Travaux pratique 3V513 :

Étude enzymatique et structurale de la lactate déshydrogénase

Étudiants : Charles-Henri Buffet et Daniel Amselem

Enseignants : Tom Lemonnier et Brono Collinet

Introduction
La lactate déshydrogénase (qu’on appellera par la suite LDH) est une enzyme présente dans la
plupart des organismes, et est nécessaire à la fermentation lactique, puisqu’elle permet de
convertir le pyruvate (produit de la glycolyse) en lactate (qui peut aussi donner du pyruvate,
qui jouera un rôle lors du cycle de Krebs et, d’une manière plus globale, de la phosphorylation
oxydative), et inversement. La réaction permet de renouveler le NAD+, utilisé jusqu’alors
pendant la glycolyse, à partir du NADH.

Figure 1 : Réaction catalysée par la lactate déshydrogénase (image : wikipedia.fr)

Il existe plusieurs types de LDH, dont une LDH du cœur et une LDH du muscle. Nous nous
intéresserons à la LDH du cœur. L’objectif du TP est de répondre à la problématique suivante :

Quelles sont les caractéristiques structurales de la LDH, ainsi que son activité enzymatique ?

Pour cela, nous allons, en première partie, présenter l’étude cinétique de l’activité enzymatique
d’une lactate déshydrogénase de cœur. En prémisse, le % d’erreur par étudiant dans le binôme
sera déterminé. Le dosage de l’activité par suivi de l’oxydation du NADH, par spectroscopie
UV-Visible, nous permettra de déterminer les paramètres catalytiques de la LDH (le protocole
sera détaillé dans cette partie). Une seconde partie sera consacrée à l’étude de la structure d’une
LDH, avec, d’abord, l’étude de la masse molaire par différentes techniques d’analyse : par
électrophorèse en conditions dénaturantes et par chromatographie d’exclusion moléculaire, et
finalement, l’étude de la structure quaternaire par le logiciel de visualisation tridimensionnelle
PyMOL. Pour plus de précisions, tous les calculs ont été effectués à partir d’Excel et seront
notés dans le compte-rendu avec deux chiffres significatifs.

Étude de l’activité enzymatique

Avant de réaliser un dosage de l’activité enzymatique, on détermine l’écart-type et le %-
d’erreur de chaque binôme (voir les résultats en annexe). Le protocole est le suivant : déposer
dans une cuve de 1mL : 500 μL de tampon phosphate, 430 μL d’eau distillée, 50 μL de pyruvate
à 20 mM ; puis mettre le tout dans un spectrophotomètre à 340 nm (le NADH absorbe à cette
longueur d’onde). Ajouter ensuite 10 μL de NADH à 16 Mm, et juste avant de démarrer la
cinétique, 10 μL de LDH. La cinétique est enregistrée pendant 60 secondes. Chaque binôme
réalise trois fois le protocole, afin d’avoir une meilleure précision dans les résultats (voir les
documents en annexe pour les résultats).

On étudie la fonction de saturation de la LDH de cœur par le pyruvate, en reproduisant le

protocole précédent avec un enregistrement des cinétiques sur 30 secondes et avec des volumes
de solutions différentes :

2
 Figure 2 : Paramètres de l'expérience

Les cinétiques sont rentrées dans le logiciel Kaleidagraph. La courbe de tendance n’est pas une
𝑉 × [𝑃𝑦𝑟]
courbe de forme hyperbolique de type Michaelis-Menten 𝑉𝑖 = 𝑚𝑎𝑥 , mais de type
𝐾 +[𝑃𝑦𝑟]
𝑀
inhibition par le substrat :

𝑉𝑚𝑎𝑥 × [𝑃𝑦𝑟]
𝑉𝑖 =
[𝑃𝑦𝑟]2
𝐾𝑀 + [𝑃𝑦𝑟] + 𝐾
𝑖

Une première courbe avec les 18 points est tracée avec un R2 de 0.73.

A cause de difficultés rencontrées pendant la manipulation (peut-être dues à des problèmes de

dosage), des points aberrants apparaissent sur la courbe. Il faudra donc l’ajuster en
conséquence. Pour cela, nous avons choisi de retirer deux points, ce qui a eu pour effet
d’améliorer le R2 (maintenant à 0.93, d’après le graphe ci-dessous).

3
Les paramètres cinétiques de la LDH sont, d’après notre graphe :
Vmax = 0.48489 ∆Abs.min-1
Km = 0.099583 mM
Ki = 4.1455 mM

On calcule l’activité spécifique de la LDH :

𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑎𝑡𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐴𝑆 = =
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑒𝑛 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 𝐶

La concentration initiale en enzyme est de 5 g.L-1 avec un premier facteur de dilution de 400,
puis un nouveau facteur de dilution de 100 (10 μL pour 1 mL). La Vmax étant en ∆Abs.min-1,
on utilise la loi de Beer-Lambert 𝐴 = 𝜀 × 𝑙 × 𝑐 pour obtenir une activité enzymatique en
mol.L-1.min-1, avec pour le NADH un coefficient d’extinction molaire 𝜀 =
6220 𝐿. 𝑚𝑜𝑙 −1 . 𝑐𝑚−1 . L’activité enzymatique est multipliée par 106 pour passer en μmol.L-
1
.min-1 et la concentration en enzyme est multiplié par 103 pour passer en mg.L-1.

𝑉𝑚𝑎𝑥 0.48489
× 106
𝑨𝑺 = 𝜀 × 𝑙 = 6220 = 𝟔𝟐𝟑 𝝁𝒎𝒐𝒍. 𝒎𝒊𝒏−𝟏 . 𝒎𝒈−𝟏
𝑐 5
𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 × 103
4 × 104

La Kcat est aussi un paramètre enzymologique de la LDH calculable. La relation entre la

constante catalytique et la Vmax est : 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝐾𝑐𝑎𝑡 × [𝐸]0 avec [E]0 en mol.L-1. Pour convertir
la concentration de g.L-1 en mol.L-1 on divise par la masse molaire en g.mol-1.

𝑉𝑚𝑎𝑥 0.48489
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝜀 × 𝑙 6220
𝐾𝑐𝑎𝑡 = = = = 87413.66 𝑚𝑖𝑛−1
[𝐸]0 𝐶 5
𝐷𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 × 𝑀𝑀 4 × 104 × 140164

𝑲𝒄𝒂𝒕 = 87413.66 ÷ 60 = 𝟏𝟒𝟓𝟔. 𝟖𝟗 𝒔

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Étude structurale IVaire de la LDH

Électrophorèse en conditions dénaturantes

L’électrophorèse a pour but de séparer les protéines en fonction de leur masse moléculaire
apparente. Les protéines sont dénaturées dans un tampon de charge contenant du SDS,
chargeant négativement les protéines en les déroulant, et un réducteur le 2-mercaptoéthanol qui
détruit les ponts disulfures. Les protéines, alors chargées négativement, migrent dans le gel de
polyacrylamide, en fonction de leur poids moléculaire apparent. La protéine est étudiée de façon
dénaturante, il y a eu rupture des ponts disulfures donc la protéine est sous forme monomérique.
On sait, à partir d’autres expériences, que la LDH est constituée de plusieurs sous-unités. On
remarque qu’il n’y a qu’une seule bande dans les puits LDH muscle et cœur donc les LDH du
muscle et du cœur, ici, sont constituées d’homomères.

Le puit M, avec les marqueurs de masses moléculaires, permet de faire une droite d’étalonnage
log(MM) en fonction du rapport entre la distance de migration et de la distance du front de
migration Rf. L’équation de la droite est log(MM) = -0.9164 × Rf + 2.183.

Droite étalon de l'électrophorèse

2.50
log(MM) = -0,9164*Rf + 2,1831
2.00
log(MM) (KDa)

R² = 0,999
1.50

1.00

0.50

0.00
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20
Rf

Le calcul de la masse molaire de cœur ne sera pas détaillé mais est le même que pour le muscle.
Le Rf du muscle est de 0.72. On utilise l’équation de la droite 𝑙𝑜𝑔(𝑀𝑀) = −0.9164 × 0.72 +
2.1831 = 1.53. L’inverse du log est la puissance de 10, donc on a 𝑀𝑀 = 101.53 = 33.708
kDa. On a donc pour la masse molaire du muscle 33.71 kDa et pour la masse molaire de
cœur 35.93 kDa.

La chromatographie d’exclusion en conditions natives

On étudie la masse molaire de la LDH native de cœur de deux façons par la chromatographie
d’exclusion moléculaire en conditions natives. C’est une technique d’analyse qui repose
entièrement sur un principe de séparation physique. Elle est basée sur le fractionnement des
espèces en fonction de leur masse molaire pour les protéines globulaires, mais peut-être
rapporté plus généralement au volume hydrodynamique de la protéine qui est le rayon de
Stokes.

En premier lieu, nos protéines de référence dont la masse moléculaire et le rayon de Stokes sont
connues sont éluées. Le volume d’élution est normalisé en un coefficient de distribution Kav

5
 (𝑉𝑒 −𝑉0 )
avec la formule 𝐾𝑎𝑣 = . Cela nous donne la droite d’étalonnage d’équation 𝐾𝑎𝑣 =
(𝑉𝑡 −𝑉0 )
−0.3578 × log(𝑀𝑀) + 1.1677 avec la masse molaire MM en kiloDalton.

Droite d'étalonnage :
Kav = f(log MM)
0.8

0.7
Kav = -0,3578*log(MM)+ 1,1677
0.6 R² = 0,99088
Kav

0.5

0.4

0.3

0.2
1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8
log(MM) (KDa)

Le volume d’élution de la LDH de cœur est Ve = 15.30 mL. On calcule le coefficient de

15.30 − 10.5
distribution 𝐾𝑎𝑣 = 22.89 − 10.5 = 0.39. À partir de la droite d’étalonnage on détermine la masse
molaire :
𝐾𝑎𝑣 − 1.1677 0.39 − 1.1677
𝑴𝑴 = 10 −0.3578 = 10 −0.3578 = 𝟏𝟓𝟏. 𝟔𝟒 𝑲𝑫𝒂

Une deuxième façon pour calculer la masse molaire de LDH de cœur est d’utiliser la formule
du fascicule utilisant le rayon de Stokes :

6 × 𝜋 × 𝜂 × 𝑅𝑆 × 𝑆20,𝑤 × 𝑁
𝑀𝑀 =
1−𝜐 × 𝜌

On trace d’abord la droite d’étalonnage, d'équation √−𝑙𝑜𝑔(𝐾𝑎𝑣) = 0.0099 × 𝑅𝑆 + 0.1896

pour déterminer le rayon de Stokes de la LDH.

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 Droite d'étalonnage :
√-log(kav) = f(Rs)
0.9

0.8
racine(-log(Kav)) = 0,0099*Rs + 0,1896
R² = 0,99334
0.7
√-log(kav)

0.6

0.5

0.4

0.3
10 20 30 40 50 60 70
Rs (Å)

𝑎𝑣 √−log(𝐾 ) −0.1896 √−log(0.39) −0.1896

Le rayon de Stokes 𝑅𝑆 = = , nous utilisons le Kav calculé
0.0099 0.0099
auparavant. Le rayon de Stokes est RS = 45.67 Å. On utilise la formule de MM pour obtenir
une masse molaire en g.mol-1 ou Da (1 g.mol-1 = 1 Da). Pour cela, on convertit : le rayon de
Stokes en cm 𝑅𝑆 = 47.67 × 10−8 cm, le coefficient de sédimentation en seconde 𝑆20,𝑊 =
7.3 × 10−13 𝑠.

6 × 𝜋 × 0.01 × 45.67 × 10−8 × 7.3 × 10−13 × 6.022 × 1023

𝑀𝑀 =
1 − 1 × 0.73

MM = 140164.68 𝐷𝑎 × 10−3 = 𝟏𝟒𝟎. 𝟏𝟔 𝑲𝑫𝒂

On a donc pour la même LDH de cœur deux façons de calculer la masse molaire et deux
résultats différents : sans utiliser le rayon de Stokes, la masse molaire est de 151.64 KDa ; alors
qu’en utilisant le rayon de Stokes, la masse molaire est de 140.16 KDa. La première méthode
fait l’hypothèse que le volume d’élution est lié directement à la masse molaire alors qu’en
réalité la chromatographie est une méthode qui lie le volume d’élution au rayon de Stokes, cf
présentation de la technique. La masse molaire de la LDH du cœur étudiée est de 140.16
KDa.

Calcul du nombre de sous-unités composant la LDH

L’électrophorèse en condition dénaturante nous a permis de déterminer la masse molaire d’une

sous-unité de LDH, et la chromatographie d’exclusion en conditions natives nous a permis de
déterminer la masse molaire de la LDH « native » constituée de toutes ses sous-unités. Le
nombre de sous-unités est le rapport entre la masse molaire native et la masse molaire d’une
140.16
sous-unité : 𝑁𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑢𝑠 − 𝑢𝑛𝑖𝑡é𝑠 = 35.93 ≈ 3.90 = 4. La LDH est constituée de quatre
sous-unités.

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Visualisation de la structure 3D de la LDH
À l’aide du logiciel PyMOL, on visualisera la LDH du muscle de lapin, code 3H3F, récupéré
sur une banque de données protéiques. Ici sur la banque de données structurales de RCSB.

(Q1) La structure a été résolue par radiocristallographie aux rayons X avec une résolution de
2.38 Å. (Q2) La LDH a été co-cristallisée avec : le NADH substrat de la LDH, une molécule
d’oxamate qui est un inhibiteur compétitif vis-à-vis du pyruvate et l’acétate une molécule du
solvant. (Q3) Il y a deux LDH par mailles, on observe quatre sous-unités par LDH, c’est un
homotétramère. (Q4) La sous-unité est constituée d’une alternance d’hélice ⍺ et de brin 𝛽. Les
brins 𝛽 forme un feuillet 𝛽. C’est une protéine de type ⍺/𝛽. (Q5) On peut identifier le nombre
d’atomes d’azote et de phosphore dans le NADH et la molécule d’oxamate en coloriant les
atomes, avec en bleu les atomes d’azote et en orange les atomes de phosphore. Dans le NADH
il y a sept atomes d’azote et deux atomes de phosphore. Dans la molécule d’oxamate il n’y a
qu’un azote.

(Q6) Autour de l’oxamate, il y a cinq acides aminés à moins de 4 Å : une asparagine (N) en
position 137, une arginine (R) en 168, une histidine (H) en 192, une alanine (A) en 237 et une
thréonine (T) en 247. (Q7) L’oxamate forme avec ses acides aminés cinq liaisons hydrogènes :
il forme deux liaisons hydrogènes entre l’arginine 168 et le groupement acide de l’oxamate,
deux liaisons hydrogènes avec la thréonine 247, une avec l’acide et l’autre avec l’azote de
l’amine de l’oxamate, et une seule liaison hydrogène entre l’asparagine 137 et l’alcool de
l’amide.

(Q8) On étudie maintenant le NADH. Au voisinage d’un des deux riboses constituant le NADH
il y a un atome de souffre provenant de la méthionine (M) en position 53. (Q9) On calcule la
distance entre l’atome de souffre de la méthionine et l’atome d’oxygène porté par le carbone
C2 du ribose portant l’adénine : 3.5 Å. (Q10) On calcule aussi la distance entre l’atome d’azote
de l’oxamate et l’atome d’oxygène porté par le carbone C2 du ribose portant le groupement
nicotinamide du NADH : 6 Å.

La molécule d’oxamate est un inhibiteur compétitif du pyruvate, donc il se pose sur le site du
pyruvate. On peut donc poser l’hypothèse que les acides aminés à moins de 4 Å de l’oxamate
sont aussi les acides aminés à moins de 4 Å du pyruvate : asparagine en 137, arginine en 168,
histidine en 192, alanine en 237 et thréonine en 247. Et ces cinq acides aminés devraient être
responsable de la catalyse de la LDH. On peut faire le même type d’hypothèse pour les liaisons
hydrogènes, mais la différence entre l’oxamate et le pyruvate est le groupement NH2 du
pyruvate est un méthyle sur le pyruvate. Il n’y a pas la liaison hydrogène avec l’azote. En
conséquence, on peut supposer qu’il y a quatre liaisons hydrogènes entre les acides aminés et
le pyruvate : deux liaisons hydrogène avec l’arginine 168, une liaison hydrogène avec la
thréonine 247 et une liaison hydrogène avec l’asparagine 137.

On observe de la LDH dans un cristal figé. L’azote de l’oxamate permet peut-être une
conformation dans le site diffèrent que pour le pyruvate.

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Conclusion générale
La LDH est une enzyme du métabolisme pour la fermentation lactique. Elle est constituée de
quatre sous-unités. Les sous-unités peuvent être de cœur ou du muscle et la LDH peut-être
constituée de sous-unités différentes (mélange muscle et cœur). Pour l’étude enzymatique, la
LDH du cœur était sous forme homomère, c’est-à-dire que les quatre sous-unités sont
identiques.

La LDH de cœur a une vitesse maximum de 77.96 μmol.L-1.min-1. La constante de Michaelis

Km est de 0.10 mM ce qui correspond à une grande affinité de la LDH pour le pyruvate. La
constante d’inhibition Ki vis-à-vis du pyruvate est de 4.15 mM ce qui correspond à une grande
diminution de l’affinité. Un grand Ki va diminuer la vitesse de la réaction catalysée. Pour rappel
l’équation de la vitesse en inhibition par le substrat est :

𝑉𝑚𝑎𝑥 × [𝑃𝑦𝑟]
𝑉𝑖 =
[𝑃𝑦𝑟]2
𝐾𝑀 + [𝑃𝑦𝑟] + 𝐾
𝑖

L’activité spécifique de la LDH est de 623 μmol.min-1.mg-1 c’est-à-dire que 623 μmol de
pyruvate sont catalysés par min pour 1 mg d’enzymes pures. La constante catalytique Kcat est
de 1456.89 s-1 donc une LDH peut produire 1457 molécules d’acide lactique par seconde pour
la concentration d’enzyme de TP de 5 g.L-1.

La LDH étant constitué de sous-unités cœur et muscles, la masse molaire de ses deux sous-
unités a été mesuré par électrophorèse. La masse molaire de sous-unité cœur est de 35.93 KDa
et la masse molaire de sous-unité muscle est de 33.71 KDa. La masse molaire de LDH constitué
de sous-unités uniquement cœur a été étudié par chromatographie d’exclusion moléculaire. La
masse molaire est de 140.16 KDa.

Le logiciel PyMOL a permis l’observation de la structure quaternaire de la LDH, une

homotétramère. Nous avons pu observer des sous-unités constituées d’enchainements d’hélices
⍺ et de brins 𝛽 (avec des feuillets parallèles et antiparallèles visibles). Le site du pyruvate
est occupé par un inhibiteur compétitif l’oxamate. Autour du site du pyruvate sont
présents cinq acides aminés : l’asparagine, l’arginine, l’histidine, l’alanine et la thréonine.

Afin de compléter nos informations sur la LDH, il serait intéressant de comparer nos données
(en particulier celles portant sur l’activité enzymatique) avec les données qu’on obtiendrait avec
la LDH du muscle, pour savoir s’il y a des différences notables entre les deux.