Université de M’sila

Département de Biochimie et Microbiologie

Module : Micobiologie Moléculaire

Master 2 : Microbiologie appliquée

L’ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL

Boubekeur. H

2022/2023
Le réseau de mailles constituant le gel forme un tamis
moléculaire à l’intérieur duquel les molécules d’ADN migrent.

!!!! La taille des mailles varie selon la concentration d’agarose

 L’électrophorèse permet donc de séparer les fragments

d’ADN en fonction de leur taille.
Pouvoir de séparation d'ADN linéaire, double
brin, selon la concentration d'agarose du gel

Concentration d’agarose Gamme de tailles idéales

(% en M/V) (en kb)
0.3 5 - 60

0.6 1 - 20

0.7 0.8 - 10

0.9 0.5 - 7

1.2 0.4 – 6

1.5 0.2 - 3

2.0 0.1 - 2
Préparation du gel d’agarose á 2% (pour produits d PCR)

Ebullition á 100 °C au
microonde ou au bain-
Marie + mélange

Peser 2g d’agarose
(BioRad®) 100ml de tampon Refroidir un petit peu
TAE ou TBE et faire couler
Le tampon (TAE ou TBE) utilisé dans la préparation du gel doit être le même que le tampon
de migration
50 X TAE buffer (Tris-Acetate-EDTA)

 Tris base..............................................................................................................242 g
 Glacial acetic acid (100 %)..............................................................................57,1 ml
 EDTA 0,5M......................................................................................................100 ml
pH 8 Dilution du tampon x1
avant utilisation
10 X TBE buffer (Tris-Borate-EDTA)
 Tris base (89 mM).......................................................................................107.8 g
 Boric acide (89 mM).........................................................................................55 g
 EDTA 2 mM....................................................................................................5.8 g
pH 8.3
Suivi de la migration.
Les échantillons d'ADN, avant d'être déposés dans les puits, sont
mélangés avec une solution de charge qui contient:
 Un alourdisseur (glycérol ou saccharose ) pour entraïner l'ADN au fond
du Puits.
 Des marqueurs de mobilité (colorants visibles : bleu de bromophénol et
xylène cyanol).
 Des marqueurs de taille pour l’identification (dans le puits de
référence).
Les deux marqueurs (colorants) migrent à des vitesses différentes.
 Le bleu de bromophénol (violet ) migre avec les fragments de petites
tailles (donc plus vite )
 alors que le xylène cyanol (bleu turquoise ) migre avec les fragments de
grande taille.
On peut ainsi suivre indirectement la migration de l'ADN sur le gel.
Le matériel génétique (ADN, ARN, plasmide…) est
chargé négativement, il migre vers le pôle positif
Révélation:
Les bandes d'ADN sur un gel de polyacrylamide ou
d'agarose ne sont pas visibles si l'ADN n'est pas
marqué ou coloré.

 Une méthode sensible de coloration de l'ADN consiste à

plonger le gel après électrophorèse dans du bromure
d'éthidium (BET ou EtBr) un intercalent de l’ADN qui devient
cent fois plus fluorescent sous illumination ultra-violette
lorsqu'il est lié à l'ADN.

Le BET est un produit hautement mutagène/

carcinogène, donc il doit être manipulé avec
beaucoup de soins.
 Gel agarose Bromure d’ethidium/lampe UV

Photographie de gel après migration

3 kb
2.5 kb
2 kb
1 kb
Marqueur de taille
(DNA ladder)
300 pb
200 pb
100 pb
50 pb
Autre colorants utilisès pour la rèvèlation des bandes d’ADN…

Solutions SYBR®Safe ou RedSafe® (INtRON Biotechnology)

Á ajouter dans le gel en surfusion pour une concentration de 3μl/100ml de gel

• Marquage
d’ADN

https://biotium.com
 Gel « maison » versus Flashgel®

Gel « maison » Flashgel® (Lonza)

Temps de préparation 30-40 min Prêt à l’emploi
Préparation des Tampon de charge Echantillon brut
échantillons
Durée de migration 30-45 min 6 min
Observation Transfert sur En cours de
transilluminateur UV migration

Risque Chimique, physique Très limités

 Éléctrophorèse d’ADN plasmidique
50 µl de chaque AND plasmidique (methode KIESER) est migré dans un gel d’agarose á 0.5%
á 100 V pendant 5H.
Marqueur de taille: E. coli 50192 portant les plasmides de taille de 154-, 66-, 48- et de 7-kb