GFP (Green Fluorescent Protein) et ses dérivés

I. Protéines auto-fluorescentes :

- Protéine GFP : 1ère protéine auto-fluorescente découverte sur une méduse à travaux
d’exploitation = prix Nobel de Chimie 2008 (1 zoologiste, 2 biologistes moléculaires).
Ce qui a nécessité beaucoup de travaux de génie génétique, de mutagénèse et de
biologie moléculaire.
- La protéine GFP a été découverte dans les années 60 et elle est de + en + utilisée en
imagerie cellulaire et sur des animaux taille réelle.
• 1962 : Extraction d’une protéine de méduse (l’aequorine) en voulant l’isoler,
Shimomura et Coli co-purifient une autre protéine (jaune-verte à la lumière
avec l’émission d’une intense fluorescence verte sous UV) : la GFP.

• 2010 : ­ du taux de publications en

fonction des années à outil très utilisé.

- Objectifs de la GFP : rendre les protéines fluorescentes dans tous les domaines
(marquage des éléments à différentes échelles : des protéines, des acides
nucléiques, des organites, des cellules, des organes et végétaux permettant l’étude
des fonctions cellulaires : transcription ; screening de drogues ; ...)
- Ces dernières années, il y a eu la mise en place de modèles animaux transgéniques
GFP : fluorescents (leurs organes compris).

a. Propriétés biochimiques de la GFP

à Remarquablement stable : bon candidat en tant qu’outil
• T < 65°C
• 5,5 < pH < 12,2
• 6M hydroxycholrure de guanidium
• 8M urée
• 1% SDS
- Protéine de 28kD : protéine de petite taille (+ grande que les
fluorophores habituels mais plus petites que les Ac).
- Résistantes aux protéases
- Émission de fluorescence spontanée sans nécessité de
cofacteur

Limite de la GFP : Sa forme native a tendance à former des dimères (au-

delà de 2mg/mL de concentration).
 b. Caractéristiques spectrales de la fluorescence pour la GFP
native :

• Deux pics d’excitation : 395 nm et 470 nm.

• Maximum d’émission à 509 nm avec un épaulement
jusqu’à 540 nm

c. Évolution de la protéine GFP en fonction du temps :

- 1992 : véritable outil de biologie moléculaire à le gène codant la GFP est cloné par
Prasher et Coll.

- 1994 : premier problème de provenance : la méduse (chaque organisme a ses

préférences d’utilisation des codons et ses propres promoteurs) à création d’un
système hétérologue à partir de ce gène issu du génome de la méduse pour parvenir
à la faire exprimer dans une bactérie.
• Caractérisation de la protéine : ses propriétés et sa structure via sa
production à l’aide d’une bactérie (système le + efficace de production =
bactérie car reproduction toutes les 30 minutes).

- 1996 : caractérisation et obtention de la structure par diffraction à la structure de

cette protéine GFP présente 3 acides aminés retrouvés à l’intérieur du cylindre
fermés par les feuillets β et qui permet de générer la fluorescence : le fluorophore.
Les deux extrémités (N- et C- terminales) de la protéine sont libres et non repliées,
elles émergent de la structure et sont donc accessibles : permet le “greffage” d’une
protéine d’intérêt sur l’une des extrémités pour suivre cette “chimère” in vivo.

d. Mise en œuvre Þ tentative d’expression dans le système mammifère :

- Les premières tentatives étaient un échec. Utilisation du phénomène de mutagénèse
aléatoire suivi du cribblage des mutations en observant lesquelles avaient un effet
positif ou négatif sur l’activité protéique en fonction des différentes problématiques
à une centaine de mutations silencieuses (cad sans changement AA) sont donc
introduites dans le gène ce qui a permi de comprendre les préférences d’usage des
codons par la protéine.
- Limites :
• Vitesse d’apparition de la fluorescence est très longue : découverte de la
mutation Phe64Leu qui permet une amélioration du repliement à
augmentation de la vitesse d’auto-oxydation à accélération la vitesse de la
fluorescence (2h à < 30min).
• Température a été adaptée permettant la fonctionnalité de la fluorescence
dans le corps du mammifère (température corporelle de l’homme différente
de celle de la méduse) : température optimale passe de 30 à 37°C.
• Amélioration du phénomène d’agrégation à l’aide de certaines mutations :
limitation de formation des D-dimères
• Amélioration de la solubilité de la GFP
Þ Obtention d’une GFP en 30min, à 37°C dans des cellules eucaryotes qui s’agrègent moins.
 e. GFP utilisée en biologie moléculaire Þ contraintes d’utilisation :
- Localisation particulière de certaines protéines d’intérêt à prendre en compte les
signaux de localisation de certains organites (par ex : Noyau = signal de localisation
nucléaire doit être accessible à l’extrémité de la protéine chimère).
- Activation des protéines par clivage : veiller à greffer la GFP à l’extrémité (N- ou C-
term) de la protéine d’intérêt qui reste active après clivage.
- L’orientation de la GFP ne doit pas perturber l’activité de la protéine : veiller à greffer
la GFP à l’extrémité (N- ou C-term) de la protéine d’intérêt sans impacter sa
fonctionnalité.
- La distance séparant la GFP de la protéine doit être optimale : utilisation possible de
« linker » (petit peptide de quelques AA).

f. Construction d’une protéine chimérique : fusion GFP + protéine d’intérêt

1) Isolement du gène qui code la protéine d’intérêt
2) Isolement du gène qui code la GFP
3) Fusion par ligases : création d’un gène qui va cloner la protéine chimérique
4) Transfection dans la cellule à l’aide d’un plasmide (= vecteur) sous contrôle d’un
promoteur eucaryote
5) Synthèse de l’ARNm par la machinerie cellulaire classique
6) Obtention d’une protéine fluorescente au bout de 30min
à Pratique +/- facile à mettre en œuvre (taille du gène à cloner trop grande, transfection +/-
acceptée par la cellule).

Limite : Surproduction protéique avec génération de beaucoup de fluorescence à stress

métabolique cellulaire (du réticulum endoplasmique) et apoptose possible
Fort taux de fluorescence après transfection à méfiance car dénaturation possible de la
cellule.
Þ Vérification que la protéine chimérique soit bien fonctionnelle :
 § Si absence de fluorescence à refaire la transfection en changeant l’agent
transfectant (liposome, électroporation), en changeant les ratio (plasmides –
agents transfectant), ...
Þ Contrôler la qualité de la transfection (= expression de la protéine chimère
correctement transférée et produite mais non-fluorescente) : immunomarquage
avec Ac anti-GFP
§ Si le marquage anti-GFP est exprimé par l’Ac = la protéine est intégrée dans la
cellule, mais problème d’émission de fluorescence.
o Environnement défavorable, par ex : pH problématique
o Chimères en trop faible quantité qui occupent un large espace de
distribution cytoplasmique : protéine diluée et dispersée et fluorescence
non-visible dans l’espace observé à autre technique requise.

- Création de l’EGFP : amélioration de la GFP via mutagénèse avec obtention d’1 seul
pic d’excitation et augmentation du pic d’émission permettant une fluorescence
optimisée. Par ailleurs, la dimérisation est encore diminuée voire inexistante.

Intérêt à Localisation simultanée de deux protéines différentes dans une même cellule soit
création d’un double marquage : 2 stratégies possibles.

• Stratégie 1 : générer des mutants de la GFP jusqu’à création d’une autre

couleur que le vert à décalage du spectre de couleur.
- Création de 3 variants = EBFP (bleu) ; ECFP (cyan) ; EYFP (jaune)

•Stratégie 2 : recherche dans les fonds marins d’une espèce analogue :

anémone de mer (protéine auto-fluorescente dans le rouge = DsRED)
- Moins utilisé à l’heure actuelle
- Maturation effectuée à 37°C
- Beaucoup d’agrégats de la protéine native : important travail
de mutations pour ne plus provoquer d’agrégation.
(Dimérisation = toxicité car la cellule réagit par des mécanismes
de défense, si stress trop important ® auto-phagocytose /
apoptose cellulaire ou extinction spontanée de l’auto-
fluorescence) : problème DsRED s’éteint très vite
- 33 mutations ont été nécessaires pour générer une forme
monomère de la protéine (mRFP1) : rouge

- La recherche de nouvelles molécules fluorescentes (dites AFPs) se poursuit avec la

mise à disposition d’un panel de couleurs pour la recherche en biologie moléculaire :
 8 nouvelles protéines auto-fluorescentes (toutes monomériques) sont décrites. Il
faut poursuivre leur caractérisation in vivo puis les améliorer par des mutations.

à Apparition des fluorescences en fonction des différentes longueurs d’ondes dans les
fonds marins (à l’aide de lampes utilisées lors de plongées sous-marines).

II. Applications de l’auto-fluorescence :

1. Localisation d’une protéine dans un compartiment : Étude Mitose : intérêt

pour étudier la cinétique
des cellules cancéreuses

Exemples de cellules transfectées avec des protéines associées à différents AFP dans des
organites permettant de recomposer la composition cellulaire.
- Grand intérêt : Étude de cellules vivantes (contrairement à l’immunomarquage avec
fixation cellulaire) permettant de suivre une ou plusieurs protéines et leur
déplacement au cours du temps via un microscope avec enceinte thermostatique.

- Observations des différents organites et autres éléments de la cellule :

o Réticulum endoplasmique s'étend dans toute la cellule : majorité du volume

membranaire intracellulaire.
o Mitochondries : tout un réseau +/- fusionnées entre elles.
o Appareil de Golgi = dictyosome périnucléaire.
 o Réseau de microtubules / vésicules de cargo : vésicules de sécrétion qui sont
émises à partir de l’appareil de Golgi en périnucléaire pour venir fusionner à la
membrane en avançant le long des microtubules.
o Étude de la mitose avec la chromatine colorée (la chromatine en rouge et les
microtubules en verts) ou via les centromères fluorescents.
o Étudie de l’activité d’une protéine (ex : cyclines exprimées en fonction du stade
du cycle cellulaire).
o Mise en évidence de l’activité génique (transcription) : synthèse ARNm sur un
locus précis qui diffuse ensuite dans le cytoplasme.

Méthode des cellules DRONPA permettant l’étude du cycle cellulaire (mitose >>>) : Création de protéines auto-fluorescentes
capables de changer de couleur en fonction de l’activation de la protéine d’intérêt à un moment du cycle cellulaire =
fluorescence de couleur différente (vert sur la période S-G2-M et Rouge en G1 avec une courte transition en orange).
à Intérêt : étude de la prolifération/migration in vitro pour une utilisation à terme des constructions chimériques introduites
dans les cellules cancéreuses ré-injectées dans l’animal pour visualiser l’état de la cellule au moment de sa dissémination
(notamment dans les voies sanguines).
 III. Autre type d’utilisation : dans le vivant

Les protéines fluorescentes permettent de visualiser et estimer la diffusion et le déplacement

des protéines dans une cellule.

1. Technique FRAP

Déjà utilisée en biologie cellulaire pour étudier la fluidité de la membrane et le déplacement

des protéines et des phospholipides.

Fonctionnement :
- On éteint la fluorescence dans
une zone puis on regarde si elle
revient dans cette même zone
- On transfecte notre cellule pour
qu’elle soit fluorescente, elle
exprime une protéine
fluorescente qu’on étudie
Si ma protéine n’est pas capable de se
déplacer : la zone reste éteinte
Si ma protéine est capable de se
déplacer : elle va revenir dans la zone,
celle qui est éteinte va repartir à réapparition de la fluorescence dans la zone
Plus la protéine se déplace vite, plus vite la fluorescence va revenir
Si une seule partie des protéines bouge : retour non complet
Techniques qui vont permettre de mesurer la vitesse de déplacement de la protéine et
d’estimer si 100% des protéines bougent ou pas
Extinction d’une zone à protéines éteintes et autour : protéines qui fluorescent encore

Premier cas : pas de mouvement,

immobile, protéines ne bougent pas
à zone reste éteinte
Intensité de fluorescence dans cette
zone reste nulle au cours du temps

Deuxième cas : protéines fluorescentes et

non fluorescentes bougent, déplacements
à Réapparition de la fluorescence dans la
zone d’extinction initiale
 La rapidité de la répparition est
proportionnelle à la rapidité de
déplacement.

En fluorescence : protéine cytosolique associée au

réticulum, se déplace
à Zone d’extinction va apparaitre, puis
fluorescence revient

Protéine de l’enveloppe nucléaire marquée à extinction mais sans réapparition

Protéines encrées dans l’enveloppe, ne bougent pas, donc pas de fluorescence

Mesure de la réapparition
avec des courbes
Si plusieurs fluorescences,
plusieurs protéines étudiées
à différentes courbes
Si la fluorescence ne revient
pas au taux maximal à une
partie des protéines qui ne
bouge pas (fraction mobile)
et une partie qui bouge
(fraction immobile)

Problème du FRAP : il faut

éteindre, puis attendre la
réapparition de la
fluorescence
Microscope équipé du laser,
champ d’observation, délimitation d’une zone (= zone d’extinction), calibrage du microscope
pour qu’il n’éclaire que la zone définie, augmentation de la puissance laser, pour éclairer cette
surface, et extinction du fluorochrome
Fluorochrome :
• Si utilisation de la longueur d’onde d’excitation à une puissance classique
à Excitation des éléctrons qui vont émettre la fluorescence
• Si surexcitation
à Réactions d’oxydation dans le fluorochrome qui vont l’éteindre
Changement de la puissance du laser pour déclencher l’extinction
2ème changement de la puissance du laser pour revenir à une puissance qui permet de mesurer
la fluorescence
Temps entre le moment d’extinction et le moment d’observation à suffisant pour que la
protéine soit déjà revenue (déplacement très rapide)
Certaines protéines non visibles au FRAP car le temps d’éteindre et de rechanger le réglage
du laser, au moment de l’observation on est déjà à 100% de fluorescence
Tellement rapide qu’on peut avoir un décalage qui empêche la mesure
 2. Technique FLIP

Fonctionnement à l’inverse du FRAP

On ne regarde pas la réapparition de la fluorescence mais la perte de fluorescence
Travail avec 2 zones (zone d’extinction ¹ zone d’observation)
Extinction en continu d’une zone, observation à coté pour voir si la fluorescence reste
identique ou si elle baisse

Si protéine immobile à extinction en continu de la zone à si protéine fluorescente à côté ne

bouge pas pour y venir à fluorescence à côté ne bougera pas
Pas de variation de la fluorescence à pas de mouvement de la protéine

Si protéine mobile à extinction à protéine fluorescente revient à extinction à protéine

fluorescente à extinction à protéine fluorescente revient à extinction…
Petit à petit : extinction de toutes les protéines à diminution de la fluorescence extérieure

Extinction puis observation des déplacements des protéines fluorescentes à côté

Déplacement dans les deux sens : protéines fluorescentes vont venir et protéines non
fluorescentes vont sortir

Première extinction : protéine fluorescente rentre, protéine non fluorescente sort

Deuxième extinction (toutes les protéines deviennent non fluorescentes) : protéine non
fluorescente ressort, nouvelle protéine fluorescente rentre
Troisième extinction : protéine non fluorescente sort, etc
Petit à petit : diminution de la fluorescence extérieure

Extinction d’une même zone à observation à coté à si protéines bougent à protéines

fluorescentes vont finir par passer et vont finir par les éteindre à chaque fois qu’elles passent
Petit à petit : extinction de tout le pool de protéines
à Plus long, indirect, mais permet de voir les mouvements qui étaient trop rapides en FRAP
Observation de l’extinction
Extinction en continu à observation de la diminution de fluorescence dans le compartiment
d’à coté
 Expérience : 2 cellules

Zones 1 et 2, sur
lesquelles il n’y a pas eu
d’extinction
(= témoins)
Pas d’extinction à
fluorescence ne bouge pas

Zones 3, 4, 5 et 6,
extinction faite, carré
pour observer la
fluorescence
Extinction sur le grand
carré à observation dans
les zones 3, 4, 5 et 6

Diminution de la fluorescence dans les zones 3, 4, 5 et 6, en éteignant au même endroit

Protéines vont passer, puis être éteintes au fur et à mesure
Possibilité de mesurer des vitesses de déplacement : extinction d’autant plus vite que les
protéines bougeront vite

FRAP + FLIP = 2 techniques qui permettent de voir le déplacement

Il existe aussi 2 techniques permettant d’étudier le déplacement des protéines fluorescentes :

la photoactivation et la photoconversion.
 3. Photoactivation

Protéine censée être auto fluorescente, ne

fluoresce pas dans un premier temps, flash
laser pour la rendre fluorescente
Intérêt : étude du déplacement de la
protéine d’intérêt (du noyau ou du
cytoplasme), transfection, activation de la
fluorescence dans une petite partie du
noyau, protéine d’intérêt devient
fluorescente dans le noyau, observation de
son déplacement dans le cytoplasme
Marquage de quelques protéines
radioactives, suivi pour voir leurs
déplacements

Injection d’un produit de contraste, suivi

du déplacement

Éclairage d’une partie des protéines puis

observation de leurs déplacements dans la
cellule

4. Photoconversion

Protéine fluorescente qui fluoresce

dans une couleur (au début en vert
par exemple), flash laser et
changement de fluorescence en
rouge
Même type d’utilisation que la photo
activation
Photoconversion d’une petite partie
des protéines vertes qui vont devenir
rouges puis observation de leurs
déplacements

Protéine photoactivable à pas de fluorescence à photo activation dans une zone donnée à
fluorescence verte et observation des déplacements de ma protéine
Photo activation à fluorescence qui diminue au niveau du point initial d’activation car la
protéine a bougé de place à permet de suivre l’évolution des déplacements
Cellules : réseau de mitochondries marqué en rouge
Trois types de cellules différents, cercles blancs = zones où la photo activation a eu lieu

Photoactivation à 30 s
après : observation de la
localisation de la
fluorescence verte
à déplacement de la
fluorescence des cercles
blancs
En 30 s : protéine a déjà
traversé la moitié de la
cellule
Photoactivation à un
endroit, puis observation de
l’endroit de déplacement de
la protéine

Cellule dépendante puisque

dans celle-là, ça devient
quasiment rouge
Problème : marquage des mitochondries pour les repérer
De principe, protéine dans toute la mitochondrie, peu importe l’endroit de la photo activation,
si c’est dans la mitochondrie, photoactivation de la protéine
A l’origine la protéine ne fluoresce pas, si photoactivation à un endroit sans protéine, pas
d’activation de la protéine
Problème de la photoactivation donc passage à la photoconversion

En photoconversion : vert à fluorescence rouge (permet de repérer la protéine avant de

l’éclairer) à dispersion dans la cellule
Variations de fluorescence au point de photoconversion :
- Avant photoconversion : fluorescence 100% vert 0% rouge
- Après photoconversion : perte de la fluorescence verte qui devient rouge
Au cours du temps, perte du signal rouge qui se déplace et réapparition du signal vert dans la
zone
En photoconversion : suivi du déplacement des protéines rouges qui partent et des protéines
vertes qui viennent

Exemple sur un noyau : chromatine rendue photo activable

Observation au cours du temps pour savoir si ADN intra nucléaire est en mouvement ou non
dans un noyau en interphase
Photoactivation puis observation de la cellule :
- Si ADN ne bouge pas, la zone photo
activée reste toujours au même endroit
- Si ADN bouge, déplacement de la zone
photo activée
à Photoactivation (pour ce noyau : rotation) peut
permettre de visualiser des déplacements de
masse plus importante ou d’organes, et pas
uniquement des déplacements de protéines
 5. Protéine DRONPA

Dernière évolution sur les protéines auto fluorescentes

Protéine photoactivable plusieurs fois (possibilité d’éteindre et d’activer autant de fois que
voulu)

Exemple : photo activation

1000x à intensité de
fluorescence émise par leur
protéine après
Surface recouverte par les
protéines photoactivables à
toute verte à extinction totale
à écriture des lettres avec le
laser (D ça s’allume, je re eteins,
R ça s’allume je re eteins)
Protéine photoactivable
modifiée peut être réactivée
plusieurs fois

Utilisation pour faire le suivi d’une protéine (ERK), qui peut être située dans le noyau et dans
le cytosol à possibilité d’étudier le déplacement dans un sens et dans l’autre
Sans cette protéine, pour étudier les déplacements du noyau vers le cytoplasme et inversement
à obligé de le faire sur 2 cellules
différentes (1 cellule pour activer
dans le noyau et suivre le
déplacement dans le cytosol / 1
cellule pour activer dans le cytosol et
suivre le déplacement dans le noyau)

Intérêt protéine ERK : s’allume et

s’éteint plusieurs fois à études des 2
mouvements dans la même cellule

Stimuli à éclairage du noyau et

observation du cytosol à extinction
à éclairage du cytosol et extinction
du noyau (léger décalage)
Intérêt : suivi des 2 évènements dans
la même cellule
Possibilité d’allumer à un endroit, de regarder le déplacement, puis d’éteindre et d’allumer à
un autre endroit pour regarder le déplacement

Facteur de transcription à stimuli à déplacement du facteur dans le noyau pour continuer

les transcriptions
Mise en évidence d’un échange entre la forme nucléaire et cytoplasmique (pas seulement la
forme dans le cytoplasme qui va dans le noyau, mais en même temps celle déjà dans le noyau
repart dans le cytoplasme)
Expérience : observation des déplacements, cytoplasme-noyau et noyau-cytoplasme
Activation dans le cytoplasme et observation de l’arrivée dans le noyau
Activation dans le noyau et observation du déplacement dans le cytoplasme
Expérience dans une seule et même cellule, à différents temps après la stimulation
Possibilité de reproduire l’expérience sur différentes cellules mais c’est mieux que toutes les
mesures soient faites sur une seule et même cellule

Résumés FRAP, photo activation et photo conversion

 IV. Application sur l’animal entier

Etudier des tissus, des organes

Animaux transgéniques soit complètement
fluorescents soit qui auront certains organes
fluorescents (dépend de ce qui a été effectué)
Outils d’imagerie (scanners, irms) qui existent
pour les animaux (souris, rats), un peu comme
l’imagerie médicale mais adapté pour les
animaux (plus petit)

Exemple : animal non fluorescent, injection

de cellules fluorescentes
Utilisé dans des modèles tumoraux pour voir
la dispersion des cellules fluorescentes dans
l’organisme à partir d’une tumeur, la
formation ou la dispersion d’une tumeur,
selon ce que l’on cherche à regarder

Autre type d’utilisation : Animaux fluorescents avec différents types de fluorescences en

fonction du type de cellules (au niveau du développement)
Organes prélevés :
- Première étape : Transpariser (= rendre transparents) les organes
Tous les organes sont irrigués, problème : hémoglobine (déjà colorée) dans le sang à
vient géner les images de fluorescence
- Deuxième étape : Fluorescence dans les différents organes prélevés chez ces animaux
- Troisième étape : Observation en imagerie (comme de l’imagerie clinique avec les
différents plans) à reconstitution en 3D pour modéliser les différents éléments de
l’organe

Exemple : cœur, poumon

Technique efficace, objectif : observer en direct certaines pathologies sur des animaux
(déformation, évolution de certaines parties des organes, impact de tel produit, ou de telle
infection sur les organes)