UNIVERSITÉ SULTAN MOULAY SLIMANE

Faculté des Sciences et Techniques

Béni-Mellal

Master : Ingénierie des Matériaux – Option: Matériaux Organique, Polymère et

Formulation

Module
Technique Séparatives et Extractives

Responsables:
Dr. S. ZAZOULI
Dr. M. EDDAHMI
Mr. A. HIBOT

Année universitaire
2021/2022
 AVANT-PROPOS

Ce manuel renferme les modes opératoires ainsi que les explications théoriques de l’ensemble
des manipulations destinées aux étudiants inscrits en Master Matériaux Organique, Polymère
et Formulation.

Notre but est de familiariser l’étudiant à la méthode d’extraction et de séparation en utilisant

le maximum de techniques de Laboratoires: Chauffage à reflux, extraction solide-liquide,
chromatographie sur couche mince, chromatographie sur colonne…

Le rôle de l’étudiant, sera donc d’isoler le produit de la réaction ou bien d’extraction avec le
meilleur rendement possible mais aussi avec l’indice de pureté le plus élevé.

Le temps passé en salle de travaux pratiques est généralement court et précieux, pour cela les
étudiants auront à préparer soigneusement chaque manipulation avant d’arriver en salle. Un
compte rendu sera remis par chaque binôme à la fin de chaque séance.

Avant de commencer l’expérience, il est essentiel de comprendre ce que l’on va faire,

pourquoi et comment on va le réaliser, ainsi tout étudiant doit préparer sa manipulation en
répondant aux questions théoriques posées à la fin de chaque T.P.

Au cours de chaque séance, et à tout moment, l’étudiant peut être interrogé sur son travail. Il
devra prouver qu’il comprend parfaitement ce qu’il fait. Signalons, à cet effet, qu’une partie
de la note du compte rendu tiendra compte de la façon de manipuler et la participation de
chaque étudiant en salle de travaux pratiques.
MATERIELS ET TECHNIQUES DE BASE

1. Extractions
L’opération d’extraction consiste à transférer une espèce chimique d’une phase à une autre.
La phase finale est, généralement, un liquide dans lequel le produit recherché est soluble.
Lorsque la phase de départ est constituée d’un mélange solide, on utilise une extraction
solide-liquide, lorsque la phase de départ est une solution liquide. Seule l'extraction liquide-
liquide est présentée ici, sachant que ses grands principes sont applicables à l'extraction
solide-liquide en utilisant un appareil de Soxhlet. Chaque extraction ou lavage est suivie
d’une décantation.

1.1. Extraction solide/liquide

L’extraction solide-liquide est la technique la plus utilisée pour la récupération de molécules

bioactives à partir de sources végétales. Elle est largement appliquée en industries agro-
alimentaire et pharmaceutique pour extraire des composés d’intérêt à partir des plantes pour la
production de boissons et de médicaments.

Principe:

L’extraction solide-liquide est une opération physique de transfert de matière entre une phase
solide, qui contient la substance à extraire et une phase liquide (le solvant d’extraction). Suite
au contact entre le solvant et le solide hétérogène, les substances ayant une affinité pour le
solvant sont solubilisées et passent de la phase solide dans la phase liquide. Au cours de
l’extraction, leurs teneurs (fractions) dans la phase solide diminuent et leurs concentrations
dans la phase liquide augmentent. Le transfert de matière se réalise par diffusion moléculaire
et par convection. L’extraction est un processus non stationnaire qui s’arrête au moment où
s’établit un équilibre entre les deux phases. Cependant si le solvant est continuellement
renouvelé, la diffusion se poursuit jusqu’à épuisement de la phase solide. Généralement,
l’extraction n’est pas très sélective. En plus des molécules d’intérêt, d’autres substances sont
également co-extraites à partir de la phase solide vers le solvant. La solution obtenue est
appelée extrait. La matière solide obtenue après évaporation du solvant est aussi appelée
extrait ou extrait sec. La source solide épuisée après l’extraction contient très peu ou pas de
soluté. Elle est appelée raffinat ou résidu (Schéma 1).
 Schéma 1: Représentation schématique de l’extraction solide-liquide

2. Chauffage à reflux
La température est un facteur cinétique : la vitesse des réactions augmentavec la température
d’après la loi d’Arrhenius. Lors d’une synthèse, le milieu réactionnel (contenant le solvant, les
réactifs et le catalyseur) est souvent chauffé. En outre, le chauffage permet généralement
d’accroître la solubilité des composés dans le solvant. Ainsi, afin de ne pas perdre de matière,
on utilise un montage permettant unchauffage à reflux.

Principe:

Lors du chauffage du milieu réactionnel, le solvant (et éventuellement les composés dissous)
s’évapore. Boucher simplement le ballon engendreraitune surpression à l’intérieur et donc un
risque d’explosion. Le ballon est surmonté d’un réfrigérant à eau qui est une pièce de verrerie
ouverte dont lesparois sont refroidies par une circulation d’eau continue. Les vapeurs s’y
condensent et le liquide retombe au goutte à goutte dans le milieu réactionnel: Il s’agit d’un
chauffage « à reflux ».

La température du milieu réactionnel ne peut pas excéder la température d’ébullition du

solvant. Ce dernier est choisi en fonction de la solubilité des réactifs et de la température à
atteindre: La température d’ébullition doit être assez élevée pour permettre d’accélérer
suffisamment la réaction sans dégrader les composés dissous.
 Schéma 2: Dispositif expérimental et la température d’ébullition de solvants usuels

3. Filtration

La filtration permet de séparer les constituants d'un mélange solide liquide par passage à
travers un milieu filtrant. Deux techniques sont utilisées traditionnellement, la filtration par
gravité et la filtration sous vide.

3.1. Filtration par gravité

Le liquide s'écoule librement sous l'action de son propre poids à travers le filtre.
Techniquement, le filtre en papier lisse ou plissé est placé sur un entonnoir à tige courte et de
large diamètre (Schéma 3).

Schéma 3: Montage d’une filtration

Cette méthode est généralement lente et ne permet pas une séparation optimale du solide et du
liquide. Pour pallier ces inconvénients, une filtration sous vide est souvent utilisée.

3.2. Filtration sous vide

La pression force le liquide à traverser le filtre. Cette filtration est beaucoup plus rapide que la
filtration par gravité et a l’avantage de recueillir les cristaux sans les abimer. Le matériel
nécessaire est (voir schéma 4):
1. Un entonnoir du type Büchner;

2. Un cône en caoutchouc qui s'adapte au col de la fiole à vide;

3. Des tuyaux en caoutchouc épais

4. Une fiole de garde si l'on désire recueillir le filtrat et une trompe à eau (ou une source
d'aspiration) pour créer un vide partiel ;

5. Un papier filtre taillé au diamètre de l'entonnoir de Büchner constitue le milieu filtrant.

Pour mener à bien cette filtration, il faut suivre les opérations suivantes :
 Fixer le matériel en verre aux barres de montage;
 Découper un papier filtre au diamètre juste supérieur au diamètre de toutes les
perforations de l'entonnoir;

 Mouiller le filtre avec un peu de solvant pour qu'il adhère à l'entonnoir;

 Créer un léger vide;

 Verser d'abord le liquide qui surnage, puis la totalité du mélange,

 Rétablir la pression atmosphérique à l'intérieur de la fiole à filtrer pour laver le solide ;

 Recouvrir le solide de solvant froid, appliquer de nouveau le vide, renouveler

l'opération si nécessaire ;

 Essorer le solide tout en maintenant le vide.

 Débrancher la fiole à vide pour sortir le produit essoré et le sécher.

 Schéma 4: Filtration sous vide

4. Evaporation

L’évaporateur Rotatif est un appareil qui permet d'éliminer le solvant d'un mélange
réactionnel par évaporation sous pression réduite. Puisque le point d'ébullition dépend de la
pression et diminue avec l'abaissement de celle-ci, la température nécessaire à la distillation
peut être réduite si on abaisse la pression à l'aide d'une trompe à vide. La rotation du ballon
au cours de l'évaporation a pour but d'homogénéiser la température de la solution, de
régulariser l'ébullition et d'augmenter la surface d'évaporation (évaporation plus rapide). Le
solvant vaporisé est condensé au contact de la spirale réfrigérante et recueilli dans le ballon
récepteur (s'il est très volatil, il est entraîné dans la trompe à eau : cas de l'éther).

Pour l'utilisation de l’évaporateur rotatif, suivre les étapes suivantes :

 Vérifier que la trompe à eau est branchée (robinet d'arrivée d'eau ouvert au
maximum).
 L'eau doit également circuler dans le réfrigérant.
 Graisser le rodage mâle.
 Fermer le robinet de l'évaporateur après avoir fixé le ballon que l'on continuera à
maintenir jusqu'à ce que la pression réduite soit obtenue (aspiration du ballon).
 Mettre en route le moteur d'entraînement (vitesse moyenne).
 Chauffer le ballon avec le bain d'eau.
 Arrêter le moteur d'entraînement Lorsque l'évaporation est terminée.
 Abaisser le bain d'eau.
  Maintenir le ballon.
 Ouvrir doucement le robinet de l'évaporateur pour rétablir la pression atmosphérique
 Enlever le ballon.
 Fermer les robinets d'arrivées d'eau de la trompe à eau et du réfrigérant.

Figure 1 : Evaporateur rotatif

5. Analyse et identification des produits

L’analyse a pour but de s’assurer que le produit obtenu est bien le produit attendu et de
vérifier sa pureté. Ceci est réalisé, dans le cas d’un produit solide par la mesure de son point
de fusion, à l’aide d’un banc Köfler. Dans le cas d’un produit liquide, on procède à la mesure
de son point d’ébullition ou son indice de réfraction. Ensuite, les résultats obtenus sont
comparés aux données de la littérature. Si les conditions du laboratoire le permettent,
l’analyse spectroscopique (UV, IR, RMN,…), peut être réalisée notamment pour
l’identification du produit. Nous ne détaillerons ici que les techniques utilisées dans les
manipulations de ce manuel.

5.1. Point de fusion

La détermination du point de fusion du solide recristallisé est une méthode très utilisée car
elle est simple et rapide. Elle permet de tester sa pureté. Si celui-ci n’est pas satisfaisant, la
recristallisation est répétée jusqu’à un point de fusion stable.

Principe:
Le banc Köfler est composé d'une plaque métallique, rectangulaire et à gradient de
température imposé par un système de chauffage électrique interne, d'une graduation de la
température le long de cette plaque et d'un curseur mobile. Le curseur fixé sur le devant de
l'appareil porte deux index qui déterminent respectivement une position sur la plaque
chauffante et une température sur l'échelle parallèle à la plaque. L'index de température est
mobile, sa position doit être déterminée par étalonnage du banc. Le banc Köfler, très simple
d'utilisation, permet de mesurer des températures de fusion comprises approximativement
entre 50 et 250 °C. La température est croissante de la droite vers la gauche.

Utilisation:
Le banc Köfler doit être allumé au moins 30 minutes avant la première mesure de température
afin que le gradient de température soit bien installé tout au long de la plaque métallique.

1. Il faut tout d'abord vérifier que le banc soit bien propre. Si ce n'est pas le cas, le nettoyer à
l'aide d'un morceau de coton imbibé d'éthanol.

2. Lors de la mesure de la température de fusion de cristaux, il faut dans un premier temps

réaliser une détermination grossière. On dépose des cristaux sur la droite de la plaque
chauffante (températures les plus faibles) et on déplace les cristaux délicatement vers la
gauche (températures les plus élevées) jusqu'à l'apparition de la première goutte de produit.

3. Abaisser le curseur au niveau de la fusion et lire la valeur correspondante.

4. Ayant repéré la zone de fusion, il faut ensuite étalonner le banc Köfler avec des composés à
température de fusion connue. Ce sont des composés étalons (fournis avec le banc Köfler).
L'étalonnage se fait comme toute mesure en déplaçant les cristaux à l'aide d'une spatule par
petits tas jusqu'à la fusion du composé. On déplace le curseur jusqu'à ce point et on l'abaisse.

5. Ensuite, il faut régler la vis coulissante liée au curseur de façon à se placer sur la valeur de
la température de fusion de l'étalon.

6. L'étalonnage étant fait en utilisant un étalon dont la température de fusion est proche de
celle du composé à déterminer, il suffit de recommencer la mesure avec le produit.
 Figure 2 : Banc de Köfler

4.2. Chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique d’analyse qualitative. Elle a
pour but de séparer les produits d’un mélange et permetd’identifier un composé, de vérifier sa
pureté ou de suivre l’avancementd’une réaction en analysant des prélèvements successifs du
milieu réactionnel afin de mettre en évidence l’apparition de produits et/ou la disparition
deréactifs.

Principe:

La chromatographie sur couche mince s'effectue généralement sur une fine couche de silice
(phase stationnaire) déposée sur un support. Le mélange à étudier est ensuite posé à l'aide d'un
capillaire à environ 1 cm du bord puis placé dans une cuve contenant l'éluant. Le niveau de
l'éluant devant être en dessous du produit déposé. La cuve de chromatographie est ensuite
refermée par un couvercle.
Pour une meilleure séparation, on peut placer un papier filtre sur toute la hauteur de la cuve.
Celui-ci se charge de solvant par capillarité ce qui permet une meilleure saturation de la cuve.

L'éluant migre sur la plaque de silice par capillarité et entraîne les composés du mélange
étudié. Si les vitesses de migration des composés sont différentes, ils seront séparés. La
plaque de chromatographie est ensuite lue directement si les composés sont visibles, ou placé
sous une lumière UV (Voir Figure 3).
 Figure 3: Lampe UV– 254/365 nm

Ils peuvent également être révélés en pulvérisant une solution d'acide sulfurique puis chauffé
dans une étuve. Des plaques avec révélateurs à la fluorescéine sont également disponibles.
Placées sous la lumière UV, les taches apparaissent sans avoir besoin d'avoir recours à un
révélateur. Ne pas oublier de tracer le front du solvant dès la sortie de la plaque de la cuve
avant son évaporation.

Exemple d'élution en chromatographie sur couche mince

On détermine le ratio frontal Rf = L1/L2 étant le rapport entre la distance parcourue par le
soluté divisé par la distance parcourue par le front du solvant.
 Le principe de séparation des composés par CCM est proche de celle en HPLC.

Le mélange est placé sur la plaque de silice à l'aide d'une pipette pasteur.

Le principal intérêt de la CCM est l'identification rapide des composés d'un mélange.

En contrepartie, l'analyse est uniquement qualitative et ne permet pas le dosage d'un

composé.

Toutefois, ceci est de moins en moins vrai avec l'apparition de chromatographie sur
couche mince haute performance (HPTLC).
 Ici de dépôt du produit à analyser est automatisé avec une précision extrême ce qui permet
une quantification.
4.3. Chromatographie sur colonne
La chromatographie sur colonne est une méthode de purification couramment utilisée
enchimie organique afin de séparer les constituants d’un mélange. Contrairement à
lachromatographie sur couche mince (CCM) qui estune technique essentiellement analytique,
la chromatographie sur colonneest utilisée en chimie préparative. Elle permet, en effet, de
purifier une quantité importante de produit (pouvant aller jusqu’à plusieurs grammes) pourune
utilisation ultérieure en synthèse.
Principe :

La séparation des produits d’un mélange repose sur les mêmes principes que la CCM, à savoir
leurs affinités relatives pour une phase mobile et une phasestationnaire. Lors d’une
chromatographie sur colonne, l’adsorbant placédans la colonne constitue la phase stationnaire
tandis que l’éluant qui se déplace par gravité (et parfois sous l’effet d’une surpression)
constitue la phasemobile.

Schéma 5: Chromatographie sur colonne

Si l’éluant est un mélange de solvants, la séparation peut être réalisée soit en utilisant le même
mélange tout au long de l’élution, soit en augmentant graduellement la polarité de l’éluant au
cours de l’élution : on réalise alors ungradient de polarité. Cette méthode permet d’entraîner
successivement l’ensemble des composés présents dans le mélange.
 MATERIEL UTILISE

Pour pouvoir réaliser des manipulations, le chimiste organicien, a besoin d’un certain nombre
d’instruments (généralement en verre, ou verrerie) qui permettent de faciliter son travail. Le
matériel schématisé dans la planche au-dessous, représente la verrerie utilisée dans la plupart
des laboratoires de chimie organique. Certains éléments (de verrerie) sont équipés de rodages
permettant de les relier les uns aux autres et réaliser par la suite des montages.

Important : Chaque binôme dispose d’une paillasse où se trouve le matériel spécifique de la

manipulation à réaliser. L’étudiant doit connaître parfaitement le nom de chaque matériel
qu’il utilise. A la fin de chaque manipulation, la paillasse doit être nettoyée et le matériel doit
être propre et bien rangé.
 TP 1: Synthèse et caractérisation de l’hydrazone

Ce TP a pour objectif la synthèse d’une molécule organique: l’hydrazone, par l’action de

phénylhydrazine sur la cétone de l’acide dihydroacétique, et puis le mettre en évidence par
chromatographie sur couche mince.

L’acide dihydroacétique La phénylhydrazine L’hydrazone

1. Protocole expérimental
1.1. La synthèse de l’hydrazone
• Introduire dans un ballon bien sec, 1.68 g de l’acide déhydroacétique et 15 mL de
l’ethanol.
• Préparer un bain de sable, un thermomètre à une Température de 80°C.
• Ajouter 0.99 mL de phenylhydrazine.
• Adapter un réfrigérant à air dessus l'erlenmeyer et chauffer environ 15 min.
• A la fin de la synthèse, le produit de réaction solide résultant est précipité au fond du
solvant liquide. Séparer le solide du liquide par la méthode de filtration.
1.2. Séchage de l’hydrazone à masse constante

L’hydrazone contient en général un peu du solvant dans lequel il a été synthétisé. Il

faut donc essayer d’enlever ce reste de solvant. Mise en œuvre: on utilise une « étuve »

• On choisit la température de l’étuve de manière à ce que le solvant s’évapore (T>

Teb(solvant)) mais telle que le solide reste solide (T < Tfus(solide)).
• On place le produit à sécher dans une boite de Pétri dont on a préalablement déterminé
la masse à vide.
• On place la boite sans couvercle dans l’étuve et on l’y laisse un quart d’heure.
• Au bout de ce temps, on sort la boite (attention à ne pas se brûler) et on la pèse pleine.
On obtient une masse M1.
• On remet la boite 5 minutes à l’étuve puis on repèse le tout. On obtient une masse M2.
- si la masse n’a pas varié : on est à masse constante; il n’y a plus de solvant ; le solide est sec.

- si la masse a varié: il y avait encore du solcant; on remet le tout 5 minutes à l’étuve, et ainsi
de suite jusqu’à un poids constant.

1.3. Chromatographie sur couche mince

Pour identifier l’hydrazone, nous allons comparer le produit obtenu avec celui préparer
précédemment au laboratoire par chromatographie sur couche mince CCM.

• Préparer le produit de départ, le produit synthétisé et le référence en solution dans

• l’acétate d’ethyle.
• Prendre une plaque pour chromatographie 5 cm x 3 cm (environ). Ne pas toucher avec
les doigts et tracer délicatement au crayon de papier un trait léger à 1 cm du bas de la
plaque avec 4 lettres A (Acide déhydroacétique), C (produit synthétisé), R (produit de
référence) et M le mélange.
• Déposer quelques gouttes de substance à analyser en soufflant.
• Préparer une cuve d’élution (5 mL d’un mélange: Hexane / Acétate d’éthyle).
• Poser la plaque dans la cuve et laisser l’élution s’effectuer.
• Sécher puis révélation sous une lampe UV et I2.
• Entourer les taches obtenues.
• Calculer le Rf de chaque tache. En déterminant le meilleur éluant.
1.4. Purification de l’hydrazone par chromatographie sur colonne

Si le produit (hydrazone) n'est pas pur, on pourra procéder à une purification par
chromatographie sur colonne.

Maintient la colonne verticalement à l'aide d'une pince fixée à une potence dans ce colonne
mettre ce qui suit:

• Un petit morceau de coton ;

• 1mm de sable ;
• Introduire la poudre de silice ;
• Mettre une autre couche de sable juste après la silice ;
• Déposer une quantité adéquate de produit synthétisé (hydrazone) sur le dessus de
la colonne de silice ;
• Lorsque le dépôt a bien imprégné la silice ;
 • Verser un peu d'éluant (Hexane/Acétate d’éthyle) doucement sur la paroi de la
colonne ;
• Ajouter régulièrement de l'éluant dans la colonne (Veiller à ne pas manquer
d’éluant pour ne pas sécher la colonne) ;
• Laisser couler l'éluant et récupérer des fractions dans des tubes à essai ;
• Déposer une micro-goutte de chaque tube à essai sur une CCM ;
• Regrouper les tubes à essai qui contiennent le même produit pur (hydrazone) ;
• Concentrer à l’évaporateur rotatif ;
• Calculer le rendement de la réaction ;

1.5. Caractérisation de l’hydrazone: mesure d’une température de fusion sur

banc Köffler

On utilise un banc Köffler, i.e. un banc dont la température augmente graduellement de droite à
gauche, avec une indication de la température.

• Enlever les gants;

• Placer une pointe de spatule de l’hydrazone choisi du côté froid;
• Le déplacer lentement jusqu’à ce qu’il fonde;
• Déplacer le stylet de manière à lire la température;
• Nettoyer le banc à l’aide d’un morceau de coton imbibé d’éthanol, en passant ce coton du
côté le plus chaud vers le côté le plus froid;
 TP2 : Extraction et Séparation des pigments du
Paprika

1. Introduction générale

Le paprika, aussi connu sous le terme piment doux, est une épice en poudre de couleur rouge
obtenue à partir du fruit mûr, séché et moulu du piment doux ou poivron (Capsicum annuum,
de la famille des Solanaceae). Le terme désigne aussi le fruit en lui-même.

Il existe plusieurs sortes de paprika selon la partie de la plante qui entre dans sa composition.
En effet, le paprika peut être fabriqué à partir des fruits uniquement ou à partir du fruit, de sa
tige et de ses graines.

Le paprika renferme de nombreux pigments colorés dont 3 principaux qui sont séparés par
chromatographie sur couche mince (C.C.M.):
 Ce sont des molécules colorées car:
a/Elles possèdent un système conjugué (chromophore) de 11 doubles liaisons conjuguées ;
b/Elles possèdent des groupements auxochromes:
-O–CH3 (groupement méthyle) pour le β-carotène, il absorbe dans les violets vers 450 𝑛𝑚, il
apparait donc jaune;
-O–OH (groupement hydroxyde) pour la capsorbine, groupement auxochrome plus « fort »
que les −𝐶𝐻3 donc déplacement de l’absorption vers les plus grandes longueurs d’onde, il
absorbe dans les bleus-cyan vers 500 𝑛𝑚, il apparait donc orange;
-O−O−CO−R (groupement ester) pour la capsanthine, groupement auxochrome plus « fort »
que les –OH donc déplacement de l’absorption vers les plus grandes longueurs d’onde, il
absorbe dans les bleus verts vers 520 𝑛𝑚, il apparait donc rouge.
2. Objectifs du TP
Le paprika contient de nombreux pigments colorés qui sont facilement séparés par
chromatographie. Les colorants de la poudre de paprika sont extraits par un solvant organique
(le dichlorométhane: CH2Cl2). Les constituants de l’extrait sont séparés par chromatographie
sur micro-colonne puis analysé par chromatographie sur couche mince (C.C.M).

3. Protocole expérimental
3.1. Extraction des pigments majoritaires de paprika
3.1.1. Extraction à froid
• Introduire 1 g de paprika en poudre dans un erlenmeyer ;
• Ajouter 15 mL de dichlorométhane ;
• Boucher l'erlenmeyer et l'agiter énergiquement pendant environ 15 minutes en
dégazant de temps en temps ;
• Récupérer les pigments du paprika qui ont été extraits par le dichlorométhane par la
méthode de filtration. (Avant de filtrer on mouillera le papier filtre avec quelques
gouttes de dichlorométhane) ;
• Calculer le rendement de l’extraction
3.1.2. Extraction à chaud
• Dans un ballon de 100 mL, équipé d’un dispositif de chauffage à reflux, introduire 1g
de la poudre de paprika ;
• Ajouter 15 mL de dichlorométhane,
• Introduire quelques grains de pierre ponce,
 • Chauffer à reflux pendant 15 minutes.(La température d'ébullition du dichlorométhane
est de 41°C à la pression atmosphérique) ;
• Refroidir le ballon à température ambiante (sous l'eau du robinet) ;
• Filtrer son contenu pour récupérer les pigments du paprika qui ont été extraits par
le dichlorométhane. (Avant de filtrer on mouillera le papier filtre avec quelques
gouttes de dichlorométhane) ;
• Calculer le rendement de l’extraction
3.2. Chromatographie sur micro-colonne
Cette étape se passe par 4 procédés:

a) Préparation de la micro-colonne

Maintient une pipette pasteur verticalement à l'aide d'une pince fixée à une potence dans cette
pipette mettre ce qui suit:

• Un petit morceau de coton ;

• 1mm de sable ;
• Introduire la poudre de silice dans la pipette à l'aide d'une seringue ;
• Mettre une autre couche de sable juste après la silice.

b) Dépôt de l'échantillon

A l'aide d'une pipette pasteur, prélever un peu de solution à chromatographier et la déposer sur
le dessus de la colonne de silice.

c) Alimentation la colonne en élution

• Lorsque le dépôt a bien imprégné la silice,
• Verser un peu d'éluant (dichlorométhane) sur la micro-colonne, très doucement sur la
paroi de la pipette.
• Ajouter régulièrement de l'éluant dans la colonne.

Remarque: le niveau d'éluant dans la pipette doit rester au-dessus de celui de la silice jusqu'à
la fin du développement.

d) Récupération des fractions

Laisser couler l'éluant et récupérer des fractions (12 fractions) dans des tubes à essai on
change le tube chaque 5 min. Noter les couleurs des différentes fractions dans l’ordre
chronologique (Table ci-dessous).

Fraction 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Couleur

3.3. Analyse des fractions par CCM

a) Préparation de la cuve

L'atmosphère de la cuve doit être saturée en vapeur d'éluant. Ceci impose d'avoir une cuve
bien fermée et préparée à l'avance. Sous la hotte, verser l’éluant dans un bécher sec de 100
mL, sur une hauteur de 1/2 cm. Recouvrir la cuve avec une boîte à pétri.

b) Préparation de la plaque chromatographique

• Prendre une plaque d’aluminium recouverte de silice.
• Tracer au crayon sans appuyer, une ligne à 1 cm du bord inférieur de la plaque.
• Marquer légèrement au crayon sur cette ligne (ligne de dépôt), le (ou les)
emplacement(s) où l'on déposera les solutions à analyser. Les emplacements doivent
être distants d'environ 1 cm, et à 1 cm des bords de la plaque.
c) Dépôt de l’échantillon
• A l’aide d’une pipette pasteur, d’un tube capillaire, prélever une petite goutte d’extrait
de paprika de chaque fraction récupérée (séparées par la chromatographie liquide sur
colonne), les déposer à l’emplacement marqué.
• Si la solution est trop diluée, faire plusieurs dépôts au même emplacement, en laissant
sécher entre chaque dépôt.

d) Elution
• Lorsque les dépôts sont secs, introduire la plaque verticalement dans la cuve (la ligne
de dépôt ne doit pas tremper dans l’éluant) et refermer à l’aide de la boîte à pétri.
• Au cours de l’élution, l’éluant migre sur la plaque en imprégnant la silice.
• Retirer la plaque de la cuve avec des pinces, lorsque le front du solvant est à 1 cm du
bord supérieur de la plaque.
• Repérer le front du solvant au crayon. Laisser l’éluant s’évaporer sous la hotte.
e) Révélation (développement du chromatogramme)
Observer le chromatogramme et entourer au crayon, les différentes tâches colorées qui
apparaissent. Remarque : lorsque les taches sont incolores, on les fait apparaître sous une
lampe UV ou à l'aide d'un révélateur chimique mais dans le cas du paprika, les pigments
apparaissent sous forme de taches colorées, visibles à l’œil nu.

• Calculer le rapport frontal de l’échantillon et les 3 rapports frontaux pour les 3

colorants
3.4. Analyse spectrophotométrique des différentes fractions

Analyse de trois fractions A (Jaune; β-carotène), B (Orange-Rouge; capsanthine) et C

(Orange; capsorbine)