Techniques de destruction et d’élimination des microorganismes M1 Biotechnologie microbienne Chapitre 4

Détermination de l’activité antimicrobienne

4. 1. Agents antimicrobiens
Les termes « antimicrobiens » désignent toutes substances naturelles et/ou synthétiques susceptibles de
diminuer la multiplication des microorganismes ou de les détruire sans endommager les tissus de
l’organisme.
Parmi eux, on retrouve notamment :
Des agents chimiques comme : les antibiotiques, les antiseptiques, les antifongiques, Les antiviraux
Des agents biologique tel que :
 les agents antimicrobiens d’origine microbiens
 les agents antimicrobiens d’origine végétale comme les composés phénoliques, les alcaloïdes ainsi
que les huiles essentielles

4.2. Conditions affectant l’efficacité de l’activité des agents antimicrobiens :

Taille de la population
Il faut plus de temps pour détruire une population importante que petite.

Composition de la population
L’efficacité d’un agent varie avec le type d’organisme traité car les micro-organismes varient
fortement en sensibilité.

Concentration ou intensité d’un agent antimicrobien

Habituellement, une concentration plus élevée tue plus rapidement (mais cette relation n’est pas
linéaire).

Durée de l’exposition
Exposition longue => plus d’organismes tués

Température
Un accroissement de la température augmente son activité.

L’environnement local
Plusieurs facteurs (pH et concentration de la matière organique) peuvent également influencer
l’efficacité.

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4.3.1. Evaluation de l’activité antibactérienne

3.1.1. Méthode de diffusion en milieu solide

A. Par la méthode de diffusion en disque (aromatogrammes)

La méthode de diffusion sur disque, appelée aussi méthode de Vincent ou technique de l’aromatogramme
mise au point par Schroeder et Messing en 1949. Cet examen se fait de la même manière qu'un
antibiogramme
Ce test est réalisé par dépôt des disques de cellulose imprégnés d’une quantité connue de l’agent
antimicrobien sur la gélose ensemencé préalablement par la souche testée.
Après l’incubation, la lecture des résultats se fait par mesure des diamètres des zones d’inhibition obtenues

B. Par la méthode de diffusion en puits

Elle consiste à creusé des trous de 6 à 8 mm de diamètre dans la gélose.
Un volume fixe d'extrait végétal est ensuite introduit dans le puits d'agar perforé et incubé à une température
et une durée optimales en fonction du microorganisme testé.

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3.1.2. Méthode en phase vapeur (ou Microatmosphère)

Le disque imprégné est déposé au centre du couvercle de la boîte de Pétri, renversée pendant la durée de
l’expérience. Celui-ci n’est donc plus en contact avec le milieu gélosé.
Après incubation, l’absence de la croissance microbienne se traduit par un halo translucide autour du
disque.

3.2. Détermination des doses minimales inhibitrice et bactéricide

3.2.1. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI)

La Concentration Minimale Inhibitrice (CMI), correspond à la plus faible concentration

d'antimicrobiens qui inhibera la croissance visible des microorganismes après une incubation durant de 18-
24 h. Cette valeur permet de classer une souche bactérienne dans les catégories : "sensible" ; "résistante" ;
"intermédiaire".
Les méthodes de dilution sont les plus appropriées pour la détermination des valeurs de
concentration minimales inhibitrice (CMI) d'un extrait, d'une huile essentielle ou d'une substance pure. Car
elles offrent la possibilité d'estimer la concentration de l'agent antimicrobien testé dans la gélose (dilution
d'agar) ou dans le bouillon (la micro-dilution ou la macro-dilution). Ces méthodes peuvent être utilisées
pour mesurer quantitativement l'activité antimicrobienne in vitro contre les bactéries et les champignons.

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A. Technique de micro-dilution en milieu liquide

C'est une méthode plus simple et plus économique que la méthode de macro-dilution au bouillon. Elle est
maintenant considérée comme la méthode internationale de test de sensibilité de référence

Après 18-24h d’incubation, la mesure de la turbidité peuvent être déterminés visuellement, ou par
spectrophotométrie ou par l'utilisation un indicateur de croissance en solution (Triphényl tétrazolium
chloride) (TTC). La croissance bactérienne est indiquée par l’apparition d’une couleur rouge de la solution
témoignant de la réduction ou précipitation du TTC. La CMI est ainsi déterminée par le dernier puits de la
microplaque, par ordre décroissant de la concentration, qui ne montre aucun changement de couleur

CMI par micro-dilution en microplaque de 96 puits par l’utilisation un indicateur de croissance en solution.

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B. Technique de macro-dilution en milieu liquide

La méthode de macro-dilution était parmi les premières à être développée et sert toujours de méthode de
référence. Le principe de base de ce dosage est le même que le dosage de la micro-dilution au bouillon.
Mais le test est effectué dans des tubes à essai contenant des concentrations différentes de l'agent
antimicrobien avec le même volume. Les tubes sont inoculés avec des microorganismes d'essai à des
concentrations standard. Tous les tubes de dosage doivent être incubés pendant 18-24 h dans un incubateur
d'air ambiant à 35-37 °C. Après l'incubation, les tubes sont examinés pour détecter les changements de
turbidité comme indicateur de croissance. La CMI de l'extrait de plante peut être déterminée par la
concentration la plus faible de l'agent antimicrobien qui inhibera la croissance visible du microorganisme
testé

C. Technique de macro-dilution en milieu solide

Dans cette méthode, la substance d'essai est incorporée à des concentrations connues dans la gélose et, une
fois définies, des bactéries sont appliquées sur sa surface. De cette façon, un grand nombre de bactéries
peuvent être criblées dans une seule opération de dosage. Les boites sont incubés pendant 24 h ou plus et
la croissance des bactéries sur le mélange extrait/agar est marquée soit présente ou absente de la croissance
microbienne. Les points finaux des CMI sont enregistrés comme la plus faible concentration d'agent
antimicrobien qui inhibe complètement la croissance dans des conditions d'incubation appropriées

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D. La méthode de E-test (Méthode de diffusion et de dilution)

E-test est une technique basée sur la combinaison de 2 concepts : diffusion du disque et de la dilution de
gélose. Elle consiste en l’application d’une bandelette imprégnée de concentration croissante d’un
antibiotique.
Après 24h d’incubation, la zone d’inhibition à la forme d’une ellipse et la lecture est alors directe sur la
bandelette là où celle-ci rencontre la zone d’inhibition.

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3.2.2. Détermination de la Concentration Minimale Bactéricide (CMB)

Elle correspond à la plus faible concentration d’antibiotique qui ne laisse que 0.01% au moins de survivants
de l’inoculum initial après 18h d’incubation à 37°C
Un antibiotique sera considéré comme bactéricide lorsque la CMB est au moins égale à 4 fois la CMI ;

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