Transformation de Bactéries Avec La Protéine Fluorescente GFP

Transformation
de bactéries
avec la protéine
fluorescente
GFP
Pourquoi modifier génétiquement des
organismes vivants?
• Modifier des animaux

pour créer des modèles
pour la recherche • Modifier des
moustiques pour lutter
contre les maladies
• Produire des molecules

Modifier des plantes pour : (insuline, hormones,
• les rendre résistantes aux vaccins, …)
maladies ou aux parasites
• Augmenter leurs propriétés
nutritionnelles
explorer.bio-rad.com
Brief history of insulin
• 1922 – Canadian researchers isolate
insulin, cure diabetics using bovine
insulin, and win the Nobel Prize in 1923.
Previously, diabetes had been a virtual
death sentence – there was no treatment.
• 1978 – scientists at Genentech produce
human insulin using genetically
engineered E. coli (recombinant DNA, or
rDNA).
• 1982 – Humulin approved by the FDA.
The protein products of biotech
Used to treat Made in Price per gram
Gold N/A N/A $40
Insulin Diabetes E. coli $60
Human Growth Growth disorders E. coli $227,000

Hormone
Granulocyte Colony Cancers E. coli $1,357,000
Stimulating Factor
Comment produire une protéine
en grande quantité?
1. Identifier un gène codant Gene
une proteine d’intérêt.
1. Identifier un gène codant

2. Introduire le gene dans E. coli
une bactérie

2. Introduire le gene dans
une bactérie
3. Multiplier la bactérie en
grande quantité.

une proteine d’intérêt. DNA
2. Introduire le gene dans mRNA

une bactérie
protein
grande quantité.
4. La bactérie transcrit et
traduit le gène pour
produire la protéine

2. Introduire le gene dans
une bactérie
grande quantité.
4. La bactérie transcrit et
traduit le gène pour
produire la protéine
1. Identifier un gène codant une
proteine d’intérêt.
2. Introduire le gene dans une
bactérie
3. Multiplier la bactérie en grande
quantité.
4. La bactérie transcrit et traduit le
gène pour produire la protéine
5. Purifier la protéine
Comment introduire un gène
dans une bactérie?
1. Fabriquer un plasmide (vecteur adapté aux bactéries) avec
le gene d’intérêt
2. introduire le plasmide dans la bactérie = “transformation
bactérienne”
Plasmid E. coli
Les plasmides
• Fragments d’ADN circulaire presents dans les bactéries
• Une bactérie peut acquérir de noueuax caractères grâce
à un plasmide
Chromosome
Bacterie
Plasmides
Les plasmides
• Caractéristiques d’un plasmide utilisé comme vecteur en
genie génétique
Origine de replication Gènes d’intérêt

permet à la bacterie de permettant la production
copier le plasmide avant de de proteines d’intérêt
se diviser
Gène de resistance à un
antibiotique
permet de sélectionner les
bactéries transformées
La protéine GFP
La méduse
Aequorea Victoria
aun gene ocdant
une protéine “green
fluorescent protein”
qui émet une
fluorescence verte
sous lumière UV
which glows green
under UV light.
Under visible light Under ultraviolet (UV)
light
Le plasmide pGLO
araC
Code la proteine AraC
qui contrôle
ori l’expression de la GFP
pGLO
Beta-lactamase GFP
permet la resistance à Gene for green
l’ampicilline fluorescent protein.
Comment faire entrer un plasmide
dans une bactérie?
E. coli
Plasma Membrane
Non-polar Polar
dans une bactérie?
Charges négatives
E. coli
dans une bactérie?
E. coli
Les ions calcium

de la solution de
transformation
neutralisent
partiellement
l’ADN
dans une bactérie?
E. coli
Le choc
thermique crée
des pores dans la
membrane
dans une bactérie?
E. coli
Add heat to create

pores in the
membrane
Heat Shock
Plasmid enters
cell through pore
E. coli
dans une bactérie?
refroidissement, 2 min
Pores close
E. coli
dans une bactérie?
E. coli
Ajout de milieu, et incubation pour permettre

l’expression des gènes
dans une bactérie?
AraC,
E. coli
Beta-lactamase, GFP, si
resistance à l’arabinose
l’ampicilline est présent
Ajout de milieu, et incubation pour permettre

l’expression
explorer.bio-rad.com des gènes
Sélection des bactéries
transformées
transformées
Beta-lactamase,
transformées
Ampicilline
incorporée dans la
gélose
Les bactéries sans plasmide ne se développent

pas en presence d’ampicilline
transformées
• Seules les bactéries exprimant
la beta lactamase (donc
transformées avec le pGLO) se
développent en presence
d’ampicilline
Role du gene AraC
AraC, protéine de
régulation
E. coli
AraC Controles l’expression de
la GFP
• L’arabinose AraC
fonctionne comme
un
• Sans arabinose, le système

RNA
est bloqué : la protéine AraC polymerase
blocquel’ARN polymerase ,
le gene GFP n’est pas transcrit
• Avec arabinose, la protéine

AraC change de forme et le
gene GFP est transcrit
Résumé des étapes de
tranformation
1. Solution de transformation Neutralise les charges – de l4ADN
2. Incubation sur la glace ralentit les mouvements de la membrane

avant le choc thermique pour augmenter l’efficacité du choc thermique
3. Choc thermique Crée des pores dans la membrane
4. Incubation sur la glace Restore la membrane.

après le choc thermique
5. Incubation at temperature Permet l’expression de la beta lactamase
ambiante dans le milieu
LB broth
6. Culture sur boites de petri Sélection des bactéries transformées et
LB/amp formation de colonies

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Transformation

• Modifier des animaux

• Produire des molecules

Insulin Diabetes E. coli $60

Human Growth Growth disorders E. coli $227,000

1. Identifier un gène codant

1. Identifier un gène codant

1. Identifier un gène codant

2. Introduire le gene dans mRNA

1. Identifier un gène codant

Origine de replication Gènes d’intérêt

Les ions calcium

Add heat to create

Ajout de milieu, et incubation pour permettre

Ajout de milieu, et incubation pour permettre

Les bactéries sans plasmide ne se développent

• Sans arabinose, le système

• Avec arabinose, la protéine

2. Incubation sur la glace ralentit les mouvements de la membrane

4. Incubation sur la glace Restore la membrane.

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