Polycopie TAB Cour Les Série

Réalisée par :
Dr BENAROUS Khedidja
2014-2015
1 Benarouskh_Cours de TAB. http://geniebiologique.e-monsite.com

Liste des figures
Figure 1. Schéma réactionnel de la dissociation de l’eau ........................................................................ 6
Figure 2. Structure 2D et 3D de la molécule d’eau ................................................................................... 7
Figure 3. Schéma représentant le phénomène de solvatation ................................................................ 8
Figure 4. Echelle de pH à gauche et photo de Sörensen à droite ............................................................ 9
Figure 5. Exemples des pH de quelques liquides biologiques. ................................................................ 9
Figure 6. Courbes de titration acido-basiques (NaOH avec HCl) .......................................................... 14
Figure 7. Courbes de titration .................................................................................................................. 16
Figure 8. Spectre électromagnétique ...................................................................................................... 28
Figure 9. Courbe d’étalonnage réalisée avec un standard ..................................................................... 35
Figure 10. Spectre A=f(λ) ......................................................................................................................... 35
Figure 11. Les effets des chromophores ................................................................................................. 36
Figure 12. Sections des colonnes ............................................................................................................. 88
Figure 13. Le chromatographe ................................................................................................................ 88
Figure 14. Système classique de CLHP. .................................................................................................. 92
Figure 15. Les étapes de la chromatographie d’affinité ......................................................................... 96
Figure 16. Principe de la chromatographie échangeuse d’ions............................................................. 98
Figure 17. Principe de la chromatographie gel filtration .................................................................... 100
Figure 18. Détermination d’une masse moléculaire inconnue............................................................ 101
Figure 19. Schéma de l’appareillage d’électrophorèse capillaire ....................................................... 109

Liste des tableaux
Tableau 1. Principaux indicateurs et leurs zones de virage .................................................................. 14
Tableau 2. Structures et pKa de quelques solutions tampons ............................................................... 17
Tableau 3. Différents transitions électroniques ..................................................................................... 31
Tableau 4. Principaux chromophores ..................................................................................................... 36
Tableau 5. Exemples de quelques spectres d’absorption UV des biomolécules : ................................ 38
Tableau 6. Exemples des Spectres IR des biomolécules ........................................................................ 48
Tableau 7. Exemples de quelques spectres RMN-1H et RMN-13C des biomolécules : ...................... 59

Table des matières
Chapitre I : Solutions Acides, basiques et tampons ................................................................................... 5
I. Introduction générale ..................................................................................................................... 6
II. Solutions acides et bases ................................................................................................................ 8
III. Solutions tampons .................................................................................................................... 16
Série n°1: Acides et Bases .................................................................................................................... 19
Chapitre II : Spectroscopie......................................................................................................................... 25
I. Introduction générale ................................................................................................................... 26
II. Spectroscopie UV-visible .............................................................................................................. 30
Série n°2 : Spectroscopie UV-VISIBLE ................................................................................................. 39
III. Spectroscopie IR ....................................................................................................................... 43
Série n°3 : spectroscopie Infrarouge « IR »......................................................................................... 50
III. Spectroscopie RMN ................................................................................................................... 53
Série n°4 : spectroscopie RMN «RMN-1H et RMN-13C» .................................................................... 61
IV. Spectrométrie De Masse (SM)............................................................................................... 65
Série n°5 : spectrométrie de masse ............................................................................................. 71
Chapitre III : Techniques chromatographiques et électrophorétiques .................................................... 76
Introduction générale et grandeurs chromatographiques ................................................................ 77
1. Chromatographie sur couche mince « CCM » ou Thin layer chromatography «TLC» ............ 82
Série n°6 : Chromatographie sur couche mince « CCM » ................................................................... 86
2. La chromatographie en phase gazeuse « CPG ».......................................................................... 87
3. Chromatographie liquide à haute performance « HPLC » ......................................................... 90
Série n°7 : Chromatographie« CPG » et « HPLC » ............................................................................... 93
4. Chromatographie d’affinité « affinity chromatography » .......................................................... 96
5. Chromatographie ionique « ion chromatography » ................................................................... 98
6. Chromatographie d’exclusion moléculaire ou Gel filtration ..................................................... 99
Série n°8 : Chromatographies d’affinité, échangeuse d’ions et exclusion de gel ........................... 102
7. Electrophorèse « electrophoresis » ........................................................................................... 105
Série n°9 : Techniques électrophorétiques ....................................................................................... 110

Chapitre I : Solutions Acides, basiques
et tampons

I. Introduction générale
1. Historique
- L'eau était considérée par les Anciens comme l'un des 4 éléments fondamentaux: le monde
était composé d'un mélange de ces 4 principes essentiels en proportion variable.
- Elle a été considérée comme un corps simple jusqu'au XVIIIème siècle.
- Puis plusieurs chimistes découvrirent que l'eau n'était pas un corps simple en effectuant la
synthèse puis l'analyse.
- Citons les précurseurs, Priestley qui produisit de l'eau à partir de la combustion de
l'hydrogène (1774), Watts (1783) qui émit l'hypothèse que l'eau n'était pas un corps simple,
Monge qui en réalisa la synthèse sous l'action d'une étincelle électrique à partir d'un
mélange d'oxygène et d'hydrogène.
- Mais l'expérience de synthèse décisive fut celle de Lavoisier et Laplace (1783) qui
synthétisèrent l'eau à partir de l'hydrogène et l'oxygène au cours d'une expérience publique
mémorable.
- La décomposition de l'eau eut lieu plus tard, après la découverte de la pile électrique par
Volta en 1800.
- L'électrolyse de l'eau permit de mesurer le rapport respectif de l'oxygène et de l'hydrogène
pour arriver finalement à la formule chimique bien connue H2O.
- La première électrolyse pratique (et spectaculaire) fut réalisée dès 1800 à Paris par
Robertson; la formule chimique fut précisée par les travaux théoriques de Dalton (1803) et
Avogadro (1811).
2. Propriétés de l’eau
a. Propriétés chimiques
- L'eau est un excellent solvant qui dissous un très grand nombre de sels, de gaz, de
molécules organiques.
- Les réactions chimiques de la vie se passent en milieu aqueux;
- Les organismes sont très riches en eau (jusqu'à plus de 90%).
- Elle a longtemps été considérée comme un solvant neutre intervenant peu ou pas dans les
réactions chimiques (catalyseur ou réactif).
- Dans les réactions chimiques, l'eau intervient d'abord par sa dissociation en protons H+,
souvent associés à H2O pour former des protons hydratés H3O+, et en ions hydroxyle OH-
(figure 1).
Figure 1. Schéma réactionnel de la dissociation de l’eau

- C'est le rapport entre ces 2 types d'ions qui détermine le pH de la solution (pH: logarithme
de l'inverse de la concentration molaire en H+). pH= - log [H+]
- La [H+] de l'eau pure = 1,0 x 10-7 mol/L, le pH de l'eau = 7
- Comme l'eau pure contient autant d'ions H+ que d'ions OH-, l'eau est une substance neutre.
b. Propriétés physiques
- Elles sont : température, densité, masse, viscosité, chaleur spécifique.
- La densité de l'eau varie avec sa température; elle augmente lorsque la température baisse,
mais la densité maximale est à 4°C avec 0,997 (0,997 g/cm3) et la masse volumique de la
glace: 0,920 g/cm3.
- L'état physique de l'eau dépend de la température et de la pression. Le passage liquide-gaz
se fait classiquement à 100°C à la pression normale.
- La concentration molaire de l'eau = 55,6 mol/L.
- La concentration molaire s'exprime en mol/litre ou en mol/1000 mL
- 1000mL d'eau = 1000g
- 1 mole d'eau = 18 g
- x mole d'eau = 1000 g Donc x = 55,6 moles.
3. Structure de l’eau
- Les molécules d’eau sont maintenues ensemble par des liaisons covalentes polaires entre un
atome d’oxygène et deux atomes d’hydrogènes (figure 2).
Figure 2. Structure 2D et 3D de la molécule d’eau
- L’angle entre deux O-H dans la molécule d’eau est de 104,5°.

- Dans la molécule d’eau, la densité en électrons est plus importante autour de l’atome d’oxygène
qu’autour de l’atome d’hydrogène responsable, ce qui donne à la liaison O-H un caractère semi-
polaire.
- La répulsion mutuelle entre les charges positives formées sur l’atome d’hydrogène est responsable
de l’angle formée entre les deux liaisons OH ; cet angle est plus grand que celui qui est caractéristique
des liaisons covalentes.
- δ+ et δ- indiquent une positivité et une négativité partielle des charges.
- Cette distribution inégale des électrons dans la molécule d’eau fait agir comme un dipôle
c’est-à-dire qu’elle se comporte pratiquement comme un barreau magnétique (aimanté),
mais au lieu d’avoir deux pôles magnétiques opposés, elle a deux pôles électriques opposés,
l’un positif et l’autre négatif.
4. Exemples d’utilisation d’eau : solvatation des sels
- L’incorporation des molécules d’eau entre les ions et les molécules est appelée hydratation
ou solvatation.
- Le pouvoir dissolvant de l’eau résulte du fait que les molécules d’eau peuvent vaincre les
interactions électrostatiques entre chacun des ions.
- La figure ci-dessous montre l’organisation des ions Na+ et Cl- d’un cristal de chlorure de
sodium (NaCl).
- De faibles liaisons électrostatiques se forment entre les atomes d’oxygène (à charge
partiellement négative) et les cations Na+ (chargé +).
- Une telle liaison se forme aussi entre les atomes d’hydrogène (partiellement +) et les anions
Cl- (chargés -).
- Quand les molécules d’eau entourent les ions, elles s’orientent de sorte que leurs pôles
positifs s’opposent aux anions (les ions chargée -) et que leurs pôles - s’opposent aux
cations (les ions chargée +).
- Cette orientation va réduire l’attraction électrostatique entre les cations et les anions
dissous.
- Par cet aspect la molécule d’eau agit comme un isolant.
A: Représentation de la structure
cristalline très organisée du chlorure de
sodium montrant les tailles ioniques
relatives de Na+ et Cl-.
B : Hydratation de chlorure de sodium,
les atomes d’oxygène des molécules
d’eau sont attirés par les cations et les
atomes d’hydrogène sont attirés par les
anions.
Figure 3. Schéma représentant le phénomène de solvatation
II. Solutions acides et bases

1. Historique
- Un chimiste danois, Sörensen (1868-1939) a structuré une échelle, appelée échelle du pH,
qui simplifie beaucoup les calculs et qui permet de noter les [H+] et [OH-] dans les solutions.
- Le pH est une formule mathématique (figure 4 et 5):
 pH= - log [H+]
- La [H+] de l'eau pure = 1,0 x 10-7 mol/L, le pH de l'eau = 7

- Comme l'eau pure contient autant d'ions H+ que d'ions OH-, l'eau est une substance neutre.
- Une substance dont le pH < 7 est un acide.
- Une substance dont le pH > 7 est une base.
Figure 4. Echelle de pH à gauche et photo de Sörensen à droite
Figure 5. Exemples des pH de quelques liquides biologiques.
2. Des Définitions des acides et bases

Trois théories ont été avancées :
a. Selon Arrhénius (un chimiste Suédois, 1859-1972, prix de Nobel en 1903, Def en
1875)
Un acide : est une substance qui en solution aqueuse fournit « libère » des ions H+ « protons ».
HA  H   A ex :
H 2O
 HCl(g) →H+(aq) + Cl-(aq)

 HBr(g) →H+(aq) + Br-(aq)
Une base : est une substance qui en solution aqueuse libère des ions OH-. BOH 
2
 B  OH 
H O
:
 NaOH →Na+ + OH-
 KOH →K+ + OH-
b. Selon Brönsted (Brønsted) (un chimiste Danois, 1879-1947, Def en 1923) et

Lowry (un chimiste anglais, 1874-1936)
Un acide : est une espèce chimique (ions, molécules) qui libère des ions H+. Simplement : Un acide
est un donneur de protons. HA 

2
 H   A (Même ex.)
H O
Une base : est une espèce chimique (ions, molécules) qui capte (gagne) des ions H+. Simplement :
 
Une base est un accepteur de protons. B  H 
  BH H O
2
:
 Br- + H+ →HBr
 Cl- + H+ →HCl
C’est la théorie la plus utilisée actuellement car HBr et HCl sont des acides et Br- et Cl- sont des bases et
elles sont appelées bases conjuguées, d’où vient l’appellation couple acide-base HBr/Br- d’une façon
générale :
BH  B  H  →on note un couple acide-base BH/B-, B- est la base conjuguée de l'acide BH.
H 2O
Exemples: Couple acide éthanoïque /ion éthanoate: CH3CO2H/CH3CO2-

Couple acide phosphorique /ion dihydrogénophosphate: H3PO4/H2PO4-
Couple dioxyde de carbone en solution aqueuse /ion hydrogénocarbonate: H2CO3 ou CO2
(aq)/ HCO3-
Couple ion ammonium /ammoniac: NH4+/NH3 .
En résumé : Une réaction acido-basique est un échange (transfert) de protons entre deux couples
acide-base.
*Le cas de l’eau :
Réaction des couples acide-bases dans l'eau :
On en déduit donc que l'eau est une molécule ampholyte (ou bien on peut dire que l'eau est
amphotère. C'est la même chose) car elle peut être à la fois acide et base.
c. Selon Lewis (un chimiste et un physicien américain, 1875-1946, def en 1923)

Un acide : est une espèce qui possède une orbitale moléculaire « OM » vide (case vacante) sur sa
couche externe. Simplement : Un acide est un accepteur du doublet d’électrons. Ex : AlCl3, BH3,
AlF3.
Une base : c’est un donneur des doublets d’électrons. Ex :

Remarque: La réaction entre une base et un acide de Lewis forme un adduit de Lewis. Les doublets
non liants de la base de Lewis viennent combler les lacunes des couches de valence des acides de Lewis.
ex: NH3 + AlCl3 →NH3+ -AlCl3.
3. Equilibres de dissociation, sa constante et le degré d’ionisation
La dissociation peut être totale ou partielle selon le cas des électrolytes (forts ex : HCl ou faibles
ex : CH3COOH).
Pour les électrolytes faibles, il y a toujours un équilibre de dissociation qui est caractérisé par une
constante d’équilibre ou constante de dissociation (d’ionisation) K.
K
A H O 

3

HA  H 2O  H3O  A HAH 2O


Ex : l’acide acétique : K 
CH COO H O 
3

3

CH 3COOH H 2O

*Le coefficient de dissociation ou le degré d’ionisation α : qui caractérise le degré de la force de
l’électrolyte et par définition :
α = nombre de moles dissociés/ nombre de moles initiales tel que : 0    1
Ex :
CH3COOH  H 2O  CH3COO  H3O
t=0 C 0 0
t=teq C- αC αC αC
K
CH COO H O  
3

3

 2C 2
 K H 2O 
 2C 2
K
CH 3COOH H 2O C (1   )H 2O C (1   )

Car K [H2O]=constante=K
 2C
K C’est la loi de dilution d’Ostwald.
(1   )
Donc :
  1,   1 , K   électrolyte fort
  0, K  0 non électrolyte « pas de dissociation »
0   1 électrolyte faible dissolution partielle
Une augmentation de K Une production importante des ions
4. La force des acides et des bases

- Cette force est liée directement à leurs constantes de dissociation.
a) Constante d’acidité Ka et pKa
On définit alors la constante d'acidité :

Ka = (A-) (H3O+)/(AH)
Un couple acide-base est caractérisé par la valeur de pKa. On définit pKa par : pKa = - logKa
b) Constante de basicité Kb et pKb

Alors que l'équilibre suivant définit une constante de basicité :
Kb = (AH) (OH-)/(A-) Mais le produit Ka.Kb = Ke=10-14 et pKe=14 = pKa + pKb et pKb=-logKb
La définition d'une constante de basicité Kb est donc inutile. On utilise donc uniquement les
constantes d'acidité Ka.
5. Calcul de pH des solutions aqueuses acides et bases

Données :
● Concentration de l'acide ou de la base
● Constante d'équilibre du couple acide-base
● Produit ionique de l'eau Ke
● Activité de l'eau : aH2O = [H2O] = 1
Inconnues :
● Les concentrations de toutes les espèces dissoutes : [AH], [A-], [H3O+] et [OH-]
Deux de ces inconnues sont liées par la relation Ke. Donc si on connaît l'une on connaît forcément
l'autre. Cela réduit donc le nombre d'inconnues à 3.
Relations (autres que Ke) :
● Concentration de l'acide ou de la base C = [AH] + [A-] (acide) ou C = [BH+] + [B] (base)
● Constante d'équilibre du couple acide-base :
KA = [H3O+][A-]/[AH] ou KA = [H3O+][B]/[BH+]
Electroneutralité :
[H+] = [A-] + [OH-] ou [BH+] + [H+] = [OH-]
On a donc 3 relations et 3 inconnues. Pour résoudre cela il nous faut donc utiliser une équation du
3ème degré.
L'équation est la suivante :
a[H3O+]3 + b[H3O+]² + c[H3O+] + d = 0

Comme il est difficile de résoudre ce genre d'équations, on va l'approximer par une équation du 1er
degré ou une équation du 2nd degré (selon les cas).
pH d’un acide fort pH = - log C
pH d’un acide faible pH = 1/2(pKa – log C0)
pH d’une base fort pH = log C + 14
pH d’une base faible pH = 1/2(14+pKa + log C0)
pH d’un acide et de sa base

conjuguée (* couples pH = pKa + log (Cb/Ca)= pKa + log ([base]/[acide])
ampholytes)
6. Titrage acide –base

- Les titrages (ou dosage) acide-base sont une des techniques les plus utilisées de la chimie
analytique. Le problème consiste à déterminer la quantité d’acide dans une solution en y
ajoutant une quantité équivalente d’une base, ou vice-versa.
- Le point d’équivalence sera atteint lorsqu’on aura ajouté autant d’équivalents de base qu’il
y avait d’équivalents d’acide initialement.
- Lors d’un titrage acide-base, on détecte la fin de la réaction de neutralisation (point
d’équivalence) en mesurant le pH à l’aide d’un pH-mètre ou en employant un indicateur
coloré qui change de couleur dans une zone de pH donnée.
- Un indicateur est un acide faible dont la forme acide HIn est caractérisée par une couleur
différente de celle de sa base conjuguée In–.
- Le point de virage de l’indicateur est le pH auquel les concentrations des deux formes HIn
et In– sont égales :
Ex : bleu de bromothymol, pKa = 6,8

Choix d’un indicateur : Un indicateur acide-base doit être choisi de sorte que son point de virage
soit proche du pH du point d’équivalence du titrage.
Tableau 1. Principaux indicateurs et leurs zones de virage
Il existe aussi un grand nombre d’indicateurs acide-base naturels. Ces composés sont souvent des
molécules de la classe des anthocyanines et sont responsables de la couleur rouge ou bleue de
certains végétaux (hortensia, coquelicot, chou rouge, bleuet, ...).
7. Courbes de neutralisation
- Pratiquement, nous avons deux manières de réaliser un titrage acide-base :
o Soit on fixe le volume d’un acide et on fait varier le volume de la base (figure 6 a).
o Soit on fixe le volume d’une base et on fait varier le volume de l’acide (figure 6 b).
(a) Un acide fort par une base forte (NaOH (b) Une base forte par un acide fort (HCl
ajouté à HCl) ajouté à NaOH)
Figure 6. Courbes de titration acido-basiques (NaOH avec HCl)
- Nous distinguons 4 cas (figure 7):

o Titrage d’un acide fort avec une base forte (AF-BF) → sel neutre

o Titrage d’un acide fort avec une base faible (AF-Bf) → sel acide faible
o Titrage d’un acide faible avec une base forte (Af-BF) → sel base faible
o Titrage d’un acide faible avec une base faible (Af-Bf) → sel dépend de la force de la
base ou l’acide. (Ce titrage très difficile à réaliser.) et on cite aussi d’autres cas :
o Titrage d’un diacide ou triacide – base forte ;
o Titrage d’un diacide ou triacide – base faible.
1. Titrage d'un acide fort par une base forte:
2. Titrage d'un acide faible par une base forte

3. Titrage d'une base faible par un acide fort
Figure 7. Courbes de titration
III. Solutions tampons

Les solutions tampons, formées par une solution du mélange d’un acide faible et de sa base
conjuguée, sont appelées ainsi parce que leur pH est relativement insensible à de petites variations
de la concentration en acide ou en base ou à la dilution.
1. Mesure (Calcul) de pH
Le même pH d’un acide et de sa base conjuguée : pH = pKa + log (Cb/Ca)= pKa + log
([base]/[acide])
1. Importance des solutions tampons
Ces solutions sont très importantes du point de vue pratique dans des applications en chimie et
biologie où l’on désire maintenir le pH à une valeur constante au cours d’une réaction.
Exemple : le sang pH=7,4 à 37°C, la salive pH entre 6,5 et 7,5 (contient l’alpha amylase), les sucs
gastriques (enzymes comme peptase) de pH =1,5.
Les solutions tampons utilisées en milieux biologiques sont généralement les phosphates, les
protéines et les carbonates.

Un couple acide-base conjuguée ne permet pas de réaliser des solutions tampons de n’importe
quelle valeur du pH. L’effet tampon est en effet maximum pour pH = pKa.
Exemple : Ajoutons 0.1 mol de HCl à 1 litre d’eau pure. Le pH initial est de 7.00.
Après addition du HCl, le pH est de 1. Le pH varie de 6 unités.
Ajoutons maintenant 0.1 mol de HCl à une solution tampon contenant 1 M en acide acétique et 1 M
en acétate de sodium. Le pH initial de la solution est pHinitial = pKa – log ([acide]/[base]) = 4.75 – log
(1/1) = 4.75.
Le HCl ajouté réagit avec la base CH3COO– et redonne de l’acide acétique non dissocié: [base] = 1 –
0.1 = 0.9, [acide] = 1 + 0.1 = 1.1
Le nouveau pH sera : pH = pKa – log (1.1 / 0.9) = 4.75 – 0.09 = 4.66
Le pH n’aura varié que de 0.09 unité.
Le tableau 2 représente les structures et pKa de quelques solutions tampons.
Tableau 2. Structures et pKa de quelques solutions tampons
Composé Structure pKa1 pKa 2 pKa 3
Acide acétique CH3COOH 4.76

Chlorure d’ammonium NH4Cl 9.3
Acide carbonique H2CO3 6.4 10.3
Acide citrique C6H8O7 3.1 4.7 5.4
Diéthanolamine C4H11NO2 9.5
Acide fumarique C4H4O4 3.0 4.5
Tris (hydroxy-méthyl-
C4H11NO3 8
aminométhane)
Acide phosphorique H3PO4 2.1 7.2 12.3
2. Préparation des solutions tampons
Ex1: comment préparer une solution tampon de carbonate à pH=7.4 ?
Acide carbonique et son sel ou sa base (HCO-3 ou CO- -3). (Sel quand il est lié à un Na+)
pH = pKa + log (Cb/Ca)= pKa + log ([base]/[acide])
Le choix est :
H2CO3, HCO3-Na+ pKa1=6.4
HCO3-Na+, CO3- - 2Na+ pKa2= 10.3
H2CO3 , CO3- - 2Na+
Selon le pH demandé, on va choisir le couple approprié qui est H2CO3, HCO3-Na+ avec un pKa1=6.4
(le plus proche de 7.4)

pH  pKa  log
HCO   7.4  6.4  log HCO   log HCO   1  HCO   10  HCO   10H CO 

3

3

3

3 
H 2CO3  H 2CO3  H 2CO3  H 2CO3  3 2 3
Ex2: calculer le pH d’une solution mélange de 5 ml d’acétate de sodium à 0.1 M et 4 ml d’une

solution d’acide acétique à 0.1 M.
pH  pKa  log
CH COO 
3

CH 3COOH 
Calculant les concentrations de CH3COOH, CH3COO-
CH COO   CV
3
V
 n 5 * 0.1
 
V 9
 5.10 2
M;
t t
CH 3COOH   4 * 0.1  5.10 2 M

9
5 *10 2
pH  4.76  log  pH  4.85
4 *10 2
Quel est la variation du pH de cette solution HCl 0.1M (après l’ajout d’1 ml) ; solution d’HCl apporte
des ions H3O+ qui réagissent avec les ions CH3COO-.
CH3COO  H3O  CH3COOH [CH3COOH]↗ [CH3COO-]↘
Calculant les nouvelles concentrations :
CH COO   CV
3
V
 n 5 * 0.1 1* 0.1
 
V 10

10
 4.10 2
M;
t t
CH 3COOH   4 * 0.1  1* 0.1  5.10 2 M La variation de pH=∆pH=0.19~0.2

10 10
2
4 *10
pH  4.76  log  pH  4.66
5 *10 2

Université AMAR TELIDJI-LAGHOUAT-ALGERIE
Département de Biologie- TD TAB-
Série n°1: Acides et Bases

Acides et bases, neutralisation et calculs des concentrations des espèces
chimiques
Exercice 1 : QCM
1. Le Ka d'un acide est 8.10-3. 2. Le pKa d'un acide est 9,4. 3. Pour H2S:
Son pKa vaut : Son Ka vaut : A) Ka1 < Ka2 B) Ka1 = Ka2
A) 2,1 B) 8 C) 3 A) 109.4 B) 4.10-10 C) 9,4.10- C) Ka1 > Ka2
10
4. Une base est d'autant plus 5. Si pKa1 < pKa2, 6. La constante d'hydrolyse
forte : A) l'acide A1 est plus fort que d'un sel tel que Na2CO3 est :
A) qu'elle réagit rapidement l'acide A2 A) inversement proportionnelle
avec un acide B) l'acide A1 est plus faible que au Ka de l'acide dont il provient
B) qu'elle est la plus l'acide A2 B) proportionnelle au Ka de
concentrée C) les acides A1 et A2 sont de l'acide dont il provient
C) que son coefficient de force moyenne C) proportionnelle au Ka de cet
dissociation dans l'eau est acide
élevé
D) que l'acide conjugué est fort
7. Selon Brönsted, une base 8. Lequel de ces acides est le 9. Dans la théorie de
est d'autant plus forte : plus fort en solution aqueuse Brönsted, un acide est un :
A) qu'elle peut capter un plus ? A) donneur de proton(s)
grand nombre de protons A) HF, Ka = 6,7.10-4 B) capteur de proton(s)
B) que son acide conjugué est B) CH3COOH, Ka = 1,8.10-5 C) donneur ou capteur de
fort C) HPO4-, Ka = 4,4.10-13 proton(s) selon le cas.
C) que son acide conjugué est D) HNO2, Ka = 5,1.10-4
faible E) H2S, Ka = 1,0.10-7
10. Dans la théorie de 11. Dans le système en 12. Une solution de carbonate
Brönsted, l'ion HSO3- est : équilibre NH4+ + H2O ↔ NH3 de sodium Na2CO3 est
A) un acide B) une base + H3O+, l'ion NH4+ est : A) acide B) basique C) neutre
A) un acide B) une base C)
neutre
Exercice 2 : Acide fort et mélange des acides forts

L’acide nitrique est un acide fort (HNO3). On dissout dans un litre de solution aqueuse 1,26 g d’une
solution commerciale d’acide nitrique à 50% (richesse en masse). Soit S1 la solution obtenue.
1. Calculer la concentration en acide nitrique de la solution S1.

2. Faites l’inventaire de toutes les espèces présentes dans S1 et calculer leurs concentrations
molaires.
3. Donner la valeur du pH de la solution aqueuse S1.
On dilue la solution S1 précédente au dixième dans une fiole jaugée de 200,0 mL. On obtient la
solution S2.
1. Quel volume de solution S1 doit-on prélever ? Quelle verrerie doit-on utiliser ?
2. Quel est le pH de la solution S2 ?
Calculer le pH de la solution obtenue en mélangeant 2 litres d’acide chlorhydrique à 0,05 mol/L et 3
litres d’acide nitrique à 0,15 mol/L.
Exercice 3 : Acide faible
Toutes les solutions sont à 25°C. Le produit ionique de l’eau est Ke= 10-14.
Une solution d’acide propanoïque de concentration C1= 0, 330 mol.L-1 a un pH égal à 2,7.
1. Calculer les concentrations molaires de toutes les espèces chimiques contenues dans cette
solution.
2. En déduire le pKa du couple CH3CH2COOH/ CH3CH2COO-.
3. Définir et calculer le coefficient de dissociation de l’acide propanoïque de cette solution.
On dispose d’une solution d’acide éthanoïque dont le pKa de cet acide est de 4.75 et sa
concentration C2=0.075 mol/l.
1. Quel est le pH de la solution ?
2. Calculer les concentrations molaires de toutes les espèces chimiques contenues dans cette
solution.
3. quelle est son degré de dissociation α ?
Comparer la force de ces deux acides.
Exercice 4 : Base faible et base forte

On dispose d’une solution aqueuse d’ammoniaque. Le pKa du couple NH4+/NH3 est égal à 9.25 à
25°C. le pH de la solution vaut 10.85.
1. Quelles sont les concentrations, exprimées en mol/l de toutes les espèces dissoutes ?
2. Quelle est la concentration C de la solution ?
3. Quel est le degré de protonation a de l’ammoniaque
On mélange n volume V1 égal à 100 ml d’une solution aqueuse d’hydroxyde de sodium de
concentration C1 = 0.001 mol/l avec un volume V2 = 50 ml d’une solution aqueuse d’ammoniaque
de concentration C2 =0.01 mol/l.
1. Quel est le pH de chacune des solutions avant mélange ?
2. Quel est le pH de la solution obtenue après mélange ? quelle est sa composition, exprimée
en mol/l, en chacune des espèces dissoutes ?

Exercice 5: Dosage Acide fort- Base forte
On dispose d’une solution aqueuse d’acide chlorhydrique de volume V=100ml et de
concentration=0.08mol/l.
1. Calculer les valeurs des pH en fonction de V, ml par ml, V désignant le volume de solution
aqueuse d’hydroxyde de sodium de concentration égale à 0.2 mol/l qu’on verse dans la
solution. On calculera notamment des les pH pour les valeurs caractéristiques V=0, V=0.5
Ve, V=Ve, V=2Ve.
2. Tracer la courbe de dosage pH=f (V).
3. Calculer la masse m de sel, dont on donnera la formule chimique, qu’on peut recueillir à
V=Ve, lorsqu’on laisse évaporer l’eau résiduelle.
Exercice 6: Dosage Acide fort- Base faible

On dispose d’une solution aqueuse d’ammoniaque de concentration =0.08mol/l et de volume V =
100 ml.
1. Calculer les valeurs, ml par ml, des pH de la courbe pH= f (V) lorsqu’on verse un volume V
d’une solution d’acide chlorhydrique de concentration =0.2 mol/l. On calculera notamment
des les pH pour les valeurs caractéristiques V=0, V=0.5 Ve, V=Ve, V=2Ve.
2. Tracer la courbe pH= f (V).
3. Quelle masse m en sel, dont on donnera la formule, peut-on espérer recueillir lorsqu’on
aura évaporé l’eau et qu’on se situera à l’équivalence ?
Exercice 7 : Dosage d’une solution d’acide propanoïque (acide faible-base forte)

Dans un volume Va = 50,0 mL d’une solution A d’acide propanoïque de concentration molaire Ca =
0,20 mol.L-1, on ajoute progressivement une solution B d’hydroxyde de sodium de concentration Cb
= 0,10 mol/L.
1. Étude de la solution A
1.1. Écrire l’équation de la réaction de l’acide propanoïque avec l’eau.
1.2. Calculer le pH de la solution d’acide propanoïque. Toutes les relations utilisées seront justifiées.
2. Étude de la solution à l’équivalence du dosage.
2.1. Écrire l’équation de la réaction de dosage.
2.2. Indiquer si la solution obtenue à l’équivalence est acide, basique ou neutre. La réponse est à
justifier sans calcul.
2.3. Calculer le volume Ve de solution B d’hydroxyde de sodium versé pour atteindre l’équivalence.
3. Étude de la solution S obtenue à la demi-équivalence du dosage.
3.1. Faire l’inventaire des espèces chimiques majoritaires présentes dans la solution S.
3.2. Écrire la relation entre [C2H5COO-] et [C2H5COOH], dans la solution S, sans tenir compte de la
réaction de ces espèces avec l’eau ; en déduire le pH de la solution S.

3.3. Préciser le nom et les propriétés de cette solution.
3.4. Il est possible de réaliser une solution de même pH que la solution S en mélangeant deux
solutions parmi celles proposées dans le tableau ci-dessous, en utilisant les concentrations et les
volumes indiqués.
Indiquer le mélange à effectuer, en justifiant la réponse par un calcul de quantité de matière.

Données (à 25 °C)
Produit ionique de l’eau : pKe = 14,0
Constante d’acidité du couple C2H5COOH/C2H5COO-: pKa = 4,9.
Exercice 8: Dosage d’une solution d’acide phosphorique (polyacide-base forte)

1. L’acide phosphorique H3PO4 est un triacide. Les forces de chacune de ses acidités sont
suffisamment différentes pour qu’on puisse les doser séparément. On considère une solution (S) de
cet acide.
1.1. Placer sur un axe gradué en unité de pH de 0 à 14 les espèces prédominantes de cet acide.
1.2. Le pH de la solution (S) est de 2,1.
1.2.1. Indiquer les espèces majoritaires issues de l'acide phosphorique dans (S) ; justifier la
réponse.
1.2.2. Donner, sans aucun calcul, le coefficient de dissociation de l'acide phosphorique dans (S).
2. On procède au dosage de la solution (S) par une solution d'hydroxyde de sodium (soude).
On relève les valeurs du pH de la solution en fonction du volume de soude versé.
La courbe de dosage comporte deux sauts de pH correspondant aux deux équivalences E1
(V1, pH1) et E2 (V2, pH2).
2.1. Étude de la première équivalence.
2.1.1. Indiquer l'espèce majoritaire qui impose le pH à la première équivalence E1.
2.1.2. Expliquer pourquoi cette espèce est un ampholyte en écrivant les équations de ses réactions
avec l’eau.
2.1.3. Sans justifier, donner l’expression littérale du pH à la première équivalence E1, puis calculer
pH1, valeur du pH à l'équivalence E1.
2.2. Étude de la deuxième équivalence.
2.2.1. Écrire l’équation de la réaction de dosage entre E1 et E2.
2.2.2. Calculer la constante KR de cette réaction ; commenter le résultat.
2.2.3. Indiquer l'espèce majoritaire qui impose le pH à la deuxième équivalence E2.
2.2.4. Sans justifier, donner l’expression littérale du pH à la deuxième équivalence E2, puis calculer
pH2, valeur du pH à l'équivalence E2.
2.3. Étude de la réaction de dosage après la deuxième équivalence.
2.3.1. Écrire l’équation de la réaction de dosage après la deuxième équivalence
2.3.2. Calculer la constante KR de cette réaction ; commenter le résultat.
2.3.3. Indiquer quelle est la conséquence de ce résultat sur la courbe tracée.
Données (à 25 °C)
pK1 (H3PO4 /H2PO4-) = 2,1
pK2 (H2PO4-/ HPO42-) = 7,2
pK3 (HPO42-/ PO43-) = 12,4
Produit ionique de l’eau à 25 °C : pKe = 14,0
2. Solutions tampons
Exercice 1 :
* Calculer le pH de la solution obtenue par dissolution dans 500 mL d’eau déminéralisée de :
- 0,60 g de dihydrogénophosphate de sodium (M= 119,98 g/mol)
- 1,42 g d’hydrogénophopshate de disodium (M= 141,96 g/mol)
Données : pKa (dihydrogénophosphate/ hydrogénophophate) = 7,2
* Calculer le pH du mélange suivant :
-V1 =200 mL d’une solution d’ammoniaque de concentration C1=0,020 mol/L.
-V1 =400 mL d’une solution de chlorure d’ammonium de concentration C2=0,015 mol/L.
Données : pKa(NH4+/NH3) = 9,2
Exercice 2 :
Données (à 25 °C) ; pKa du couple NH4+/NH3 : 9,2
Masse molaire du chlorure d’ammonium, NH4Cl : M = 53,5 g.mol-1
Produit ionique de l’eau : Ke = 1,0.10-14
1. Indiquer les propriétés d’une solution tampon.
2. Écrire les équations des réactions de l’ammoniac et de l’ion ammonium avec l’eau.
3. Calculer la valeur du rapport des concentrations [NH3]/[NH4+] dans le mélange tampon lorsque le
pH est égal à 10,0.
4. Déterminer la masse de chlorure d’ammonium NH4Cl à dissoudre, sans variation notable de
volume, dans un litre de solution d’ammoniac à 2,00 mol/L pour réaliser une solution tampon de
pH = 10,0. Justifier les éventuelles approximations.
5. La solution tampon ainsi préparée est utilisée pour réaliser un dosage complexométrique à un pH
voisin de 10.
Le bécher de dosage contient initialement 80,0 mL de la solution tampon précédente et la prise
d’essai à doser ; à l’équivalence du dosage complexométrique, le volume dans le bécher est de 100
mL. La réaction de dosage a alors libéré 2,0×10-3 mole d’ions H3O+.

1. Écrire l’équation de la réaction des ions H3O+ avec la solution tampon ; montrer qu’elle est
pratiquement totale.
2. Déterminer alors les concentrations en NH3 et en NH4+ à l’équivalence du dosage
complexométrique.
3. Calculer, à l’équivalence du dosage complexométrique, la nouvelle valeur du pH.
Commenter le résultat en faisant apparaître le rôle de la solution tampon.

Chapitre II : Spectroscopie

I. Introduction générale
1. Historique
- Spectre : n.m. (lat. Spectrum, de spectare, regarder, v. 1570) ; Ensemble de rayons colorés
résultant de la décomposition d’une lumière complexe : le spectre solaire comprend les
couleurs de l’arc-en-ciel.
- L'anglais Isaac Newton (1642-1726), en faisant passer la lumière solaire à travers un prisme
de verre, montre en 1666 que la lumière blanche est composée de couleurs élémentaires,
chaque couleur étant déviée d'une quantité différente. C'est le phénomène de la réfraction.
- L'anglais William Herschel (1738-1822), d'origine allemande, montre en 1880 l'existence
d'un rayonnement au-delà du rouge, découvrant ainsi l'existence des infra-rouges.
- L'allemand R.W. Ritter (1776-1810) découvre l'existence du rayonnement ultra-violet par
une méthode qui a précédé de 38 ans la découverte de la photographie avec des sels
d'argent par le français Louis Jacques Daguerre.
- L'anglais Thomas Young (1773-1829) met en évidence l'aspect ondulatoire de la lumière et
mesure le premier avec précision les longueurs d'onde avec un réseau de diffraction.
Chaque couleur pure est caractérisée par sa longueur d'onde propre.
- Newton avait toujours été réticent à une interprétation ondulatoire de la lumière, préférant
penser en termes de "corpuscules." En vérité, la lumière est un rayonnement
électromagnétique qui présente à la fois des caractéristiques d'onde et de particules (sans
masse, appelés les photons).
- L'allemand Joseph Fraunhofer (1787-1826) observe, décrit et dessine en 1814 le spectre du
Soleil. Il fut le premier à étudier en 1823 le spectre des planètes et des étoiles les plus
brillantes.
- L'allemand Gustav Kirchhoff (1824-1887) avec l'aide de Robert Bunsen (1811-1899)
découvre les lois du rayonnement qui portent son nom.
- Les anglais John Herschel (1792-1871) et W. Fox Talbot (1800-1877) suggèrent pour la
première fois d'utiliser la spectroscopie pour l'analyse chimique des substances.
- J. Herschel et les français Hippolyte Fizeau (1819-1896) et Léon Foucault (1819-1868)
étudient le spectre infrarouge du Soleil.
2. La spectroscopie
- La spectroscopie, ou spectrométrie, est l'étude expérimentale du spectre d'un phénomène
physique.
- C’est la translation de la chimie quantique « une science théorique » à une science
expérimentale.
- Est une interaction matière-onde électromagnétique.
- La spectroscopie est de deux types :
 Spectroscopie atomique : est l’absorption atomique.

 Spectroscopie moléculaire : plusieurs types ex :
 Spectroscopie infrarouge et Raman (IRL) : spectro de rotation et vibrations
 Spectroscopie visible et ultraviolet et fluorimétrie : spectro de transitions
électroniques
 Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
 Spectrométrie de masse (SM) : bombardement de matière par une énergie
électronique.
 Spectroscopie X………………. etc
3. Onde électromagnétique
- La lumière est une radiation électromagnétique qui possède :
• une composante électrique E (champ)
• et une composante magnétique B (champ)
- Ces composantes oscillent à la fréquence ν pour des photons (Le photon est la particule
qui compose les ondes électromagnétiques, des ondes radio aux rayons gamma en passant
par la lumière visible) d’énergie hν ; L’énergie est reliée à la longueur d’onde λ.
Les 2 champs se propagent comme fonction
sinusoïdale.
E : l’énergie en Joules
h : constante de Planck, 6.63 10-34 J.s
c : vitesse (célérité) de la lumière= 2.998 108 m.s-1
ν : fréquence
: nombre d’onde
λ:Longueur d’onde
- Une radiation peut-être caractérisée par:
Longueur d’onde (λ en nm): Répétition dans l’espace, distance
entre 2 sommets « max et min », 2 points successives dans le
même sens.
Période (T en s) : le temps nécessaire à une longueur d’onde.
Pour V=C=3.108 m/s donc λ =T.V=T.C
Fréquence (en Hz=s-1): Répétition dans le temps, le nombre de
tours par unité de temps : ν=1/T.
Nombre d’onde ( en cm-1): nombre de longueurs d’ondes dans 1

cm. =1/λ = ν/C
4. Le spectre électromagnétique
- C’est le résultat de l’interaction matière-one électromagnétique (figure 8).

- Le spectre est une représentation graphique liant l’intensité du rayonnement et ν, et
l’interprétation de ce spectre donne des informations sur la matière.
- Le spectre électromagnétique est représenté sous forme de zones (régions) selon longueur
d’onde et l’énergie λ, E.
Figure 8. Spectre électromagnétique
5. Appareillage général
Source lumineuse
Cellule (porte échantillon)
Elément de dispersion (prisme), monochromateur
Détecteur (enregistreur, affichage…..)
6. Modes d’interactions physiques de la matière avec l’énergie

- Interaction avec une radiation électromagnétique:
On mesure l’énergie absorbée ou émise, les variations d’énergie sont interprétées en fonction de
la structure moléculaire du composé analysé.
* Dans le premier cas il s’agit d’une technique d’absorption (RMN, IR, UV..) ;

* Dans le second cas, c’est la technique d’émission (luminescence ou fluorescence et
phosphorescence).
- Interaction avec des électrons:
La molécule est fragmentée en ions, l’interprétation des fragments permet de remonter dans
certains cas à la structure moléculaire. Cette technique est dite la spectroscopie de masse.
7. L’absorption de radiations par une molécule

- L’énergie E0 d’une molécule est égale : E0= Ee + Ev + Er ; Ee>> Ev >> Er
Ee : énergie électronique dépend du nombre d’électrons et de la forme de la molécule
Ev : énergie vibrationnelle dépend de la nature des noyaux et de leurs arrangements
Er : énergie rotationnelle dépend de la structure de la molécule
- L’absorption d’une radiation par une molécule provoque une modification de son énergie.
- En fonction de la nature de la radiation (c’est à dire de sa longueur d’onde λ), Ee, Ev ou Er
sera modifiée. Après absorption de la radiation, la molécule a pour énergie :
E1 = E0 + hν
*A chaque domaine de fréquence correspond un
type de changement d’état pour la molécule.
*L’absorption d’une radiation UV ou visible (très
énergétique) va modifier la configuration
électronique de la molécule : transition
électronique.
*L’absorption d’une radiation infrarouge modifie
l’état énergétique e vibration : transitions
vibrationnelles.
*Pour un niveau électronique, il existe plusieurs
niveaux vibrationnels proches.
*Ces niveaux vibrationnels sont divisés en niveaux
rotationnels encore plus proches.
Remarques :
- Dans la spectroscopie, on peut remarquer 2 phénomènes :
 Une spectroscopie d’émission « SE » où la matière donne (fournie) une énergie sous
forme des radiations électromagnétiques.
 Une spectroscopie d’absorption « SA » où la matière absorbe des ondes
électromagnétique et c’est la plus répandue (utilisée).
- La durée de vie dans un état excité est très petite, donc le retour de la matière à son état
fondamental est nécessaire.

II. Spectroscopie UV-visible
1. Introduction
- Lorsqu’une molécule (ou atome) est irradiée par de la lumière ultraviolette ou visible, elle
peut subir une transition électronique des électrons de valence (électrons de la couche
externe) au cours de laquelle un électron est excité et monte de l’état fondamental à un état
excité.
- Le domaine UV-visible appartient au spectre électromagnétique, il est étalé de 10 nm-800
nm tel que :
10-200 nm : UV lointain : pas de pratique (nécessite sous vide pour faire l’analyse)
200-400 nm : UV proche : c’est le domaine utilisé.
400-800 nm : visible (les 7 couleurs)
2. Electrons de valence
- Sont les électrons de la dernière couche dans l’atome (ou molécule). Exemples :
11 Na : 1S 2 2S 2 2 P 6 3S 1
Atomes : 19 K : ....................4S 1
13 Al : ....................3S 2 3P1
Molécules : butane : C4H10 n’absorbe pas dans l’UV
MeOH : CH3OH absorbe dans l’UV.
Eau : H2O absorbe dans l’UV.
Ethylène : H2C=CH2 absorbe dans l’UV.
3. Les transitions électroniques
- Chaque électron dans l’atome est caractérisé par 2 :
 Energie (niveau)
 Une orbitale atomique
- Dans la molécule, chaque électron est caractérisé par :
 Energie (niveau)
 Une orbitale moléculaire
- L’orbital moléculaire est le résultat de la combinaison (l’union) de 2 orbitales atomiques.
- Une transition d’un électron grâce à une énergie d’une orbitale moléculaire liante (état
fondamentale) à une orbitale moléculaire non liante (état excité) nous permet d’identifier 4
types de transitions électroniques (tableau 3):
 *
 *
n *
n *
On peut classer les énergies par ordre décroissant :

Et l’inverse pour la longueur d’onde λ.
Tableau 3. Différents transitions électroniques
Transitions Longueur
Exemples de structures
électroniques d’onde λ
  * λ<160nm (UVL) Hydrocarbures saturés : alcanes : C5, C6, C7, C8….
Caractéristique des composés saturé + un hétéro-

n  * 160<λ<180nm
atome : O, S, N, P, X « halogène »
Caractéristique des composés insaturés : C=C, C=C
 * λ>200nm
(triple liaison)
Caractéristique des composés insaturés + un hétéro-
n * >200nm
atome : O, S, N, P, X « halogène » : C=O, C=N, C=N, C=S.
Conjugaison des
conjugaison↗ λ↗ Ex ; éthylène -C=C-, butadiène -C=C-C=C-.
doubles liaisons
Dans le visible, les
transitions Ainsi, les métaux de transition qui possèdent des
électroniques mises (350-750 nm) électrons d peuvent être étudiés dans cette zone
en jeu sont également spectrale.
de type d → d*.
4. Appareillage
Pour obtenir un spectre d’absorption d’une molécule, il faut:
- Créer un rayonnement → une source rayonnement
- Sélectionner une longueur d’onde → un monochromateur et son optique associé
- Mesurer l’absorption du rayonnement→ un détecteur de signal
- Mise en forme du signal → un analyseur

4.1. Les Mono-faisceaux
La source lumineuse: -dans le visible (350-
750 nm): lampe à
incandescence à
filament de tungstène
-dans l’ultraviolet: tube
à décharge rempli
d’hydrogène ou de
deutérium
Le monochromateur: sélecteur de bande

La cuve: en plastique lorsqu’on
travaille dans l’eau ou
l’éthanol, sinon en
quartz -2 faces planes
dépolies et 2 faces
transparentes pour le
passage de la lumière
Un Est un récepteur.
photomultiplicateur Est composé d’un
Le système de mesure et lecteur digital, d’une
d’enregistrement imprimante et de
l’enregistreur.
4.2. Les Doubles faisceaux

Différences entre un appareil mono-
faisceau et un appareil double-
faisceau:
2 cuves: une pour l’échantillon à
analyser, une pour la référence(ou
blanc). La référence est généralement
le solvant de l’échantillon.
Le faisceau lumineux issu de la source
est alternativement dirigé, en
fonction de la position des miroirs,
vers la cuve contenant la référence,
puis celle de l’échantillon.
Le récepteur mesure directement
l’absorbance de l’échantillon

 Comparaison entre mono faisceau et double faisceau
Type d’appareil avantages inconvénients
mono faisceau -peu onéreux -pas de blanc au même temps
-simple d’utilisation avec l’échantillon.
-idéalement adapté pour des
études quantitatives
-appareil portatif
double faisceau il peut
-réaliser des spectres sur - plus complexe
l’ensemble de la gamme - cher
spectrale: mode qualitatif. - généralement non portatif
-lire l’absorbance à une
longueur d’onde donnée: mode
quantitatif
-soustraire l’absorbance
résiduelle du solvant.
5. Applications analytiques
5.1. Analyse quantitative
5.1.1. La loi de Beer-Lambert
C’est la loi de Beer-Lambert qui fournit une relation quantitative entre I0 et I.

La transmittance « T » : Pour une substance donnée, à une longueur d’onde donnée, on a:
𝑰
𝑻=𝑰 <𝟏
𝟎
Si T=1, I=I0 → la substance n’absorbe pas à cette longueur d’onde.

Si T proche de 0, I<<I0 → la substance absorbe fortement à cette longueur d’onde.
L’absorbance « A » :
𝑰𝟎
𝑨 = −𝒍𝒐𝒈𝑻 = 𝒍𝒐𝒈 → 𝒍𝒂 𝒍𝒐𝒊 𝒅𝒆 𝑩𝒆𝒆𝒓 − 𝑳𝒂𝒎𝒃𝒆𝒓𝒕: 𝑨 = 𝜺 𝒍 𝑪
𝑰
Avec : A : absorbance ou D.O : densité optique
ε : coefficient d’extinction molaire en L.mol-1.cm-1 ou a : coefficient d’extinction en L.g-1.cm-1.
l : largeur de la cuve en cm ; C : concentration en mol/l ou en g/l.

L’absorbance est donc proportionnelle à la quantité de substance traversée. Les absorbances sont
additives. Pour un mélange comprenant n composés on lira :
5.1.2. Limite de la validité de la loi de Beer-Lambert

 Le rayonnement incident doit être monochromatique
 Le milieu traversé doit être homogène et limpide (ou solution)
 Les solutions doivent être diluées et de prendre en considération le coefficient de dilution
dans les calculs ;
 Pour des mesures précises, l’absorbance ne doit pas excéder 1 (0.1<A<0.9), et elle doit être
fixe (pas de fluctuation).
5.1.3. Méthode de dosage quantitative :
5.1.3.1. Directe
i/ Méthode de comparaison
On veut déterminer la quantité d’un composé X qui est connu :
- Le choix de λ est : de la littérature ou réaliser un spectre UV-visible du composé (analyse
qualitative).
- Préparation d’une solution étalon (standard, référence) du composé c’est-à-dire avec une
concentration bien déterminé.
- Mesure de l’absorbance de cette solution Aet à λmax .
- Dans les mêmes conditions, on mesure une absorbance du composé X : Ax à λmax.
Aet   etmax
 x .l.Cet Aet Cet A .C
-    Cx  x e
Ax   etmax
 x .l.C x
Ax Cx Ae
ii/ Méthode d’étalonnage
C’est une méthode utilisé pour déterminer la concentration d’une solution ou le coefficient
d’extinction et les étapes sont (figure 9) :
- Détermination du λmax
- Tracer une droite d’étalonnage
- Lire l’absorbance de l’échantillon à la même longueur d’onde que celle employée pour
effectuer la droite d’étalonnage.
- Reporter sur la droite d’étalonnage l’absorbance lue et déterminer la concentration de
l’échantillon.

Figure 9. Courbe d’étalonnage réalisée avec un standard
5.1.3.2. Indirecte (dosages absorptiométriques)

- La mesure de la variation de la densité optique d’une solution, au cours d’un dosage
volumétrique, permet de déterminer le point d’équivalence du dosage (voir TD).
5. 2. Analyse qualitative :
5.2.1. Le spectre pour déterminer λmax
- Une analyse qualitative en UV-visible est basée sur la réalisation d’un spectre (figure 10).
- Ce spectre est une représentation graphique de l’absorbance (A) ou la transmittance (T) en
fonction de la longueur d’onde et souvent elle est A=f (λ) (voir figure).
- Un spectre UV-visible négatif signifie que l’échantillon n’absorbe pas les radiations UV-
visible.
- L’échantillon qui ne contient pas des insaturations n’absorbe pas en UV-visible, pour le
doser il faut chercher des réactifs spectraux (spectrals reagents).
Figure 10. Spectre A=f(λ)
5.2.2. Les chromophores (voir tableau)

- C’est un nom grec signifie : porteur de couleurs.
- est une molécule colorée. ce terme désigne le groupement d'atomes au sein de cette
molécule qui est responsable de sa couleur.
- Plus précisément, un atome ou un groupement chimique responsable à l’absorbance (π→π*,
n→π*) ex : C=C, C=N, C=O, C=N (3 liaisons), NO2, F (lorsqu’il est lié à autre composé), cycle
benzénique

- Exemples des chromophores naturels : β-carotène.
- On peut distinguer des types de chromophores (spectraux) selon les modifications
effectuées pour l’absorbance (figure 11 et tableau 4):
- Modification de la longueur d’onde de la transition électronique
 Un décalage vers le rouge (λmax ↗), c’est à dire les énergies plus faibles est un effet
bathochrome.
 Un décalage vers le bleu (λmax ↘), c’est à dire les énergies plus élevées est un effet
hypsochrome.
- Modification du coefficient d’extension molaire donc de l’intensité
 Une diminution de ε est qualifiée d’effet hypochrome
 Une augmentation de ε est qualifiée d’effet hyperchrome
Figure 11. Les effets des chromophores
Tableau 4. Principaux chromophores
Coefficient
Transitions Longueur
Groupement chromophore d’extinction (ε
électroniques d’onde λ (nm)
en l.mol-1.cm-1)
Ethylène 170 15800
 *
Hexène-2 185 10000
Heptyne-1  * 184 2. 103
278 8
Ethanal n *
290 16
 *
279 15
Propanone n *
190 102

 *
Oxime de la
 * 190 5. 103
propanone
Azométhane n * 340 5
Butadiène  * 220 3.104
Benzène  * 255 102
Remarque :
Les facteurs qui influent la longueur d’onde et l’absorbance :

 L’influence de la conjugaison de l’insaturation : insaturation↗ => λ↗ ; A ↗
 L’influence de pH : pH ↗=> λ↗ ; A ↗, La tyrosine, par exemple, voit son maximum
d'absorption et son coefficient d'extinction molaire croitre lorsque le pH croît de 6 à 13.
 L’influence de la polarité du solvant : chromophore polaire dans des solvants polaires
=> λ↘, chromophore polaire dans un solvant apolaire => λ↗.

Tableau 5. Exemples de quelques spectres d’absorption UV des biomolécules :
Spectres d’absorption des nucléotides Spectres d’absorption de l’ADN
Spectre UV des protéines et des acides

Spectre UV des acides aminés
nucléiques
Spectre UV de la caféine Absorption des lipides en UV
Vitamine E absorbe à 225 nm

Les lipides absorbent généralement entre 200-
212 nm et les groupements responsables de
cette absorption sont : les doubles liaisons
(insaturations) et la fonction carbonyle C=O

Série n°2 : Spectroscopie UV-VISIBLE
Exercice 1 : QROC
1. Décrire les effets 2. Quelles sont les transitions 3. Est-ce que cette molécule
hypsochrome, bathochrome, électroniques dans cette absorbe dans l’UV et
hyperchrome et hypochrome. molécule : pourquoi ?
CH3-CHOH-CHO CH3-(CH2)2-CH=CH-(CH2)2-
COOH
4. Comment peut-on 5. Comment peut-on 6. citer un acide aminé qui
déterminer λmax d’un composé déterminer ξ d’un composé X ? absorbe à 280 nm.
X?
Exercice 2:
I. L’acétone est un composé de formule semi développée CH3-CO-CH3, et qui absorbe les radiations
électromagnétiques dans l’UV.
a. Expliquer pourquoi l’acétone absorbe dans l’UV ?
b. Quel est le groupement fonctionnel responsable à cette absorption ?
c. Quelles sont dans l’UV les transitions électroniques possibles que nous observons ? les classer
par ordre d’énergie d transition et d’intensité d’absorption.
d. Représenter le spectre théorique de l’acétone.
II. Dans une expérience pour le dosage de l’acétone dans les milieux biologiques, une courbe
d’étalonnage a été réalisée entre l’absorbance A et la concentration de l’acétone C en mg/l à une
longueur d’onde bien précise. La courbe est donnée ci après. Les solutions étalons de l’acétone sont
préparées dans l’hexane.
absorbance A
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 100 200 300 400 500
Concentration C en mg/l
a. Pourquoi le choix de l’hexane comme solvant ?

b. Calculer le coefficient d’extinction molaire de l’acétone. Déduire l’équation de Beer-
Lambert correspondante. On donne l=1cm.
c. Des échantillons de sang et d’urine pour des personnes saines et d’autres malades
par les composés cétoniques sont analysés. Les résultats trouvés sont résumés dans
le tableau suivant :

Absorbance (sang) Absorbance (Urine)
Personnes saines 0.068 0.097
Personnes malades 0.189 0.198
Calculer la concentration de l’acétone dans chaque échantillon. Discuter les résultats obtenus.
Exercice 3 : Méthode de dosage quantitative Indirecte (dosages absorptiométriques)

Les indicateurs colorées acido-basiques, appelés aussi molécules sondes de pH, sont des molécules
dont les propriétés spectroscopiques, en général l'absorption dans l'UV-visible, dépend du pH de la
solution. Elles présentent l’avantage d’être efficaces à des concentrations très faibles. Cette
technique est l'une des rares permettant une mesure de pH dans des volumes inférieurs au mm3 et
allant jusqu'au mm3. Dans toute la suite la largeur de la cuve est l = 1 cm et le solvant est l'eau. Une
solution de colorant de concentration C, absorbant à une longueur d'onde l avec un coefficient
d'absorption molaire e, est placé dans une cuve de longueur l à l'intérieur d'un spectromètre UV-
visible. A partir du rapport de l'intensité mesurée I sur l'intensité initiale I0, on peut déduire
l'absorbance A ou densité optique.
1) Quelle relation existe-t-il entre I, I0 et A ? Rappeler la loi de Beer-Lambert.
2) Une solution de concentration C=1.10-5 mol/L présente une absorbance de 0,02 dans une cuve de
trajet optique de 1 cm. Quel est le coefficient d'absorption molaire ξ de la molécule? Quel est son
unité ?
Sachant qu'il n'est pas possible de mesurer des absorbances supérieures à 2, quelle est la
concentration maximale que l'on puisse mesurer ? Commenter cette valeur.
3) Les dérivés du phénol sont utilisés comme sonde de pH grâce à leurs propriétés
spectroscopiques et acido-basiques. Quelle(s) caractéristique(s) possède(nt) les molécules qui
présentent une bande d'absorption dans l'UV-visible ?
Le p-nitrophénol est un acide faible. Son pKa, voisin de 7, peut être déterminé par dosage pH-
métrique et par dosage spectrophotométrique. La figure ci-dessous (figure 1) montre la courbe de
titrage (courbe a) de 10 mL d'une solution de p-nitrophénol de concentration 1.10-4 mol/L par la
soude 1.10-2 mol/L.
FIGURE 1

Les courbes de répartition (courbes b et c) des deux formes acide-base conjuguée, obtenues par
simulation, sont également représentées (pourcentages rapportés à l'échelle de droite)
4) Le p-nitrophénol est-t-il un acide plus fort ou plus faible que le phénol ? Justifier.
5) Comment expliquez-vous la très faible amplitude du saut de pH autour du point d'équivalence ?
6) Quelles sont les conditions, satisfaites ici, faisant que l'on ait pH=pKa à la demi-équivalence?
Le titrage précédent est suivi par spectrométrie UV-visible. On obtient les courbes de la figure ci-
dessous (Figure 2):
7) Les longueurs d'onde des deux maximums observés sur la figure 2 sont respectivement 310 nm
et 390 nm. Identifier les deux formes du p-nitrophénol correspondantes.
8) Lorsque, à une longueur d'onde λiso les deux espèces ont le même coefficient d'absorption
molaire ξiso on observe sur les différents spectres un point particulier appelé point isobestique.
Identifier ce point sur la figure. Justifier votre réponse.
Exercice 4 :
Le paracétamol, aussi appelé acétaminophène, est la substance active de nombreuses spécialités
médicamenteuses de la classe des antalgiques antipyrétiques non salicylés. Il est indiqué dans le
traitement symptomatique de la fièvre et des douleurs d'intensité faible à modérée, seul ou en
association à d'autres analgésiques. Le nom paracétamol vient de la contraction de para-acétyl-
amino-phénol.
On veut déterminer la quantité du paracétamol dans deux échantillons (urine et sang). Pour ce
faire nous avons préparer des solutions filles à partir d’une solution mère de concentration 0.5
mg/ml, afin de réaliser une courbe d’étalonnage de ce médicament en utilisant les deux réactifs
phénol (20 g/l)/NH4OH (4M) (7/3) formant ainsi un complexe bleu stable qui absorbe 620 nm. Les
résultats obtenus sont dressé dans le tableau suivant :
Vol (ml)
C (mg/ml) 0.005 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Abs 0.012 0.032 0.199 0.396 0.684 0.977 1.28 1.58

1/ Remplir le tableau en calculant les volumes prélevés de la solution mère pour préparer ces
différentes concentrations des solutions filles.
2/ Tracer la courbe d’étalonnage de : A= f (C). Déduire le coefficient d’extinction de ce médicament
en mg-1.cm-1.ml.
3/ déterminer la concentration du paracétamol dans les 2 échantillons dont l’absorbance de
paracétamol dans l’urine est de 0.285 et celle de sang est de 0.482.
4/ Selon la structure chimique de paracétamol, Est-ce que ce médicament absorbe en UV ?,
pourquoi le dosage n’a pas été effectué en UV ? Expliquer ; nommez ce déplacement de longueur
d’onde de l’UV vers le visible.
5/ Quels sont les transitions électroniques possibles dans cette molécule en UV?
6/ Dans ce dosage le domaine de la linéarité de la loi de Beer-Lambert est-elle respectée ?
Expliquer.

III. Spectroscopie IR
1. Introduction
Question: Comment s'assurer que le produit obtenu lors de la réaction suivante est bien celui
attendu?
Réponse: La spectroscopie infrarouge est idéale pour confirmer la présence de groupements

fonctionnels.
Notez la présence de bandes à 3080 (=CH) …alors qu'apparaîtront de nouvelles bandes à 3324
et 1642 cm-1 (C=C) qui disparaîtront… (OH) et 1069 cm-1 (C-O).
2. Principe
- Les radiations infrarouges de fréquences (nombres d'ondes) comprises entre 4000 et 400 cm -1
sont absorbées par une molécule en tant qu'énergie de vibration moléculaire (transitions
vibrationnelles).
- Les molécules diatomiques n'ont qu'une seule liaison, qui peut être étirée. Les molécules les
plus complexes ont beaucoup de liaisons, et les vibrations peuvent être conjuguées, ce qui
conduit à des absorptions infrarouges à des fréquences caractéristiques qui peuvent être liées
à des groupes chimiques.
- Les transitions vibrationnelles (vibrations) sont :
 D’élongations : c’est la Variation de la distance interatomique au niveau des liaisons
chimiques (les plus utilisées en IR), qui sont :

 Elongation symétrique (symetrical stretching)
 Elongation asymétrique (asymetrical stretching)
 De déformations angulaires : c’est la variation de l'angle entre deux liens adjacents
(au niveau des angles des liaisons chimiques), qui sont :

 déformations angulaires symétriques :
 cisaillement (scissoring) : dans le plan.
 Torsion (Twistting): hors du plan.
 déformations angulaires asymétriques :
 bascule ou balancement (rocking) : dans le plan.
 Hochement (wagging) : hors du plan
- Ainsi par exemple, les atomes d'un groupe CH2, que l'on trouve communément dans les
composés organiques.
- Ex : H2O
- Rq : Les élongations requièrent généralement de plus hautes énergies (plus hautes fréquences)
que les déformations angulaires.
- Ces absorptions sont quantifiées; la fréquence d'oscillation dépend des masses des atomes et
de la force du lien: LOI DE HOOKE
1 dyne= 1g.cm/s2, dyne/cm=g.cm/s2.cm=g/s2
- En UV-visible, les composés ces radiations sont insaturées et les transitions sont électroniques,
mais en IR, les transitions sont vibrationnelles et pour que les molécules absorbent ces
radiations il faut qu’elles possèdent un moment dipolaire.
- On appelle dipole, le système formé de deux charges égales mais de signe opposé séparées par
une distance d.
- Un dipole est caractérisé par son moment dipolaire électrique µ.
- Le moment dipolaire est une grandeur qui se mesure expérimentalement.
- L'existence d'un moment dipolaire dans une molécule a son origine dans la différence
d'électronégativité entre atomes.

- Nous avons vu que la densité électronique est plus élevée au voisinage de l'atome le plus
électronégatif.
- Ceci entraîne une dissymétrie dans la répartition des électrons de liaison.
- Ex : La molécule H—Cl possède un moment dipolaire électrique non nul.
- Par convention, le vecteur moment dipolaire expérimental est orienté de la charge négative
vers la charge positive (NB : Cette convention peut être inversée dans certains livres de
chimie). Les notations +d et -d représentent des charges partielles; c'est, bien sûr, l'atome le
plus électronégatif qui porte la charge partielle négative.
- Rq : les molécules qui possèdent un moment dipolaire non nul absorbent l’IR moyen et les
composés qui possèdent un moment dipolaire nul absorbent l’IR lointain et on les étudie par la
spectroscopie RAMAN et ce sont :
 Les molécules homogènes : Cl2, O2, H2…….
 Les molécules symétriques : CO2……
3. Facteurs influençant les fréquences de vibrations
a. Effet de la force de la liaison:
b. Effet de la masse des atomes:
c. Effet de la polarisation du lien:

- La vibration de liens polarisés donnera lieu à des bandes intenses, alors que les bandes de
liens non-polarisés seront peu ou pas visibles.

4. Appareillage
a. Principe
b. Types
- Spectrophotomètre IR double faisceaux (le plus utilisé) : existence d’un monochromateur.
- l'Infra-Rouge à Transformée de Fourrier ou IRTF : en anglais Fourier transform infrared
spectroscopy – FTIR (au lieu d’un monochromateur, la lumière infrarouge passe au travers
d'un interféromètre : est une méthode de mesure qui exploite les interférences intervenant
entre plusieurs ondes cohérentes entre elles).
5. Applications analytiques
ii. Analyse quantitative
- L’intensité de l’absorption à la longueur d’onde est reliée à la concentration des groupes
chimiques responsables de l’absorption mais elle reste une technique non fiable (utilisée)
pour le dosage.
iii. Analyse qualitative
- Elle est utilisée pour l’identification des structures moléculaires (par identification des
groupements chimiques qu’ils les constituer) par interprétation des spectres IR qui sont la
transmission (transmittance) en fonction du nombre d’onde (cm-1) T %= f (ν’).
1. Spectre IR (T=f (ν’), division en 4)
- Le spectre IR utilisé s’étend de 4000-400 cm-1 qui correspond à l’IR moyen.
- Il est divisé en 4 régions :
Nombre d’onde ῦ
région Mode de vibration Groupement chimique
(cm-1)
Vibration d’élongation des liaisons
1 2700-3700 C-H, N-H, O-H
simples
Vibration d’élongation des triples
2 1850-2700 C≡C, C≡N
liaisons
3 1550-1850 Vibration d’élongation des doubles C=C, C=O, C=N, N=O

liaisons + Vibration de déformation
des liaisons simples : C-O, N-H
Connaitre le degré de
700-1550 substitution des
Vibration d’élongation et de
4 Région de l’empreinte cycles benzéniques et
déformation des autres liaisons
digitale les formes (ortho,
para, méta)
- Le spectre présente plusieurs formes de bandes qui sont :
 bande large ex : O-H, fine ex : C=O
 bande intense forte, moyenne, faible.
2. Comment analyser un spectre IR ?
- Un spectre IR contient plusieurs bandes avec plusieurs formes, pratiquement c’est
impossible d’interpréter toutes ces bandes, on interprète seulement 5-8 bandes
caractéristiques.
- Les bandes de la région 4 sont difficiles à interpréter.
- Pour interpréter un spectre il faut identifier la présence des bandes caractéristiques
comme :
 Un groupe carbonyle est-il présent?
Le groupe C=O génère une bande intense dans la région entre 1820 et 1660 cm-1.
Cette bande est souvent la plus intense du spectre et de largeur moyenne. Elle est généralement
très évidente!
 Si C=O est présent, déterminez quel type en recherchant les bandes suivantes:
ACIDE Un groupe OH est-il aussi présent? Recherchez une bande large vers 3400-2400 cm-
1.
AMIDE Un groupe NH est-il aussi présent? Recherchez une bande d'intensité moyenne vers
3500 cm-1. Si présent, le pic est-il simple (NH) ou double (NH2)?
ESTER Un lien C-O est-il présent? Recherchez une bande intense vers 1300-1000 cm-1.
ANHYDRIDE Y-a-t-il deux bandes carbonyles (vers 1810 et 1760 cm-1), plutôt qu'une seule?
ALDÉHYDE Les deux bandes CH caractéristique d'un aldéhyde sont-elles présentes vers 2850 et
2750 cm-1 (i.e. à la droite des autres bandes CH)?
CÉTONES Vous avez une cétone si les cinq autres options ont été éliminées.
 Si C=O est absent, recherchez la présence des fonctions suivantes:
Recherchez la large bande OH vers 3600-3300 cm-1.
ALCOOL ou
Confirmez cela en trouvant la bande C-O vers 1300-1000 cm-1.
PHÉNOL
Pour les phénols, confirmez aussi la présence d'un cycle aromatique
 Des DOUBLES LIAISONS ou des CYCLES AROMATIQUES sont-ils présents?
génèrent une bande faible vers 1650 cm-1.
Les liens C=C
Cycle Des bandes moyennes à fortes dans la région de 1650 à 1450 cm-1 indiquent
aromatique souvent la présence d'un cycle aromatique.
La présence de bandes CH à la gauche de 3000 cm-1 (=C-H) confirme la présence
insaturations
d'une ou plusieurs insaturations.
 Des TRIPLES LIAISONS sont-elles présentes?
NITRILES ont une bande fine d'intensité moyenne (C≡N) vers 2250 cm-1.
ont une bande fine de faible intensité (C≡C) vers 2150 cm-1. Recherchez aussi la
ALCYNES présence de la bande ≡C-H vers 3300 cm-1 afin de déterminer si l'alcyne est
terminal ou pas.
 Le groupe NITRO est-il présent?

Recherchez la présence de deux bandes NO2 intenses vers 1600-1500 cm-1 et 1390-1300 cm-1.
 Si votre analyse n'a révélé la présence d'aucun de ces groupes fonctionnels, vous avez
probablement un ALCANE.
Vous devriez avoir un spectre assez simple avec des bandes CH à la droite de 3000 cm-1, ainsi que
quelques autres bandes vers 1450 cm-1 et 1375 cm-1.
Tableau 6. Exemples des Spectres IR des biomolécules
Spectres IR de glucose
Groupements chimiques
Spectre IR de la caféine
Groupements chimiques
Spectre IR de l’aspirine

6. Avantages et inconvénients de l’infrarouge
a. Avantages
- Elle est une technique rapide : quelques minutes suffisantes pour obtenir un spectre IR d’un
échantillon.
- Elle est une technique non destructive : l’échantillon est récupéré intacte après analyse, une
propriété très importante.
- Elle ne nécessite pas une grande quantité d’échantillon : on peut faire l’analyse avec 1 g de
l’échantillon.
- Elle n’est pas onéreuse : le coût de passage des échantillons en IR n’est pas cher.
b. Inconvénients
- L’IR ne peut généralement pas être utilisée pour estimer les substances minérales (molécules
organiques).
- L’IR ne peut pas donner un spectre pour des échantillons en traces (signal est faible).

Série n°3 : spectroscopie Infrarouge « IR »
Exercice 1 : QROC
1. Citer la différence entre ces trois techniques : UV-visible, Fluorescence, IR (décrire les
différences dans un tableau).
2. A quelle liaison peut-on attribuer un pic intense vers 1710-1730 cm-1 ?
3. En IR, comment peut-on indiquer la présence d’un groupement amine NH2 et le
groupement OH ?
Exercice 2 : identification des groupements fonctionnels à partir des spectres
Pour chacun des spectres suivants quels sont les groupes fonctionnels que vous pouvez identifier ?
Spectre 1 Spectre 2
Spectre 3 Spectre 4
Exercice 3 :
Un laborantin maladroit a mélangé les étiquettes des produits suivants : l’hexane (solution 1),
hexanal (solution 2), hexanol (solution 3), acide hexanïque (solution 4), éthanoate d’hexanyle
(solution 5). Il effectue une analyse IR afin de remettre les étiquettes en place. Attribuer chaque
spectre à la solution correspondante.
Spectre A : pics vers 3000 cm-1.
Spectre B : pics vers 3000 cm-1 ; bande large vers 3400 cm-1
Spectre C : pics vers 3000 cm-1 ; pic vers 1715 cm-1
Spectre D : pics vers 3000 cm-1 ; pic fort à 1715 cm-1
Spectre E : bande large vers 3300 cm-1 ; pic à 1715 cm-1

Exercice 4 :
Attribuer un spectre à l'acétone (propanone) et l'autre à la 4-méthyl penta-3-ène-2-one.
Même questions pour les composés: (dipropylether, 2-méthypropanoate d'éthyle et 4-

Méthylpentan-2-one)
Spectre 1 Spectre 2
Spectre 3
Exercice 5 :
L'analyse centésimale d'un composé, obtenu pur après une suite de manipulations, a permis de
trouver sa formule brute: C6H12O. Le spectre IR du composé, est donné ci-après. Trouver la formule
semi-développée du composé.

III. Spectroscopie RMN
1. Introduction : Un peu d'histoire :

- C'est en 1946 que deux groupes de physiciens, l'équipe du Professeur BLOCH à Stanford et
l'équipe du Professeur PURCELL à Harvard, en cherchant à mettre en évidence des transitions
entre les états de spins nucléaires, concept purement théorique à cette époque, ont obtenu pour
la première fois des signaux R.M.N...
- Après le succès de cette démarche relevant de la recherche fondamentale, la Résonance
Magnétique Nucléaire (R.M.N.) est née et a explosé vers de multiples applications touchant :
- La chimie avec l'élaboration des structures chimiques et la dynamique moléculaire, plus
récemment, le domaine médical avec l'Imagerie par Résonance Magnétique (ou I.R.M.)...
- Notez à ce propos que le qualificatif "Nucléaire" a disparu de l'intitulé pour ne pas effrayer (à
tort...) les malades...
- Nous limiterons le développement de cet ensemble d'autoformation à l'utilisation de la
Résonance Magnétique Nucléaire en Chimie pour l'élucidation structurale.
2. Principe :
- Un noyau est observable par R.M.N. s'il présente des propriétés magnétiques caractérisées par
l'existence d'un spin I non nul...
- Un noyau = proton+ neutron= nucléon
- Les nucléons sont chargés positivement et sont toujours en rotation possédant des propriétés
magnétiques.
- Ils sont caractérisés par un nombre magnétique quantique I qui dépend lui-même du nombre de
masse A et le nombre atomique Z.
A
- On peut symboliser un noyau par Z X .
Caractéristique du noyau
A Z I Exemples
(Absorption RMN)
Noyau magnétique inerte,
Pair pair 0
12 16
6 C, 8 O
pas d’absorption RMN
Noyau actif
Pair impair 1, 2, 3, 4, 5… magnétiquement,
10 14
5 B, 7 N
absorption RMN
Noyau actif 1 13 31
Pair ou 1 , 3 , 5 , 7 1 H , 6 C ,15 P avec
impair magnétiquement,
impair 2 2 2 2 I=1/2
absorption RMN
- I≠0 ie : un noyau magnétiquement actif : existence d’un moment magnétique    . p
 le moment magnétique Avec mI : le nombre
la constante gyromagnétique (caractéristique pour quantique magnétique :
 chaque noyau) mI=I, I-1, I-2, I-3,…., -I
h I est le nombre quantique de
p p .mI
quantité du mouvement avec 2 spin
Ex : I=½, mI= ½, -½, I=1, mI=1,0,-1.

- L’influence d’un champ magnétique extérieur « B0 » sur un noyau est une émission d’énergie :
E=µ. B0 Donc
h
E  . .mI .B0
2
Cette énergie est caractéristique d’un état excité.
- Donc l’état fondamental (B0=0) va éclater en 2 états excités avec des énergies différentes qui
dépend de mI, ce phénomène est appelé : résonance (basculement) du spin nucléaire = transition
nucléaire (excitation du noyau).
Ce qui donne fréquence nécessaire pour la transition nucléaire = c’est la
 fréquence de Larmor qui sont des ondes radio.
 .B0
2
3. Appareillage (instrumentation)
3.1. Principe
- Utilisation des cryoaiments à basse température, effets de Joule négligeable.

- L’échantillon est solubilisé dans un solvant inerte (magnétiquement inactif) ils sont
généralement deutériés (au lieu de H c’est D) ex : H2O par D2O, CCl4, CDCl3; CD3COCD3; CD3OD;
C5D5N;DMSO-d6.
- Le produit à analyser doit être pur.
- Plus de 60 éléments sont détectable en RMN.
3.2. Types
Il existe 2 types de spectromètres :
Le spectromètre à balayage ou à onde continue (continuous-wave, cw) ;
Le spectromètre par transformée de Fourier (FT-NMR).
4. Types de RMN
4.1. RMN-1H

a. Principe
- 1H est l’élément le plus simple.
- Très répondus : eau, composés organiques, produits pharmaceutiques.
- I=½, mI= ½, -½, actif en RMN avec deux niveaux d’énergie donc possibilités de
transitions.
H Une valeur de ν c’est-à-dire un signal donc information sur la structure de
H  .B0
2 l’échantillon
- Ex : le MeOH présente 4 atomes de H, la question est ce que ces atomes présente un signal ou
plusieurs ?
- L’expérience a montré que le méthanol présente 2 signaux avec un rapport d’intensité 3 :1, c'est-
à-dire que le MeOH possède 2 types de protons : deux environnements différents : CH3-O-H.
- Ce spectre peut être interprété par la notion de l’effet d’écran. C'est-à-dire que l’interaction de B0
n’est pas la même pour les 2 protons dus aux environnements chimiques différents.
- On définit le champ magnétique réel B* B*= B0 (1-σ) avec σ la constante d’écran électronique.
- σ dépend de : l’électronégativité, environnement chimique, forme géométrique, encombrement
stérique.
b. Déplacement chimique
- En RMN, le spectre est l’intensité du signal en fonction d’une grandeur appelée déplacement
chimique δ (ppm : partie par million) qui définit par :
 réf  i
νréf : la fréquence en Hz de la référence TMS (tétraméthylsilane)
 ( ppm)  νi : la fréquence en Hz de proton considéré ou à analyser.
0
ν0 : la fréquence en mégaHz (MHz) de l’appareil
- Relation structure- déplacement chimique :
 L’électronégativité augmente → δ↗. Ex : δ CH3F > δ CH4.
 Le degré de substitution ↗→ δ↗. Ex : δ R3CH> δ R2CH2> δ RCH3
 La nature de l’atome qui porte le proton : (carbone, azote ou oxygène le plus souvent)
- L’intervalle de δ est de 0- 14 ppm :
c. Spectre RMN-1H et son interprétation (couplage spin-spin)

- Le spectre RMN est l’intensité de signal= f (δ), cette intensité dépend du nombre de protons (H).
- Ex : CH3-OH, 2 types de protons donc deux signaux de rapport 3:1.
- Ex : acétate de benzyle :

Dans un spectre RMN-1H, l’intensité d’un signal est mesurée par sa
surface.
L’intégration des surfaces des signaux se présente sous la forme
d’une série de paliers.
La hauteur de chaque palier est proportionnelle au nombre de H
correspondants.
Exemple :
Trois pics attribuables respectivement aux protons du

méthyle, du méthylène et du cycle aromatique.
Couplage spin-spin et constante de couplage :

 Les protons portés par un même carbone ou des atomes adjacents vont présenter des
couplages spin-spin. Le couplage ne peut avoir lieu qu’entre protons magnétiquement
différents.
 Le couplage avec un autre proton se traduit par la formation d'un doublet, avec 2 protons
par un triplet etc…. Lorsqu’un hydrogène possède n hydrogènes voisins équivalents entre
eux, son signal apparait sous la forme d’un multiplet à (n+1) pics :
 Si, pour des protons, il y a couplage avec deux groupes voisins de n1 et n2 protons, la
multiplicite est donnée par : (n1+1) (n2+1).
 Exemple : CH3-CH2-CHCl2
 La multiplicité du signal du CH2 est égale a : (n1+1)(n2+1) = (3+1)(1+1) = 8.
 Les rapports d’intensité des composantes suivent la règle du triangle de Pascal.
Les pics d’un multiplet sont espaces d'une quantité notée J appelée constante de couplage
et exprimée en hertz.
4.2. RMN-13C
a. Principe
Il existe deux isotopes pour le carbone : 12C : 98.9% et 13C : 1.1 %.
12 6C : est inactif magnétiquement (A et Z pairs) pas de RMN-12C.
13 6C : est actif magnétiquement « I=1/2 », nécessite une étude en RMN-13C.
b. Déplacement chimique
δ de 0 →250 ppm (due à la taille de C et le temps d’analyse)
Relation structure- déplacement chimique :
 L’électronégativité augmente → δ↗. Ex : δ C-Cl > δ C-Br.
 Le degré de substitution ↗→ δ↗. Ex : δ R4C> δ R3CH> δ R2CH2> > δ RCH3
 La nature de l’atome qui lie le carbone: (azote ou oxygène le plus souvent).
c. Couplage spin-spin
On a 2 types de couplage :
 Couplage 13C-13C : n’est pas observé parce qu’on ne peut pas trouver 2 atomes 13C-13C
successivement liés.
 Couplage 13C-1H : il est bien observé, il nous donne beaucoup d’informations sur la
structure moléculaire du composés à analyser. Ex : CH3 → signal de multiplicité « q » le
signal de C + 3 signaux des 3 protons.
d. Le Découplage
Dans un spectre RMN-13C découplé des signaux de protons (absence des signaux de
protons), le nombre des signaux indique le nombre des Carbones dans la molécule s’il n’y a
pas un axe de symétrie.
Ex :

Dans le spectre RMN-13C, il y’a 6 signaux par contre dans la
molécule donnée il existe 12 atomes de carbone, donc la
molécule contient un axe de symétrie (symétrique).
Exercice d’application : un composé organique de formule brute C4H10O, possède 4 isomères

et pour différencier entre ces 4 isomères, on fait des analyses IR et RMN-1H, on obtient les
résultats suivants :
Pour A : pas de bande d’absorption caractéristique en IR ; par contre on remarque dans son
spectre RMN-1H 2signaux (2H, m) ; (3H, t).
Pour B : en IR, bande large à ν= 3300 cm-1, en RMN-1H : 5 signaux : (2H, t), (2H, m), (2H, m),
(3H, t), (1H, s).
Pour C : en IR, bande large à ν= 3300 cm-1, en RMN-1H : (3H, d), (1H, s), (1H, m), (2H, m), (3H, t).
Pour D : en IR, bande large à ν= 3300 cm-1, en RMN-1H : (9H, s), (1H, s)
Solution :
IR RMN Structure semi

Composé
ν (cm-1) interprétation Donnés Interprétation développée
Pas de fonction (2H, m) CH3-CH2
Pour A / CH3-CH2-O-CH2-CH3
chimique (3H, t) CH3-CH2
(2H, t) CH2-CH2
3300, (2H, m) CH2-CH2-CH2
Pour B bande O-H (2H, m) CH3-CH2-CH2 CH3-CH2-CH2-CH2-OH
large (3H, t) CH3-CH2
(1H, s) O-H
(3H, d) CH3-CH
3300, (1H, s) O-H
CH3-CHOH-CH2-CH2-
Pour C bande O-H (1H, m) CH3-CH-CH2 CH3
large (2H, m) CH-CH2-CH2
(3H, t) CH3-CH2
3300,
(9H, s) 3 (CH3)
Pour D bande O-H
(1H, s) O-H
large

Tableau 7. Exemples de quelques spectres RMN-1H et RMN-13C des biomolécules :
Spectres RMN de glucose (glucopyranose)

Spectre RMN-1H
N°C δ(ppm) multi intens Gpt prp

a 3.40 t 1H CH-CH
b 3.49 t 2H CH-CH
c 3.58 s 3H 3(O-H)
d 3.65 s 2H 2(O-H)
e 3.76 q 1H CH2-CH-CH
f 3.79 t 2H CH2-CH
g 5.41 d 1H CH-CH
Spectre RMN-13C
N°sig δ(ppm) multi Gpt prp

1 62,2 t -CH2
2 71.5 d -CH
3 72.2 d -CH
4 72.6 d -CH
5 78.3 d -CH
6 98.5 d -CH
Spectre RMN de la caféine

Spectre RMN-1H
N°sig δ(ppm) multi intens Gpt prp

a
b
c
d
Spectre RMN-13C
1
2
3
4
5
6
7
8

Spectres RMN des Acides aminés
Spectre RMN-1H de la Valine
N°sig δ(ppm) multi intens Gpt

prp
a
b
c
d
e
Spectre RMN-13C de la Valine (découplé)

1
2
3
4
Spectre RMN de Leucine

Spectre RMN-1H
N°sig δ(ppm) multi intens Gpt
prp
a
b
c
d
e
f
Spectre RMN-13C
1
2
3
4
5

Série n°4 : spectroscopie RMN «RMN-1H et RMN-13C»

Exercice 1 : déterminations des structures développées
Déterminer la structure du produit de formule brute C6H14, dont les spectres 1H et 13C découplé du
proton sont présentés ci-dessous.
Spectre RMN-1H Spectre RMN-13C
Exercice 2:
(http://www.crystallography.fr/crm2/fr/labo/pages_perso/Bonnet/polyExosRMNSV2.pdf)
Déterminer la structure du produit de formule brute C4H8O2, dont les spectres 1H et 13C découplé
du proton sont présentés ci-dessous.
Exercice 3 :
Déterminer la structure de ces deux isomères.

Exercice 4 : Examen TAB de 1ére année Magister Biologie « UATL »

Question 1 : Attribuer à chaque molécule son spectre RMN-13C approprié :
leucine tyrosine isoleucine phénylalanine
Question 2 :
On veut déterminer la quantité d’un médicament X dans un échantillon. Pour ce faire nous avons
réalisé une courbe d’étalonnage de ce médicament X, en utilisant les deux réactifs phénol (20
g/l)/NH4OH (4M) (7/3) formant ainsi un complexe bleu stable qui absorbe 620 nm. Les résultats
obtenus sont dressé dans le tableau suivant :
C (mg/ml) 0.005 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Abs 0.012 0.032 0.199 0.396 0.684 0.977 1.28 1.58
1/ Tracer la courbe d’étalonnage de : A= f (C). Déduire le coefficient d’extinction de X en mg-1.cm-
1.ml.
2/ déterminer la concentration de X dans l’échantillon dont l’absorbance est de 0.285.

3/ Ce médicament X absorbe en UV, pourquoi le dosage n’a pas été effectué en UV ? nommez ce
déplacement de longueur d’onde de l’UV vers le visible.
4/ Dans ce dosage le domaine de la linéarité de la loi de Beer-Lambert est-elle respectée ?
Expliquer.
Dans le but de déterminer la structure chimique de ce médicament X de formule brute C8H9NO2,
nous avons réalisé une analyse spectroscopique à savoir : IR, RMN-1H et RMN-13C (les figures sont
données ci-dessous).
1/Calculer le degré d’insaturation de la molécule. Déduire.
2/ Interpréter les bandes importantes du spectre IR et donner les groupements chimiques présents
dans cette structure.
3/Compléter le Tableau des résultats de RMN-1H.
4/ Compléter le Tableau des résultats de RMN-13C.
5/Proposer une formule semi-développée du médicament X. Indiquer sur chaque atome
d’hydrogène et de carbone son numéro de signal et multiplicité. Quel est le nom de ce médicament ?
Spectre IR
Spectre RMN-1H
n°si Mul Groupemen
δ int
g t t proposé
2.0 3
1
4 H
5.3 1
2
5 H
6.9 2
3
3 H
7.2 1
4
3 H
7.4 2
5
5 H
Spectre RMN-13C

Groupement
N°sig δ Mult
proposé
A 24 q
B 116.1 d
C 123.0 d
D 131.1 s
E 154.1 s
F 168.9 s

IV. Spectrométrie De Masse (SM)
1. Historique
- Première mesure de spectres de masse en 1912 par J.J. Thompson qui a permet de calculer
expérimentalement la masse moléculaire de l’échantillon.
- Couplage de la chromatographie en phase liquide en 1973 par McLafferty.
2. Principe
- La SM est une méthode d’analyse qui permet la détermination des masses moléculaires des
composés analysés ainsi que leur identification et que leur quantification, en plus elle permet de
séparer les isotopes.
- Elle est fondée sur la séparation et la détection d’ions formés dans une source d’ionisation.
- Une matière ou un échantillon neutre …….ionisé….. ions……. Séparation……informations

M  énergie électroniq ue arrachemen
  t d  M   1e
'un e
- M  e  M   2e
.. .

ex : N H 3  e  N H 3  2e
- La masse de l’ion moléculaire= la masse de la molécule car la masse de l’électron est négligeable
par rapport à la masse de son noyau (neutrons + protons).
- La masse de l’atome est pratiquement la masse de son noyau (P + n).
- Après l’injection de l’échantillon dans l’appareil, il va être ionisé, accéléré, analysé et détecté.
3. Appareillage
a. Principe et constitution:
- Le spectromètre de masse est un instrument qui comprend différents constituants placés en
série et qui permettent successivement, après introduction de l’échantillon par chromatographie
(cas de couplage) ou injection directe, l’évaporation et l’ionisation des molécules de l’échantillon
(source), l’accélération des ions formés, la séparation de ces ions en fonction de leur rapport
masse sur charge (m/z) (analyseurs utilisant différents principes physiques) et enfin leur
détection.
Chambre d’injection : l’échantillon neutre (sans
charge) est injecté.
Chambre d’ionisation : l’échantillon est ionisé
par un flux d’électron (bombardement
électronique), ionisation par impact électronique.
(l’équation :..)
Chambre d’accélération : donner aux ions une
vitesse pour atteindre l’analyseur.
Chambre de séparation (analyseur).
b. Types : il existe plusieurs types d’appareils selon plusieurs critères :
- Sources d’ions :
 Impact électronique ou électro-ionisation (EI : Electron Impact ou Electron Ionization )
 Ionisation chimique (CI : Chemical Ionization )
 Photo-ionisation

 Ionisation-désorption
 Ionisation-nébulisation
 Thermo-ionisation
 Sources à décharge électrique
- Analyseurs
 Analyseurs à secteur magnétique
 Spectromètres de masse à résonance cyclotronique ionique et à transformée de Fourier
(FTICR et FTMS)
 Filtres de masse quadripolaire
 Pièges à ions (Ion Trap )
 Spectromètres de masse à temps de vol (TOF-MS)
 Spectromètres de masse tandem (MS/MS)
 Comparaison des différents types d’analyseurs
4. Spectre de masse
- Est une représentation graphique (ou sous forme d’un tableau) entre la masse (le rapport
masse/charge : m/z) et sa proportion (le pourcentage de son intensité). On a 2 types de spectre
masse :
 Spectre de masse spécifique : l’énergie

électronique d’ionisation utilisée est de
l’ordre 15 e.V, cette énergie suffit d’ioniser la
molécule, on obtient un spectre de masse
simple contient un seul pic qui est le pic
moléculaire qui représente la masse
moléculaire.
 Spectre de masse générale : l’énergie
électronique d’ionisation utilisée est de
l’ordre 75 e.V, cette énergie suffit d’ioniser et
de fragmenter la molécule, on obtient un
spectre de masse complexe qui contient
plusieurs pics. 2 pics caractéristiques :
 le pic moléculaire qui représente la masse
moléculaire, il représente la m/z le pus
elevé.
 Le pic de base correspond à une intensité
100 % (ou proche de 100 %)
Remarques :
- Le pic moléculaire n’est pas nécessaire qu’il soit égal au pic de base (en intensité %).
- Chaque pic présente des pics accompagnants qui correspondent aux isotopes.
- Le pic moléculaire est accompagné par des pics de masse m/z plus grande d’une unité ou plus
(M+, M++1, M++2, M++3, M++4) : 4 unités avec des intensités plus faibles.
Ex :
Spectre de masse spécifique : Toluène :
Le spectre
La possibilité du pic moléculaire :
C7 1H 8  m / z  92
12
C7H8, m/z=92
C12C6 1H 8  m / z  93
13
C7 1H 7 2 H  m / z  93
12
Spectre de masse générale : de Toluène

m/z % Caractéristique du spectre :
38 9.4 Le pic de base (à 100 %) : m/z= 91
39 5.3
45 4
50 6.3
61 1.1
62 4.1 L’ion moléculaire : m/z=92 (68 %)
65 11 On remarque 2 autres pics accompagnant de 92
91 100 m/z=93→ 4,9 %
92 68 m/z=94→ 0,2 %
93 4.9 m/z=92 → M+→ 12C7 1H8
94 0.2 m/z=93 → M++1→ 13C 12C6 1H8 ou 12C6 1H72H
m/z=94 → M++2→ 13C 12C61H72H ; 13C2 12C51H8 ; 12C71H62H2
ces 2 pics sont le résultat de la contribution des isotopes.
5. Interprétation de spectre de masse et identification de masse moléculaire :
- Localiser le pic moléculaire et les pics de la contribution des isotopes (M++1, M++2, M++3),
nous avons 2 cas :
 Pour un spectre spécifique : le pic moléculaire = pic de base.
 Pour un spectre générale : le pic moléculaire ≠ pic de base⇒ il faut affecter la valeur
de l’intensité du pic moléculaire à 100 % et recalculer les % des pics isotopiques
(c’est-à-dire calculer M++1, M++2, M++3.. par rapport à M+).
Ex :
I% m/z m/z I%
68 % → 100 %
68 92 M+ 92 100
4.9 % → X
4.9 93 M +1 93
+ 7.2
0.2 % → Y
0.2 94 M++2 94 0.29
(𝑴+ +𝟏)%
- Calculer le nombre des atomes de carbones : 𝐧𝒄 = 𝟏,𝟏%
, 1.1 % : est le pourcentage
relatif de 13C.
(𝑴+ +𝟏)% 𝟕,𝟐
Ex : 𝐧𝒄 = 𝟏,𝟏%
= 𝟏,𝟏 = 𝟕 donc 7 atomes de carbone et la masse de C=12 donc
7*12=84 et
92-84= 8 → 8H c’est-à-dire que la formule brute est : C7H8 : le toluène.
- La règle d’azote :
 Si la masse moléculaire est paire : la molécule possède dans sa structure 0 ou un
nombre pair d’azote.
 Si la masse moléculaire est impaire : la molécule possède obligatoirement dans sa
structure un nombre impair d’azote (1N, 3N, 5N……).
- Proposer une ou des formules brutes par combinaison des interprétations du spectre de
masse.

- Vérifier et confirmer la formule brute correcte ou approprié par l’application des règles de
Baynone.
(𝑴+ + 𝟏)% = 𝟏, 𝟏 𝒏𝒄 + 𝟎, 𝟑𝟖 𝒏𝑵 + 𝟎, 𝟎𝟏𝟔 𝒏𝑯 + 𝟎, 𝟎𝟒 𝒏𝑶
+
(𝟏, 𝟏𝒏𝑪 )𝟐
(𝑴 + 𝟐)% = + 𝟎, 𝟐𝒏𝑶
𝟐𝟎𝟎
- Si nous avons dans un spectre de masse, un pic moléculaire et un pic isotopique de M + et
M++2 avec des intensités presque équivalente indique l’existence d’un atome de Br (brome),
et si M+ % = 3 (M++2) % indique la présence d’un atome de Cl (chlore).
- Ex :
(𝑴+ +𝟏)% 𝟗,𝟗
m/z I% 𝐧𝒄 = 𝟏,𝟏%
= 𝟏,𝟏 = 𝟗 la masse de C=9*12=108
150 100 150-108=42, la masse moléculaire est paire donc un nombre pair de N : soit 0
151 9,9 N ou 2N.
152 0,9 2N=2*14=28 le reste 42-28=14 donc 14H. donc la formule est : C9H14N2.
0N donc 42 : 1O ou 2O : 1O :42-16=26 H (refusé), 2O : 42-32=10 H : C9H10O2.
Confirmer la formule appropriée par les règles de Baynone :
C9H14N2 C9H10O2 % de m°
M +1 % 10,88
+ 10,14 9,9
M++2 % 0,49 0,99 0,9
Ex : voir topo (les spectres de masses sont obtenus à partir de :
http://webbook.nist.gov/chemistry/name-ser.html )
6. Spectres SM de quelques molécules chimiques et biomolécules

7. Exemples de quelques spectres de masse des biomolécules:
Spectres de masse des Acides aminés

Spectre de masse de Valine
m/z I% Recalcul I
%
M+
M++
1
Spectre de masse de tryptophane

m/z I% Recalcul I
%
M+
M++
1
Spectre de masse des sucres

Série n°5 : spectrométrie de masse
Exercice 1 : recherche d'une formule semi développée d'un composé inconnu

Dans le but de déterminer la structure chimique d'un composé organique inconnu, nous avons
réalisé quelques analyses spectroscopiques.
1- La spectrométrie de masse du composé inconnu a donné les résultats suivants :
m/z Intensité %
1- Déduire la masse moléculaire du composé.
88 100
2- Quelle est la formule brute de ce composé?
89 4,62
3- Discuter de l'insaturation du composé
90 0,49
2- Dans le spectre Infra Rouge du composé on remarque une série de bandes d'absorptions, les
plus importants sont: à 2850 cm-1 et à 1750 cm-1. Quels sont les deux groupements
chimiques qui correspondent à ces deux bandes.
3- La figure ci-dessous montre le spectre RMN du proton du composé inconnu.
a. De l'analyse de ce spectre, dresser un tableau qui regroupe les informations
suivantes: le nombre de signaux, la multiplicité des signaux, l'intensité de chaque
signal, la valeur du déplacement chimique et le type de protons (groupement
fonctionnel).
b. Proposer une formule semi développer du composé étudié.
c. Indiquer sur chaque proton le symbole correspondant sur le spectre ainsi sa
multiplicité.
4- Le composé étudié absorbe t-il dans le domaine ultrac-violet? Pourquoi? Dessiner son
spectre UV en précisant le type des transitions électroniques possibles et leurs intensités.
Exercice 2 : EMD de TAB, 3ème année génie bio, UATL :28/05/2005, Problème (14 points)

On donne ci-après les spectres de masse (spectre 1 et tableau 1), infra rouge (spectre 2), ultraviolet
(tableau2), RMN-1H (spectre3), RMN-13C (spectre 4) d'un composé inconnu.
A- Spectre de masse (spectre 1 et tableau 1)
1- Indiquer la masse moléculaire du composé. Déterminer sa formule brute à partir de l'intensité
des pics isotopiques associés au pic moléculaire. Discuter l'insaturation de la molécule.
2- Expliquer la présence des pics à m/z : 39 ; 51, 65 ; 77 ; 92 ; 112 ; 119.
B- Spectre UV (tableau 2)
1- A quels types de transitions électroniques correspondent les bandes d'absorption 215, 221 et
266 nm ?
2- Que pouvez-vous en déduire pour la molécule cherchée?
C- Spectre IR(spectre 2)
1- Quels sont les oscillateurs associés aux bandes d'absorption A (840 cm -1), B (1050 cm-l), C (1400
à 1600 cm-l), D (1700 cm-1) et E (2510 cm-l ).
D- Spectre RMN-13C (spectre4)
1-A partir du spectre discuter le degré de symétrie de la molécule inconnue.
2- Sous forme de tableau, déduire de l'analyse du déplacement chimique, de l'intensité, les
différents groupes d'atomes susceptibles d'être présents dans la molécule cherchée.
E- Spectre RMN-1H (spectre3)
1- A partir du déplacement chimique et de l'intensité des signaux, la multiplicité des signaux, affiner
les propositions faites dans la question précédente.
2- Proposer une formule semi-développée plane de la molécule. Indiquer les coupures conduisant
aux principaux fragments relevés sur le spectre de masse.
3- Sur cette formule, indiquer à coté de chaque groupe de protons le numéro de son signal sur le
spectre 3, et à coté de chaque groupe de carbone le numéro de son signal sur le spectre 4.
Tableau 2 (spectre
UV)

Exercice 3 : Examen de spectrométrie appliquée, Université de Provence
On donne ci-après les spectres de masse (spectre 1), ultra-violet (spectre 2), infra-rouge (spectre
3), RMN-13C totalement découplé des 1H (spectre 4), RMN-13C avec découplage hors résonance
des 1H (spectre 5) et RMN-1H (spectre 6) d'un composé inconnu.
A- Spectre de masse, (spectre 1)
1- De quel atome pouvez-vous suspecter la présence? Pourquoi?
2- Déterminer la formule brute du composé à partir de l’intensité des pics isotopiques associés au
pic moléculaire.
3- Etudier les pics de m/z =120, 92 et 28.
4- Discuter l'insaturation de la molécule.
B- Spectre UV (spectre 2)
1- A quels types de transitions électroniques correspondent les bandes d'absorption de longueur
d'onde supérieure à 200 nm?
2- Que pouvez-vous en déduire pour la molécule cherchée?
C- Spectre IR (spectre 3)
Quels sont les oscillateurs associés aux bandes d'absorption a, b et e?
D- Spectre RMN 13C (spectres 4 et 5)
1- A partir du spectre totalement découplé des protons (spectre 4) déterminer le degré de symétrie
de la molécule inconnue.
2- Sous forme d'un tableau, déduire de l'analyse du déplacement chimique, de l'intensité et des
figures de couplage des signaux des spectres 4 et 5 les différents groupes d'atomes présents dans le
composé.
E- Spectre RMN 1H (spectre 6)
1- A partir du déplacement chimique, de la largeur et de l'intensité des signaux du spectre 6 affiner
les propositions faites dans la question précédente.
2- Toujours sous forme de tableau donner pour chaque signal la figure de couplage (multiplicité des
signaux).
F- Conclusion
1- Proposer une formule semi-développée plane du composé.
2- Sur cette formule, indiquer en face de chaque groupe de protons le numéro de son signal sur le
spectre 6. Justifier l'attribution si nécessaire.
3- Préciser en face de chaque carbone le numéro de son signal sur le spectre 4.
4-Compléter l'attribution des signaux des spectres de masse (spectre 1) et IR (spectre 3).

Chapitre III : Techniques
chromatographiques et
électrophorétiques

Introduction générale et grandeurs chromatographiques
a. Historique
- Le botaniste russe Mikhail Tswett (1872-1919) fut, en 1906, le premier à utiliser le terme
chromatographie.
- À partir de 1903, Tswett utilisa des colonnes d'adsorption pour séparer des pigments de plantes.
- On spécula donc l'étymologie du mot « chromatographie » à partir du grec « khrôma-» pour
couleur et donc pigment, « Graphein » qui signifie "écrire".
- La chromatographie est une technique d'analyse chimique de la chimie analytique pouvant être
couplée à un détecteur en vue d'une analyse qualitative et/ou quantitative. En chromatographie,
l'échantillon contenant une ou plusieurs espèces est entraîné par un courant de phase mobile
(liquide, gaz ou fluide supercritique) le long d'une phase stationnaire (papier, gélatine, silice,
polymère, silice greffée etc). Chaque espèce se déplace à une vitesse propre dépendant de ses
caractéristiques et de celles des deux phases.
- La chromatographie analytique est utilisée pour identifier ou doser les composés chimiques d'un
mélange et .
- La chromatographie préparative est utilisée pour purifier assez de produit pour d'autres
utilisations. Son but est d'obtenir de la substance ; c'est pourquoi, à toute échelle, elle implique de
collecter des fractions.
b. Définitions
- Chromatographie : méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinités des
substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la
technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase
mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire,
soit de leur solubilité différente dans chaque phase.
- Phase stationnaire : phase fixe soit sur la surface intérieure d'une colonne soit sur une surface
plane.
- Phase mobile : phase qui se déplace à travers la phase stationnaire, en entraînant les analytes. La
phase mobile ne doit pas interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes.
- Chromatogramme : graphique d’une fonction de la concentration en analyte en fonction du
temps (ou du volume) d’élution.
c. Principe
- La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile à
travers une phase stationnaire. Celle-ci retient plus ou moins fortement les substances contenues
dans l'échantillon dilué selon l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les
forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces
moléculaires et la phase stationnaire.

- Les différents composants de l'échantillon ont généralement une vitesse caractéristique qui
permet de les séparer, voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est fortement
dépendante de la nature de la phase mobile et de la phase stationnaire.
d. Grandeurs caractéristiques en analyse chromatographique sur colonne
Le pouvoir séparateur d’une colonne est fonction des vitesses relatives d’élution. Ces vitesses sont
donc fonction du coefficient de distribution des solutés entre les 2 phases :
Le pic chromatographique est assimilable à une courbe de

Laplace - Gauss. Une telle courbe (courbe "en cloche") est
caractérisée:
- par son maximum M placé sur un axe de symétrie ;
- par deux points d'inflexion I et I’ ;
- par l'écart type noté σ, au niveau de points d'inflexion.
Si, par convention, on attribue la valeur 1 à l'ordonnée de M,
ces deux points d'inflexion ont une ordonnée voisine de 0,6.
Le pic chromatographique peut être considéré comme inscrit
dans un triangle isocèle ABC, dont les côtés sont tangents à la
courbe aux points d'inflexion.
On a également:
- ω (largeur du pic à la base) = 4 . σ
- δ ou ω1/2 (largeur du pic à la mi-hauteur)= 2,35 . σ
Tableau. Les grandeurs caractéristiques en chromatographie.

Grandeur Définition Loi
Coefficient de CS est la concentration du soluté en phase
distribution stationnaire et CM la concentration du
(de partage) soluté en phase mobile.
temps qui s’écoule entre l’injection de
Temps de l’échantillon et l’apparition d’un pic de
tR
rétention tR soluté sur le détecteur d’une colonne
chromatographique.
temps nécessaire pour qu’une espèce non
Temps mort tM
retenue par la phase stationnaire traverse tM
la colonne.
Temps réduit
t'R = tR − tM
t'R
Volume réduit
V'R = VR − VM
V'R

Vitesse linéaire
L est la longueur de la colonne.
moyenne de
déplacement
du soluté
Vitesse linéaire
moyenne de la
phase mobile
Débit D Le débit d’écoulement de la phase mobile.
paramètre expérimental important

permettant de décrire la vitesse de
progression des solutés dans les colonnes.
C’est le rapport des quantités d’un analyte
présentes à l’équilibre dans les 2 volumes
de phase stationnaire et mobile adjacentes.
Facteur de Le facteur de capacité dépend de la
capacité k' température (CPG), du remplissage de la
colonne (CPG), de la composition de la
phase mobile et stationnaire (HPLC)...
 k'<1 : élution trop rapide
 1<k'<5 : élution optimale
 5<k' : élution trop lente
L’efficacité d’une colonne dépend du degré
d’élargissement du pic qui se produit à
mesure que l’analyte parcourt la colonne.
Cet élargissement dépend du temps de
séjour de l’analyte dans les 2 phases :
 tR grand : pics larges ;
Élargissement  tR petit : pics fins.
des bandes et L’efficacité d’une colonne s’évalue à partir
efficacité d'une de l’un ou l’autre de ces deux termes :
colonne  H = hauteur équivalente à un plateau
théorique
 N = nombre de plateaux théoriques
L’efficacité augmente quand N augmente ou
quand H diminue à L constante. σ est la
variance, ω est la largeur de la base du pic,
δ la largeur du pic à mi-hauteur.
La résolution RS d'une colonne est la
mesure quantitative de son aptitude à
séparer deux analytes A et B :
 Si RS > 1,5 : séparation complète de A et B
 Si : séparation incomplète de A et
B
 Si RS < 0,75 : analytes A et B mal séparés
Lien entre résolution et nombre de plateaux
théoriques :
Résolution de Cette relation permet de remarquer que la
résolution RS d'une colonne est
la colonne
proportionnelle à la racine carrée de sa
longueur car le nombre de pics théoriques
N est proportionnel à la longueur L de la
colonne. Avec une phase stationnaire
donnée on peut améliorer la résolution de
la colonne en augmentant le nombre de
plateaux théoriques donc en augmentant la
longueur de la colonne. Mais ceci augmente
la durée de l’analyse, un compromis est
donc nécessaire.

rapport du coefficient de distribution du
soluté qui est retenu le plus sur le
coefficient de distribution du soluté qui est
Facteur de retenu le moins. Le facteur de sélectivité de
sélectivité α deux analytes permet d’estimer à quel point
la colonne peut les séparer. Il est donc
utilisé pour calculer le pouvoir séparateur
d’une colonne. α>1 toujours.
e. Méthodes d'optimisation
 Modification de la hauteur équivalent à un plateau théorique (diamètre colonne,
granulométrie…)
 Modification du facteur de capacité (composition phase mobile, température, solvant…)
 Modification du facteur de sélectivité (composition phase mobile, température colonne,
composition phase stationnaire, effets chimiques (complexes…)
f. Divers classifications des chromatographies

1. Classification selon la nature physique de la phase mobile (liquide, gaz)
2. Classification selon la manière dont est immobilisée la phase stationnaire (sur
colonne, de surface)
3. Classification selon la manière dont les solutés sont retenus dans la phase
stationnaire (par élution, par rétention)
4. Classification selon le type d’interactions entre solutés et phase stationnaire
(Adsorption, partage, échange d’ions, exclusion-diffusion, interactions
biospécifiques, interactions hydrophobes).

Année universitaire 2013/2014

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1. Chromatographie sur couche mince « CCM » ou Thin layer

chromatography «TLC»
1.1. Définition et appareillage
La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes
d'adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d'une
phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique
ou d'aluminium. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances
migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.
Les principaux éléments d'une séparation chromatographique sur couche mince sont:
- La cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé
par un couvercle étanche.
- La phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre adsorbant
est fixée sur une plaque de verre (ou aluminium ou plastique) à l'aide d'un liant comme le
sulfate de calcium hydraté (plâtre de Paris) l'amidon ou un polymère organique, elle est de 2
types :
 Polaire : gel de silice(ou oxyde de silicium : SiO2), l'alumine (ou oxyde d’aluminium Al2O3).
 Apolaire : polyamides (polymère organique du nylon), séphadex, RP-18, Cellulose.
- L'échantillon : environ un microlitre (µl) de solution diluée (2 à 5 %) du mélange à analyser,
déposé en un point repère situé au-dessus de la surface de l'éluant.
- L'éluant ou la phase mobile: un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long de la
plaque en entraînant les composants de l'échantillon. Il est de 2 types :
 Polaire : méthanol, eau distillée, éthanol, acétone…
 Apolaire : hexane, chloroforme, éther de pétrole ou benzène….
- Rq : lorsqu’on utilise une phase stationnaire polaire, la phase mobile doit être apolaire et vice
versa.
1.2. Principe de la technique
- Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve, l'éluant monte
à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de
l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant.
- Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la
plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se
déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l'action de
rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes
d'adsorption.
- Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité
migrent plus rapidement que les composants polaires.
1.3. Types de la CCM
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- CCM analytique : les plaques sont en plastique d’épaisseur de 0.2 mm de la phase stationnaire,
elle est utilisée pour détecter la constitution d’un produit ou sa pureté.
- CCM préparative : les plaques sont en verre d’épaisseur 1 mm de la phase stationnaire (20*20
cm ou 20*10cm), utilisée pour récupérer les fractions des produits séparés pour les étudier en
UV, IR, RMN ou SM.
NB : La CCM peut être effectué en une ou deux dimensions, pour une dimension est appelée la
chromatographie monodimensionnelle, pour 2 dimensions est appelée la chromatographie
bidimensionnelle.
1.4. Applications de la CCM
- Lorsque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle aisé et rapide de la
pureté d'un composé organique. Si l'analyse, réalisée avec divers solvants et différents
adsorbants, révèle la présence d'une seule substance, on peut alors considérer que cet
échantillon est probablement pur.
- De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de
composants d'un mélange, on peut l'employer pour suivre la progression d'une réaction.
- La chromatographie sur couche mince est également la technique habituell
- ement employée pour rechercher le meilleur solvant, avant d'entreprendre une séparation par
chromatographie sur colonne.
- Ex : séparation des acides aminés par CCM et le révélateur et la ninhydrine, séparation des
sucres et le révélateur est le réactif de Molish.
1.5. Description d'une analyse par CCM selon l'ordre chronologique
1.5.1. Préparation de la cuve chromatographique.
 Introduire l'éluant ou le mélange de solvants (qu’il est précédemment choisi selon la nature
de la phase stationnaire et de l’échantillon).
 Ajuster le niveau à environ 0,5 cm du fond de la cuve.
 Fermer le récipient (la cuve doit être saturée de vapeur de solvant). Pour que la saturation
et l'élution soient plus rapides, on peut placer une bande de papier filtre contre les parois
de la cuve chromatographique.
1.5.2. Préparation de la plaque CCM

 Tracer sur la plaque à l’aide d’un crayon de papier une ligne horizontale située à une
distance de 1 à 2 cm du bord inférieur de la plaque en faisant attention à ne pas rayer le
support, c’est la la ligne de dépôt des échantillons.
 Marquer les emplacements de dépôts à effectuer, ils doivent être espacés d’au moins 2 cm
et les deux extrêmes doivent se trouver à plus de 2 cm du bord.
 Tracer sur la plaque à l’aide d’un crayon de papier une ligne horizontale située à une
distance de 1 à 2 cm du bord supérieur de la plaque en faisant rayer le support, c’est le

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front de solvant.
1.5.3. Dépôt de l'échantillon sur la plaque.
 Dissoudre l'échantillon dans un solvant approprié en solution de 2 à 5 %.
 Déposer environ 0,5 µl de la solution en un point situé à 1 cm de l'extrémité inférieure de
la plaque (le point déjà marqué); le diamètre de la tache doit être d'environ 2 mm pour la
disposition de plusieurs produits. Pour la CCM préparative les taches sont de plus grande
taille et n’ont pas de forme circulaire.
 Sécher à l'aide d'un séchoir; éventuellement faire de nouvelles applications
1.5.4. Développement du chromatogramme.

 Placer la plaque dans la cuve en position verticale.
 Refermer le récipient.
 Lorsque le front du solvant se trouve à environ 1 cm de l'extrémité supérieure de la plaque
(la ligne déjà tracée), la retirer.
1.5.5. Révélation et calcul de Rf
 Sécher la plaque à l'aide d'un séchoir
 Révéler les taches sous une lampe UV ou à l'aide d'un révélateur ex : vapeur d’iode.
 Cercler les taches et pointer leur centre.
 Calculer les Rf (retarding factor ou rapport frontal) tel que Rf= di/ds ;
di : distance parcourue par le composé (mesure au centre de la tache) ;
ds : distance parcourue par le front du solvant.
NB : Pour un couple éluant et support déterminé, Rf est une caractéristique de chaque soluté à la
température de l'expérience. Rf est toujours indépendant de la longueur de bande utilisée.
2. Chromatographie sur papier ou paper chromatography

2.1. Principe de la technique et applications:
- La technique ressemble à celle de la CCM mais le principe repose sur des phénomènes de
partage.
- La phase mobile est le plus souvent un solvant organique et l'eau;
- la phase stationnaire est constituée par l'eau elle-même adsorbée sur la cellulose du papier ou liée
chimiquement à elle.
- Comme en chromatographie sur couche mince, l'échantillon, mis en solution, est déposé en un point
repère du papier et le solvant, qui se déplace par capillarité, fait migrer les composants de
l'échantillon à des vitesses variables selon leur solubilité.
- Généralement, les composés les plus solubles dans l'eau ou ceux qui forment facilement des
associations par liaisons hydrogène sont fortement retenus par la phase stationnaire et migrent
donc lentement.

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- Lorsque l'eau est un des solvants de la phase mobile, le ou les solvants organiques doivent y être
assez solubles. Des produits comme l'acide éthanoïque, le propanol, le phénol ou la pyridine sont les
solvants les plus fréquemment utilisés en mélange avec de l'eau pour développer un
chromatogramme.
- La chromatographie sur papier est employée principalement pour l'analyse de composés très
polaires, tels les acides aminés, les sucres et les composés polyfonctionnels.
- Ses plus grands inconvénients par rapport à la CCM sont:
 une durée de développement beaucoup plus longue
 une séparation généralement moins bonne.
- On peut utiliser du papier filtre ordinaire, mais il est préférable de se procurer du papier conçu pour
cet usage, ayant un faible taux d'impuretés et dont les caractéristiques sont uniformes. Les marques
principales sont Whatman, Schleicher et Schüll, Durieux, Arches.
- Il existe huit catégories de papier Whatman, classés selon leur épaisseur, la texture de leur surface
et la vitesse avec laquelle l'eau y diffuse. Par exemple le papier Whatman n° 1 est le plus utilisé, mais
si on désire une grande vitesse d'écoulement, on emploiera le n° 4; le papier n° 20 est très lent, mais
il permet une meilleure séparation, donnant des taches très denses et uniformes.
- La description de l'analyse par chromatographie sur papier est identique à celle sur couche mince.

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Série n°6 : Chromatographie sur couche mince « CCM »

Exercice 1 : déterminations des constituants des huiles essentielles de peaux d’orange
On effectue la chromatographie sur couche mince (CCM) de l’huile essentielle de peaux d’oranges.
On réalise les dépôts suivants :
* Dépôt 1 : Limonène
* Dépôt 2 : Linalol
* Dépôt 3 : Citral
* Dépôt 4 : huile essentielle de peaux d’oranges.
La plaque est placée, verticalement, dans un fond d’éluant. Après élution
et révélation, on obtient le chromatogramme ci-dessous.
1- Quel est le rôle de l’éluant ?
2- Les espèces déposées sont incolores. Que doit faire l’expérimentateur
pour révéler le chromatogramme?
3-a- Quels sont les constituants de l’huile essentielle de peaux d’oranges
? Justifier votre réponse.
3-b- Calculer le rapport frontal de chaque espèce chimique. Vérifier la
réponse donnée à la question 3-a-.
Exercice 2 :
Un corps gras naturel constitué d'un mélange de triglycérides (TG), est soumis à l'action de la lipase
pancréatique. Cette enzyme permet l'hydrolyse des acides gras en position 1 et 3 des TG, ce qui
mène à des acides gras libres (AGL) et des 2-monoglycérides (2-MG), lorsque la réaction est totale.
Les AGL ont été purifiés à partir du lipolysat par chromatographie échangeuse d'anions. Cette
chromatographie permet, outre la fraction AGL, de purifier une seconde fraction constituée de
glycérides neutres (GN). Différents échantillons ont été analysés en chromatographie sur couche
mince (gel de silice). Le mélange de solvant utilisé, de polarités différentes, étant : éther de pétrole /
éther diéthylique.
Les dépôts effectués sont :
1 : Témoin Triglycérides (TG)

2 : Témoin 1, 2-Diglycérides et 1, 3-Diglycérides (DG)
3 : Témoin Monoglycérides (MG)
4 : Témoin Acides Gras
5 : Echantillon milieu de lipolyse
6 : Echantillon Fraction Glycérides Neutres (GN) provenant de la
chromatographie échangeuse d'anions
7 : Echantillon Fraction Acides Gras Libres (AGL) provenant de la
chromatographie échangeuse d'anions
Questions :
1 - Donner en quelques lignes le principe de la chromatographie sur couche mince utilisée. En

fonction de quel(s) critère(s) les différents composés vont-ils être séparés ?
2 - Ecrire la réaction mettant en jeu les TG et la lipase pancréatique.
3 - Analyser le chromatogramme ci-dessus. Est-ce que la réaction de lipolyse est totale ?

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2. La chromatographie en phase gazeuse « CPG »

2.2. Historique
- En 1952, A.J.P Martin et A.T. James annoncèrent la naissance de la chromatographie en phase

gazeuse.
- Cette technique a vécu son âge d'or entre 1955 et 1960, avec l'invention des colonnes capillaires
par M.J.E. Golay (1957), du détecteur à ionisation à argon (1958), suivi du détecteur à ionisation
de flamme (1958) et du détecteur à capture d'électrons (1960).
2.3. Principe de la technique
- La CPG s'applique à des échantillons gazeux ou susceptibles d'être vaporisés (volatils) sans
décomposition dans l'injecteur.
- La phase mobile est alors un gaz inerte inactif avec les échantillons (soit : hélium, azote, argon ou
hydrogène), appelé gaz vecteur, qui balaie en permanence la colonne.
- Cette dernière, placée dans un four thermostaté, est un tube de faible section enroulé sur lui-
même et contenant la phase stationnaire.
- Un grand choix de détecteurs permet l'analyse sélective et parfois l'identification de mélanges
très complexes.
2.4. Types de CPG : Selon la nature de la phase stationnaire, la CPG est divisée en 2 :
- La chromatographie gaz-solide « CGS »: la phase stationnaire est solide, elle est appelée aussi
chromatographie d’adsorption.
- La chromatographie gaz-liquide « CGL »: la phase stationnaire est liquide, elle est actuellement
utilisé grâce à sa rapidité des analyses, elle est appelée aussi chromatographie de partage.
2.5. Appareillage
Les appareils de chromatographie gazeuse sont appelés chromatographes. Ils sont principalement
composés:
- d'un four (type chaleur tournante) qui permet une programmation de température ajustable de
20 °C (-100 °C pour certains systèmes) à 450 °C et qui est également équipé d'un système de
refroidissement rapide;
- d'un système d'injection, qui va permettre d'introduire et de rendre volatil l'échantillon à
analyser. L'injection peut se faire d'une manière manuelle ou automatique à l'aide d'un
échantillonneur; l’injecteur est de plusieurs types selon la colonne utilisée :
 Pour les colonnes remplie : injection directe, froide (on-column) et injection à l’aide
de vannes.
 Pour les colonnes capillaires : en plus des 2 premiers, injection avec division (split),
injection sans division (splitless).

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- d'une colonne sur laquelle les différentes molécules de l'échantillon injecté vont se séparer
suivant leurs affinités avec la phase stationnaire; elle est de 2 types (figure 12) :
 Colonnes remplies : en verre ou silice, longueur de 2m, diamètre de 3 mm.
 Colonnes capillaires : en acier inox ou verre, longueur de 10m à 100m, diamètre : 0,1
à 0,53 mm.
Figure 12. Sections des colonnes

- d'un système de détection : A la sortie de cette colonne, un détecteur très sensible et sélective
est placé, qui va permettre de mesurer le signal émis par les différentes molécules et de pouvoir
les identifier. Pour l'enregistrement du signal émis par le détecteur, des logiciels sur PC
remplacent avantageusement les enregistreurs analogiques sur papier; il est de plusieurs types :
 Un TCD : détecteur à conductivité thermique.
 Un FID : détecteur à ionisation de flamme
 Un ECD : détecteur à absorption électronique
 Un SM : détecteur à spectrométrie de masse.
- d'un système de détendeur-régulateur pour les gaz utilisés (hélium, hydrogène, azote et air
comprimé). Sur les chromatographes modernes, on trouve des systèmes électroniques pour la
régulation des gaz qui sont également purifiés par des cartouches filtrantes.
- La phase stationnaire doit résister à l’élévation de la température, elle est choisie selon la
nature des composés à analyser, ils ont classé par polarité croissante par exemple :
 Phases stationnaires polaires : polyéthylène glycols, cyclodextrines……..
 Phases stationnaires non polaires : diméthylpolysiloxane,……
- Le chromatographe est présenté dans la figure 13.
Figure 13. Le chromatographe
2.6. Applications analytiques

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2.6.1. Analyse qualitative

- Les phases stationnaires sont classées suivant leur constante de McReynolds qui est calculée à
partir des indices de rétention de Kovats.
- Pour une phase stationnaire donnée, si l’on injecte des alcanes d'une série analogue à n atomes
de carbone, les temps de rétention réduits permettent de tracer une droite dite de « Kovats »
d’équation log t’R = an + b avec a et b des constantes.
A partir de cette droite on définit l’indice de Kovats (de
rétention) pour un produit x:
La constante de McReynolds = Iphase - Isqualane.

Plus la valeur obtenue est élevée, plus la phase est polaire.
Remarque : le squalane est une phase de polarité nulle (hydrocarbure
paraffinique saturé).
Exemple :
On veut déterminer la constitution d’une huile essentielle par analyse en CPG en calculant les indices de
Kovats de chaque composé élué, nous avons élué les alcanes pour obtenir un chromatogramme (a), le
chromatogramme des huiles essentielles (b).
′ ′
𝑙𝑛𝑡𝑟(𝑥) −𝑙𝑛𝑡𝑟(𝑛) 𝑙𝑛45−𝑙𝑛30
I1= 100 (6)+100 ′ ′ = 600+100 = 658.49
𝑙𝑛𝑡𝑟(𝑛+1) −𝑙𝑛𝑡𝑟(𝑛) 𝑙𝑛60−𝑙𝑛30
′ ′
𝑙𝑛𝑡𝑟(𝑥) −𝑙𝑛𝑡𝑟(𝑛) 𝑙𝑛90−𝑙𝑛80
I2= 100 (8)+100 ′ ′ = 800+100 =852.78
𝑙𝑛𝑡𝑟(𝑛+1) −𝑙𝑛𝑡𝑟(𝑛) 𝑙𝑛100−𝑙𝑛80
À l’aide des bases de données, on peut déterminer le nom du composé par son indice de Kovats.
2.6.2. Analyse quantitative : Il existe plusieurs méthodes d’analyses quantitatives ex :
Méthode d’étalonnage interne : la plus utilisée, elle consiste à introduire un étalon interne dans
l’échantillon et il doit posséder ces caractéristiques :
 inerte (pas de réaction avec l’échantillon) ;
 absent dans le mélange à analyser ;
 Son temps de rétention est localisé au milieu du chromatogramme.
Pour chaque pic de l’échantillon, on applique : mi=ki . Ai avec : mi : masse injecté (à déterminer), ki :
coefficient de réponse, Ai : aire de pic.
Pour l’étalon interne, on applique : me=ke . Ae avec : me : masse injecté de l’étalon, ke : coefficient de
réponse, Ae : aire de pic de l’étalon. Ainsi on détermine la masse de chaque composé par :
m𝑖 𝑘 𝐴 𝐴𝑖
𝑚𝑒
= 𝑘 𝑖 ∗ 𝐴 𝑖 = 𝑘𝑖/𝑒 ∗ 𝐴𝑒
Donc
𝑒 𝑒
𝐴𝑖
𝑚𝑖 = 𝑚𝑒 ∗ 𝑘𝑖/𝑒 ∗
𝐴𝑒
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3. Chromatographie liquide à haute performance « HPLC »

3.1. Historique
On peut situer à 1967, grâce aux travaux de HUBER et HUZSMAN, le début de la chromatographie
liquide à haute vitesse, plus tard appelée à juste titre chromatographie liquide haute
performance (CLHP).
3.2. Principe :
- L'échantillon à analyser est poussé par la phase mobile liquide dans une colonne remplie d'une
phase stationnaire de fine granulométrie.
- Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de la
pression dans le système.
- Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les composants le long de la phase
stationnaire.
- La fine granulométrie de la phase stationnaire permet une meilleure séparation des composants.
- En effet, pour un même volume de phase stationnaire la surface d'échange augmente si les
"grains" qui la composent sont de diamètre plus petit.
- Les pics obtenus sont plus étroits donc la résolution est améliorée (les pics sont bien séparés, on
peut donc bien les différencier), le seuil de détection est également plus bas (des pics étroits et
hauts sont plus faciles à isoler du bruit de fond que des pics larges et bas).
- La combinaison de ces attributs - rapidité et résolution élevées - conduit à l'appellation « haute
performance ».
- Les solvants utilisés sont des combinaisons miscibles d'eau et de divers liquides organiques
(alcools, acétonitrile, dichlorométhane, ...).
- La composition de la phase mobile est modifiée au cours de l'analyse, c'est le mode dit
"gradient" ou "élution graduée" (en opposition au mode "isocratique", pour lequel la
composition de la phase mobile reste la même tout au long de l'analyse).
- Par exemple, sur une colonne apolaire, en utilisant un mélange eau/méthanol comme phase
mobile, les composants les plus hydrophobes sont élués avec une concentration élevée en
méthanol alors que les composants plus hydrophiles sont élués préférentiellement avec une
concentration faible en méthanol. Selon la nature de la phase stationnaire, on commencera par
une concentration élevée en méthanol ou le contraire.
3.3. Types de CL :
La chromatographie en phase liquide (CPL) est une méthode de séparation mettant en oeuvre
différents modes représentés sur la figure ci-dessous.

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3.4. Appareillage :
Dans tous les appareils de CLHP (figure 14), on retrouve un ensemble de modules reliés entre eux
par des tubes de faible diamètre. Une ou plusieurs pompes assurent le débit du solvant d'élution. En
amont de l'injecteur se trouve la ou les colonnes où s'effectuera la séparation puis en bout de chaîne
le détecteur.
- La pompe : C'est la partie qui sert à stocker l'éluant et à l'injecter sous pression dans la colonne,
elle permet de travailler en mode gradient et isocratique.
- Vanne d'injection : c'est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il existe des boucles de
différents volumes, (ex : 20μl, 25 µl..). Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la
taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser. Le système de la
boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour l'analyse
quantitative.
- Une colonne est un tube, souvent en inox ou en verre (matériau inerte aux produits chimiques).
Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs
généralement de 15 à 30 cm.
- La phase stationnaire :
 La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc
utiliser un éluant apolaire, les produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement
aux produits apolaire qui sortent en tête. L'inconvénient d'une telle phase, c'est une
détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de
reproductibilité des séparations.
 La phase inverse est majoritairement composée de silices greffées par des chaînes linéaires de
8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant
polaire (ACN, MeOH, H2O). Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en
premier. L’avantage : il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la
qualité de la séparation est donc maintenue constante.
- Les détecteurs : qui sont :
 Détecteurs universels (conventionnels) : spectrophotomètriques (UV-visible) et
réfractomètres.
 Détecteurs spécifiques : fluorimétrie, conductimétrie, électrochimie.

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Figure 14. Système classique de CLHP.

3.5.1. Analyse qualitative
L’analyse qualitative consiste à identifier les analytes par leur temps de rétention qui pour des
conditions données (solvant, débit, colonne etc) est caractéristique du composé.
3.5.2. Analyse quantitative
La surface d’un pic est proportionnelle à la quantité injectée de l’analyte correspondant.
On a alors : On écrira donc :
A = km*m A = kC*C
A = aire du pic A : aire du pic
m : masse du composé injectée. C : concentration du composé injectée.
km : coefficient de réponse massique du détecteur KC : est le coefficient de réponse du
dans les conditions utilisées. détecteur.
Dans la pratique, on injecte les composés en
solution et on préfère utiliser les concentrations
plutôt que les masses. Il y a proportionnalité entre
la masse injectée et la concentration du soluté, à
condition de toujours injecter le même volume de
solution.
- En plus de la méthode d’étalonnage interne, il existe une autre méthode appliquée pour la HPLC
qu’elle est : Méthode de l’étalonnage externe.
- La HPLC est appliquée pour :
 L’analyse des acides aminés.
 L’analyse des médicaments dans les liquides biologiques.
 L’analyse des extraits végétaux : tanins, composés phénoliques, alcaloïdes……..etc

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Série n°7 : Chromatographie« CPG » et « HPLC »
Exercice 1 : Séparation des esters méthyliques d'acides gras.

L'estérification des acides gras d'un corps gras naturel (un mélange de triglycérides) peut être
réalisée en incubant le corps gras avec du trifluorure de bore (catalyseur de la réaction) dans le
méthanol (CH3-OH, donneur des groupements méthyls), à 100°C durant 15 min.
Le chromatogramme ci-dessous représente le profil d'élution d'esters méthyliques d'acides gras
saturés et insaturés repris dans l'hexane après injection en chromatographie en phase gazeuse. Le
temps de rétention (tr) est indiqué en minutes, au-dessus de chaque pic :
rapport tr /
acide gras :
tr : aire (%) : tr C18:0
8.98 30.783 ac. laurique
0,12
(C12:0)
17.16 15.976
ac. myristique
19.00 29.293 0,25
(C14:0)
22.90 14.636 ac. palmitique
0,53
29.32 8.761 (C16:0)
ac. stéarique
1
(C18:0)
ac. oléique (C18:1
1,11
; 9)
ac. linoléique
1,33
(C18:2 ; 9, 12)
ac. linolénique
1,71
(C18:3 ; 9, 12, 15)
ac. arachidique
1,88
(C20:0)
ac. arachidonique
(C20:4 ; 5, 8, 11, 3,24
14)
Questions
1 - Quel est le principe de la chromatographie utilisée ? Il existe deux techniques pour une telle
chromatographie. Donnez en les principes en quelques lignes.
2 - Le standard interne est ici l'acide stéarique (C18:0) qui présente un temps de rétention de 17,16
minutes. A l'aide du tableau ci-dessus, déterminer la nature des autres acides gras élués. Que
représente le premier pic (tr : 1,7 min) ? Selon quel(s) critère(s) les acides gras sont-ils élués ?
3 - Calculer la masse des différents produits dans l'échantillon, sachant que l'on a injecté 132
microgrammes d'esters méthyliques d'acides gras saturés et insaturés.

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Exercice 2 : EMD 2 de Chimie Analytique (Partie 1, 2003-2004)
L'utilisation du mélange paracétamol et caféine comme analgésique et antipyrétique est utilisé

actuellement dans des nouvelles formulations pharmaveutiques. L'analyse qualitative et
quantitative, simultanée du paracétamol et de la caféine dans les médicaments sous forme de
comprimés, par HPLC a été réalisée en utilisant la méthode de 1'étalonnage interne.
L'étalon interne utilisé est le composé cétrimide de structure chimique semblable aux deux autres
mais il n'est pas présent dans la formule du médicament
Le chromatogramme ainsi que les paramètres de rétention sont représentés ci-dessous :
1- Analyse qualitative: Déterminer tous les paramètres chromatographiques (de rétention et de

séparation) sous la forme d'un tableau.
Discuter ce tableau est dire :
Si l'étalon interne convient bien pour cette analyse. Justifier votre réponse.
Si ces conditions sont optimales.
2- Analyse quantitative : Nous avons établi les courbes d'étalonnage du paracétamol et de la
caféine et nous avons déterminé les équations des droites respectives ; Le tableau suivant illustre
ces équations:
La phase mobile est un mélange de : eau/méthanol

20/80 v/v.
La phase stationnaire une colonne microbandapack
C18.
Où Y représente le rapport des hauteurs des pics du Caféine (ou du paracétamol) sur celui de
l’étalon interne.

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La méthode préconisée est précise et reproductible. Nous l'avons appliqué au dosage simultané de
caféine et du paracétamol dans deux médicaments différents. Nous avons obtenu les deux
chromatogrammes suivants:
l- A partir de ces deux chromatogrammes et

du tableau ci-dessus, déterminer les
concentrations respectives du Caféine et du
Paracétamol contenus dans ces deux
médicaments.
2- D'après les normes internationales
pharmaceutiques ce type de médicaments
doit contenir:
- 25µg/ml de Caféine
- 180 µg/ml de Paracétamol.
Comparer vos résultats aux normes et
conclure.

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4. Chromatographie d’affinité « affinity chromatography »

4.1. Historique
- Ce mode de chromatographie connaît depuis 1970 un développement sans précédent et est appelé à
prendre une place encore plus grande avec l'essor des biotechnologies.
4.2. Principe
- Elle est basée sur l’interaction spécifique et réversible qui peut exister entre 2 molécules : l’une
étant la macromolécule (protéine ou acide nucléique) à séparer, l’autre un ligand (ou effecteur)
immobilisé sur un gel inerte par covalence pour constituer la phase stationnaire.
- La phase mobile est un solvant ou mélange de solvant.
- La séparation se fera selon l’affinité du composé à analyser avec le ligand (reconnaissance grâce
à un site de liaison spécifique).
- Les liaisons entre le ligand et son partenaire son : des liaisons hydrogènes (le plus souvent),
hydrophobes et ioniques.
- Trois types d'affinités sont utilisés :
 affinité enzyme-substrat
 affinité ligand-récepteur
 affinité antigène-anticorps
- Très souvent, la molécule fixée sera le substrat, le ligand, ou bien l'anticorps. Ceci permettra de
purifier l'enzyme, le récepteur ou l'antigène, respectivement.
- La chromatographie d’affinité se déroule en 3 étapes (figure 15):
1- Etape de fixation : Le mélange de molécules contenant le composé à purifié est chargé sur la
colonne d'affinité. Seule la molécule présentant une affinité pour la colonne sera retenue par
l'effecteur greffé sur la phase stationnaire.
2- Etape de purification : En continuant à faire passer du tampon dans la colonne, toutes les
molécules contaminantes sont éliminées et éluées.
3- Etape d'élution : La molécule purifiée est décrochée de la colonne et est recueillie dans
l'éluat.
Figure 15. Les étapes de la chromatographie d’affinité
- Pour l’élution il faut changer les conditions par :

 pH (Ajout du Tampon) ou la force ionique (l’ajout du sel).

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 augmentation de la concentration du ligand libre (car il a plus d’affinité vers le récepteur)…..

4.3. Appareillage
- Cette chromatographie peut être sur colonne ouverte (à basse pression) ou sur colonne fermée
(à haute pression).
- La phase stationnaire (le gel d'affinité) : elle est constituée d'un effecteur fixé par covalence à un
support (carboxyméthylcellulose, Séphadex, gel de polyacrylamide) par l'intermédiaire d'un
bras de fixation ("spacer" en anglais).
Le support doit posséder ces propriétés :
 Insoluble dans l’eau.
 Stable chimiquement et mécaniquement.
 Contient des groupements fonctionnels permettant la fixation des
spacers.
- Généralement les supports utilisés sont des dérivés de la carboxyméthylcellulose ou CM-

cellulose ex :
 La CM-aminohexylique : permet la fixation d'un effecteur à fonction carboxyle.
- O - CH2 - CO - NH - (CH2)6 - NH2 (spacer long)
 La CM-hydrazide : permet la fixation d'un effecteur à fonction carboxyle.
- O - CH2 - CO - NH - NH2 (spacer court)
 La CM- aminohexylique (ou aminododécylique) succinylée : permet la fixation d'un
effecteur à fonction - NH2 réactive.
- O - CH2 - CO - NH - (CH2)n -NH - CO - CH2 - CH2 - COOH (n = 6 ou 12, spacer long)
Rq : La longueur du bras est choisie de manière à limiter les contraintes stériques.
- Effecteurs :
 Affinité enzyme-substrat: substrats, analogues, inhibiteurs réversibles, effecteurs allostériques,
coenzymes.
 Affinité ligand-récepteur: haptènes (une molécule de faible poids moléculaire antigènique),
antigènes, anticorps.
 Affinité antigène-anticorps: hormones, peptides, analogues peptidiques.
Cette technique consiste à purifier une protéine (analyse qualitative) et elle peut déterminer la
quantité de cette protéine (analyse quantitative), les grandeurs utilisées sont les mêmes pour une
chromatographie liquide.

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5. Chromatographie ionique « ion chromatography »

5.1. Historique
- Est une technique récente apparait en 1970 par H. Small, T. S. Stevens et W. L. Bauman qui ont
associé la chromatographie d’échange d’ions comme technique et la conductimétrie comme
détecteur.
5.2. Types :
La chromatographie ionique est une méthode de la CL qui basée sur la séparation et l’analyse des
ions (cations/anions, organique/inorganique ou molécules ionisables) à un pH donné, elle est de 3
types :
 La chromatographie d’échange d’ions (ou échangeuse d’ions)
 La chromatographie de paires d’ions.
 La chromatographie d’exclusion d’ions.
5.3. Principe de la chromatographie échangeuse d’ions
- La phase stationnaire : un échangeur d’ions, un solide « organique (résine ou cellulose) ou
minéral » comportant des groupements fonctionnels ionisés, fixes, porteur de charge +/-, avec
des ions mobiles de charge contraire pour assurer la neutralité (figure 16).
Résine-G+/ Y- + anion- <=> Résine-G+/anion- Résine-G-/X+ + cation+ <=> Résine-G-

+ Y- /cation+ + X+
Résine anionique : qui échange réversiblement des Résine cationique : qui échange réversiblement
anions. Une résine anionique est chargée des cations. Une résine cationique est chargée
positivement. négativement.
Figure 16. Principe de la chromatographie échangeuse d’ions.
- La séparation est basée sur la différence d’affinité vis-vis de la résine et la vitesse de migration.
- L'élution consiste à déplacer l'ion fixé par un autre, de densité de chargé et de concentration plus
élevée on utilise de petits ions fortement chargés : Cl-, HO-, Na+, H+...
- Les groupements fonctionnels des résines cationiques (résines classées d'après leurs aptitudes à
l'ionisation) :
Résine sous forme Résine sous forme
Résine cationique Exemple
acide sodique
sulfoniques (très fortement
Résines cationiques Résine-SO3-/H+ Résine-SO3-/ Na+
ionisées, quel que soit le
fortes : (contre-ion : H+) (contre-ion : Na+)
pH):
Résines cationiques
à groupement phospho : Résine-H2PO4- / H+ Résine-H2PO4- / Na+
intermédiaire :

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carboxyliques (non ionisées

Résine-COO- / H+ Résine-COO- / Na+
Résines cationiques en milieu fortement acide) :
faibles : à groupement
Résine-CH2-COO- / H+ Résine-CH2-COO- / Na+
carboxyméthyl :
Résines cationiques phénoliques (uniquement
Résine-O- / H+ Résine-O- / Na+
très faibles : ionisées en milieu alcalin) :
- Les Groupements fonctionnels des résines anioniques :
 Résines anioniques fortes :
 résines à groupements aminés quaternaires.
 résines à groupements aminés tertiaires.
 Résines anioniques faibles :
 résines à groupements aminés secondaires et primaires.
5.4. Appareillage
La chromatographie par échange d'ions se pratique le plus souvent sur colonne en

basse/moyenne/haute pression, mais la méthode peut être transposée sur couche mince. Du papier
échangeur d'ions est également commercialisé.
5.5. Applications analytiques : c’est toujours la même chose et pour plus de détail voir TD.
Elle est utilisée pour la séparation des protéines et des acides nucléiques……..
6. Chromatographie d’exclusion moléculaire ou Gel filtration

6.1. Historique
- Elle a été inventée en 1955 mais en 1964, J. C. Moore a publié ses travaux dans la préparation
des colonnes d’une chromatographie de gel filtration basée sur les granules de polystyrène (avec
porosité contrôlée).
6.2. Principe
- La chromatographie d’exclusion stérique (CES) permet la séparation des molécules en fonction
de leur taille et de leur forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux (figure 17).
- Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont
donc éluées les premières, au niveau du volume mort (Vm ou V0). Les petites et moyennes
molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée.
- Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires. Il existe une relation
linéaire entre le volume d'élution et le logarithme de la masse moléculaire.

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.
Figure 17. Principe de la chromatographie gel filtration
6.3. Appareillage
- Cette chromatographie s’effectue sur colonne ouverte ou fermé, elle contient les mêmes
éléments que la chromatographie sur colonne ouverte ou la HPLC, mais la différence est dans la
phase stationnaire ou le gel.
- Les gels sont de 2 types :
 Gels hydratés (les plus utilisés) : qui présente une grande affinité vers l’eau, ex : le
SéphadexTM (G10 à G200) qui sont des polyosides bactériens de type dextran et le
SépharoseTM (agarose).
 Gels permanents : ce sont des copolymères organiques ou bien des minéraux (silice). Ici, des
effets d'adsorption s'ajoutent au tamisage moléculaire.
- Les critères de choix d’un gel (pour une meilleure sélectivité) sont :
 Le Gain d’eau : correspond au nombre de grammes d'eau fixés par gramme de
substance sèche.
 Le diamètre des pores
 La limite d’exclusion
- Cette technique est utilisée pour déterminer le poids (masse) moléculaire d’une protéine grâce à
la relation linéaire entre le logarithme décimale de ce dernier et le volume d’élution.
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- Les résultats sont représentés (figure 18) :

 Soit l'on porte logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution (Figure 2
ci-dessous) : log MM = f (Ve)
 Soit l'on porte logarithme de la masse moléculaire en fonction du KAV, le coefficient de partage
entre la phase liquide et la phase gel : log MM = f (KAV). Le KAV, est le coefficient de partage
entre la phase liquide et la phase gel : KAV = (Ve - Vm) / (Vt - Vm) avec :
 Vt = volume total (il est mesuré en remplissant la colonne d'eau)
 Vm = volume mort (il est déterminé en mesurant le Ve d'une substance totalement
exclue)
Figure 18. Détermination d’une masse moléculaire inconnue.

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Série n°8 : Chromatographies d’affinité, échangeuse d’ions et exclusion

de gel
Exercice 1 : Chromatographie gel filtration
A/ On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des
protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (MM) en Daltons (Le débit de la colonne
est de 5 ml / min) :
Protéine MM tr (min)
Aldolase 145000 10,4
Lactate
135000 11,4
déshydrogénase
Phosphatase
80000 18,4
alcaline
Ovalbumine 45000 26,2
Lactoglobuline 37100 28,6
1 - Rappeler à quoi correspond le Dalton.
2 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve.
3 - Pour la glucokinase, tr = 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l'aide du graphique
précédent.
B/ Un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM =
67000 Da) est déposé sur colonne de séphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da).
Rappel : MM = masse moléculaire.
1 - Tracer un diagramme d'élution vraisemblable (DO en fonction de Ve) en indiquant le volume
mort.
C/ On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d'une protéine p par chromatographie
d'exclusion. La limite d'exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM. L'étalonnage du gel
se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les volumes d'élution (Ve,
exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant :
MM (Da) Ve (ml)
Dextran 2000000 45
Fibrinogène 340000 60
Catalase 230000 75
Lactoglobuline 19000 132
1 - Rappeler à quoi correspond le Dalton.
2 - La protéine p montre, quant à elle, un volume d'élution Ve = 113 ml. Déterminer sa MM.
Exercice 2 : Chromatographie échangeuse d’ions
A/ Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est
soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide
d'un tampon à pH = 6.
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1 - Dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ?

B/ Soit un mélange de 2 polypeptides A et B, et d'un octapeptide C. La composition globale en
acides aminés, pour chacun de ces peptides, est la suivante :
Nombre de résidus :
AA pKa
peptide A peptide B peptide C
Arg 12 8 12 2
Lys 10 12 16 1
Glu + Asp 4,5 13 10 -
His 6 2 8 -
Cys 8 2 1 1
a - NH2 7,8 2 1 1
a - COOH 3,8 2 1 1
Questions :
1 - Que peut-on dire du peptide A ?
2 - A pH = 4,5, quelles sont les charges globales de A, B et C ?
3 - On veut séparer ces trois composés par chromatographie échangeuse d'ions. Quel type de résine
allez-vous choisir ?
4 - A pH = 4,5, ces composés sont-ils fixés sur la résine ? Comment éluer les produits fixés ? Quel
sera l'ordre d'élution des composés retenus ? A quel pH élue t'on le peptide C ? Conclusions ?
Exercice 3 : Purification des protéines en utilisant les 3 techniques chromatographiques

Une enzyme a été purifiée en trois étapes, en partant de 1000 g d'un extrait brut contenant au total
20000 unités de cette enzyme.
Questions :
1 - Compléter le tableau ci-dessous :
taux de
protéine (g) : activité (UE) : rendement :
purification :
Extrait brut 1000 20000
Chromato. d'exclusion 200 14000
Chromato. d'échange
15 4500
d'ions
Chromato. d'affinité 0,5 3500
2 - Quelles conclusions peut-on tirer de cette étude ?

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Exercice 4 :
Nous avons deux mélange protéiques et nous voulons les séparer en utilisant la chromatographie
échangeuse d’ions avec un pH de séparation = 7, les mélanges des protéines avec leurs pHi sont
montrés dans le tableau suivant :
Le mélange Les protéines pHi

Sérumalbumine 4,9
A Uréase 5
Chymotrypsinogène 9,5
Ovalbumine 4,6
B Cytochrome c 10,65
Lysozyme 11
1. Donner le principe de la chromatographie échangeuse d’ions.
2. Quels sont les types de la chromatographie échangeuse d’ions ? Donner le principe de
chaque type.
3. On veut séparer chaque mélange en utilisant un type de la chromatographie échangeuse
d’ions, Déterminer le type approprié pour chaque mélange. Justifier votre choix. Discuter
l’élution ou la rétention de chaque protéine.
Charge à Type de Rétention ou

Le mélange Les protéines pHi
pH=7 chromatographie élution
Sérumalbumine 4,9
A Uréase 5
Chymotrypsinogène 9,5
Ovalbumine 4,6
B Cytochrome c 10,65
Lysozyme 11

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7. Electrophorèse « electrophoresis »
7.1. Historique
- Elle a été décrit il y a un siècle par Kohlrausch, Il a fallu attendre jusqu’en 1937 pour que Tiselius
montre l’utilité de la méthode à frontière mobile pour séparer les protéines du sérum sanguin.
- À partir de 1976, les acides nucléiques et les nucléotides ont été analysés avec une
extraordinaire finesse par électrophorèse permettant de connaître la séquence des ADN (acide
désoxyribonucléique), nucléotide par nucléotide.
7.2. Principe
- L‘électrophorèse est une technique importante dans la purification et la séparation de très
nombreuses molécules chargées électriquement, fondée sur leur mobilité sous l’effet d’un champ
électrique et en contact du support approprié.
- Elle est devenue un outil principalement analytique, indispensable à la détermination de
propriétés de molécules aussi essentielles que leur point isoélectrique, leur mobilité
électrophorétique (µ) et leur taille.
- Des particules ayant une charge électrique nette et soumises à l'action d'un champ électrique se
déplacent dans la direction du champ vers le pôle de signe opposé à leur charge, à une vitesse
proportionnelle à cette charge : les anions (-) se déplacent vers l’anode (+), les cations (+) se
déplacent vers la cathode (-).
7.3. Comparaison entre chromatographie et électrophorèse
Caractéristique électrophorèse chromatographie
Migration des espèces en solution La répartition des molécules d’un

porteuse de charges électrique à constituant entre 2 phases non
Principe
l’effet d’un champ électrique et en miscibles suivant un coefficient de
contact d’un support approprié. partage Kd.
Phase de
séparation et
interactions
Protéines, acides nucléiques, Acides Aminés, sucres simples, huiles

Echantillon
polypeptide essentiels, protéines
Basée sur les forces ioniques

Phase mobile (tampon), variation de PH, Propriétés Solvant ou mélange de solvants
dénaturantes, et chimiques
Tamis moléculaire Phase stationnaire

Phase solide
Exemple: gel d’Agarose Exemple: gel de silice

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UV- visible, électrochimie, UV- visible, électrochimie,

Détecteur
Fluorescence, Spectrométrie de masse Fluorescence, SM
7.4. Facteurs influençant l’électrophorèse
Effet de la force Effet du rayon r Effet de la Effet de la
Effets de la charge
ionique µ de la particule viscosité ƞ température Ɵ
u↘ si µ ↗ u ↘ si r ↗ u ↘ si ƞ ↗ u ↘ si Ɵ ↗
La mobilité ↘ La mobilité ↘ La mobilité ↘ La mobilité ↘
lorsque la force lorsque le rayon lorsque la lorsque la
ionique↗ de la particule ↗ viscosité↗ température ↗ car
la viscosité ↗.
7.5. Types d’électrophorèses
8.5.1. Selon le but de l’analyse
a. électrophorèse analytique : Elle a pour but la séparation du plus grand nombre possible de
constituants d'un mélange. Les supports souvent utilisés sont les gels d'amidon, de
polyacrylamide et d'acrylamide-agarose, gels possédant les propriétés filtrantes qui permettent
de séparer les particules non seulement en fonction de leur charge électrique mais aussi de leur
taille.
b. électrophorèse préparative : Elle a pour but d'obtenir des quantités plus ou moins
importantes d'un ou plusieurs constituants d'un mélange ; aussi le rendement de l'opération
doit-il être pris en considération aux dépens de la finesse de la séparation. Les supports utilisés
sont la cellulose, la poudre d'amidon et les gels d'acrylamide.
8.5.2. Selon la manière d’immobilisation de support
a. électrophorèse zonale (EZ): c’est une électrophorèse sur surface, elle est de 2
types :
i. EZ sur couche mince ou sur gels horizontaux :
- C’est la forme la plus simple.
- Très utilisée pour la séparation analytique et préparative.
- Utilise des supports poreux, imbibé dans un tampon et inerte pour minimiser le phénomène de
diffusion.
- Elle est utilisée pour des molécules de faible poids moléculaires.
- Les supports sont : Papier (Séparation des Acides Aminés, Peptides, Protéines, Nucléotides),
Acétate de cellulose (Séparation des substances radioactives, des Acides Aminés, Peptides,
Protéines, Nucléotides, Permet la quantification) et Silice (Séparation de protéines ou
d’hydrolysat de protéines de 2 dimension), gel d’agarose (pour l’analyse d’ADN et les produits de
restriction).

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Dépôt de côté du support Dépôt au milieu du support

- Elle est de différents types :
Immunoélectrophorèse (IEP) Bidimensionnelle Isoélectrofocalisation (IEF)
pour détecter une interaction C’est une méthode très est une méthode de séparation des
antigène/anticorps, L’IEP est une résolutive et très reproductible. protéines dans un courant
méthode de fractionnement des L’analyse des protéines se fait électrique suivant leur point
protéines présentes dans le sang, par leurs coordonnées spatiales: isoélectrique pHi ou pI avec un
après contact du liquide à analyser leurs PHi (première dimension), gradient de pH.
avec des anticorps marqués. et leurs masses moléculaires une protéine se déplacera et se
(deuxième dimension). fixera au pH ou sa charge nette est
égale à zéro.
ii. EZ sur gels verticaux :

- Séparation de substances à haut poids moléculaires (protéines, Acides nucléiques) en utilisant
des gels comme support.
- Les gels utilisés sont divers et par exemple : Gel d’agarose, gel de polyacrylamide…….
 Gel de polyacrylamide :
 utilisé pour la Séparation des molécules de poids moléculaire 104 à 106 Da ;
 possède une faible capacité d’adsorption ;
 Analyse quantitative et révélation par fluorescence car il n’absorbe pas à l’UV.
 il est constitué d’acrylamide (neurotoxique) et de bis-acrylamide (agent réticulant et il est
neurotoxique).
- Elles sont de types :
 Electrophorèse en milieu non dénaturant (Gel PolyAcrylamide Electrophoresis
« PAGE ») :
- Généralement, la séparation des protéines est basée sur leur charge et leur taille (influence de la
porosité du gel ou support).
- En plus, c’est une migration à l’état natif (structures oligomériques conservées).

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 Electrophorèse en milieu dénaturant (SDS-PAGE des protéines) :

- SDS : sodium dodécyl sulfate (détergent ionique en C12), son rôle est :
 Solubilise généralement les protéines.
 Dénature les protéines par le dépliement de leurs structures tridimensionnelles, la
séparation des sous unités protéiques et la migration des monomères.
- Ici la séparation et basée seulement sur le poids moléculaire (taille) puisque toute les protéines
dénaturées sont chargées négativement.
 Applications analytiques :
En plus de la séparation des

macromolécules, l’électrophorèse
zonale (généralement sur gels) est
utilisée dans la détermination du
poids moléculaire en utilisant des
marqueurs de poids moléculaires
connus.
 Appareillage : un générateur électrique, les électrodes (anode et cathodes), les 2 réservoirs

de tampon, le gel de séparation, peigne pour former les puits, plaques en verre pour couler
de gel.
b. électrophorèse capillaire : est une électrophorèse sur colonne et elle est basée
sur :
- Utilisation d’un champ électrique très élevé (200 – 500 V/cm) pour avoir une séparation rapide
à haute résolution.
- Nécessite quelques nl de l’echantillon (0.1 – 10 nl).
- Utilisation de détecteurs quantitatifs tels que ceux de la HPLC.
- Elle est de 2 types :
 Electrophorèse capillaire pure : elle comporte :
 Electrophorèse capillaire de zone ECZ : Nommée aussi ECZ libre (FCZE). Mise en œuvre
simple avec une bonne séparation.
 Electrophorèse capillaire sur gel ECG : elle combine la bonne résolution de
l’électrophorèse classique sur gel et la simple instrumentation utilisée en ECZ.

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 Isoélectrofocalisation capillaire EIFC : Cette séparation n’est pas basée sur la différence
de mobilité électrophorétiques mais par la différence de pHi des solutés.
 Electrophorèse capillaire couplée (électro-chromatographie) : elle comporte :
 Electrochroamatographie capillaire CEC : L’électrochromatographie apporte à
l’électrophorèse capillaire la sélectivité des phases stationnaires de la HPLC, et à cette
dernière les efficacités élevées rencontrées en CE {hybride entre les avantages de l’EC et la
HPLC}.
 Electrocinétique capillaire EKC : Technique qui permet la séparation de solutés neutre
et/ ou chargés.
- Appareillage :
Figure 19. Schéma de l’appareillage d’électrophorèse capillaire

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Département de Biologie- TD TAB- 2013/2014
Série n°9 : Techniques électrophorétiques
Exercice 1 : Séparation électrophorétique de trois acides aminés :
L'électrophorèse d'un mélange de trois acides aminés : acide aspartique (Asp), lysine (Lys) et valine
(Val), effectuée à pH= 2, montre le profil électrophorétique suivant :
Acide aminé pHi
Asp 2,98
Lys 9,74
Val 5,97
1. Indiquer sur le profil électrophorétique, la position des trois acides aminés du mélange. Justifier
la réponse à l'aide des pHi des acides aminés (voir tableau).
2. Justifier l'emplacement de la ligne de dépôt du mélange.
Exercice 2 : Séparation électrophorétique de trois acides aminés :
La papaïne, enzyme d'origine végétale, présente de nombreuses applications industrielles

(brasserie, hydrolysat de poissons, ...) et pharmaceutique. Elle est extraite d'un latex obtenu à partir
de la tige, des feuilles et des fruits du papayer. A partir d'un extrait E1 de latex, on prépare par
filtration sur Kieselguhr de la papaïne "industrielle" (extrait E2), puis par gel-filtration de la
papaïne commercialisée (extrait E3).
1. Etude des extraits E2 et E3 par électrophorèse sur acétate de cellulose.
Une électrophorèse sur acétate de cellulose des extraits E2 et E3 donne les résultats schématisés
sur la figure 1 (électrophorégrammes A et B). L’utilisation en parallèle, d'étalons (chymopapaïne,
lysozyme, papaïne purifiée) donne les résultats également schématisés sur la figure 1
(électrophorégrammes C, D et E).
L’électrophorèse est réalisée dans les conditions suivantes :
- tampon Tris-glycine pH= 9,3 ;
- ddp = 200 v ;
- dépôt de 10 µL à 50 g/l ;
- coloration à l'Amidoschwartz.
1.1. Analyser les résultats obtenus. Quel est l'ordre de grandeur du pHi des protéines impliquées
dans l'électrophorèse ? De quel type de protéines s'agit-il?
1.2. Justifier l'utilisation de l'extrait E3 en pharmacologie.

L3 Biochimie
2. Détermination de la masse molaire moléculaire M de la papaïne pure

La masse molaire moléculaire de la papaïne pure est déterminée par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide à pH= 7, après traitement par le dodécyl-sulfate de sodium (SDS).
Le tableau ci-après indique les distances de migration (d) mesurées dans les mêmes conditions
pour différentes protéines étalons et pour la papaïne pure :
2.1. Donner le principe de la méthode d'étude.
2.2. Déterminer la masse molaire moléculaire de la papaïne pure.
Protéines M en g/mol d en mm
Ovalbumine 43000 37,6
Pepsine 34700 44,5
Myoglobine 17200 70,0
Cytochrome c 13500 79,0
Papaïne pure ? 59,5

L3 Biochimie
Références bibliographiques :
Bibliographie
 Carole Mc Quarrie, Donald A. McQuarrie, Peter A. Rock, Chimie générale, De Boeck

Supérieur, 10 nov. 2000 - 1174 pages
 Émile Biémont, Spectroscopie moléculaire: Structures moléculaires et analyse spectrale, De
Boeck Supérieur, 18 mars 2008 - 428 pages.
 Françoise Lafont, Christian Plas, Patrice Cazaubon, Exercices de biochimie: biologie
générale, analyse biochimique, biochimie clinique, Doin, 2000 - 381 pages.
 Filippo Rusconi, Manuel de spectrométrie de masse à l'usage des biochimistes, Lavoisier, 1
mai 2011 - 640 pages.
 Gérard Coutouly, Emile Klein, Eric Barbieri, Mostafa Kriat, Travaux dirigés de biochimie,
biologie moléculaire et bioinformatique, Doin, Oct 2, 2006 - 346 pages
 H. Gunzler, IR Spectroscopy. An Introduction, 1ère ed., Wiley-VCH, 2002.
 Jonathan Clayden, Stuart Warren, Nick Greeves, Peter Wothers, Chimie organique, De Boeck
Supérieur, 10 déc. 2002 - 1534 pages.
 Steven S. Zumdahl, Chimie des solutions, De Boeck Supérieur, 1999 - 442 pages
Webographie
Cours et TD :
www.123bio.net
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/chromato/A1.html
http://www.sciences-en-
ligne.com/DIST/Data/Ressources/lic2/chimie/chi_exp/chromatographie/meth_chromato.htm
www.techniques-ingenieur.fr/
Bases de données :
http://sdbs.db.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi
https://irdatabase.globalcache.com/
http://www.nmrdb.org/
http://www.chemspider.com/
https://www.cas.org/content/chemical-substances
http://www.massbank.jp/?lang=en
www.sigmaaldrich.com/
http://webbook.nist.gov/chemistry/name-ser.html

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Figure 1. Schéma réactionnel de la dissociation de l’eau

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Figure 2. Structure 2D et 3D de la molécule d’eau

- L’angle entre deux O-H dans la molécule d’eau est de 104,5°.

Figure 3. Schéma représentant le phénomène de solvatation

II. Solutions acides et bases

8 Benarouskh_Cours de TAB. http://geniebiologique.e-monsite.com

Figure 4. Echelle de pH à gauche et photo de Sörensen à droite

Figure 5. Exemples des pH de quelques liquides biologiques.

2. Des Définitions des acides et bases

 HCl(g) →H+(aq) + Cl-(aq)

b. Selon Brönsted (Brønsted) (un chimiste Danois, 1879-1947, Def en 1923) et

est un donneur de protons. HA 

Exemples: Couple acide éthanoïque /ion éthanoate: CH3CO2H/CH3CO2-

c. Selon Lewis (un chimiste et un physicien américain, 1875-1946, def en 1923)

Une base : c’est un donneur des doublets d’électrons. Ex :

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3. Equilibres de dissociation, sa constante et le degré d’ionisation

HA  H 2O  H3O  A HAH 2O

CH 3COOH H 2O

  0, K  0 non électrolyte « pas de dissociation »

0   1 électrolyte faible dissolution partielle

Une augmentation de K Une production importante des ions

4. La force des acides et des bases

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On définit alors la constante d'acidité :

b) Constante de basicité Kb et pKb

5. Calcul de pH des solutions aqueuses acides et bases

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pH d’un acide fort pH = - log C

pH d’un acide faible pH = 1/2(pKa – log C0)

pH d’une base fort pH = log C + 14

pH d’une base faible pH = 1/2(14+pKa + log C0)

pH d’un acide et de sa base

6. Titrage acide –base

Ex : bleu de bromothymol, pKa = 6,8

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- Nous distinguons 4 cas (figure 7):

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1. Titrage d'un acide fort par une base forte:

2. Titrage d'un acide faible par une base forte

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Figure 7. Courbes de titration

III. Solutions tampons

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Tableau 2. Structures et pKa de quelques solutions tampons

Composé Structure pKa1 pKa 2 pKa 3

Acide acétique CH3COOH 4.76

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H 2CO3  H 2CO3  H 2CO3  H 2CO3  3 2 3

Ex2: calculer le pH d’une solution mélange de 5 ml d’acétate de sodium à 0.1 M et 4 ml d’une

CH 3COOH   4 * 0.1  5.10 2 M

CH 3COOH   4 * 0.1  1* 0.1  5.10 2 M La variation de pH=∆pH=0.19~0.2

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Série n°1: Acides et Bases

Exercice 2 : Acide fort et mélange des acides forts

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