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Chap 8 : Animaux transgéniques

I. Intro

1) Génomique fonctionnelle
Génomique fonctionnelle : décrypter le rôle des gènes :
- Afin de mieux comprendre le rôle des voies biologiques
- Afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques

Différents modèles animaux existent :

- Ver
- Drosophile
- Poulet
- Poisson Zèbre (Zebrafish)
- Rat
- Souris

2) Arguments de choix de la souris comme modèle

- Elevage facile
- Animal de petite taille
- Caryotype proche de celui de l’Ho (85% d’homologie)
- Caractéristiques physiologiques proches de celles de l’Ho
- Tests phénotypiques disponibles (phénotype = expression du génotype)

3) Historique de la mutagénèse dirigée chez la souris

- 1976 : Souris transgéniques par infection rétrovirale d’embryons en cours de clivage
- 1980-1981 : Souris transgéniques par micro-injection d’ADN dans le pronucléus du zygote
- 1981 : Établissement de lignées de cellules souches embryonnaires
- 1986 : Souris transgéniques via l’obtention de chimères avec des cellules ES modifiées génétiquement
- 1987 : Première expérience de mutagenèse dirigée : obtention de cellules ES porteuses d’une
mutation nulle dans le gène HPRT
- 1989 : Premières souris mutantes obtenues par recombinaison homologue dans les cellules ES
- 1994 à aujourd’hui : Création de remaniements chromosomiques. Création de mutations
conditionnelles
Cellules ES = cellules souches embryonnaires

II. Aperçu des différents modèles transgéniques existants

1) Inactivation d’un gène d’intérêt

= Knock-out
- Pour mieux comprendre sa fonction
- Pour valider son implication dans une pathologie (mais le + svt : plsrs mutations dans une maladie)

2) Humanisation d’un gène d’intérêt

- Pour créer un modèle murin pour une pathologie humaine
- Pour permettre production par la souris d’une protéine humaine (ex : IgG humaine)
- Pour analyser différences Ho/souris

3) Introduction de mutations ponctuelles dans un gène d’intérêt

- Pour reproduire chez souris mutation observée chez Ho dans pathologie donnée
- Pour comprendre rôle des domaines fonctionnels/sites actifs d’une protéine

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4) Surexpression gène d’intérêt

Pour reproduire chez souris surexpression observée chez Ho dans pathologie donnée → étude des
conséquences

III. Manipulation génétique du génome murin

1) Transgénèse par injection d’ADN dans le pronucléus mâle de l’œuf

a) Rappels sur le dvpt embryonnaire chez souris

= Introduire un morceau d’ADN étranger dans la souris → difficulté : embryon très petit (100 µm de diamètre)
et très difficile à manipuler

Dans le blastocyste, on a des cellules de l’ICM (masse cellulaire interne) = cellules ES qui vont donner l’individu
entier ; puis va s’accrocher à la paroi utérine

b) Transgénèse par injection d’ADN dans le pronucléus mâle d’un œuf

Transgénèse : introduction d’ADN étranger dans le génome d’une espèce animale

Etapes :
- Identifier gène d’intérêt
- Produire une construction contenant ce gène + séquences régulatrices (promoteur…)
- Insérer la construction dans le génome de l’hôte

Exemple de construction plasmidique utilisée pour une transgénèse :

Gène : HEL 2x (HEL avec 2 mutations)
Promoteur : CAG : chicken β-actin promoter

On peut rajouter une séquence qui code pour la GFP pour suivre la
protéine par fluorescence.
Pb : la partie fusionnée avec la GFP risque de ne plus être
fonctionnel

Autre système sans protéine de fusion : système IRES = séquence qui

permet au ribosome de sauter de la fin de la séquence codante au
début de la suivante

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Recueillir des ovocytes = embryon au

stade 1 cellule → injecter dans le
pronucleus male (+ gros et + facile à
visualiser au microscope) l’ADN linéaire
et propre (injection de 1-2 pmol d’ADN).

Insertion dans le génome → au hasard

(souvent plusieurs copies les unes
derrière les autres → nous garantit
d’avoir + de protéines exprimées).
Pas tout à fait au hasard car la
chromatine doit être ouverte pour
l’insertion → les sites d’ouverture de la
chromatine sont des sites d’insertion
privilégiés.

Puis on réimplante les ovocytes

(oviductes) chez une femelle (« mère
porteuse ») qui a subi un traitement
hormonal (gestation de 3 semaines).
Puis on crible les portées pour vérifier la
présence du transgène (via PCR).

On garde les souris (TgI +) = souris

fondatrices (F0), qu’on croisera avec des
souris sauvages.
1ère génération de croisement = F1, etc…

Promoteurs utilisés :
- Ubiquitaires : ex : Ubiquitine Chumaine, CAG…
- Ciblés : cellule‐spécifique, tissu-spécifique

Avantage de la technique :
Rapide (bcp + que la recombinaison homologue)

Inconvénients de la technique :
- Intégration au hasard, non ciblée : possibilité d’insertion dans région essentielle du génome, risques
d’activation d’oncogènes
- Chaque fondateur génère une lignée différente (localisation du transgène différente) : temps
d’analyse pour le choix du fondateur
- Impossible de reproduire à l’identique (dès le début il faudra congeler des embryons pour garder une
trace)

Applications de la technique :
- Etude de la fonction d’un gène par sa surexpression : potentiel oncogénique (Bcl2), effet dominant
négatif (= allèle muté à l’état hétérozygote qui a un effet dominant sur l’allèle sauvage)
- Créer un modèle de maladies humaine (ex : cancers : surexpression de Bcr/Abl et leucémies)
- Production de protéines

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2) Transgénèse lentivirale

a) Principe
Famille Rétroviridae, genre Lentivirus,
HIV sous forme modifiée = non pathogène → virus intégratif = intègre une
partie de son génome à celui de la cellule infectée → on va donc intégrer un
transgène à son génome.

On va produire un antivirus à forte concentration, et on l’utilisera pour

infecter des souris = insère dans le génome de la souris son génome.

Ce qui est inséré = la partie de 5’LTR à 3’LTR : on se débrouille pour mettre

le transgène entre ces parties et on enlève les protéines du virus (= génome
non-infectieux)

Méthode :

Cellule packaging = cellule intermédiaire qui produit les particules virales = virion « infectieux »
+ plasmides (contient les protéines accessoires du virus (enveloppe, GAG etc…)

Le virion « infectieux » synthétisera des particules non infectieuses → n’a pas les protéines pour.

Ici, on voulait exprimer la protéine FKBP11 + protéine GFP sans que ce soient des protéines de fusion ; le
ribosome va se décrocher la où il y a la grosse flèche → 2 protéines différentes.

Une fois le virus injecté dans l’espace périplasmique → implantation dans souris porteuses → criblage par PCR
etc…

b) Exemple d’un promoteur non ubiquitaire, mais dépendant d’un tissu

Production d’histone-H2B-GFP sous la dépendance du promoteur
myogénine = expression du transgène dans les muscles.

c) Applications : idem à la transgénèse classique

Avantage : idem que transgénèse classique + rendement supérieur

Inconvénients : idem que transgénèse classique

- Intégration au hasard

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- Chaque fondateur génère une lignée différente : temps d’analyse

- Impossible de reproduire à l’identique

3) Transgénèse par recombinaison homologue dans les cellules ES

a) Rappels sur les cellules ES

Cellule souche = indifférenciée, peut

s’auto-renouveler + se différencier en
cellules spécialisée

Les différents types :

- Totipotente : peut donner un
organisme entier (ovocyte fraichement
fécondé)
- Pluripotente : cellules ES (peut donner
les 3 feuillets embryonnaire)
- Multipotente : cellules du foie, intestin
etc…

b) Recombinaison homologue dans les cellules ES

Principes :
- Echange d’ADN entre une séquence d’ADN exogène et une séquence homologue présente in situ,
dans le chromosome
- Les cellules de mammifères contiennent la machinerie enzymatique nécessaire
- Evènement rare, donc à sélectionner

Recombinaison homologue et sélection

Il faut des bras d’homologie en amont et en aval

Protéine bleu → on casse l’exon, donc protéine sera bcp + courte et non fonctionnel = souris KO

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Micro-injection des cellules ES recombinantes et genèse des chimères

Stade blastocyste → cellules ES normales puis injection de cellules ES modifiées = mélange de cellules ES
normales et modifiées puis implantation dans femelle porteuse (dite pseudo-gestante)
Accouplement avec mâle stérile pour qu’elle soit prête à la nidation
 Obtention de chimères = souris avec deux couleurs différents (noire : blastocyste et gris : cellules ES
modifiées)
Si uniquement des souris noires : cellules ES modifiées ne se sont pas implantées
Plus elle sera brune et plus on aura des chances qu’elle ait intégré cellules ES modifiées

Pb : technique très longue (1 an et demi – 2 ans)

c) Obtention de souris KO par recombinaison homologue dans les cellules ES

Il faut sélectionner les cellules qui ont fait la recombinaison homologue → syst de double sélection

Insertion dans séquence à échanger :

- Gène de résistance à néomycine
- En aval bras homologie 3’ : gène TK → ne
va pas s’insérer !

S’il n’y a pas de recombinaison homologue mais au

hasard : aussi insertion du gène TK

1e sélection = sélection positive avec néomycine → sélectionne toutes les cellules où il s’est passé qqch

Puis culture avec Ganciclovir → cellules avec gène de la TK vont mourir = cellules avec l’insertion au hasard
Ganciclovir : transformé par TK (thymidine kinase) en produit toxique pour la cellule (analogue de nt qui va
bloquer transcription)
 Sélection des clones ES + vérification par électrophorèse et Southern Blot

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Résumé :

Application : obtenir des souris KO → casser séquence codante du gène

Etude de la fonction d’un gène
Avantage : abolition complète expression gène
Inconvénients :
- Invalidation complète gène peut conduire à létalité embryonnaire
- Pb redondance de fonction de certains gènes
- Effet pléiotropique de certains gènes (sont exprimés de manière ubiquitaire)

d) Obtention de souris KI (knock-in)

Principe et applications :
On remplace gène sauvage par gène qui va s’exprimer :
- Gène muté → expression d’une protéine (modèle de pathologie humaine, mutation poncuelle → ex
mucoviscidose)
- Expression modèle humanisé d’un gène (ex : prod IgG humaine/murine)

Application intéressante : surexpression d’un gène murin normal par insertion ciblé dans locus particulier (ex
locus ROSA) → ne modifiera pas expression de gènes importants pour la souris

e) Obtention de modèles murins conditionnels : syst Cre-Lox

Objectif recombinaison conditionnelle : permettre invalidation gène KO ou expression gène muté (KI) :
- Dans cellule ou tissu particulir
- A un tps donné
 Syst Cre-Lox

Cre = recombinase produite par bactériophage P1 → recombinaison spécifique entre 2 sites loxP

Pour éliminer exon d’un gène → entoure de sites loxP (représentés

par flèches) → excision de la partie entre ces sites
= souris floxée → croisée avec souris qui exprime Cre → souris
obtenue exprime allèle sauvage partout sauf là où elle a exprimée
la Cre

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Cre ne s’exprime pas partout : sous dépendance promoteur cellule ou tissus-spécifique

Application : production d’un modèle KO conditionnel dans une cellule donnée ou un tissu donné

Si a exprimée Cre dans tous les tissus → KO total. Intérêt : même si létalité embryonnaire → on peut exprimer
Cre que dans certains tissus (évite perte de tps et d’argent)

En + : permet d’exprimer gène rapporteur → dans cellules ou Cre aura agit : expression de la GFP (gain de tps)
➔ Introduction GFP → si Cre : suppression de la séquence stop (entre les deux sites loxP) → GFP va être
exprimée

Exemple : cf TD (avec gène carabin)

Avantages :
- Contourner létalité embryonnaire
- Analyser effet d’une mutation dans tissu ou cellule donné

Modèle inductible
Expression à un temps donné → Cre = protéine de fusion avec récepteur (ex : R à stéroïde)
Sans agoniste : Cre inactive
Injection agoniste (ex : clamocifène) → expression Cre (changement de conformation)
Cre inductible : peut être ubiquitaire ou tissu spécifique

IV. Génotypage des souris transgéniques :

PCR sur queue de souris (cf. ex de Carabin en TD)

V. Ex de nouvelles technologies : Crispe-Cas9

Avantage : + rapide
Permet d’introduire mutation ponctuelle à un site ciblé
Cas9 : quand apporte oligont → va remplacer séquence du locus endogène
Syst qui provient des bactéries → leur permet d’insérer dans génome viral des séquences capables de le casser
→ protection quand infecté