PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3
Recherche de microorganismes spécifiés
prise d’essai devra représenter 1 pour cent du lot, à moins que
l’emploi d’une quantité moindre ne soit prescrite ou justifiée
et autorisée.
Dans le cas de produits pour lesquels le nombre total d’entités
constituant un lot est inférieur à 200 (par exemple échantillons
utilisés dans des essais cliniques), la taille de l’échantillon
peut être réduite à 2 unités, ou à 1 unité si la taille du lot est
inférieure à 100.
Effectuez les prélèvements au hasard dans le produit en vrac
ou les récipients dans lesquels est conditionnée la préparation.
Pour obtenir la quantité requise, mélangez le contenu d’un
nombre de récipients suffisant pour former l’échantillon.
5-2. EXAMEN DU PRODUIT
5-2-1. Filtration sur membrane. Utilisez un appareil de
filtration permettant le transfert de la membrane sur le milieu.
Préparez l’échantillon par une méthode dont l’applicabilité a
été établie comme décrit dans la section 4, et introduisez la
quantité appropriée d’échantillon dans 2 membranes filtrantes.
Filtrez immédiatement. Lavez chaque filtre selon la procédure
préalablement établie.
Transférez l’une des membranes sur du milieu gélosé aux
peptones de caséine et de soja, pour le DGAT, et l’autre
membrane sur du milieu Sabouraud dextrosé-gélosé, pour
le DMLT. Incubez la boîte de milieu gélosé aux peptones de
caséine et de soja à 30-35 °C pendant 3-5 jours, et la boîte
de milieu Sabouraud dextrosé-gélosé à 20-25 °C pendant
5-7 jours. Calculez le nombre d’UFC par gramme ou par
millilitre de produit.
Pour l’examen de dispositifs transdermiques ◊ou des films
orodispersibles◊, filtrez séparément 10 pour cent du volume
de la préparation décrite sous 4-5-1 sur 2 membranes stériles.
Transférez l’une des membranes sur du milieu gélosé aux
peptones de caséine et de soja, pour le DGAT, et l’autre sur du
milieu Sabouraud dextrosé-gélosé, pour le DMLT.
5-2-2. Dénombrement sur plaques
5-2-2-1. Ensemencement en profondeur
Préparez l’échantillon par une méthode dont l’applicabilité a
été établie comme décrit dans la section 4. Préparez au moins
2 boîtes de Petri par milieu et par niveau de dilution. Incubez
les boîtes de milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja à
30-35 °C pendant 3-5 jours et les boîtes de milieu Sabouraud
dextrosé-gélosé à 20-25 °C pendant 5-7 jours. Sélectionnez les
boîtes correspondant à une dilution donnée et présentant le
plus grand nombre de colonies inférieur à 250 pour le DGAT
et à 50 pour le DMLT. Prenez la moyenne arithmétique par
milieu des dénombrements et calculez le nombre d’UFC par
gramme ou par millilitre de produit.
5-2-2-2. Etalement en surface
Préparez l’échantillon par une méthode dont l’applicabilité a
été établie comme décrit dans la section 4. Préparez au moins
2 boîtes de Petri par milieu et par niveau de dilution. Pour
l’incubation et le calcul du nombre d’UFC, procédez comme
décrit pour l’ensemencement en profondeur.
5-2-3. Méthode du nombre le plus probable
Préparez et diluez l’échantillon par une méthode dont
l’applicabilité a été établie comme décrit dans la section 4.
Incubez tous les tubes à 30-35 °C pendant 3-5 jours. Effectuez
si nécessaire une subculture, selon la procédure préalablement
établie. Pour chaque niveau de dilution, notez le nombre de
tubes présentant une croissance microbienne. Déterminez le
nombre le plus probable de microorganismes par gramme ou
millilitre de produit à examiner à l’aide du tableau 2.6.12.-3.
5-3. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Le nombre de germes aérobies totaux (DGAT) est considéré
comme égal au nombre d’UFC obtenues avec le milieu
gélosé aux peptones de caséine et de soja ; si des colonies de
moisissures ou levures sont détectées sur ce milieu, elles sont
(2) Ce chapitre a fait l’objet du processus d’harmonisation des pharmacopées. Voir chapitre 5.8. Harmonisation des pharmacopées.
Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes
2.6.13.
comptabilisées dans le DGAT. Le nombre total de moisissures
et levures (DMLT) est considéré comme égal au nombre
d’UFC obtenues avec le milieu Sabouraud dextrosé-gélosé ;
si des colonies de bactéries sont détectées sur ce milieu,
elles sont comptabilisées dans le DMLT. Si l’on prévoit
que le DMLT risque de dépasser le critère d’acceptation
du fait de la croissance bactérienne, du milieu Sabouraud
dextrosé-gélosé contenant des antibiotiques peut être utilisé.
Si le dénombrement est effectué par la méthode du NPP, la
valeur calculée est le DGAT.
Lorsqu’un critère d’acceptation est prescrit en matière de
qualité microbiologique, il est interprété comme suit :
– 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20 ;
– 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 ;
– 103 UFC : nombre maximal acceptable = 2000, et ainsi de
suite.
Les solutions et milieux recommandés sont décrits dans le
chapitre général 2.6.13.
01/2021:20613
2.6.13. CONTRÔLE
MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS
NON STÉRILES : RECHERCHE DE
MICROORGANISMES SPÉCIFIÉS(2)
1. INTRODUCTION
Les essais décrits ci-après permettent de contrôler l’absence,
ou la présence limitée, de microorganismes spécifiés pouvant
être décelés dans les conditions décrites.
Ces essais sont en premier lieu destinés à déterminer si
une substance ou préparation satisfait à une spécification
préétablie en matière de qualité microbiologique. Il convient
dans ce cas de se conformer aux indications données ci-après,
notamment en ce qui concerne le nombre d’échantillons à
prélever et l’interprétation des résultats.
D’autres méthodes microbiologiques, notamment des
méthodes automatisées, peuvent être utilisées à condition
que leur équivalence avec la méthode de la pharmacopée ait
été démontrée.
2. PRÉCAUTIONS GÉNÉRALES
Préparez les échantillons comme décrit dans le chapitre
général 2.6.12.
Si le produit à examiner possède une activité antimicrobienne,
celle-ci est autant que possible éliminée ou neutralisée comme
décrit dans le chapitre général 2.6.12.
Si des substances tensioactives sont utilisées pour la
préparation des échantillons, leur absence de toxicité à l’égard
des microorganismes considérés et leur compatibilité avec les
neutralisants utilisés doivent être démontrées comme décrit
dans le chapitre général 2.6.12.
3. FERTILITÉ ET PROPRIÉTÉS INHIBITRICES DES
MILIEUX, APPLICABILITÉ DE LA MÉTHODE D’ESSAI ET
TÉMOINS NÉGATIFS
L’aptitude de l’essai à permettre la détection des
microorganismes en présence du produit à examiner doit
être établie. L’applicabilité de la méthode d’essai doit être
confirmée chaque fois qu’un changement susceptible d’affecter
le résultat de l’essai est apporté au mode opératoire ou au
produit.
5061
2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3

3-1. PRÉPARATION DES SOUCHES DE RÉFÉRENCE
Utilisez des suspensions standardisées stables des souches
de référence ou préparez des suspensions comme indiqué
ci-après. Les cultures sont effectuées selon un système de lot
de semence tel que les microorganismes viables utilisés pour
l’inoculation n’aient pas subi plus de 5 passages à partir du lot
de semence primaire d’origine.
3-1-1. Microorganismes aérobies. Cultivez séparément
chacune des souches bactériennes de référence dans du milieu
liquide aux peptones de caséine et de soja ou sur du milieu
gélosé aux peptones de caséine et de soja, à 30-35 °C pendant
18-24 h, et la souche de référence de Candida albicans sur du
milieu Sabouraud dextrosé-gélosé ou dans du milieu liquide
Sabouraud dextrosé, à 20-25 °C pendant 2-3 jours.
– Staphylococcus aureus : par exemple ATCC 6538,
NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276 ;
– Pseudomonas aeruginosa : par exemple ATCC 9027,
NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275 ;
– Escherichia coli : par exemple ATCC 8739, NCIMB 8545,
CIP 53.126, NBRC 3972 ;
– Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Typhimurium :
par exemple ATCC 14028 ; ou Salmonella enterica subsp.
enterica sérovar Abony : par exemple NBRC 100797,
NCTC 6017, CIP 80.39 ;
– Candida albicans : par exemple ATCC 10231, NCPF 3179,
IP 48.72, NBRC 1594.
Utilisez de la solution tampon peptonée au chlorure de sodium
pH 7,0 ou de la solution tampon phosphate pH 7,2 pour
préparer des suspensions témoins. Utilisez les suspensions
dans les 2 h ou dans les 24 h si elles sont conservées à 2-8 °C.
3-1-2. Clostridies. Utilisez une souche de Clostridium
sporogenes, par exemple ATCC 11437 (NBRC 14293,
NCIMB 12343, CIP 100651) ou ATCC 19404 (NCTC 532
ou CIP 79.03). Cultivez la souche clostridienne de référence
dans des conditions anaérobies dans du milieu renforcé pour
clostridies à 30-35 °C pendant 24-48 h. On peut également,
plutôt que de préparer puis diluer une suspension fraîche de
cellules végétatives de C. sporogenes, utiliser pour l’inoculation
une suspension de spores stable. Cette suspension peut être
maintenue à 2-8 °C pendant une durée validée.
3-2. TÉMOIN NÉGATIF
Pour vérifier les conditions opératoires, effectuez un contrôle
sur un témoin négatif préparé en substituant le diluant choisi
à la préparation à examiner. Aucune croissance microbienne
n’est observée. Un contrôle sur un témoin négatif est
également effectué lors de l’examen du produit comme décrit
dans la section 4. L’obtention d’un résultat non conforme
nécessite une investigation.
3-3. FERTILITÉ ET PROPRIÉTÉS INHIBITRICES DES
MILIEUX
Effectuez ce contrôle sur chaque lot de milieu, qu’il soit acheté
prêt à l’emploi ou préparé à partir d’un milieu déshydraté ou
des ingrédients décrits.
Vérifiez que les milieux concernés présentent les propriétés
voulues (voir tableau 2.6.13.-1).
Contrôle de la fertilité, milieux liquides : ensemencez un
échantillon du milieu approprié avec une petite quantité (au
maximum 100 UFC) du microorganisme approprié. Incubez à
la température spécifiée pendant une durée inférieure ou égale
à la durée minimale spécifiée pour l’essai. Une croissance
clairement visible du microorganisme, comparable à celle
obtenue sur un lot de milieu précédemment contrôlé et
approuvé, est observée.
Contrôle de la fertilité, milieux solides : opérez par la méthode
d’ensemencement en surface, en ensemençant chaque
plaque avec une petite quantité (au maximum 100 UFC) du
microorganisme approprié. Incubez à la température spécifiée
pendant une durée inférieure ou égale à la durée minimale
spécifiée pour l’essai. Une croissance du microorganisme
comparable à celle obtenue sur un lot de milieu précédemment
contrôlé et approuvé est observée.
Contrôle des propriétés inhibitrices, milieux liquides ou solides :
ensemencez le milieu approprié avec au moins 100 UFC du
microorganisme approprié. Incubez à la température spécifiée

Tableau 2.6.13.-1. – Fertilité, propriétés inhibitrices et propriétés indicatives des milieux

Milieu Propriétés Microorganisme de référence
Recherche des bactéries gram-négatives Milieu d’enrichissement pour les Fertilité E. coli
résistantes aux sels biliaires entérobactéries Mossel P. aeruginosa
Inhibition S. aureus

Milieu gélosé à la bile-violet-rouge Fertilité + indication E. coli

avec glucose P. aeruginosa
Recherche d’Escherichia coli Milieu liquide de MacConkey Fertilité E. coli
Inhibition S. aureus

Milieu gélosé de MacConkey Fertilité + indication E. coli

Recherche des salmonelles Milieu liquide d’enrichissement pour Fertilité Salmonella enterica subsp. enterica
les salmonelles Rappaport-Vassiliadis sérovar Typhimurium ou Salmonella
enterica subsp. enterica sérovar Abony
Inhibition S. aureus

Milieu gélosé xylose-lysine- Fertilité + indication Salmonella enterica subsp. enterica

désoxycholate sérovar Typhimurium ou Salmonella
enterica subsp. enterica sérovar Abony
Recherche de Pseudomonas aeruginosa Milieu gélosé-cétrimide Fertilité P. aeruginosa

Inhibition E. coli
Recherche de Staphylococcus aureus Milieu gélosé mannitol-sel Fertilité + indication S. aureus

Inhibition E. coli
Recherche des clostridies Milieu renforcé pour clostridies Fertilité C. sporogenes

Gélose Columbia Fertilité C. sporogenes

Recherche de Candida albicans Milieu liquide Sabouraud dextrosé Fertilité C. albicans

Milieu Sabouraud dextrosé-gélosé Fertilité + indication C. albicans

5062 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3
pendant une durée égale ou supérieure à la durée maximale
spécifiée pour l’essai. Aucune croissance du microorganisme
n’est observée.
Contrôle des propriétés indicatives : opérez par la méthode
d’ensemencement en surface, en ensemençant chaque
plaque avec une petite quantité (au maximum 100 UFC) du
microorganisme approprié. Incubez à la température spécifiée
pendant une durée comprise dans l’intervalle spécifié pour
l’essai. Les colonies sont comparables, quant à leur aspect et
aux réactions indicatives observées, à celles obtenues sur un
lot de milieu précédemment contrôlé et approuvé.
3-4. APPLICABILITÉ DE LA MÉTHODE D’ESSAI
Pour chaque produit à examiner, procédez à la préparation
de l’échantillon comme décrit dans le paragraphe approprié
de la section 4. Ajoutez chaque souche de référence au
moment du mélange, dans le milieu prescrit. Effectuez
l’essai individuellement avec chaque souche de référence.
Utilisez un nombre de microorganismes équivalant, au
maximum, à 100 UFC dans la préparation à examiner après
ensemencement.
Effectuez l’essai comme décrit dans le paragraphe approprié de
la section 4, en incubant pendant la durée minimale prescrite.
Les réactions indicatives décrites dans la section 4 doivent
montrer la présence des microorganismes spécifiés.
Si le produit présente une activité antimicrobienne, il faut
apporter les modifications voulues à la procédure d’essai (voir
chapitre général 2.6.12, section 4-5-3).
S’il s’avère impossible de neutraliser l’activité antimicrobienne
exercée par un produit donné sur un microorganisme dont la
recherche est prescrite, ce microorganisme sera présumé ne
plus être présent dans le produit.
4. CONTRÔLE DES PRODUITS
4-1. BACTÉRIES GRAM-NÉGATIVES RÉSISTANTES AUX
SELS BILIAIRES
4-1-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre général
2.6.12, en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du
produit à examiner, mais avec comme diluant du milieu
liquide aux peptones de caséine et de soja. Mélangez, puis
incubez à 20-25 °C pendant un temps suffisant pour assurer la
revivification des bactéries, mais insuffisant pour permettre
leur multiplication (généralement 2 h mais pas plus de 5 h).
4-1-2. Absence de ces bactéries. Sauf indication contraire,
utilisez le volume d’inoculum correspondant à 1 g du produit,
préparé comme décrit sous 4-1-1, pour ensemencer du milieu
d’enrichissement pour les entérobactéries-Mossel. Incubez à
30-35 °C pendant 24-48 h. Repiquez sur du milieu gélosé à la
bile-violet-rouge avec glucose et incubez 30-35 °C pendant
18-24 h.
Le produit satisfait à l’essai s’il n’est pas observé de croissance
de colonies.
4-1-3. Essai quantitatif
4-1-3-1. Sélection et subculture. Ensemencez des
quantités appropriées de milieu d’enrichissement pour les
entérobactéries-Mossel avec la préparation décrite sous
4-1-1 et/ou des dilutions de cette préparation contenant
respectivement 0,1 g, 0,01 g et 0,001 g (ou 0,1 mL, 0,01 mL et
0,001 mL) du produit à examiner. Incubez à 30-35 °C pendant
24-48 h. Repiquez chacune des cultures sur du milieu gélosé à
la bile-violet-rouge avec glucose. Incubez à 30-35 °C pendant
18-24 h.
4-1-3-2. Interprétation. La croissance de colonies constitue un
résultat positif. Notez la plus petite quantité de produit qui
donne un résultat positif et la plus grande quantité de produit
qui donne un résultat négatif. Déterminez le nombre probable
de bactéries à l’aide du tableau 2.6.13.-2.
Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes
2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés
Tableau 2.6.13.-2. – Interprétation des résultats
Résultats obtenus avec une quantité de produit de Nombre
probable de
bactéries par
0,1 g ou 0,01 g ou 0,001 g ou gramme ou
0,1 mL 0,01 mL 0,001 mL millilitre de
produit
+ + + > 103
+ + − < 103 et > 102
+ − − < 102 et > 10
− − − < 10
4-2. ESCHERICHIA COLI
4-2-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre général
2.6.12, en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du
produit à examiner, et ensemencez une quantité appropriée
(déterminée comme décrit sous 3-4) de milieu liquide aux
peptones de caséine et de soja avec 10 mL d’échantillon ou la
quantité correspondant à 1 g ou 1 mL de produit. Mélangez,
puis incubez à 30-35 °C pendant 18-24 h.
◊Pour les films orodispersibles, filtrez sur une membrane
stérile le volume d’échantillon correspondant à 1 film, préparé
comme décrit dans la section 4-5-1 du chapitre général
2.6.12, puis transférez la membrane dans 100 mL de milieu
liquide aux peptones de caséine et de soja. Incubez à 30-35 °C
pendant 18-24 h.◊
4-2-2. Sélection et subculture. Agitez le récipient, puis
transférez 1 mL du milieu liquide aux peptones de caséine
et de soja dans 100 mL de milieu liquide de MacConkey et
incubez à 42-44 °C pendant 24-48 h. Repiquez sur du milieu
gélosé de MacConkey et incubez à 30-35 °C pendant 18-72 h.
4-2-3. Interprétation. La croissance de colonies indique
la présence possible d’E. coli, à confirmer par des essais
d’identification.
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
d’aucune colonie ou si les essais de confirmation de
l’identification sont négatifs.
4-3. SALMONELLES
4-3-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez le produit à examiner comme décrit dans le chapitre
général 2.6.12 et ensemencez une quantité appropriée
(déterminée comme décrit sous 3-4) de milieu liquide aux
peptones de caséine et de soja avec une quantité d’échantillon
correspondant à au moins 10 g ou 10 mL de produit.
Mélangez, puis incubez à 30-35 °C pendant 18-24 h.
4-3-2. Sélection et subculture. Transférez 0,1 mL du milieu
liquide aux peptones de caséine et de soja dans 10 mL
de milieu liquide d’enrichissement pour les salmonelles
Rappaport-Vassiliadis et incubez à 30-35 °C pendant 18-24 h.
Repiquez sur du milieu gélosé xylose-lysine-désoxycholate et
incubez à 30-35 °C pendant 18-48 h.
4-3-3. Interprétation. La croissance de colonies rouges
bien développées, avec ou sans centre noir, indique la
présence possible de salmonelles, à confirmer par des essais
d’identification.
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
d’aucune colonie du type décrit ou si les essais de confirmation
de l’identification sont négatifs.
4-4. PSEUDOMONAS AERUGINOSA
4-4-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre général
2.6.12, en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du
produit à examiner, et ensemencez une quantité appropriée
(déterminée comme décrit sous 3-4) de milieu liquide aux
peptones de caséine et de soja avec 10 mL d’échantillon
ou la quantité correspondant à 1 g ou 1 mL de produit.
Mélangez. Pour les dispositifs transdermiques ◊ou les films
5063
2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3

orodispersibles◊, filtrez sur une membrane stérile le volume
d’échantillon correspondant à 1 dispositif ◊ou à 1 film◊,
préparé comme décrit dans la section 4-5-1 du chapitre
général 2.6.12, puis transférez la membrane dans 100 mL de
milieu liquide aux peptones de caséine et de soja. Incubez à
30-35 °C pendant 18-24 h.
4-4-2. Sélection et subculture. Repiquez sur du milieu
gélosé-cétrimide et incubez à 30-35 °C pendant 18-72 h.
4-4-3. Interprétation. La croissance de colonies indique la
présence possible de P. aeruginosa, à confirmer par des essais
d’identification.
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
d’aucune colonie ou si les essais de confirmation de
l’identification sont négatifs.
4-5. STAPHYLOCOCCUS AUREUS
4-5-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez un échantillon comme décrit dans le chapitre général
2.6.12, en utilisant une dilution au 1/10 d’au moins 1 g du
produit à examiner, et ensemencez une quantité appropriée
(déterminée comme décrit sous 3-4) de milieu liquide aux
peptones de caséine et de soja avec 10 mL d’échantillon
ou la quantité correspondant à 1 g ou 1 mL de produit.
Mélangez. Pour les dispositifs transdermiques ◊ou les films
orodispersibles◊, filtrez sur une membrane stérile le volume
d’échantillon correspondant à 1 dispositif ◊ou à 1 film◊,
préparé comme décrit dans la section 4-5-1 du chapitre
général 2.6.12, puis transférez la membrane dans 100 mL de
milieu liquide aux peptones de caséine et de soja. Incubez à
30-35 °C pendant 18-24 h.
4-7-2. Sélection et subculture. Repiquez sur du milieu
Sabouraud dextrosé-gélosé et incubez à 30-35 °C pendant
24-48 h.
4-7-3. Interprétation. La croissance de colonies blanches
indique la présence possible de C. albicans, à confirmer par
des essais d’identification.
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence
d’aucune colonie du type décrit ou si les essais de confirmation
de l’identification sont négatifs.
La section suivante est donnée à titre d’information.
5. SOLUTIONS ET MILIEUX DE CULTURE
RECOMMANDÉS
Les solutions et milieux de culture suivants se sont avérés
satisfaisants pour la réalisation des essais de contamination
microbienne prescrits dans la Pharmacopée. D’autres milieux
peuvent être utilisés dès lors que leur applicabilité peut être
démontrée.
Solution tampon mère. Transférez 34 g de phosphate
monopotassique dans une fiole jaugée de 1000 mL, dissolvez
dans 500 mL d’eau purifiée, ajustez à pH 7,2 ± 0,2 avec de
l’hydroxyde de sodium, complétez à 1000,0 mL avec de l’eau
purifiée et mélangez. Répartissez en récipients et stérilisez.
Conservez à une température de 2-8 °C.
Solution tampon phosphate pH 7,2. Préparez un mélange
de solution tampon mère et d’eau purifiée (1:800 V/V) et
stérilisez.
Solution tampon peptonée au chlorure de sodium pH 7,0
Phosphate monopotassique 3,6 g

4-5-2. Sélection et subculture. Repiquez sur du milieu gélosé Phosphate disodique dihydraté 7,2 g équivalant à 0,067 M de
mannitol-sel et incubez à 30-35 °C pendant 18-72 h. phosphate
Chlorure de sodium 4,3 g
4-5-3. Interprétation. La croissance de colonies
jaunes/blanches entourées d’une zone jaune indique la Peptone de viande ou de caséine 1,0 g
présence possible de S. aureus, à confirmer par des essais
Eau purifiée 1000 mL
d’identification.
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
d’aucune colonie du type décrit ou si les essais de confirmation
Milieu liquide aux peptones de caséine et de soja
de l’identification sont négatifs.
Peptone pancréatique de caséine 17,0 g
4-6. CLOSTRIDIES
Peptone papaïque de soja 3,0 g
4-6-1. Préparation de l’échantillon et traitement à la
chaleur. Préparez un échantillon comme décrit dans le Chlorure de sodium 5,0 g
chapitre général 2.6.12, en utilisant une dilution au 1/10 (avec 2,5 g
Phosphate dipotassique
un volume total minimal de 20 mL) d’au moins 2 g ou 2 mL
du produit à examiner. Divisez l’échantillon en 2 fractions Glucose monohydraté 2,5 g
d’au moins 10 mL. Chauffez l’une d’elles à 80 °C pendant
Eau purifiée 1000 mL
10 min, puis refroidissez rapidement. Ne chauffez pas l’autre.
4-6-2. Sélection et subculture. Ensemencez une quantité Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après
appropriée (déterminée comme décrit sous 3-4) de milieu stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
renforcé pour clostridies avec 10 mL de chacune des fractions, Milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja
ou la quantité correspondant à 1 g ou 1 mL de produit. Peptone pancréatique de caséine 15,0 g
Incubez en anaérobiose à 30-35 °C pendant 48 h. Après
incubation, effectuez à partir de chaque récipient un repiquage Peptone papaïque de soja 5,0 g
sur de la gélose Columbia, puis incubez en anaérobiose à Chlorure de sodium 5,0 g
30-35 °C pendant 48-72 h.
Gélose 15,0 g
4-6-3. Interprétation. La croissance anaérobie de bâtonnets
(avec ou sans endospores) donnant une réaction catalase Eau purifiée 1000 mL
négative indique la présence de clostridies, à confirmer par
des essais d’identification. Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après
Le produit satisfait à l’essai si l’on n’observe la présence stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
d’aucune colonie du type décrit ou si les essais de confirmation Milieu Sabouraud dextrosé-gélosé
de l’identification sont négatifs. Dextrose 40,0 g
4-7. CANDIDA ALBICANS Mélange de peptone peptique de tissu animal et de 10,0 g
peptone pancréatique de caséine (1:1)
4-7-1. Préparation de l’échantillon et pré-incubation.
Préparez le produit à examiner comme décrit dans le chapitre Gélose 15,0 g
général 2.6.12 et ensemencez 100 mL de milieu liquide Eau purifiée 1000 mL
Sabouraud dextrosé avec 10 mL d’échantillon ou la quantité
correspondant à 1 g ou 1 mL de produit. Mélangez, puis Ajustez le pH pour qu’il soit de 5,6 ± 0,2 à 25 °C après
incubez à 30-35 °C pendant 3-5 jours. stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.

5064 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3 2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés

Milieu dextrosé-gélosé à la pomme de terre Rouge neutre 30,0 mg

Infusion de pomme de terre 200 g Violet cristallisé 1 mg
Dextrose 20,0 g Eau purifiée 1000 mL
Gélose 15,0 g
Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,1 ± 0,2 à 25 °C après
Eau purifiée 1000 mL stérilisation. Portez à ébullition pendant 1 min en agitant
constamment, puis stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé.
Ajustez le pH pour qu’il soit de 5,6 ± 0,2 à 25 °C après Milieu liquide d’enrichissement pour les salmonelles
stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé. Rappaport-Vassiliadis
Milieu liquide Sabouraud dextrosé Peptone de soja 4,5 g
Dextrose 20,0 g
Chlorure de magnésium hexahydraté 29,0 g
Mélange de peptone peptique de tissu animal et de 10,0 g
peptone pancréatique de caséine (1:1) Chlorure de sodium 8,0 g
Eau purifiée 1000 mL Phosphate dipotassique 0,4 g

Ajustez le pH pour qu’il soit de 5,6 ± 0,2 à 25 °C après Phosphate monopotassique 0,6 g
stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé. Vert malachite 0,036 g
Milieu d’enrichissement pour les entérobactéries-Mossel
Eau purifiée 1000 mL
Hydrolysat pancréatique de gélatine 10,0 g

Glucose monohydraté 5,0 g Dissolvez en chauffant doucement. Stérilisez à l’autoclave

selon un cycle validé, à une température ne dépassant pas
Bile de boeuf déshydratée 20,0 g 115 °C. Le pH doit être de 5,2 ± 0,2 à 25 °C après chauffage
Phosphate monopotassique 2,0 g et passage à l’autoclave.
Milieu gélosé xylose-lysine-désoxycholate
Phosphate disodique dihydraté 8,0 g
Xylose 3,5 g
Vert brillant 15 mg
L-Lysine 5,0 g
Eau purifiée 1000 mL
Lactose monohydraté 7,5 g
Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,2 ± 0,2 à 25 °C après Saccharose 7,5 g
chauffage. Chauffez à 100 °C pendant 30 min et refroidissez
immédiatement. Chlorure de sodium 5,0 g

Milieu gélosé à la bile-violet-rouge avec glucose Extrait de levure 3,0 g

Extrait de levure 3,0 g Rouge de phénol 80 mg
Hydrolysat pancréatique de gélatine 7,0 g Gélose 13,5 g
Sels biliaires 1,5 g Désoxycholate sodique 2,5 g
Chlorure de sodium 5,0 g Thiosulfate de sodium 6,8 g
Glucose monohydraté 10,0 g Citrate ferrique et d’ammonium 0,8 g
Gélose 15,0 g Eau purifiée 1000 mL
Rouge neutre 30 mg
Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C après
Violet cristallisé 2 mg chauffage. Chauffez à ébullition, refroidissez à 50 °C et
1000 mL répartissez en boîtes de Petri. Ne chauffez pas en autoclave.
Eau purifiée
Milieu gélosé-cétrimide
Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C après Hydrolysat pancréatique de gélatine 20,0 g
chauffage. Chauffez à ébullition ; ne chauffez pas en autoclave.
Chlorure de magnésium 1,4 g
Milieu liquide de MacConkey
Sulfate dipotassique 10,0 g
Hydrolysat pancréatique de gélatine 20,0 g
Cétrimide 0,3 g
Lactose monohydraté 10,0 g
Gélose 13,6 g
Bile de boeuf déshydratée 5,0 g
Eau purifiée 1000 mL
Pourpre de bromocrésol 10 mg
Glycérol 10,0 mL
Eau purifiée 1000 mL

Ajustez le pH pour qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après

stérilisation. Stérilisez à l’autoclave selon un cycle validé. Chauffez à ébullition pendant 1 min en agitant. Ajustez le pH
pour qu’il soit de 7,2 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation. Stérilisez
Milieu gélosé de MacConkey à l’autoclave selon un cycle validé.
Hydrolysat pancréatique de gélatine 17,0 g Milieu gélosé mannitol-sel
Peptones de viande et de caséine 3,0 g Peptone pancréatique de caséine 5,0 g

Lactose monohydraté 10,0 g Peptone peptique de tissu animal 5,0 g

Chlorure de sodium 5,0 g Extrait de viande de boeuf 1,0 g

Sels biliaires 1,5 g D-Mannitol 10,0 g

Gélose 13,5 g Chlorure de sodium 75,0 g

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 5065
2.6.27. Contrôle microbiologique des produits cellulaires PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3

Gélose 15,0 g microbiologique avant l’administration au patient, ainsi que

Rouge de phénol 0,025 g les quantités disponibles pour les essais et les problèmes liés
à l’échantillonnage. Ces approches peuvent être appliquées
Eau purifiée 1000 mL lorsque l’essai de stérilité, décrit dans le chapitre général
2.6.1. Stérilité, est nécessaire mais ne peut être effectué pour
Chauffez à ébullition pendant 1 min en agitant. Ajustez le pH des raisons techniques ou du fait des caractéristiques du
pour qu’il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation. Stérilisez produit cellulaire à examiner.
à l’autoclave selon un cycle validé.
1-1. DURÉE DE CONSERVATION
Milieu renforcé pour clostridies
La durée de conservation des produits cellulaires dépend des
Extrait de viande de boeuf 10,0 g caractéristiques de la cellule et des conditions de conservation.
Peptone 10,0 g Pour les produits cellulaires qui ne sont pas cryoconservés, la
durée de conservation ne dépasse généralement pas 3-4 jours
Extrait de levure 3,0 g et peut même parfois n’être que de quelques heures. Dans

Amidon soluble 1,0 g ce cas, le statut microbiologique du produit final ne peut

pas être déterminé avant l’administration, selon le chapitre
Glucose monohydraté 5,0 g général 2.6.1.

Chlorhydrate de cystéine 0,5 g 1-2. COMPOSITION DE L’ÉCHANTILLON

Chlorure de sodium 5,0 g Des contaminants microbiens peuvent se trouver à la surface

ou à l’intérieur des cellules ou d’autres composants du produit
Acétate de sodium 3,0 g cellulaire, et peuvent ne pas être détectés si seuls sont analysés

Gélose 0,5 g des surnageants comme les milieux de culture ou de transport.

Sauf exception justifiée, l’échantillon contrôlé doit être
Eau purifiée 1000 mL représentatif de tous les composants du produit cellulaire.

Faites gonfler la gélose, dissolvez en chauffant à ébullition sous 1-3. TAILLE DE L’ÉCHANTILLON
agitation constante. Si nécessaire, ajustez le pH pour qu’il soit En raison de contraintes liées à l’utilisation d’un seul donneur
de 6,8 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation. Stérilisez à l’autoclave ou aux capacités de production, la quantité d’échantillon
selon un cycle validé. disponible pour l’essai à la fin du procédé de fabrication
Gélose Columbia peut être limitée. Cependant, pour tenir compte de l’erreur
d’échantillonnage, qui pourrait conduire à la non-détection
Peptone pancréatique de caséine 10,0 g
d’une contamination microbienne, la taille de l’échantillon doit
Peptone peptique de viande 5,0 g être suffisante pour assurer une sensibilité et une spécificité
appropriées de la méthode choisie.
Peptone pancréatique de coeur 3,0 g
1-4. JUSTIFICATION DU CHOIX DE LA MÉTHODE
Extrait de levure 5,0 g
Le choix de la méthode doit être fondé sur les caractéristiques
Amidon de maïs 1,0 g du produit final et sur le procédé de fabrication. Afin d’assurer
l’innocuité du produit pour l’usage qui en sera fait, le choix
Chlorure de sodium 5,0 g
de la méthode ou de la combinaison de méthodes peut être
Gélose, selon pouvoir gélifiant 10,0-15,0 g appuyé par une analyse des risques liés à une exposition
potentielle à des contaminants microbiologiques, et aux
Eau purifiée 1000 mL
caractéristiques et utilisation prévue du produit cellulaire. Les
Faites gonfler la gélose, dissolvez en chauffant à ébullition milieux et les temps d’incubation utilisés pour ces méthodes
sous agitation constante. Si nécessaire, ajustez le pH pour doivent être choisis en tenant compte des propriétés de la
qu’il soit de 7,3 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation. Stérilisez à matière première et des conditions du procédé de fabrication
l’autoclave selon un cycle validé. Laissez refroidir à 45-50 °C ; pouvant favoriser la croissance de microorganismes
ajoutez si nécessaire une quantité de sulfate de gentamicine spécifiques (moisissures et levures ou bactéries psychrophiles,
correspondant à 20 mg de gentamicine base et répartissez en thermophiles ou exigeants, par exemple). La composition
boîtes de Petri. du produit cellulaire peut physiquement entraver certaines
méthodes d’essai (par exemple, en cas de turbidité du milieu
de culture après addition de l’échantillon à examiner).
01/2021:20627 Les approches suivantes peuvent être appliquées pour le
contrôle microbiologique :
– des méthodes automatisées fondées sur la croissance,
– une combinaison d’une préculture et d’une détection par
des méthodes alternatives (5.1.6),
2.6.27. CONTRÔLE – une détection directe par des méthodes alternatives (5.1.6),
MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS – des méthodes basées sur l’essai de stérilité prescrit dans le
CELLULAIRES chapitre général 2.6.1.

Ce chapitre ne concerne pas le contrôle du sang ou des 2. CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES

composants sanguins humains, qui relève de la Directive
2002/98/CE du Parlement européen et du Conseil du 27 janvier
2003 et la Directive 2004/33/CE de la Commission du 22 mars
2004 portant application de la Directive 2002/98/CE.
1. INTRODUCTION
Les approches du contrôle microbiologique des produits
cellulaires décrites dans le présent chapitre général tiennent
compte des caractéristiques et des limites de ces produits,
en particulier leur durée de conservation qui ne permet
pas toujours de terminer les essais classiques du contrôle
2-1. PRÉCAUTIONS GÉNÉRALES
L’essai est réalisé dans des conditions aseptiques,
conformément aux réglementations en vigueur concernant
les matières potentiellement infectieuses. Les précautions
prises pour éviter une contamination microbienne ne doivent
pas affecter les microorganismes recherchés. L’essai est
réalisé dans des conditions régulièrement vérifiées par des
prélèvements adéquats effectués dans la zone de travail et
par des contrôles appropriés. L’examen tient compte de la
possible présence dans l’échantillon de substances inhibitrices
susceptibles d’affecter le résultat de l’essai.

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