République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université 20 Aoû t 1995 Skikda

Exposé sur :

PCR: Polymerase Chain Reaction

Réalisé par :

-Mihoub Rokia - Mallem Nesrine

- Mezedjri Selma - Tebai Ibtissem
PLAN
 C’est quoi une P C R …
 Le mixe ré actionnel

 Les cycles de la P C R

 Dé tection et analyse du produit de P C R

 Les applications de la P C R
C’ E ST Q U O I U N E P C R

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique

utilisée en biologie moléculaire pour amplifier quelques
copies d'un morceau d'ADN, générant des milliers à des
millions d'exemplaires d'une séquence d'ADN particulière.
L E MIXE RÉ ACTIONNEL
Nous avons besoin de quoi….

 ADN cible
Enzyme (Taq polymerase)
dNTPs
Amorces
Mg2+
Tampon
 L E MIXE RÉ ACTIONNEL
ADN cible

Environ 10000 copies de l'ADN cible sont né cessaires pour dé tecter le produit
dans 25-30 cycles de P C R .
 Utilisez 1pg-1ng de plasmide ou d’ADN virales
 Utiliser 1ng-1μg de modè les gé nomiques
L E MIXE RÉ ACTIONNEL
Amorces

Choix des amorces:

 Généralement entre 20 et 30 nucléotides
 40-60 % GC pour une bonne fusion lors de l’hybridation avec l’adn cible
des Tm comparables. Les oligonuclé otides amorces doivent s’hybrider à
l'ADN matrice dans les mê mes conditions de tempé rature,
des sé quences qui ne soient pas complé mentaires entre elles (en
particulier dans la ré gion 3’),
des sé quences qui ne contiennent pas de sé quences ré pé té es inversé es
(pas de repliement intramolé culaire).
L E MIXE RÉ ACTIONNEL
Taq Polymérase

Taq Polymérase est une enzyme thermostable extraite de la

bactérie Thermus aquaticus
 Stable à T° allant jusqu'à 95° C
 Haute processivité
Taq Pol a une activité exonuléasique 5'-3 ' seulement, pas
d’activité Proofreading
L E MIXE RÉ ACTIONNEL

dNTP
 Deoxynucleotides : (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
Concentration optimale 200 µM, en excès par rapport a
l’ADN matrice

Mg2+
 Nécessaire pour la réaction de polymérisation de la Taq
 Concentration optimale 1,5 à 2 mM

Tampon

Le tampon de la Taq ADN polymerase est un tampon 10X [Tris

HCl 200 mM (pH 8,4), KCl 500 mM]
 L E S C YC L E S DE LA P C R
Cycle 3
Cycle 2

Cycle 1

A D N matrice

Amplification en exponentielle……
L E S C YC L E S D E L A P C R
CYCLE NUMBER DNA copy number
0 1
1 2 Amplification en exponentielle
2 4
3 8
4 16
5
6
32
64
Copies of DNA=2 N
7 128
8 256 1.8E+09

9 512 1.6E+09
10 1,024
11 2,048 1.4E+09

12 4,096 1.2E+09

DNA copy number

13 8,192
1.0E+09
14 16,384
15 32,768 8.0E+08
16 65,536
6.0E+08
17 131,072
18 262,144 4.0E+08
19 524,288
2.0E+08
20 1,048,576
21 2,097,152 0.0E+00
0 5 10 15 20 25 30 35
22 4,194,304
PCR cycle
23 8,388,608
24 16,777,216
25 33,554,432
26 67,108,864
27 134,217,728
28 268,435,456
29 536,870,912
30 1,073,741,824
31 1,400,000,000
32 1,500,000,000
33 1,550,000,000
34 1,580,000,000
L E S C YC L E S D E L A P C R
Etape 1 : Dé naturation de l’ADN matrice à 95°C
L E S C YC L E S D E L A P C R
Etapes 2: Hybridation des amorce avec l’ADN cible à la
température Tm (40 et 65°)
L E S C YC L E S D E L A P C R

Etape 3 (Elongation): a 72°C la Taq polymérase catalyse l’extension

des amorces en utilisant l’ADN cible comme matrice
L E S C YC L E S D E L A P C R
D É T E C T I O N E T A NA LY S E D U P RO D U I T D E
PCR
É lectrophorè se
D É T E C T I O N E T A NA LY S E D U P RO D U I T D E
PCR Marqueur
poids
moléculaire

Puits

Sens de
migration
Echantillon

Visualisation des bandes grâ ce a un fluorophore (EX:

Bromure d’é thidium)
L E S A P P L I C AT I O N S D E L A P C R
Clonage
L E S A P P L I C AT I O N S D E L A P C R
RT PCR: real time PCR

Technique qui permet de

quantifier l’ADN en
temps ré el
L E S A P P L I C AT I O N S D E L A P C R
Séquençage