ANT(4’) (4" Am et Is
(phénotype KT Nucléotidyltransférase
Km, Tm, Gm R AAC(6’)- APH(2’’) Am, Is et Nt
(phénotype KTG) Phosphotransférase-
nucléotidyltransférase

Am :amikacine ; Gm :G :gentamycine ; Km :K :kanamycine ; S :

streptomycine Is : isépamicine ; Nt : nétilmicine ; Tm : T : tobramycine
97
Cinq phénotypes composites

 Sm+ KmNm
 Sm+ KmGmTm,
 Sm+ KmTm
 KmNm+ KmGmTm
 Sm + KmNm + KmGmTm

 Les disques pour l’analyse des phénotypes sont au minimum

de 3 : Kanamycine, Gentamycine et Tobramycine et au
maximum de sept: 7; kanamycine, néomycine, gentamycine,
tobramycine, amikacine et netilmicine

98
 L’interprétation de la Kanamycine est valable pour
néomycine, framycétine, paromomycine, amikacine et
isépamycine.
 L’interprétation de la Gentamycine est valable pour
nétilmicine et la résistance est croisée avec l’ensemble des
aminosides (sauf streptomycine): que l’aminoside soit bon ou
mauvais substrat, son association avec une pénicilline ne produit
plus l’effet bactéricide habituellement observé
 Le test de seulement quelques aminosides pour lesquels les
résistances s’expriment à haut niveau permet d’identifier ces
phénotypes
 La réponse pour l’amikacine et la nétilmicine est simplement
déduite du profil de résistance ou de sensibilité des 3
aminosides testés K,T, G.
 Pour les SCN il semble que la nétilmicine puisse conserver une
activité bactéricide contre certaines souches résistantes à la
gentamicine.

99
Phénotype KmTm

TM K GM

 Résistance aux aminosides

(TM, K) par expression de
l'enzyme de modification ANT
(4'-4'') acquise.

100
 Phénotype KmGmTm

TM K GM

 Résistance aux aminosides (TM, K, GM)

par expression de l'enzyme de modification
APH (2'')- AAC (6') acquise.
 S aureus : R Genta  R à tous les aminosides
(sauf Strepto)
 R Kana  R à Amikacine

101
 Staphylococcus et aminoglycosides

Phénotypes Mécanismes Lecture interprétation

K T G Nm Akn Net
KNm* APH(3’)-III R S S R R S

KTG APH(2 ’’)+AAC( R R R S R R

6’)
KT ANT(4’) R R(I) S R R S

R: peut apparaitre S mais répondre R : résistance toujours détectée

R
K: kanamycine,T: tobramycine,G :gentamycine,Nm :néomicine,Akn: amikacine, Net: nétilmicine

*SARM PVL+ (K R, T S, F I/R, Fq S)

102
Quelques phénotypes «impossibles»

Kanamycine Gentamicine Tobramycine Commentaires

S S R Rendre Kana R

Vérifier
S R S identification:
pureté et/ ou re
tester
Vérifier
R R S identification
pureté et/ou re
tester

103
 III – Macrolides,
lincosamides,
streptogramines
et kétolides

104
III – Macrolides, lincosamides et
streptogramines et kétolides

A/ - Structure et activité
Le groupe MLSK sont 4 familles d’antibiotiques qui possèdent des
structures chimiques différentes mais un mode d’action commun
 Macrolides
 Lincosamides
 Streptogramines (anciennement synergistines)
( virginamycine et pristinamycine)
 Kétolides ; dérivé de l’érythromycine A, macrolide à 14 atomes
de carbone.

105
 Macrolides :
 Un noyau lactone à 14 atomes :
(érythromycine, oléandomycine, roxithromycine, dirithromycine et clarithromycine)
 Un noyau lactone à 15 atomes : ( azithromycine)
 Un noyau a 16 atomes : ( spiramycine, josamycine )

 Lincosamides:
Prolines alkylées ( lincomycine et clindamycine)

 Streptogramines: (anciennement synergistines)

Constitués d’une association de 2 facteurs : A macrolactone et B depsideptide cyclique
qui agissent en synergie
( virginamycine et pristinamycine, quinupristine-dalfopristine)

 Kétolides:
dérivé de l’érythromycine A, macrolide à 14 atomes de carbone.(télithromycine)
Les macrolides ont une activité bactériostatique vis a vis des staphylocoques, seules les
streptogramines, association de 2 composés agissent en synergie, ont une activité
bactéricide temps dépendante.
Ces antibiotiques ont un mode d’action commun, ils bloquent la synthèse protéique en
se fixant au niveau de l’ARN ribosomal 23S de la sous-unité 50S du ribosome. Ce mode
d’action commun explique les résistances croisées observées entre ces familles.
106
B/ - Résistance
Trois grands mécanismes d’inégale importance sont impliqués
dans la résistance de S. aureus aux MLS
1/ Modification de cible ribosomale (sous-unité
50S)
 Mécanisme:
Cette résistance est liée à la synthèse par les souches d’une enzyme
d’origine souvent plasmidique qui diméthyle une adénine de l’ARN
ribosomal ( ARN 23 S de la sous unité 50S)
Cette méthylation provoque une modification de la cible ribosomale des
macrolides et entraîne une résistance croisée entre tous les macrolides, les
lincosamides et les facteurs B des streptogramines et kétolides (d’où le
nom de ce phénotype)
L’activité des streptogramines A n’est pas modifiée et la synergie entre les 2
facteurs contre les souches résistantes aux MLSB est maintenue, au moins
en bactériostase.
Cette résistance est sous la dépendance de différents déterminants
génétiques. Les gènes ermA, ermB et ermC sont présents chez les
Staphylocoques. Ces gènes sont portés par des transposons (ermA) ou par
des plasmides (ermC)
107
 Phénotypes
La synthèse de la méthylase peut être constitutive ou inductible.
L’expression de la résistance s’effectuera donc selon deux
phénotypes différents
Phénotype MLSB inductible
Se caractérise par une résistance aux macrolides inducteurs à
14 atomes (érythromycine, oléandomycine, roxithromycine,
clarithromycine) et à 15 atomes (azithromycine) et une sensibilité
aux macrolides non inducteurs à 16 atomes ( josamycine,
spiramycine, midécamycine) aux lincosamides( lincomycine et
clindamycine) et au composé B des streptogramines et aux kétolides
Phénotype MLSB constitutif
Se caractérise par une résistance à tous les macrolides de 14 à 16
chainons, les lincosamides, les kétolides et aux composé B des
streptogramines. Les streptogramines (facteur A+B) dont la
pristinamycine restent actives.
Activité bactériostatique de la pristinamycine est peu ou pas touchée
par contre l’activité bactéricide est atteinte. CMI1.5mg/L contre
0.33MG/L pour les souches sensibles pouvant atteindre 16mg/L)

108
Phénotype MLSB inductible

Résistance à
érythromycine et
antagonisme avec
clindamycine
 risque accru de
sélection de
mutants

- R aux macrolides à 14 atomes (érythro, roxithro,clarithro) et 15 atomes (azithro).

109 - Ceux à 16 atomes (spira, josa) et la télithro restent actifs.
MLSB inductible

110
 Phénotype MLSB
Génotype erm
R inductible : Erythro R, Linco S, Pristina S.
Mais risque de sélection de mutants
constitutifs si traitt par linco/clinda  Linco I
R constitutive  Erythro R, Linco R,
Pristina/ Quinu-dalfo S Mais altération de
l’activité bactéricide

MLSb inductible MLSb constitutive

111
Recommandations CASFM 2013:
Devant une souche résistante à l’érythromycine et
sensible à spiramycine ou lincomycine ou
clindamycine

 Rechercher le caractère inductible de cette résistance

(antagonisme érythromycine - lincomycine).
 En l’absence d’induction, répondre sensible à la
spiramycine,lincomycine et clindamycine.
 En présence d’induction, répondre sensible à spiramycine,
lincomycine et clindamycine avec le message suivant : de rares
échecs cliniques ont été rapportés par sélection de mutants
constitutifs résistants.
 En cas de résistance à la clindamycine, l’activité de la
pristinamycine est diminuée.
112
Eucast 2014 ; on teste la clindamycine
même interprétation
Rechercher le caractère inductible de cette résistance
(antagonisme érythromycine - clindamycine).

113
2/ Inactivation enzymatique
 Lincosamides ( phénotype L)
L’acquisition d’une 3-lincomycine (4clindamycine) nucléotidyltransférase codée
par des gènes lin plasmidiques, modifie ces antibiotiques et confère un haut
niveau de résistance à la lincomycine et un bas niveau de résistance à
la clindamycine cette résistance isolée est retrouvée surtout chez les
Staphylocoques à coagulase négative
(S. sciurii, S. cohnii, S.xylosus).

 Streptogramines ( phénotypes SA-SB ou SA)

La synthèse plasmidique de deux enzymes streptogramine A acetyltransférase
(gènes vat, vat B) et streptogramine B hydrolase
(gène vgb)  phénotype SA-SB
 Une résistance isolée au facteur A associée à une résistance non enzymatique
à la lincomycine (phénotype LSA) a été mise en évidence.

Ces mécanismes peuvent s’associer entre eux et à une résistance de type

MLSB
114
phénotype L

E SP L PR

115
 Phénotype LSa

Sensibilité diminuée à la
clindamycine (CM) et à la
pristinamycine (PT), par
inactivation de l'antibiotique ou
par surexpression d'un système
d'efflux.

116
3/ Efflux actif
Mécanisme d’efflux actif ATP dépendant
Résistance aux macrolides à 14 et 15 atomes (gène msrA)
Résistance isolée au composé A des streptogramines
(gènes vga et vgaB)

117
 Phénotype M
Génotype msr(A)

Efflux actif dû au gène msr(A)

- R modérée à Erythro
- Linco S, pas d’antagonisme
- Pristina S

118
 Staphylococcus et macrolides
Type MLSB MLSB MLSB+SA LSA M
sauvage induct Const.
Erythromycine S R R R S R
Lincomycine* S (s)** R R R S
Pristinamycine S S S R I S

MLSB: plasmide ( ermC ) ou chromosome (transposon erm A)

méthylation ARNr23S (=modification de cible)
MLSB+SA : Plasmidique-Acétyltransférase (SA) (gène vat) et
hydrolyse (SB) (gène vgb) associée au phénotype KT
LSA: ?
M: efflux (gène mrsA)
*Lincomycine= clindamycine (meilleure détection)
** (S): si les deux disques sont prés R
119
120
 Dalfopristine-quinupristine (Synercid®)

 Vidal: « dernier recours, sur documentation »

-pneumonies nosocomiales
-infections de la peau et des tissus mous
 bactéricide, réduction de l’activité sur les souches MLSb-C
 7,5 mg/kg/8h IV, SGI 5%, PIV 60’

121
Staphylococcus et macrolides

 R naturelle LSA: S. cohnii , S. xylosus, S. sciurii

 R acquise:
 Modification de la cible:
 Méthylation ribosomale
- gène erm A(Tn554) ermC (plasmide)
- expression inductible ou constitutive
 Inactivation enzymatique
- Gène vat, vat B et vgb
- Lin (A)
 Efflux : - gène msr(A)
122
 Reconnaissance des phénotypes de résistance
Nom du Génotype Mécanisme M 14- M16 Lin PrI Pr Pri Kétolide
phénotype de résistance 15 (B) II(A)

Sensible - S S S S S S S S

MLSB ermA, Modification R Sa Sa S S S S

inductible ermC de cible

MLSB constitutif ermA, Modification R R R R S S* R

ermC de cible
L linA,LinA’ Inactivation S S R*** S S S S

LSA Inconnu Inconnu S S I/R S R S/I S

SA+SB VatA, vatB Inactivation S S S(ou R R R S

Modification +vgb I)***
enzymatique des
facteurs A ou B

M mrsA Efflux actif R S S S** S S S

efflux

SA Vga, vgB Efflux S S S S R S/I S

Efflux du facteur A probable

M14: érythromycine, roxithromycine, clarithromycine, dirithromycine) M15 : azithromycine. M16: spiramycine,

josamycine, midécamycine, tylosine ; Lin : lincomycine ; Pri I : pristinamycine facteur (I ou B) Pri II :pristinamycine
facteur (II ou A), S* *bactéricidie altérée pour certaines souches. Sa :risque de sélection de mutant R*** résistant à
la linco et sensibilité clinda (interpréter (I) I*** Possibilité de résistance à la lincomycine et à la
123
clindamycine en cas de présence des gènes vga(A) ou vga (Av)
 Reconnaissance des phénotypes de résistance
Nom du phénotype Mécanisme M 14- M16
de 15 SP Lin Pri Kétoli
résistance E des
MLSB R Sa Sa S S
inductible Modification de
cible
MLSB constitutif R R R S* S
L S S R*** S S
inactivation
LSA S S I/R S/I S
SA+SB S S S(ou R R
Modification enzymatique des
facteurs A ou B I)***
M Efflux actif R S S S S
efflux

SA Efflux probable S S S S/I S

Efflux du facteur A

M14: érythromycine, roxithromycine, clarithromycine, dirithromycine) M15 : azithromycine. M16: spiramycine,

josamycine, midécamycine, tylosine ; Lin : lincomycine ; Pri I : pristinamycine facteur (I ou B) Pri II :pristinamycine
facteur (II ou A), S* *bactéricidie altérée pour certaines souches. Sa :risque de sélection de mutant R*** résistant à
la linco et sensibilité clinda (interpréter (I) I*** Possibilité de résistance à la lincomycine et à la
clindamycine en cas de présence des gènes vg(A) ou vga (Av)
124
  Phénotypes composites: Tous les phénotypes
décrits ci-dessus peuvent s’associer ce qui rend
complexe l’identification du phénotype composite
résultant;
 Exemple d’ association: phénotype MLSB +phénotype S

 Antibiotique à étudier:
 Erythromycine , lincomycine ou clindamycine et
pristinamycine est suffisant pour un antibiogramme
standard
 Le choix de la lincomycine plutôt que la clindamycine a
pour intérêt d’identifier le phénotype L et de mieux
reconnaitre le pnénotype LSA

125
 IV – RIFAMPICINE

V – FOSFOMYCINE

126
IV – RIFAMPICINE

 La résistance à la Rifampicine (phénotype R) antibiotique

bactéricide dépendant est liée à la sélection de mutants résistants
( modification de la sous unité  de la RNA polymérase DNA
dépendante ne fixant plus l’antibiotique
 La fréquence de mutation est importante( 10-6 à 10-7) nécessitant
l’utilisation de cet antibiotique en association.
 On distingue deux niveaux de résistance
 De haut niveau avec des CMI 32mg/L
 De sensibilité diminuée ( CMI=1-4mg/L), souches rarement isolées

127
 V – FOSFOMYCINE

• Bactéricide temps dépendant 1ere étape de la synthèse de la

paroi
• Nécessité de l’utiliser en association
• Le mécanisme de résistance le plus fréquent est lié à la
sélection de mutants au niveau du système de transport (
Résistance homogène), la présence de colonies dans la zone
d’inhibition ne doit pas être prise en compte.
• Une résistance de nature plasmidique (gène fosB) avec une
inactivation enzymatique de l’antibiotique a été décrite
récemment.
• L’espèce saprophyticus est naturellement résistante à la
fosfomycine.
• La fosfomycine bloquerait la synthèse de la PLP2a, ce qui
permet une synergie avec les -lactamines sur les SAMR
sensibles à la fosfomycine.
128
 VI – FLUOROQUINOLONES

129
VI – FLUOROQUINOLONES

S. aureus est naturellement résistant aux quinolones

de 1ère génération (acide nalidixique, acide
pipémidique) mais sensible aux fluoroquinolones
antibiotiques bactéricides temps dépendant, doués
d’une excellente diffusion tissulaire et cellulaire.

130
 Trois mécanismes de résistance ont été décrits :

• Mauvaise affinité par modification de la cible, l’ADN gyrase.

L’acquisition de la résistance est liée à la survenue de mutations
chromosomiques dans les gènes gyrA et parC qui provoquent une
diminution de la liaison des quinolones sur leurs cibles intracellulaires,
les complexes ADN-gyrase et ADN-topoisomérase IV. Cette féquence
de mutation est élevée d’ou la nécessité de l’association avec un
autre antibiotique
• Efflux actif des quinolones sous la dépendance du gène norA qui
confère une résistance de bas niveau aux fluoroquinolones hydrophile
(ciprofloxacine, ofloxacine) (S.aureus, S. epidermidis, S.
haemolyticus)
• Défaut de pénétration de la paroi bactérienne

Les deux derniers mécanismes sont peu fréquents par rapport au

premier.
131
 La résistance étant croisée entre les
différentes fluoroquinolones,
- un seul représentant de cette classe peut être
étudié (péfloxacine, ofloxacine, levofloxacine,
ciprofloxacine)

 Résistance naturelle
- S. saprophyticus aux fluoroquinolones
132
S. aureus et fluoroquinolones

- Résistancepar mutations
au niveau de la cible (ADN gyrase)
-Résistance à l’ofloxacine croisée pour
l'ensemble des fluoroquinolones

133
VII – SULFAMIDES ET TRIMETHOPRIME
• La résistance aux sulfamides (Phénotype Su) est de nature
chromosomique chez SARM liée a une hyperproduction
d’acide para aminobenzoique. Elle peut être seule ou associée.
• La résistance à la triméthoprime (phénotype Tp) est soit de
nature plasmidique par acquisition d’une dihydrofolate
réductase n’ayant plus d’affinité pour la triméthoprime et
conférant un haut niveau de résistance.
• Soit de nature chromosomique par hyperproduction d’une
dihydrofolate réductase normale conférant un bas niveau de
résistance
• Cette résistance est presque toujours associée à Su

134
VIII – TETRACYCLINES
Activité bactériostatique, excellente diffusion tissulaire et cellulaire
Deux mécanismes de résistance :
- Système d’efflux :Phénotype T
gène plasmidique (tet K ou tet L) qui code la synthèse d’une protéine
membranaire (TET) qui  efflux actif des tétracyclines mais non de
la minocycline
- Modification du ribosome : Phénotype TM
gène transposable (tet M) qui code pour la synthèse d’une protéine
qui protège le ribosome de l’inhibition de la sybthèse protéique
pour les tétracyclines  Résistance constitutive de haut niveau aux
tétracyclines et de bas niveau à la minocycline.
Interprétation de la tétracycline S = valable pour minocycline et
doxycycline.

Interprétation de la tétracyclinre R: faire la CMI pour minocycline et/ou la

doxycycline ( Eucast)

135
CASFM-EUCAST 2014

136
IX – PHENICOLES

 Antibiotique bactériostatique à bonne diffusion

tissulaire
 Résistance plasmidique de haut niveau
(chloramphénicol acétyl transférase)= Phénotype C
 Interprétation du Chloramphénicol 
interprétation Thiamphénicol

137
X – ACIDE FUSIDIQUE

 Bactériostatique excellente diffusion tissulaire et

cellulaire.
 Deux types de mécanismes de résistance acquise :
 Sélection de mutants du facteur d’élongation EF-G
++++
 Type plasmidique = Modification de perméabilité

138
 XI – GLYCOPEPTIDES

139
XI – GLYCOPEPTIDES

 Deux produits : vancomycine et teicoplanine (Targocid®)

- Spectre anti-Gram positifs (macromolécules trop grosses
pour passer à travers les porines des Gram-)
- Action bactéricide lente
- Toxicité rénale non négligeable (vancomycine)

 Mécanisme d’action
- Arrêt de la synthèse de la muréine
- Les glycopeptides se lient aux résidus D-Ala-D-Ala du
peptidoglycane en cours de synthèse et empêchent
l’action des transglycosilases
- Lyse bactérienne en 36-48h
- Lentement bactéricides, temps dépendants, pratiquement
toujours actifs sur S.aureus.

140
 Indications

Vancomycine
- Usage uniquement hospitalier
- Traitement des infections à staphylocoques méti R
(oxacilline plus rapidement bactéricide sur les méti s)

Teicoplanine
- Mêmes indications que vancomycine
- Préférée en cas d’insuffisance rénale, d’effets secondaires à la
vancomycine, de traitement prolongé (ambulatoire) et pour
préserver le capital veineux

141
 Glycopeptides et Staphylococcus

Vancomycine Teicoplanine
S aureus Sensibilité Des VRSA
Diminuée G Aux E.U.

1956.....................1980...1987 ......1990...1997...............200….

Japon

SCN I ou R à la teico. CMI>4 • 1ère souche de S. haemolyticus I à la

mg/L mais S à la Vanco vancomycine CMI:8mg/let R à la teicoplanine
• 1ère souche de S aureus I a la teicoplanine

142
Résistance acquise
- Rare encore en France
- Résistance de haut niveau chez les entérocoques
(souches épidémiques nosocomiales de E.faecium
(surtout) ;
- Résistance de bas niveau chez les staphylocoques
à coagulase - (teicoplanine) et les staphylocoques
dorés méti R (teicoplanine et vancomycine)

143
 Mécanismes

- Chez les entérocoques :

 perte d’affinité de la cible pour les glycopeptides, par exemple,
synthèse de D-ala-D-lactate au lieu de D-ala-D-ala
 gènes métaboliques portés par des transposons

- Chez les staphylocoques :

 modifications pariétales complexes (surproduction de
muréine...)
 pas encore d’acquisition des transposons des entérocoques

144
 Mécanisme de résistance
 Souches VISA, GISA, Hétéro-VISA: Mutations

 Souches VRSA :Acquisition de vanA des entérocoques

(plasmidique)
145
 Résistance du S aureus aux glycopeptides

 VRSA :
 S.aureus ayant acquis le gène plasmidique van A d’entérocoque ; CMI
vancomycine 16mg/L
 ( 5 souches dans le monde USA)
 VISA/GISA :- population homogène
 Description de souche depuis 1997 au Japon puis EU
 Souches intermédiaires à la vancomycine ( CMI 8mg/L) ; rares mais échec
clinique à la vancomycine
 10 cas dans le monde depuis 1995
 Hétéro-VISA :: - Populations hétérogènes
 Description de souche en 1996 au Japon:
 Sensibles à la vancomycine ( CMI : 4mg/L)
 Sous population (10-5 à 10-8) de sensibilité diminuée ( CMI : 8mg/L)
 Critères CA-SFM ; teicoplanine= marqueur ( souches intermédiaire )
 1 à 25% des SAMR au Japon

146
 • Deux phénotypes sont à distinguer parmi les
souches de sensibilité diminuée GISA

I ou R à la teicoplanine et S à la vancomycine (bien que limites)

S. haemolyticus ;S. epidermidis ; SCN ; rare chez S.aureus

I ou R à la teicoplanine et I à la vancomyvcine
S.haemolyticus, S.aureus

147
CASFM 2013
 Catégorisation clinique des souches de S.aureus selon
les valeurs critiques de la CMI (g/ml) de la
vancomycine et teicoplanine.

antibiotique charge Sensible Résistant Ø

S R
S aureus Teicoplanine 30µg 2(mg/l)  2(mg/l) ≥17 -
Vancomycine 2(mg/l)  2(mg/l)

S. non aureus Teicoplanine 30µg 4(mg/l)  4(mg/l) ≥17 -

Vancomycine 2(mg/l)  2(mg/l)

CMI Eucast 2014

148
  Critères de suspicion de la sensibilité diminuée aux
glycopeptides GISA ou VISA, GRSA ou VRSA, hétéro-VRSA ou
hétéro GISA (selon CASFM)
 Méthode de diffusion en milieu gélosé :
 Diamètre de la zone d’inhibition <17mm autour du disque de l’un
des deux glycopeptides ( Vanco ou Teico)
 Diamètre de la zone d’inhibition autour d’un disque de teicoplanine
est inférieur d’au moins 3 mm à celui de la vancomycine
 Quelques colonies sont présentes dans la zone d’inhibition de l’un
des deux glycopeptides
 Il existe un phénomène d’interaction/ synergie ou antagonisme entre
l’un des glycopeptides et un disque d’oxacilline à 5g.
 Méthode automatisée
Lorsque les souches sont catégorisées I ou R a au moins l’un des
glycopeptides
 Attention aux S aureus R à la méticilline et à la gentamicine
(GISA)
149
Eucast 2014
 La méthode de diffusion n'est pas utilisable car elle ne permet pas la différenciation entre les
souches sensibles de celles de sensibilité diminuée aux glycopeptides ne faisant pas intervenir
la présence du gène vanA.
 Pour S. aureus, la résistance de haut niveau aux glycopeptides ( CMI > 16 mg/l) est
exceptionnelle.
 La sensibilté diminuée est rare (prévalence de 1% chez S. aureus). Elle est définie par la
présence d’une sous-population résistante (caractère hétérogène), qui rend difficile sa
détection in vitro.
La recherche d’une sensibilité diminuée aux glycopeptides (GISA) doit être réalisée pour toute
souche de S. aureus en cas d’utilisation thérapeutique envisagée. Cette détection ne doit pas être
réalisée par diffusion en milieu gélosé. Elle peut être effectuée par la détermination de la CMI par
méthode de diffusion en gradient, par dilution en gélose ou par microdilution en milieu liquide.
Cependant, la présence d’une sous-population résistante de S. aureus n’étant pas détectée par les
méthodes autres que la microdilution en milieu liquide, un test de détection complémentaire doit
être réalisé.
Si le test de détection est négatif (S. aureus non GISA) la CMI déterminée par diffusion en
gradient peut être rendue.
Si le test de détection est positif (S. aureus GISA), il convient de ne pas rendre la CMI au clinicien,
en raison de la présence d’une sous-population résistante. Rendre alors «sensibilité diminuée aux
glycopeptides».
150
 3 méthodes de détection complémentaire
 -Test particulier ou test de criblage :
Milieu MH + 5mg/l de Teicoplanine ensemencée par
dépôt de 10l d’une suspension de 6. 108 UFC/ml (Mac Farland 2)
incubation 35-37° pendant 24H à 48 H
inclure un test témoin + : ( S. haemolyticus CIP 107204)
inclure un témoin - : S. aureus ATCC 25923
Lecture : présence d’au moins 4 colonies
Une fois la diminution de sensibilité suspecté la catégorisation
clinique de ces souches (S, I, R) se fait par la détermination des CMI de
la vancomycine et teicoplanine (dilution en milieu Mueller Hinton
gélosé (spot) ou microdilution en bouillon ou E-test.
 -Macro bandelette : Test de sensibilité à la teicoplanine et la
vancomycine par diffusion en gradient (bandelettes) sur milieu coeur-
cerveau avec un inoculum McFarland 2.
La sensibilité diminuée est mise en évidence lorsque la croissance de la
souche n’est pas inhibée par 8 mg/l de vancomycine et de teicoplanine,
ou par 12 mg/l de teicoplanine seule.
 - Méthodes en milieu liquide manuelle ou automatisée : les
souches de sensibilité diminuée sont détectées comme étant
151
«résistantes».
CMI des glycopeptides par le E- test

E test modifié:
écouvillonnage avec 200 µl
d’une suspension
équivalente à 2 Mc Farland
d’une gélose cœur-cervelle.
Incubation à 35 -37°C
pendant 24-48h. Test positif
si CMI de la Vancomycine
et de la teicoplanine ≥8 mg/l
ou si CMI de la
teicoplanine seule ≥12 mg/l

CMI sont de 1,5 mg/l (S) pour la

Vancomycine et de 4 mg/l (S) pour la
152 Teicoplanine.
TRAITEMENT
 S. aureus sensible à la méticilline
 Traitement de choix :
Bêta-lactamine + aminoside
(oxacilline, cloxacilline) + (gentamicine)
 Si allergie aux bêta-lactamines :
Vancomycine + aminoside
 Prise en compte des propriétés pharmacocinétiques des antibiotiques
pour traiter les infections:
neuroméningées :
chloramphénicol, fluoroquinolones, fosfomycine
cefotaxime+ vancomycine…
cutanées et osseuses:
Acide fusidique, fluoroquinolones, rifampicine, synergistines…
Les endocardites:
Pénicilline M + gentamicine
Infection urinaire non compliquée:
Amoxicilline+ acide clavulanique

153
  SARM
Le choix est plus restreint
Souvent résistant aux fluoroquinolones, macrolides et
apparentés et parfois aux aminosides .

Glycopeptides + 1 ou 2 ATB autres antibiotiques ( parmi aminoside ,

acide fusidique, cotrimoxazole, fosfo, rifampicine . Si intolérance
glycopeptides ; les associer 2 à 2
Bactériemie primitive: glycopeptides ± autre Alternative : céfotaxime
+fosfomycine
Pleuropneumopathie: glycopeptides+autre ;Alternative: céfotaxime +
fosfomycine ou linézolide
Méningite: vancomycine +autre alternative: cefotaxime + fosfomycine
Infection ostéoarticulaire: glycopeptide + 1 ou si matériel étranger 2
autres antibiotiques; de préférence parmi rifampicine, fluoroquinolone, acide
fusidique.
Alternative ou relais (ambulatoire): 2 antibiotiques parmi teicoplanine,
rifampicine,
154 acide fusidique, FQ, cotrimoxazole, pristinamycine si Erytro S
155
 Linézolide (ZYVOXID®)
 Caractéristiques:
 Couverture anti-Gram positif totale
 Formulation IV et orale avec bioéquivalence totale
 Pas d’adaptation au poids, à l'âge, à la fonction rénale ou
hépatique
 Pas de dosage
 Peu sélectionnant
 Effets secondaires:
 Digestifs. Cutanés. Hématologiques. Neuropathie. Syndrôme
sérotoninergique. Acidose lactique

156
157
158
Eucast 2014

159
160
 www.sfm-microbiologie.org/.../casfm/CASFM_EUCAST_V1_0_2014.pdf

161
162
163
164
165
166