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TECHOZYME - JUILLET 2014

Tout ce que vous devez savoir pour réussir vos gels d’agarose

Les différents types d’applications en électrophorèse d’acides nucléiques tirent partie des propriétés très spéci_ques des différents agaroses et dérivés d’agarose. Le bon choix
d’agarose dépend de la taille de l’ADN à analyser et des différentes manipulations nécessaires en amont ou en aval. Les températures de géli_cation et de fusion, l’électro-endosmose et
la résistance du gel sont tous des facteurs déterminants dans le choix de l’agarose adapté à votre application.

Sommaire

Comprendre les caractéristiques techniques des agaroses (lexique)

Comment choisir son agarose ?

Questions fréquemment posées

Annexes techniques

Comprendre les caractéristiques techniques des agaroses : petit lexique des termes employés

Électro-endosmose (EEO)

Le courant d’électro-endosmose : les supports d’électrophorèse (gel) possèdent, aux pH opérationnels, plus ou moins de charges négatives (sulfates dans le cas de l’agarose). Une
couche mobile de charges positives se forme dans le solvant au contact du support et entraîne la phase liquide vers la cathode. Dans le cas de l’électrophorèse sur agarose (ou sur gel
en général), on cherche à minimiser ce phénomène en utilisant de l’agarose très pur. En effet, ce courant peut accélérer ou ralentir la migration des molécules (ADN, ARN, protéines…) et
dans certains cas, être plus puissant que les forces électriques.

Pour les acides nucléiques, on utilise des agaroses faiblement chargés avec une faible valeur d’EEO (> ou égale à 0,15).
Les agaroses plus ou moins chargés restent utilisés pour des techniques de séparation de protéines qui ne nécessitent pas un pouvoir de résolution très élevé.
On peut aussi citer la technique d'électro-immunodiffusion quantitative de Laurell qui met en oeuvre un agarose sulfaté (à électro-endosmose élevée) imprégné par un tampon de pH 9,2
chargé en immunoglobulines (anticorps). Dans un tel système, l'électro-endosmose liée au support contrarie la faible mobilité électrophorétique des anticorps dans ce tampon pH 9,2
(les anticorps ont un pHi élevé) et annule leur mobilité. Ils vont donc rester en place dans le gel et sont recrutés au fur et à mesure par un antigène en migration électrophorétique.

Gels d’agarose pour la biologie moléculaire :

X
LE= « Low Electro-endosmosis » : qualité d’agarose très faiblement chargée (voir SeaKem® LE Agarose)

Question ?
Gels d’agarose pour les protéines :

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ME « Medium Electro-endosmosis » : qualité d’agarose moyennement chargé utilisé pour l’électrophorèse de protéines du sérum et l’IEP (immuno-electrophorèse) (voir SeaKem® ME
Agarose).

HE « High Electro-endosmosis » : qualité d’agarose fortement chargé utilisé pour augmenter la résolution en l’électrophorèse de protéines du sérum et IEP (immuno-electrophorèse), IEP
croisée et contre –IEP (CIEP) (voir SeaKem® HE Agarose).

HEEO « Very High Electro-endosmosis » : qualité d’agarose très fortement chargé, utilisé dans les applications nécessitant un courant d’endosmose comme l’IEP d’IgG et IgM. Peut
s’utiliser en mélange avec de l’agarose HE pour obtenir une valeur d’EEO spéci_que (voir SeaKem® HEEO).

Qualité d’agarose « Biologie Moléculaire » ou GTG®

Qualité « Biologie Moléculaire » : les contrôles qualités de ces agaroses concernent la liaison à l’ADN, l'activité DNase et RNase, un faible bruit de fond de luorescence après coloration
au BEt.

Qualité spéciKque GTG® (Genetic Technology Grade®)   : en complément des contrôles qualité «   Biologie Moléculaire   », ces agaroses GTG® sont soumis à des contrôles
supplémentaires assurant une reproductibilité de lot à lot (résolution ADN, clonage et digestion enzymatique « in-gel » et tests restriction-ligation pour les agaroses « Low Melting »
SeaKem® GTG® Agarose).

Point de fusion

C’est la température à laquelle l’agarose solidi_é fond quand vous le chauffez. Elle varie en fonction du type et de la concentration d’agarose dans le gel.
Agarose « low melting » : agarose à bas point de fusion, qui fond très rapidement à température modérée (environ 65°C) au lieu de 80-90°C pour un agarose plus classique.

Température de géliKcation

C’est la température à laquelle l’agarose en solution chauffé dans le tampon va se solidi_er en refroidissant. Elle varie en fonction de la concentration d’agarose dans le gel. L’agarose à
base température de solidi_cation va se solidi_er à faible température (26-30°C) au lieu de 35-38°C pour un agarose plus classique.

Humidité

Le degré d’humidité (« moisture ») permet d’évaluer la stabilité d’un agarose. Si un agarose se réhydrate, il ne va pas se conserver. Un agarose de bonne qualité a un degré d’humidité
très faible (≤ à 10%).

SpéciKcation techniques des agaroses par application

Comment choisir son agarose ? Quelles sont les caractéristiques techniques à privilégier selon ses
applications ?

L’agarose « standard » sera sutsant pour simplement faire migrer un ADN; il faudra néanmoins adapter son choix à la taille des fragments d’ADN à séparer et à la résolution demandée.
En effet, un même agarose ne pourra pas séparer toutes les tailles d’ADN en modi_ant seulement le % d’agarose utilisé. Chaque qualité d’agarose a une fenêtre de séparation optimale
pour une gamme de taille déterminée. Augmenter le % d’agarose dans un gel pour séparer des petits fragments au-delà des préconisations du fabriquant, donnera un résultat très
médiocre. Il est plus approprié d’utiliser un agarose adapté aux petits fragments avec un % beaucoup plus faible pour obtenir une séparation optimale.
Il n’y a donc pas d’agarose « universel ». Néanmoins un agarose plus « standard » peut être utilisé couramment au laboratoire pour de l’analytique (migration & visualisation) (Agarose
Seakem® LE), et en complément disposer d’agaroses plus spécialisés en fonction des besoins tels que :

Des agaroses dédiés :

Aux très petites tailles (20 bp - 800 bp) : Metaphor®Agarose

Aux petites tailles (50 bp -1 kb) : gamme d’agarose NuSieve®

Aux grandes tailles (1 kb-10 Mb) : Seakem® Gold

Des agaroses avec une qualité « Biologie Moléculaire » dédiés à l’électrophorèse analytique :

MetaPhor® Agarose

SeaKem® LE Agarose

NuSieve® 3:1 Agarose

SeaPlaque® Agarose (agarose low melting)

Des agaroses avec une qualité spéciKque GTG® (Genetic Technology Grade®) adaptés à l’électrophorèse préparative ou à des applications comprenant une digestion enzymatique de
l’ADN en aval.

SeaKem® GTG® Agarose

SeaPlaque® GTG® Agarose (agarose low melting)

NuSieve® GTG® Agarose (agarose low melting)

SeaKem® Gold Agarose

Un agarose à bas point de fusion « low melting » est utilisé pour puri_er des bandes d’ADN à partir de gel d’agarose en vue d’un clonage. Il est plus facile à faire fondre à basse
température sans risque d’endommager son ADN :

NuSieve® GTG® Agarose

SeaPlaque® Agarose ou SeaPlaque® GTG® Agarose

Un agarose à température de géliKcation basse est utilisé pour faire des réactions enzymatiques « in-gel » pour emprisonner des bactéries ou levure dans l’agarose pour préparer un X

ADN génomique intact (chromosome de levure) ou des fragments d’ADNg de grande taille pour éviter de le fragmenter :
Question ?
InCert®Agarose

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SeaKem® Gold Agarose

Un agarose avec une résistance de gel supérieure est à privilégier pour des applications de « blotting » (Southern ou Northern Blot), beaucoup moins fragile à manipuler :

NuSieve® 3 :1 Agarose

SeaKem®LE Agarose

SeaKem®GTG® Agarose

SeaKem® Gold Agarose

Guide d’achat pour choisir votre agarose en fonction de votre application

Choisir le bon pourcentage % d’agarose (en fonction de la taille des fragments à séparer et du tampon utilisé)

L’électrophorèse en gel d’agarose est aussi utilisée à la place de l’acrylamide pour les protéines dans le cas d’applications particulières

Questions fréquemment posées :

Quel tampon donne la meilleure résolution en électrophorèse sur gel d’agarose ?

Pour les petits fragments d’ADN (<1 000 bp), quand le découpage de bande n’est pas nécessaire, nous recommandons d’utiliser le tampon TBE 1X. Ce tampon donne des bandes plus
_nes et une meilleure résolution des bandes proches que le tampon TAE. Pour les grands fragments d’ADN (>15 kb) le tampon TAE 1X permet une meilleur résolution et les fragments
de grande taille sont mieux séparés. Mais il faut noter que le TAE tamponne moins bien, et risque donc de s’épuiser durant la migration.
Le gel doit être immergé sous 3 à 5 mm de tampon pour éviter qu’il ne sèche. Mais trop de tampon diminue la résistance du circuit entre anode et cathode, entrainant un  ralentissement
de la migration, une surchauffe excessive et une distorsion des bandes.

Propriétés des tampons

En savoir plus sur les tampons
Large choix de tampon de migration en poudre (sachets pré-pesés) ou concentrés prêts à l’emploi

Est-il possible de réutiliser mon tampon de migration ?

Non, car votre tampon risque d’être épuisé. La vitesse d’épuisement dépend du tampon utilisé et de sa capacité à tamponner. Quand il y a un épuisement du tampon, le gel
fond/surchauffe et/ou l’ADN donne des « smears ». Un tampon TBE 0,5X a une capacité tampon bien supérieure à un tampon TAE 1X au pH utilisé habituellement.
Une cuve  d’électrophorèse classique (15 cm x 30 cm) de capacité 1,5 à 2 L peut supporter 40 à 50 watts/h avant épuisement du tampon. Pour une mini-cuve, il n’y aura pas
d’épuisement du tampon à 10 à 13 watts/h. On peut éviter l’épuisement du tampon en créant un recyclage du tampon en circuit fermé (parfois nécessaire si la migration dure plusieurs
heures ou si le tampon a une capacité à tamponner trop faible).

Comment dois-je couler mes gels pour obtenir la meilleure résolution ?

Les gels doivent être coulés sur 3 à 4 mm d’épaisseur. L’épaisseur du peigne a aussi son importance. Un peigne _n (1 mm d’épaisseur de dents) donne des bandes plus _nes.
En savoir plus sur la préparation des gels d’agarose

Pourquoi mes bandes d’ADN font parfois « des vagues » et seulement sur une ou 2 pistes ?
De l’agarose séché restant sur les dents du peigne est souvent la cause de ce problème. Si le peigne a mal été nettoyé avant de couler un gel, cet agarose résiduel et séché va s’attacher
au gel nouvellement coulé et créer une fracture dans le puits quand le peigne est retiré. Ceci se voit lorsque le gel est sur le transilluminateur. Il faut également faire attention en retirant
le peigne du gel et d’autant plus s’il s’agit d’agarose à bas point de fusion « low melting » (plus délicat à manipuler). Pour ce type de gel, il est préférable de refroidir le gel à 4°C pendant
30 min et/ou d’immerger le gel avec du tampon froid avant de retirer le peigne.

Combien d’ADN dois-je déposer par puits pour obtenir une bonne résolution ?
La quantité d’ADN par puits est variable, ce qui est important est la quantité d’ADN par bande. La quantité minimale d’ADN que vous pourrez détecter dépendra du colorant utilisé. Par
exemple, une bande d’ADN de 10 ng pourra être détectée par du BEt (bromure d’éthidium) (maximum 100 ng/bande pour avoir une bande assez _ne). Cette quantité est moindre avec
des colorants plus sensibles comme le Gelstar® (à partir de 20 pg d’ADN double brin) ou le GelGreen®. La quantité optimale d’ADN à déposer par puits est calculée comme la fraction
de l’ADN total qui est dans la bande d’intérêt, représenté comme suit :
Taille du fragment d’intérêt (kb)    X 100 = % d’ADN dans la bande d’intérêt
Taille de  l’échantillon d’ADN (kb)

Voir un exemple :
L’échantillon d’ADN d'une taille de 48,5 kb est séparé sur gel en 8 fragments après digestion enzymatique. Votre bande d’intérêt fait 2,3 kb.
2,3 kb__  X 100=4,7% de l’ADN dans le fragment d’intérêt
48,5 kb
Si vous déposez 1 µg d’ADN, alors 4,7% de 1 µg d’échantillon déposé représentera votre fragment d’intérêt soit 47 ng. Cette quantité est compatible avec une visualisation après
coloration au BEt.

Pour augmenter la _nesse des bandes, utilisez un tampon de charge contenant du Ficoll® à la place du glycérol ou du saccharose comme le DNA Loading Buffer (Réf.
LON50655). L’utilisation de glycérol de faible masse moléculaire peut permettre à l’ADN de remonter sur les côtés du puits avant la migration, ce qui donne des bandes en forme de U.
Un tampon de charge avec une force ionique trop grande peut donner des bandes diffuses. Dans l’idéal, l’échantillon d’ADN devrait être repris dans du tampon de migration ou du moins
dans un tampon de charge ayant une force ionique plus faible que celle du tampon de migration.
En savoir plus sur les tampons de charge

À quel voltage dois-je faire migrer mon gel d’agarose ?

Nous recommandons une migration à 4-10 volts/cm (la taille en cm correspond à la distance entre les électrodes et non à la longueur du gel) dans des conditions d’électrophorèse
horizontale normales.

Si le voltage est trop élevé : la résolution des bandes est réduite (surtout pour un ADN >15 kb) principalement à cause d’une surchauffe du gel. Dans ce cas,
les meilleures séparations sont obtenues en gradient de voltage <5 volts/cm

Si le voltage est trop faible : la mobilité des petits fragments (>1 kb) est réduite et les bandes sont diffuses.

Les gels en agarose Metaphor® permettent de séparer des fragments d’ADN de petite taille à 4,5–5 volts/cm en cuve horizontale standard.
Tableau des voltages, temps de migration et tampon recommandés X

Est-il utile de recouvrir ma cuve avec son couvercle pendant la migration ? Question ?
Oui, le couvercle des cuves d’électrophorèse a son utilité : les supports « ouverts » conduisent à des courants d'évaporation. Lors de la mise en œuvre de certaines techniques où des

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performances séparatives élevées sont inutiles, on travaille parfois en « milieu ouvert ». La production de chaleur par effet Joule génère un courant d'évaporation qui devient alors un
nouveau paramètre de la mobilité. Il sutt de travailler en « milieu fermé » pour éviter l'évaporation.

Comment améliorer la reproductibilité de mes expériences ?

Pour avoir des gels de caractéristiques identiques entre différentes expériences et pouvoir plus facilement comparer les résultats (par ex. application diagnostic, industrie), il est
possible d’utiliser des gels pré-coulés de caractéristiques bien dé_nies avec des contrôles qualité précis :

Guide pour choisir votre gel pré-coulé

Gels Latitude™

Gels Reliant™

Gels du système Flashgel®

Pourquoi utiliser l’agarose pour certains gels de protéines ?

L’électrophorèse de protéines en gels d’agarose est une alternative aux gels de polyacrylamide et amène certains avantages :

Possibilité de séparer des protéines de haut poids moléculaire (> 600 kDa)

Facilité de préparation et de manipulation

Possibilité de puri_er ses protéines d’intérêt à partir d’une bande de gel

Les protéines ainsi puri_ées peuvent être utilisées directement pour immuniser un animal pour produire des anticorps

Non-toxique

Possibilité de faire migrer les gels en vertical ou horizontal

Applications des gels d’agarose pour protéines

Il est souvent préconisé de changer d’intercalant pour des raisons de sécurité, de toxicité. Par quoi peut-on remplacer le bromure d’éthidium ?
Le Bromure d’Ethidium (BEt) est de plus en plus remplacé par d’autres intercalants considérés comme moins toxiques pour le manipulateur. Nous vous conseillons comme alternative le
GelGreen™
GelRed™ et GelGreen™ qui appartiennent à une nouvelle génération de colorants luorescents des acides nucléiques dédiés au remplacement du bromure d’éthidium. Ils sont :

Non toxiques aux concentrations utilisées. Validés par le test Ames, non toxiques pour les manipulateurs et la faune aquatique. Rejets liquide possibles à
l’évier et solides à la poubelle.

Plus sensibles que le BEt, le SybrSafe™. Compatibles UV ou lumière bleue (Dark Reader ™). Utilisables dans le gel ou en post coloration.

Très stables à température ambiante

Annexes techniques :

Préparation des gels d’agarose

Dépôt et migration d’ADN sur gel d’agarose

Détection de l’ADN et mesure de taille de l’ADN sur gel

« In-gel » pour le chams pulsé

Découpage de bandes d’ADN sur gel

Séparation de l’ARN sur gel d’agarose

Applications spéciales (banques d’ADNc, culture cellulaire)

Séparation des protéines sur gel d’agarose

IEF de protéines en gel d’agarose

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