COMPRENDRE ET GERER

LE RISQUE PHAGE
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 SOMMAIRE
1. Des bactéries lactiques au yaourt
2. Introduction générale sur les bactériophages
1. Définition & morphologie
2. Cycle de vie
3. Mécanismes de résistance des bactéries aux phages & développement de cultures résistantes aux
phages
4. Méthodes de détection

3.Les phages dans l’industrie laitière

1. Où les trouve-ton? Où peuvent-ils se multiplier?
2. Impact sur les cultures
3. Mesures préventives
4. Mesures curatives
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 LE ROLE DES BACTERIES LACTIQUES
DANS UN YAOURT
Souches LB principalement
Lactose
Bactéries lactiques Arôme

Lait Acide lactique

Exopolysaccharides
Souches ST principalement
-
- H+
- Viscosité
Diminution du pH jusqu’au point iso électrique
- -
-
Réseau
Caséine
caséique
YAOURT
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LA CONSTRUCTION DES CULTURES
5
INTRODUCTION GENERALE
 QU’EST-CE QU’UN BACTERIOPHAGE
Virus capable d’infecter des bactéries & qui peut entrainer la lyse de la cellule hôte.

• Les phages ont seulement 1 type d’acide nucléique (ARN, ADN) & se reproduisent à partir
de leur propres acides nucléiques

• Le génome code pour 3 fonctions :

- Synthèse de la capside
- Lyse de la paroi cellulaire
- Réplication des phages

Incapable de se développer seul. Doit utiliser la machinerie de la cellule hôte, ce qui

implique un parasitisme absolu.
Phase latente: 4 mois à 15 ans

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 QU’EST-CE QU’UN BACTERIOPHAGE
 Les phages sont constitués:
 D’une tête (souvent polyédrique), une capside qui
renferme le matériel génétique (AND double brin
95% ou ARN).
24 to 200nm

 Une queue, rigide ou flexible, de longueur

variable, impliquée dans l'entrée de l'ADN du
phage dans la cellule bactérienne.

 Les phages sont très spécifiques à une souche

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 LE CYCLE DE VIE DES BACTERIOPHAGES
 Cycle de vie

Attachement à la cellule hôte = adsorption

 Des récepteurs spécifiques présents sur la paroi de la cellule
permettent aux phages de se fixer et d’injecter leur matériel
génétique

Les phages se multiplient très

30min
rapidement!

100 phages 2 bactéries

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 LES MECANISMES DE RESISTANCE

Prévention de l’adsorption grâce à l’absence de Prévention de la multiplication intracellulaire des

récepteurs phages sur la paroi cellulaire phages

Modification chimique ou mutation des gènes codant pour les • Mécanisme de restriction-modification
récepteurs phages modifiant l’imbrication “ naturelle” entre la
bactérie et le phage • Mécanisme de multiplication abortive
 LES MECANISMES DE RESISTANCE

Mécanisme de restriction-modification (R/M)

ADN du phage Restriction ou digestion de l’ADN du phage par
ADN de la bactérie les endonucléases

Plasmide codant pour les enzymes Méthylation de l’ADN bactérien par la méthylase pour
de restriction différencier les deux ADN
 LES MECANISMES DE RESISTANCE
La recherche Chr Hansen

Molecular identification (fingerprint)

Spontaneous phages mutant resistant (Phage hardening)

Transfer of phage resistance plasmids by conjugaison

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 LES EFFETS DES BACTERIOPHAGES

• Augmentation du temps
Effets sur le pH d’acidification Effet typique des phages sur le pH au cours de
• Arrêt de l’acidification pH l’acidification
7
• Augmentation de la post acidification

6
• Yaourts fermes liquides
Effets sur la texture • Perte de texture
5
5 10 18
• Croissance de microorganismes heures
indésirables Fermentation normale
Autres effets • Arrière-goût dans le produit fini pH après attaque phagique sévère
Fermentation perturbée par les phages
La culture se répare elle-même
 LES METHODES DE DETECTION DES PHAGES
Test d’inhibition Plages de lyse
Comparaison entre une culture témoin et la même culture auquel l’échantillon contenant Dénombrement sur agar / spot test
potentiellement des phages a été ajouté

ATP-métrie
Détermination de l’ATP bioluminescence

Criblage par sonde AN

(PCR: Polymerase Chain Reaction)

Microscope électronique
 LES METHODES DE DETECTION DES PHAGES
Méthode plage de lyse

3. Attaque d’une cellule bactérienne par un phage unique. Libération

1. Dilution des échantillons des phages et lyse des bactéries à proximité.

Agar

Cellules
bactériennes

2. Mélanger la gélose avec la souche spécifique 4. Dénombrement des plages de lyse

Lyses isolées: numération en ufc/ml
 LES METHODES DE DETECTION DES PHAGES
Test d’inhibition

A : contrôle – référence pH
B : test – Delta pH vs A
Lait + culture C : inhibition chimique

Référence, suivi d’acidification

A ∆ pH
inhibition forte
0.60

Lait + culture + échantillon

inhibition moyenne

Echantillon à tester , suivi d’acidification 0.30

B inhibition faible
0.10
Absence d’inhibition

Lait + culture + échantillon chauffé Interprétation des résultats

Phages détruits, test d’un éventuel inhibiteur chimique
15 C
 LES METHODES DE DETECTION DES PHAGES
Test d’inhibition: méthode pH Multiscan

Méthode interne CH

 Miniaturisation du test d’inhibition.

- Indicateur colorimétrique: vert et pourpre de bromocresol.
- Même conditions d’incubation
- Lecture de la couleur de chaque puits par scanner
- Traduction des données colorimétriques en données pHmétriques

Avantages :
- Nombre de tests
- Gain de temps
- Traitement des données

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LES PHAGES EN INDUSTRIE LAITIERE
 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE

A. Origine et concentration des phages

B . Actions préventives
A. Les bonnes pratiques de fabrication
B. Plan de nettoyage et de désinfection

C. Actions correctives
A. Recommandations
B. Diagnostic
 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Origine et concentration
 Origines possibles de la contamination :
 Environnement : les phages peuvent être présents sur les sols, dans l’eau, l’air,
les égouts….
 Matières premières : le lait et ses dérivés (sérum, poudre de lait ou de sérum,
lait concentré…..)…
 Equipement/process : nettoyage et désinfection insuffisants

 Concentration:
 Partout dans le process ou les phages sont en contact avec les cultures

 Les raisons de la présence des phages

 Traitement thermique du lait ou des ingrédients insuffisant
 Contamination croisée des lignes amont et aval
 Culture affaiblie (respect des paramètres de fabrication)
 Nettoyage et désinfection insuffisants
 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Origine et concentration
Technologie Yaourts fermes

!
!

Réception Pasteurisation Standardisation MG Standardisation MP NEP

!
!
DVS !

NEP
Pasteurisation Homogénéisation Stockage à froid Réchauffage Conditionnement
 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Origine et concentration
Recycling
 CIP utilisé pour nettoyer des équipements critiques : sérum, eaux blanches
Whey

 CIP non spécifique

Packaging
 Nettoyage et désinfection inefficaces
 Fréquence de nettoyage insuffisante

Heating
Coldstorage
Heattreatment

 Traitement thermique trop faible

 Nettoyage et désinfection inefficaces
R

 Fréquence de nettoyage insuffisante

CIPStation

D
S

Recipe

 Poudre de lait
A

 Poudre de sérum ou mélange

 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Actions préventives
 BONNES PRATIQUES DE FABRICATION
1- Nettoyage et désinfection des équipements et des ateliers:
 Tous les équipements doivent être nettoyés aussi souvent que nécessaire
 Après nettoyage, une désinfection est nécessaire en fonction du type de l’équipement

2- Traitements thermique:
 La plupart des phages sont détruits par un traitement thermique de 92°C 6 min
 Efficacité du traitement thermique dépend de la concentration phagique et de la recette

3- Effectuer un monitoring régulier selon le process et la configuration du site

 Les échantillons doivent être sélectionnés avec soin

4- Culture de rotation ou back up

 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Actions préventives
 BONNES PRATIQUES DE FABRICATION : 4 POINTS PRINCIPAUX
1- Gestion des nettoyages et de la désinfection
 Fréquence
 Gestion des NEP

2- Gestion des flux (respect de la marche en avant)

 Matières 1ères
 Air
 Employés

3- Limiter la dispersion des souillures

 Garder les sols secs et propres
 Nettoyages des surfaces et des locaux
 Gestion des déchets

4- Contrôles des paramètres de fabrication

 Températures
 Taux d’inoculation, recettes…
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 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Actions préventives
 BONNES PRATIQUES DE FABRICATION : AUTRES POINTS

1- Locaux et conception
 Les portes et les fenêtres doivent rester fermées
 Climatisation

2- Hygiène des employés

 Propreté
 Tenues de travail

3- Procédures de travail
 Toutes les procédures de tavail doivent être écrites et respectées
 Check list en cas de contamination phagique

4- Bonnes pratiques d’ensemencement

 Désinfection des sachets
 Vêtements et personnel dédiés
 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Actions préventives
 NETTOYAGE ET DESINFECTION

Paramètres à définir :
Nettoyage
 Produit
 Fréquence  Nettoyage acide/soude:
 Concentration  Soude : 80°C, 2%, 20min.
 Conditions: température & pH  Dénaturation de la solution si T > 85°C
 Acide : 65°C, 1%, 15min.
 Endommagement des joints si T > 65°C

 Vérifier que le débit soit suffisant

 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Actions préventives
Définir un plan spécifique de nettoyage &désinfection :
- Conditions habituelles de production
- Alerte phage

Désinfection chimique Désinfection thermique

Acide peracétiqe : acide acétique + H2O2
• Eau chaude 95°C
• Concentration usuelle: 150-200 ppm
• Concentration curative: 300 – 400 ppm • Minimum 10-15min
• Effet corrosif si > à 400 ppm
• Contrôle de la température en fin de circuit
• T° usuelle: 20 - 40°C
• Dangereux si T > 45°C
• Temps: 15min

• Recommandations des fournisseurs

 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Actions préventives
Traitement des matières premières et paramètres des procédés

Résistance thermique

Source: AIF project 11339 N, final report, Prof. Hinrichs, Prof. Heller
 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Actions préventives
Traitement des matières premières et paramètres des procédés

RESULTATS SUR LA RESISTANCE THERMIQUE DES PHAGES (PHACARA PROJECT – 2014)

Inactivation complète des phages après 6 min de traitement thermique (81 to 93°C)

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 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Actions correctives
Utilisation de la culture de secours pendant 2 ou 3 semaines

Augmenter la désinfection
 Augmenter la fréquence
 Augmenter les concentration de chlore ou d’acide per acétique 400 ppm (Vs 150/200 ppm)
 Augmenter la désinfection de l’environnement:
 Fréquence d’ajout de chlore dans les égouts
 Désinfection de l’air

Vérifier le process (mise à jour et respect des plans de maintenance)

 Corrosion
 Accessibilité des espaces à nettoyer (bras morts)
 Contrôle de possible contaminations croisées entre les matières premières au niveau des raccordements de canalisations
 Contrôles des enregistrements process

Phage diagnostic
 Prélèvement d’échantillons tout au long du process
 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Actions correctives
 Comment envoyer les échantillons à Arpajon
» Submit samples
˃ Bottles should be labeled with: Sample number, data of production and vat number
˃ E-mail: frfro@chr-hansen.com, inform number of samples, which cultures have been used at the
dairy.

» Sample handling and shipping (avoid growth of phages during shipping)

˃ Filter whey through a 0.45 or 0,2 μm sterile filter (5 ml) (can be send in envelopes by post)
IF Milk samples can not be filtrated without centrifugation
˃ Freeze the samples (50 ml) (send in freezer packs)
˃ Refrigerate immediately (50 ml) (send in freezer packs)

Please avoid leakage of samples during the shipping!

˃ Send to: Chr. Hansen

Att: Arpajon Phage Team
Le moulin d’Aulnay – B.P. 64
91292 Arpajon Cédex
 COMMENT GERER LE RISQUE PHAGE EN USINE
Actions correctives
 Filtration method

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1. Lower pH of the sample to pH 4.50/4.60 by addition of small drops of concentrated hydrochloric acid to obtain an artificial coagulation of the sample. For safety
reasons, gloves and glasses are mandatory. For finish acid products like yogurt, the acidification step is not necessary.

2. Put a paper filter in a plastic funnel over a plastic bottle. Add the acidified sample in the filter and wait until the liquid flows

3. Filter-sterilise the liquid phase through 0.2µ disc. If necessary, use a 0.8µ filter disc before. Filtration step allows to separate bacteria from the way to keep only
the possible virus. This step must be made in a sterile environment.
CHR. HANSEN vous aide à maitriser le risque phage:
 en vous proposant un support adapté à vos
besoins
 en mettant ses experts à votre disposition
 en améliorant continuellement ses cultures et ses
connaissances